CN108410787A

CN108410787A - 一种合成乳酰-n-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN108410787A
Application number: CN201810206004.3A
Authority: CN
Inventors: 刘龙; 王淼; 陈坚; 堵国成; 李江华; 董晓敏
Original assignee: Shanghai Bright Dairy and Food Co Ltd
Current assignee: Shanghai Bright Dairy and Food Co Ltd; Bright Dairy and Food Co Ltd
Priority date: 2018-03-13
Filing date: 2018-03-13
Publication date: 2018-08-17

Abstract

本发明提供了一种合成乳酰‑N‑新四糖的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌在枯草芽孢杆菌168基因组上重组整合有乳糖透性酶基因，及在枯草芽孢杆菌168中转化有包含β‑1,3‑N‑葡糖氨基转移酶基因和β‑1,4‑半乳糖转移酶基因的质粒。本发明利用枯草芽孢杆菌自身代谢途径中的尿苷二磷酸半乳糖，乙酰氨基葡萄糖尿苷二磷酸，作为前体物质，仅需要从外源添加乳糖并在乳糖透性酶的作用下转入细胞，合成乳酰‑N‑新四糖，并分泌到胞外。本发明的重组枯草芽孢杆菌合成乳酰‑N‑新四糖在胞外积累量达到1071mg/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产乳酰‑N‑新四糖奠定了基础。

Description

一种合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于遗传工程的技术领域，具体涉及一种合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

母乳寡糖(Human Milk OligosaccharideshMOs)是人类母乳中的第三大固体组分，仅次于乳糖和脂肪。由于HMOs在口腔和小肠中不能被分解，所以HMOs是重要的益生元，可以被肠道中的有益微生物菌群利用，促进双歧杆菌的增殖、阻碍病原体的粘附、调节肠道上皮细胞应答、免疫调节等。到目前为止，包括乳酰-N-新四糖在内的HMOs已经在临床实验中被应用到婴儿配方奶粉和食品添加剂中。从乳酰-N-新四糖开始，可以通过岩藻糖基化或唾液酸化进一步得到岩藻糖基或唾液酸基的寡糖。因此，合成乳酰-N-新四糖具有重要的意义。目前发展的化学合成大多需要繁琐的保护、脱保护操作和大量的分离纯化工作，总体合成收率较低；酶法合成方面，酶的来源以及酶严格的底物适应性限制了其在寡糖大量合成中的应用，而且其提取过程中有毒溶剂的使用也不适用于营养品的生产。生物合成因其原料便宜、安全，更适合食品级产品的生产。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是GRAS(generally regard as safe)菌株，其自身代谢途径中包含尿苷二磷酸半乳糖，乙酰氨基葡萄糖尿苷二磷酸的合成途径，而这两种物质可以作为底物参与合成乳酰-N-新四糖。

因此，如何利用枯草芽孢杆菌，通过代谢工程改造并发酵合成食品安全级乳酰-N-新四糖，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，构建的重组枯草芽孢杆菌可以高效合成乳酰-N-新四糖。

具体的，一方面，本发明提供了一种合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌在枯草芽孢杆菌168基因组上重组整合有乳糖透性酶基因，及在枯草芽孢杆菌168中转化有包含β-1,3-N-葡糖氨基转移酶基因和β-1,4-半乳糖转移酶基因的质粒。

其中，β-1,3-N-葡糖氨基转移酶基因和β-1,4-半乳糖转移酶基因均来源于脑膜炎双球菌，乳糖透性酶基因来源于大肠杆菌。

优选的，所述质粒为pP43NMK。

第二方面，本发明还提供了一种所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，该构建方法包括以下步骤：

(1)通过融合PCR构建包含amyE基因同源臂、乳糖透性酶基因、P43启动子、博来霉素抗性基因序列的重组片段；

(2)将β-1,3-N-葡糖氨基转移酶基因和β-1,4-半乳糖转移酶基因连接到质粒上，构建重组质粒；

(3)将步骤(1)得到的重组片段转化枯草芽孢杆菌168，通过验证获得重组枯草芽孢杆菌mA0；

(4)将步骤(2)构建的重组质粒转化步骤(3)的重组枯草芽孢杆菌mA0，得到合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌。

