CN113652385B - 一种高产乳酰-n-四糖的微生物的构建方法及应用 - Google Patents

一种高产乳酰-n-四糖的微生物的构建方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113652385B
CN113652385B CN202110900124.5A CN202110900124A CN113652385B CN 113652385 B CN113652385 B CN 113652385B CN 202110900124 A CN202110900124 A CN 202110900124A CN 113652385 B CN113652385 B CN 113652385B
Authority
CN
China
Prior art keywords
lactoyl
gene
tetraose
udp
glucosamine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110900124.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113652385A (zh
Inventor
沐万孟
张文立
朱莺莺
李泽宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN202110900124.5A priority Critical patent/CN113652385B/zh
Publication of CN113652385A publication Critical patent/CN113652385A/zh
Priority to PCT/CN2022/110181 priority patent/WO2023011576A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113652385B publication Critical patent/CN113652385B/zh
Priority to US18/485,501 priority patent/US12049655B2/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01003—Glucosamine N-acetyltransferase (2.3.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01102—Beta-1,3-galactosyl-O-glycosyl-glycoprotein beta-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase (2.4.1.102)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
    • C12Y206/01016—Glutamine-fructose-6-phosphate transaminase (isomerizing) (2.6.1.16), i.e. glucosamine-6-phosphate-synthase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07023—UDP-N-acetylglucosamine diphosphorylase (2.7.7.23)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/99—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in other compounds (3.5.99)
    • C12Y305/99006—Glucosamine-6-phosphate deaminase (3.5.99.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
    • C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)
    • C12Y501/03014—UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase (non-hydrolysing) (5.1.3.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高产乳酰‑N‑四糖的微生物的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。本发明以前期构建完成的高效生产前体物质乳酰‑N‑三糖II的菌株为出发菌株，过表达合成乳酰‑N‑四糖的关键基因，使其拥有生产乳酰‑N‑四糖的合成能力。本发明通过筛选高效的β‑1,3‑半乳糖基转移酶基因，并合理设计在载体pCDFDuet‑1上共表达β‑1,3‑半乳糖基转移酶基因和强化UDP‑半乳糖途径关键基因UDP‑葡萄糖4差向异构酶基因(galE)，从而提高乳酰‑N‑四糖的合成，在摇瓶实验中，大肠杆菌生产乳酰‑N‑四糖的能力为3.04g/L，在3L发酵罐中，乳酰‑N‑四糖的产量达到25.49g/L，具备工业应用的前景。

Description

一种高产乳酰-N-四糖的微生物的构建方法及应用
技术领域
本发明涉及一种高产乳酰-N-四糖的微生物的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。
背景技术