其中，步骤(1)中，将P43启动子、博来霉素抗性基因通过融合PCR融合，获得ZP43片段；然后将amyE基因左侧同源臂、amyE基因右侧同源臂、ZP43片段、乳糖透性酶基因通过融合PCR融合，获得重组片段。重组片段的序列如SEQ ID NO.11所示。

步骤(2)中，重组质粒的序列如SEQ ID NO.20所示。

步骤(3)中，所述转化为电转化，电转化的条件为：重组片段的添加量为100-300ng，电压2.5kV，电击试剂5ms。

步骤(4)中，所述转化为电转化，电转化的条件为：重组质粒的添加量为100-300ng，电压2.5kV，电击试剂5ms。

第二方面，本发明还提供了所述的重组枯草芽孢杆菌的应用，使用所述重组枯草芽孢杆菌用于发酵生成乳酰-N-新四糖。

本发明的有益效果为：

本发明构建了利用β-1,3-N-葡糖氨基转移酶基因和β-1,4-半乳糖转移酶基因在枯草芽孢杆菌合成乳酰-N-新四糖的新途径，利用枯草芽孢杆菌自身代谢途径中的尿苷二磷酸半乳糖，乙酰氨基葡萄糖尿苷二磷酸，作为前体物质，仅需要从外源添加乳糖并在乳糖透性酶的作用下转入细胞，合成乳酰-N-新四糖，并分泌到胞外。本发明的重组枯草芽孢杆菌合成乳酰-N-新四糖在胞外积累量达到1071mg/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产乳酰-N-新四糖奠定了基础。

附图说明

图1为本发明重组枯草芽孢杆菌合成乳酰-N-新四糖的改造途径。

图2为本发明重组组枯草芽孢杆菌合成的乳酰-N-新四糖的液质联用色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的解释说明。

实施例1重组片段的构建

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组为模板，根据NCBI上公布的amyE基因(Gene ID：938356)，设计两侧同源臂引物，序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的左侧同源臂引物：

amyE-1F:5’-TATTCCGTATGTCAAGTGGCTGCGGTTTAT-3’(SEQ ID NO:1)，

amyE-1R:5’-AATTGTTATCCGCTCTCTTGACACTCCTTATTTGATTTTTTGAAGACTTACTTCGG-3’(SEQ ID NO:2)，

序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的右侧同源臂引物：

amyE-2F:5’-CTTAAGGGCAAGGCTAGACGGGACTTA-3’(SEQ ID NO:3)，

amyE-2R:5’-GGCACACCGATGTACACGTCATC-3’(SEQ ID NO:4)，

使用上述引物从枯草芽孢杆菌基因组中扩增amyE两侧同源臂基因序列；以质粒pP43NMK为模板，分别设计序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的引物：

P43-F:5’-CATTATACGAACGGTAAATCTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGAACTTTTAAATACAG-3’(SEQ ID NO:5),

P43-R:5’-AGTTTGTGTTTTTTAAATAGTACATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCGC-3’(SEQ ID NO:6),

使用上述引物，获得P43的扩增片段。以P7Z6质粒为模板，设计序列分别为SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8的博来霉素抗性基因扩增引物：

zeo-F:5’-TCAAATAAGGAGTGTCAAGAGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3’(SEQ IDNO:7)，

zeo-R:5’-AACATACCACCTATCAGATTTACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTCAGT-3’(SEQ ID NO:8),

使用上述引物，获得博来霉素抗性基因的扩增片段。将P43的扩增片段和博来霉素抗性基因扩增片段跑胶验证正确后进行柱回收。将P43的扩增片段和博来霉素抗性基因扩增片段通过融合PCR技术进行融合。第一轮PCR条件为：等摩尔量柱回收的P43和博来霉素抗性DNA，总量大于1000ng，primer star酶量25μL，加ddH₂O定容50μL，PCR条件55℃,11个循环。第二轮PCR条件：上述PCR产物为模板，zeo-F，P43-R分别为上下游引物，按照常规PCR设置条件，获得ZP43片段。

以大肠杆菌(Escherichia coli K-12)基因组为模板，根据NCBI上公布的乳糖透性酶基因lacY(Gene ID：949083)，设计序列分别为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的引物：

lacY-F:5’-GTAAGAGAGGAATGTACACATGTACTATTTAAAAAACACAAACTTTTGGATGTTCGGTT-3’(SEQ ID NO:9)，

lacY-R:5’-TAAGTCCCGTCTAGCCTTGCCCTTAAGCGACTTCATTCACCTGACGACG-3’(SEQ IDNO:10)，

使用上述引物扩增乳糖透性酶基因片段。将amyE基因左侧同源臂、amyE基因右侧同源臂、ZP43片段、乳糖透性酶基因片段跑胶验证正确后进行柱回收。通过融合PCR技术将amyE基因左侧同源臂、amyE基因右侧同源臂、ZP43片段、乳糖透性酶基因片段进行融合。第一轮PCR条件为：等摩尔量柱回收的DNA，总量大于1000ng，primer star酶量25μL，加ddH₂O定容50μL，PCR条件55℃,11个循环。第二轮PCR条件：上述PCR产物为模板，以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的序列:

zong-F:5’-CATGTAAGCCATAAGCCATTCGTAA-3’(SEQ ID NO:11)，

zong-R:5’-AGCAAGACTCATCGCAACCC-3’(SEQ ID NO:12)分别为上下游引物，按照常规PCR设置条件，获得PZL片段。重组片段PZL的序列如SEQ ID NO:13所示。

实施例2重组质粒的构建

根据NCBI上公布的脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis MC58)中的β-1,3-N-葡糖氨基转移酶基因lgtA(Gene ID:904226)通过枯草芽孢杆菌编好密码子优化后，合成如SEQ ID NO:14所示的基因序列，ATGCCGTCTGAAGCTTTTAGACGCCATAGAGCCTATCGCGAAAATAAACTTCAACCGTTAGTCTCTGTTTTAATCTGCGCTTATAACGTGGAAAAATATTTTGCCCAATCACTGGCAGCGGTTGTGAATCAGACATGGAGAAACCTGGATATTCTTATCGTCGATGATGGCTCAACAGATGGAACACTTGCTATTGCCCAAAGATTTCAAGAACAGGATGGCAGAATTCGCATCTTAGCACAGCCGCGCAATTCTGGCCTTATTCCGTCATTAAACATCGGATTAGATGAACTGGCGAAAAGCGGCGGAGGCGGAGAATATATCGCTAGAACAGATGCCGATGATATTGCTGCCCCGGATTGGATTGAAAAAATCGTTGGCGAAATGGAAAAAGATAGATCAATCATCGCAATGGGAGCGTGGCTTGAAGTGTTAAGCGAAGAAAAAGATGGCAATAGACTGGCTCGCCATCATGAACATGGAAAAATCTGGAAAAAACCGACAAGACATGAAGATATTGCCGATTTCTTTCCGTTTGGCAATCCGATTCATAATAACACAATGATCATGAGACGCAGCGTCATTGATGGCGGACTTAGATATAACACAGAACGCGATTGGGCGGAAGATTACCAGTTTTGGTACGATGTTTCTAAACTGGGAAGACTTGCATATTATCCGGAAGCGCTGGTGAAATATCGCCTTCATGCTAATCAAGTCTCAAGCAAATATAGCATCAGACAGCATGAAATTGCACAAGGCATCCAGAAAACAGCGCGCAACGATTTTCTTCAAAGCATGGGATTTAAAACAAGATTTGATTCTCTGGAATACCGCCAGATCAAAGCAGTTGCGTATGAACTGCTTGAAAAACATCTGCCGGAAGAAGATTTTGAAAGAGCAAGACGCTTTCTTTACCAATGTTTTAAACGCACAGATACATTACCGGCTGGCGCCTGGCTGGATTTTGCAGCGGATGGAAGAATGAGACGCTTATTTACACTGCGCCAGTACTTTGGAATCCTGCATAGACTGCTGAAAAACCGCTAA(SEQ ID NO:14)

分别设计序列为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的引物：

lgtA-1F:5’-ATGCCGTCTGAAGCTTTTAGACGC-3’(SEQ ID NO:15)，

lgtA-1R:5’-TTAGCGGTTTTTCAGCAGTCTATGCAGGATT-3’(SEQ ID NO:16)，

使用上述引物，以合成的β-1,3-N-葡糖氨基转移酶基因(SEQ ID NO:14)为模板扩增lgtA基因片段。

根据NCBI上公布的脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis MC58)中的β-1,4-半乳糖转移酶基因lgtB(Gene ID:904227)通过枯草芽孢杆菌编好密码子优化后，合成如SEQID NO:17的基因序列，