母乳寡糖(HMOs)被研究证实具有调节婴幼儿肠道微生物群平衡，促进新生儿大脑早期发育，提高免疫力等独特的生理功能。而HMOs的主要成分之一乳酰-N-四糖是HMOs重要的二十种核心结构之一，以其为核心单元，可经过岩藻糖基化和唾液酸化制备多种母乳寡糖。因此，LNT的高效制备对多种HMOs的大量合成具有重要作用。但是目前乳酰-N-四糖和乳酰-N-新四糖的生产成本较高且生产方法有一定局限性。尤其是乳酰-N-四糖的生产，目前研究的较少，不管是对于乳酰-N-四糖的功能研究还是产物合成研究。
目前乳酰-N-四糖可以通过化学合成和生物合成获得。化学法合成通常需要引入保护基团，步骤繁冗，且存在保护不到位，后续脱除不彻底及发生其他副反应的问题，而且常需要使用有毒有害试剂。相比之下，生物法合成由于酶与底物的特异性高，底物廉价，合成步骤简化，副产物少，产率大大提高，更适合大规模的工业化生产。目前用的酶法生产乳酰-N-四糖需要的关键的编码β-1,3-半乳糖基转移酶基因来源于紫色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)，利用一锅酶法策略，使得乳酰-N-四糖产量达到130mg。另一个已报道的编码β-1,3-半乳糖基转移酶基因来源于大肠杆菌O55:7，并已经用于微生物发酵高产乳酰-N-四糖。Albermann团队通过染色体整合了来源脑膜炎双球菌(Neisseriameningitidis)的编码β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶的lgtA基因和来源的编码β-1,3-半乳糖基转移酶的wbgO基因，高效产生乳酰-N-四糖，在发酵罐中的最高滴度为12.72g/L(Conrad J,Sprenger GA,et al.Synthesis of the human milkoligosaccharide lacto-N-tetraose in metabolically engineered,plasmid-freeE.coli.ChemBioChem.2014；15(13):1896-1900.和/>Sprenger GA,AlbermannC.Galactose-limited fed-batch cultivation of Escherichia coli for theproduction of lacto-N-tetraose.Enzyme Microb Tech.2015；75-76:37-43.)。相比于酶法合成，以微生物发酵法合成乳酰-N-四糖更加高效和安全。但目前使用的微生物方法合成的乳酰-N-四糖产量均较低，目前已报道的β-1,3-半乳糖基转移酶可能是一个限制因素，都不能达到工业化大规模生产的要求，因此，为了解决目前微生物生产的瓶颈，打造更高效的生产菌株是非常必要的。
发明内容
为了解决目前存在的问题，本发明从诸多糖基转移酶中筛选到了一种来源于P.ferrooxidans的糖基转移酶，该酶可以乳酰-N-三糖II和UDP-半乳糖为底物，生产乳酰-N-四糖，因而将其命名为β-1,3-半乳糖基转移酶，将此酶应用于乳酰-N-四糖的生产，产量较现有报道的其他的β-1,3-半乳糖基转移酶有显著提升。
本发明提供了一种重组大肠杆菌，所述大肠杆菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的β-1,3-半乳糖基转移酶，过表达葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶和β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶，并敲除编码UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的基因、编码葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶的基因和编码β-半乳糖苷酶的基因。
在一种实施方式中，编码所述β-1,3-半乳糖基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
在一种实施方式中，所述UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶WecB的NCBI序列号为YP_026253.1，葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶NagB的NCBI序列号为NP_415204.1，β-半乳糖苷酶LacZ的NCBI序列号为NP_414878.1。
在一种实施方式中，编码葡萄糖胺合成酶的基因为glmM，编码UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶的基因为glmU，编码葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的基因为glmS，glmM，glmU和glmS核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示。
在一种实施方式中，编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因为lgtA，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌中含有表达载体pCDFDuet-1，所述表达载体含有编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因。