ATGCAAAATCATGTCATTTCTTTAGCATCAGCAGCGGAAAGACGCGCTCATATTGCCGATACATTTGGCAGACATGGAATCCCGTTTCAATTTTTCGATGCGCTTATGCCGTCAGAACGCTTAGAACAGGCAATGGCGGAATTAGTTCCGGGCCTGTCAGCTCATCCGTATCTTAGCGGAGTGGAAAAAGCATGCTTTATGAGCCATGCGGTCTTATGGAAACAAGCTCTTGATGAAGGCCTGCCGTACATCACAGTTTTTGAAGATGATGTGCTGCTTGGCGAAGGAGCCGAAAAATTTCTGGCAGAAGATGCGTGGCTTCAGGAAAGATTTGATCCGGATACAGCATTTATCGTGCGCTTAGAAACAATGTTTATGCATGTCCTGACATCACCGAGCGGCGTTGCCGATTATTGTGGAAGAGCATTTCCGTTACTGGAATCTGAACATTGGGGCACAGCGGGATACATCATCTCAAGAAAAGCTATGAGATTTTTCCTGGATAGATTTGCTGCCCTTCCGCCGGAAGGCTTACATCCGGTTGATCTGATGATGTTTTCTGATTTCTTTGATCGCGAAGGAATGCCGGTGTGCCAACTGAATCCGGCTCTTTGTGCCCAGGAACTTCATTACGCCAAATTTCATGATCAAAACAGCGCACTGGGATCTCTTATCGAACATGATAGACTTCTGAACCGCAAACAACAGAGACGCGATAGCCCGGCGAACACATTTAAACATAGATTAATTCGCGCTCTGACAAAAATCTCTAGAGAACGCGAAAAAAGACGCCAAAGACGCGAACAGTTTATCGTTCCGTTTCAGTAA(SEQ ID NO:17)

分别设计序列为SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19的引物：

lgtB-1F:5’-GACTGCTGAAAAACCGCTAACCCGGGGTAAGAGAGGAATGTACACATGCAAAATCATGTCATTTCTTTAGCATCAGCA-3’(SEQ ID NO:18)，

lgtB-1R:5’-TTACTGAAACGGAACGATAAACTGTTCGC-3’(SEQ ID NO:19)，

使用上述引物，以合成的β-1,4-半乳糖转移酶基因(SEQ ID NO:17)为模板，扩增lgtB基因片段；以质粒pP43NMK为模板，分别设计序列为SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的引物：

pP43NMK-1-F：5’-TTATCGTTCCGTTTCAGTAATGATGAAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAG-3’(SEQ ID NO:20)，

pP43NMK-1-R：5’-CTAAAAGCTTCAGACGGCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCGCTA-3’(SEQ ID NO:21)，

使用上述引物，进行PCR扩增，获得的片段与以上两段扩增基因片段柱回收后通过GibsonAssembly Clonging Kit(New England Biolabs)，构建重组质粒。通过测序，验证重组质粒pP43NMK-lgtA-lgtB构建成功，重组质粒pP43NMK-lgtA-lgtB的基因序列如SEQ IDNO:22所示。

实施例3重组PZL片段枯草芽孢杆菌的构建

将构建好的重组片段PZL转化枯草芽孢杆菌感受态细胞(Bacillus subtilis168)，重组片段的添加量为100-300ng，电转条件：电压2.5kV,电击试剂5ms，37℃复苏5h后涂布博来霉素抗性平板，37℃培养24h。采用lacY-F和lacY-R引物(分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示)挑选转化子进行菌落PCR验证，出现1295bp条带，验证获得重组枯草芽孢杆菌mA0。

实施例4重组pP3NMK-lgtA-lgtB枯草芽孢杆菌的构建

构建成功的重组质粒pP43NMK-lgtA-lgtB转化重组枯草芽孢杆菌mA0。重组质粒的添加量为100-300ng，电转条件：电压2.5kV，电击试剂5ms，37℃复苏5h后涂布博来霉素抗性平板，37℃培养24h。采用lgtA-1F及lgtA-1R引物(分别如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示)挑选转化子进行菌落PCR，出现1050bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌mA1构建成功。

实施例5发酵生产乳酰-N-新四糖

本发明重组枯草芽孢杆菌mA1合成乳酰-N-新四糖的改造途径如图1所示。

将上述重组枯草芽孢杆菌mA1制成种子液，种子液培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L；种子液的制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中，培养10-12h。

将种子液以OD值为0.1的接种量接入到发酵培养基中，发酵培养基的配方为：葡萄糖40g/L、酵母粉12g/L、蛋白胨6g/L、(NH₄)SO₄6g/L,K₂HPO₄·3H₂O 12.5g/L、KH₂PO₄2g/L、微量元素10ml/L、尿素1.5g/L、乳糖10g/L、MgSO₄·7H₂O 12g/L；微量元素溶液的配置按g/L配比：MnSO₄·5H₂O 1.0、CoCl₂·6H₂O 0.4、NaMoO₄·2H₂O 0.2、ZnSO₄·7H₂O 0.2、AlCl₃·6H₂O0.1、CuCl₂·H₂O 0.1、H₃BO₄0.05、5MhCl，于37℃、220rpm条件下培养24h。在24h测得发酵液上清中乳酰-N-新四糖的产量为1071mg/L，合成的乳酰-N-新四糖的液质联用色谱图如图2所示。

对照实施例1

根据NCBI上公布的脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis MC58)中的β-1,3-N-葡糖氨基转移酶基因lgtA(Gene ID:904226)通过枯草芽孢杆菌编好密码子优化后，合成基因，分别设计序列为SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的引物：

lgtA-2F:5’-ATGCCGTCTGAAGCTTTTAGACGC-3’(SEQ ID NO:23)，

lgtA-2R:5’-TTAGCGGTTTTTCAGCAGTCTATGCAGGA-3’(SEQ ID NO:24)，

以合成的β-1,3-N-葡糖氨基转移酶编码为模板扩增lgtA基因片段；以质粒pP43NMK为模板，分别设计序列为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的引物：

pP43NMK-2F：5’-GACTGCTGAAAAACCGCTAATGATGAAAGCTTGGCGTAATCATGGTC-3’(SEQID NO:25)，

pP43NMK-2R：5’-CTAAAAGCTTCAGACGGCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCGCT-3’(SEQ ID NO:26)，

使用上述引物，进行PCR扩增，两个扩增的片段通过GibsonAssembly ClongingKit(New England Biolabs)，构建重组质粒，通过测序，验证重组质粒pP43NMK-lgtA构建成功。

将构建成功的质粒转化mA0菌，采用lgtA-2F及lgtA-2R引物挑选转化子进行菌落PCR，出现1050bp条带，验证转化成功。将37℃、220rpm下培养10-12h的种子液以OD值为0.1的接种量接入到发酵培养基，于37℃、220rpm条件下培养24h。最终在发酵上清液中未能检测到乳酰-N-新四糖。

对照实施例2

根据NCBI上公布的脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis MC58)中的β-1,4-半乳糖转移酶基因lgtB(Gene ID:904227)通过枯草芽孢杆菌编好密码子优化后，合成基因，分别设计序列为SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的引物：

lgtB-2F:5’-ATGCAAAATCATGTCATTTCTTTAGCATCAGCAG-3’(SEQ ID NO:27)，

lgtB-2R:5’-TTACTGAAACGGAACGATAAACTGTTCGCG-3’(SEQ ID NO:28)，

使用上述引物，以合成的β-1,4-半乳糖转移酶基因为模板扩增lgtB基因片段；以质粒pP43NMK为模板，分别设计序列为SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的引物：

pP43NMK-3F：5’-TTATCGTTCCGTTTCAGTAATGATGAAAGCTTGGCGTAATCATGGTC-3’(SEQID NO:29)，

pP43NMK-3R：5’-GAAATGACATGATTTTGCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATA-3’(SEQ IDNO:30)，

使用上述引物，进行PCR扩增，获得的片段与以上两段扩增基因片段通过GibsonAssembly Clonging Kit(New England Biolabs)，构建重组质粒，通过测序，验证重组质粒pP43NMK-lgtB构建成功。

将构建成功的质粒转化mA0菌，采用lgtB-2F及lgtB-2R引物挑选转化子进行菌落PCR，出现828bp条带，验证转化成功。

将37℃、220rpm下培养10-12h的种子液以OD值为0.1的接种量接入到发酵培养基，于37℃、220rpm条件下培养24h。最终在发酵上清液中未能检测到乳酰-N-新四糖。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 光明乳业股份有限公司

<120> 一种合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

<130> EKP180068-DD-1-SQ

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 1

tattccgtat gtcaagtggc tgcggtttat 30

<210> 2

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 2

aattgttatc cgctctcttg acactcctta tttgattttt tgaagactta cttcgg 56

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 3

cttaagggca aggctagacg ggactta 27

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 4

ggcacaccga tgtacacgtc atc 23

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 5

cattatacga acggtaaatc tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacag 59

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 6

agtttgtgtt ttttaaatag tacatgtgta cattcctctc ttacctataa tggtaccgc 59

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 7

tcaaataagg agtgtcaaga gagcggataa caatttcaca caggaaacag 50

<210> 8

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 8

aacataccac ctatcagatt taccgttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttattcagt 59

<210> 9

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 9

gtaagagagg aatgtacaca tgtactattt aaaaaacaca aacttttgga tgttcggtt 59

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 10

taagtcccgt ctagccttgc ccttaagcga cttcattcac ctgacgacg 49

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 11

catgtaagcc ataagccatt cgtaa 25

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 12

agcaagactc atcgcaaccc 20

<210> 13

<211> 3811

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 13

catgtaagcc ataagccatt cgtaaaagtg cgggaggaag gtcatgaata atctgcgtaa 60

tagactttca ggcgtgaatg ggaaaaataa gagagtaaaa gaaaaagaac aaaaaatctg 120

gtcggagatt gggatgatag cgggagcatt tgcgctgctt gatgtgatca tccgcggcat 180

tatgtttgaa tttccgttta aagaatgggc tgcaagcctt gtgtttttgt tcatcattat 240

cttatattac tgcatcaggg ctgcggcatc cggaatgctc atgccgagaa tagacaccaa 300

agaagaactg caaaaacggg tgaagcagca gcgaatagaa tcaattgcgg tcgcctttgc 360

ggtagtggtg cttacgatgt acgacagggg gattccccat acattcttcg cttggctgaa 420

aatgattctt ctttttatcg tctgcggcgg cgttctgttt ctgcttcggt atgtgattgt 480

gaagctggct tacagaagag cggtaaaaga agaaataaaa aagaaatcat cttttttgtt 540

tggaaagcga gggaagcgtt cacagtttcg ggcagctttt tttataggaa cattgatttg 600

tattcactct gccaagttgt tttgatagag tgattgtgat aattttaaat gtaagcgtta 660

acaaaattct ccagtcttca catcggtttg aaaggaggaa gcggaagaat gaagtaagag 720

ggatttttga ctccgaagta agtcttcaaa aaatcaaata aggagtgtca agagagcgga 780

taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccgg 840

ggatcctcta gagataccgt tcgtatagca tacattatac gaagttatct tgatatggct 900

ttttatatgt gttactctac atacagaaag gaggaactaa acatggccaa gttgaccagt 960

gccgttccgg tgctcaccgc gcgcgacgtc gccggagcgg tcgagttctg gaccgaccgg 1020

ctcgggttct cccgggactt cgtggaggac gacttcgccg gtgtggtccg ggacgacgtg 1080

accctgttca tcagcgcggt ccaggaccag gtggtgccgg acaacaccct ggcctgggtg 1140

tgggtgcgcg gcctggacga gctgtacgcc gagtggtcgg aggtcgtgtc cacgaacttc 1200

cgggacgcct ccgggccggc catgaccgag atcggcgagc agccgtgggg gcgggagttc 1260

gccctgcgcg acccggccgg caactgcgtg cacttcgtgg ccgaggagca ggactgaata 1320

acttcgtata gcatacatta tacgaacggt aaatctgata ggtggtatgt tttcgcttga 1380

acttttaaat acagccattg aacatacggt tgatttaata actgacaaac atcaccctct 1440

tgctaaagcg gccaaggacg ccgccgccgg ggctgtttgc gttcttgccg tgatttcgtg 1500

taccattggt ttacttattt ttttgccaag gctgtaatgg ctgaaaattc ttacatttat 1560

tttacatttt tagaaatggg cgtgaaaaaa agcgcgcgat tatgtaaaat ataaagtgat 1620

agcggtacca ttataggtaa gagaggaatg tacacatgta ctatttaaaa aacacaaact 1680

tttggatgtt cggtttattc tttttctttt acttttttat catgggagcc tacttcccgt 1740

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cgttctttat ttttatcttc gggccactgt tacaatacaa cattttagta ggatcgattg 1980

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cggcggtgtg ccggtcagtg aactcgttga gaaaaacgat gcgtacaaac aagaggagct 3720

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gacttattat ggggttgcga tgagtcttgc t 3811

<210> 14

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 14

atgccgtctg aagcttttag acgccataga gcctatcgcg aaaataaact tcaaccgtta 60

gtctctgttt taatctgcgc ttataacgtg gaaaaatatt ttgcccaatc actggcagcg 120

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tggattgaaa aaatcgttgg cgaaatggaa aaagatagat caatcatcgc aatgggagcg 420

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ggaaaaatct ggaaaaaacc gacaagacat gaagatattg ccgatttctt tccgtttggc 540

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aacgattttc ttcaaagcat gggatttaaa acaagatttg attctctgga ataccgccag 840

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atcctgcata gactgctgaa aaaccgctaa 1050

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 15

atgccgtctg aagcttttag acgc 24

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 16

ttagcggttt ttcagcagtc tatgcaggat t 31

<210> 17

<211> 828

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 17

atgcaaaatc atgtcatttc tttagcatca gcagcggaaa gacgcgctca tattgccgat 60

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ctggcagaag atgcgtggct tcaggaaaga tttgatccgg atacagcatt tatcgtgcgc 360

ttagaaacaa tgtttatgca tgtcctgaca tcaccgagcg gcgttgccga ttattgtgga 420

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gttgatctga tgatgttttc tgatttcttt gatcgcgaag gaatgccggt gtgccaactg 600

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<210> 18

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 18

gactgctgaa aaaccgctaa cccggggtaa gagaggaatg tacacatgca aaatcatgtc 60

atttctttag catcagca 78

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

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<400> 19

ttactgaaac ggaacgataa actgttcgc 29

<210> 20

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 20

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<210> 21

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<212> DNA

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<400> 21

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<210> 22

<211> 8608

<212> DNA

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<400> 22

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cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

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cacaattcca agaaaaacac gatttagaac ctaaaaagaa cgaatttgaa ctaactcata 540

accgagaggt aaaaaaagaa cgaagtcgag atcagggaat gagtttataa aataaaaaaa 600

gcacctgaaa aggtgtcttt ttttgatggt tttgaacttg ttctttctta tcttgataca 660

tatagaaata acgtcatttt tattttagtt gctgaaaggt gcgttgaagt gttggtatgt 720

atgtgtttta aagtattgaa aacccttaaa attggttgca cagaaaaacc ccatctgtta 780

aagttataag tgactaaaca aataactaaa tagatggggg tttcttttaa tattatgtgt 840

cctaatagta gcatttattc agatgaaaaa tcaagggttt tagtggacaa gacaaaaagt 900

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aaacaaaatc gtgaaacagg cgaaagaaag ttgtatcgag tgtggttttg taaatccagg 1080

ctttgtccaa tgtgcaactg gaggagagca atgaaacatg gcattcagtc acaaaaggtt 1140

gttgctgaag ttattaaaca aaagccaaca gttcgttggt tgtttctcac attaacagtt 1200

aaaaatgttt atgatggcga agaattaaat aagagtttgt cagatatggc tcaaggattt 1260

cgccgaatga tgcaatataa aaaaattaat aaaaatcttg ttggttttat gcgtgcaacg 1320

gaagtgacaa taaataataa agataattct tataatcagc acatgcatgt attggtatgt 1380

gtggaaccaa cttattttaa gaatacagaa aactacgtga atcaaaaaca atggattcaa 1440

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ccgaaaaata aatataaatc ggatatacaa tcggcaattg acgaaactgc aaaatatcct 1560

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cataaaaaat taaaccttga tgacacagaa gaaggcgatt tgattcatac agatgatgac 1740

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tgttattaaa aggattgaag gatgcttagg aagacgagtt attaatagct gaataagaac 1920

ggtgctctcc aaatattctt atttagaaaa gcaaatctaa aattatctga aaagggaatg 1980

agaatagtga atggaccaat aataatgact agagaagaaa gaatgaagat tgttcatgaa 2040

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tctcttggtc gtcagactga tgggccctat tcggatattg agatgatgtg tgtcatgtca 2160

acagaggaag cagagttcag ccatgaatgg acaaccggtg agtggaaggt ggaagtgaat 2220

tttgatagcg aagagattct actagattat gcatctcagg tggaatcaga ttggccgctt 2280

acacatggtc aatttttctc tattttgccg atttatgatt caggtggata cttagagaaa 2340

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tcagatcttc cttcaggtta tgaccatctg tgccagttcg taatgtctgg tcaactttcc 2640

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agaaaatgaa aggggatttt atgcgtgaga atgttacagt ctatcccggc attgccagtc 3000

ggggatatta aaaagagtat aggtttttat tgggataaag taggtttcac tttggttcac 3060

catgaagatg gattcgcagt tctaatgtgt aatgaggttc ggattcatct atgggaggca 3120

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cgaaagacaa taaaaatttt attcttgctg agtctggctt tcggtaagct agacaaaacg 3540

gacaaaataa aaattggcaa gggtttaaag gtggagattt tttgagtgat cttctcaaaa 3600

aatactacct gtcccttgct gatttttaaa cgagcacgag agcaaaaccc ccctttgctg 3660

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gacgccgccg ccggggctgt ttgcgttctt gccgtgattt cgtgtaccat tggtttactt 4320

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ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 7320

agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 7380

gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 7440

attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga 7500

agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta 7560

atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc 7620

cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg 7680

ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga 7740

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gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc 7920

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cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa 8280

cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga 8340

gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga 8400

atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg 8460

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<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 23

atgccgtctg aagcttttag acgc 24

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 24

ttagcggttt ttcagcagtc tatgcagga 29

<210> 25

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 25

gactgctgaa aaaccgctaa tgatgaaagc ttggcgtaat catggtc 47

<210> 26

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 26

ctaaaagctt cagacggcat gtgtacattc ctctcttacc tataatggta ccgct 55

<210> 27

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 27

atgcaaaatc atgtcatttc tttagcatca gcag 34

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 28

ttactgaaac ggaacgataa actgttcgcg 30

<210> 29

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 29

ttatcgttcc gtttcagtaa tgatgaaagc ttggcgtaat catggtc 47

<210> 30

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 30

gaaatgacat gattttgcat gtgtacattc ctctcttacc tata 44

Claims

1.一种合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌在枯草芽孢杆菌168基因组上重组整合有乳糖透性酶基因，及在枯草芽孢杆菌168中转化有包含β-1,3-N-葡糖氨基转移酶基因和β-1,4-半乳糖转移酶基因的质粒。

2.根据权利要求1所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，β-1,3-N-葡糖氨基转移酶基因和β-1,4-半乳糖转移酶基因均来源于脑膜炎双球菌，乳糖透性酶基因来源于大肠杆菌。

3.根据权利要求1或2所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述质粒为pP43NMK。

4.权利要求1所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，该构建方法包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，将P43启动子、博来霉素抗性基因通过融合PCR融合，获得ZP43片段；然后将amyE基因左侧同源臂、amyE基因右侧同源臂、ZP43片段、乳糖透性酶基因通过融合PCR融合，获得重组片段。

6.根据权利要求4所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，重组片段的序列如SEQ ID NO.11所示。

7.根据权利要求4所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，重组质粒的序列如SEQ ID NO.20所示。

8.根据权利要求4所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述转化为电转化，电转化的条件为：重组片段的添加量为100-300ng，电压2.5kV，电击试剂5ms。

9.根据权利要求4所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，所述转化为电转化，电转化的条件为：重组质粒的添加量为100-300ng，电压2.5kV，电击试剂5ms。

10.权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌用于发酵生成乳酰-N-新四糖。