在一种实施方式中，含有表达载体pRSFDuet-1和pETDuet-1；所述表达载体pRSFDuet-1上含有编码葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶；所述表达载体pETDuet-1上含有β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因；所述pRSFDuet-1上的核糖体结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述pETDuet-1的核糖体结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明提供了一种生产乳酰-N-四糖的方法，利用所述的重组大肠杆菌为发酵菌株。
在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌培养12～14h得到种子液，将种子液按反应体系体积的2～5％加入含有甘油的反应体系中，35～40℃震荡培养至OD600为0.6-0.8，向反应体系中加入终浓度为0.1～0.2mM的IPTG，在22～25℃诱导培养不低于90h。
在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌培养12～14h得到种子液，将种子液按反应体系体积的2～5％加入反应体系中，35～40℃震荡培养至OD600为14±3，向反应体系中加入终浓度为0.1～0.2mM的IPTG，和终浓度为5～10g/L的乳糖，在22～25℃诱导培养不低于40h。
在一种实施方式中，反应过程中维持乳糖浓度不低于6g/L，甘油浓度不低于10g/L。
在一种实施方式中，当反应体系中甘油浓度低于6g/L时，一次性添加终浓度为6g/L的甘油；当反应体系中乳糖浓度低于5g/L，一次性添加终浓度为5g/L的乳糖。
本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的β-1,3-半乳糖基转移酶在生产乳酰-N-四糖中的应用。
在一种实施方式中，以乳酰-N-三糖II和UDP-半乳糖为底物，利用所述β-1,3-半乳糖基转移酶，生产乳酰-N-四糖。
本发明提供了所述重组大肠杆菌在食品、生物、化工领域中的应用。
本发明提供了所述重组大肠杆菌在制备乳酰-N-四糖及其衍生产品中的应用。
本发明的有益效果：
本发明通过筛选高效的新型的β-1,3-半乳糖基转移酶，并应用于发酵生产乳酰-N-四糖。在本团队前期构建的高效生产乳酰-N-三糖II的宿主基础上，过表达新型的Pf-β-1,3-GalT基因，并强化前体UDP-半乳糖的供应，引入UDP-葡萄糖4差向异构酶基因galE。高效生产乳酰-N-四糖。在摇瓶实验中，大肠杆菌生产乳酰-N-四糖的能力为3.04g/L，在3L发酵罐中，乳酰-N-四糖的产量达到25.49g/L，具备工业应用的前景。
附图说明
图1为乳酰-N-四糖代谢通路图。
图2为不同来源的β-1,3-半乳糖基转移酶生物合成乳酰-N-四糖；A为来源于E.coliO55:H7的β-1,3-半乳糖基转移酶(WbgO)；B为筛选的来源于P.ferrooxidans的β-1,3-半乳糖基转移酶(Pf-β-1,3-GalT)；C为来源于C.violaceum的β-1,3-半乳糖基转移酶(Cvβ3GalT)。
图3为产物乳酰-N-四糖标样和产物样品液相图和质谱图。
图4为3L发酵罐中乳酰-N-四糖的发酵产量结果图。
具体实施方式
1、以下实例中所使用的质粒，内切酶，PCR酶，柱式DNA抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒等采用商用产品，具体操作按照试剂盒说明书进行。
2、菌落PCR，核酸琼脂糖凝胶电泳，蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳，热击转化，电转化和感受态细胞的制备和细菌基因组的提取保存等常规操作方法根据Molecular Cloning：ALaboratory Manual(Fourth Edition)进行。
3、质粒和DNA产物的测序工作交予上海生工生物工程公司完成。
4、大肠杆菌感受态的制备：TAKARA试剂盒。
5、乳酰-N-四糖发酵所用培养基及检测方法：
(1)LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。
(2)LB固体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L氯化钠，15g/L琼脂粉。
(3)发酵培养基：20g/L葡萄糖，13.5g/L磷酸二氢钾，4.0g/L磷酸氢二氨，1.7g/L柠檬酸，1.4g/L七水硫酸镁和10ml/L微量金属元素；微量金属元素包括：10g/L硫酸亚铁，2.25g/L七水硫酸锌，1.0g/L无水硫酸铜，0.35g/L一水硫酸锰，0.23g/L十水硼酸钠，0.11g/L钼酸铵，2.0g/L二水氯化钙。
(4)HPLC检测条件：高效离子交换色谱；色谱柱：CarboPac PA10(4mm×250mm)；检测器：脉冲安培检测器；流动相：A，超纯水；B，1M醋酸钠；C，250mM氢氧化钠；流速：1.0mL/min；进样量：20μL。
实施例1：重组载体的构建
重组表达载体构建具体步骤如下(所涉及到的引物序列见表1)：
(1)glmM，glmU-glmS，和lgtA基因(glmM，glmU、glmS、lgtA的核苷酸序列分别如SEQID NO.1～4所示)片段的获得以及质粒pRSF-(29)glmM-(29)glmU-glmS和pET-(T7)lgtA的构建，记载于公开号为CN111979168A的专利中。
(2)wbgO和galE基因片段的获得以及质粒pCD-wbgO-galE的构建：
wbgO由苏州金唯智通过密码子优化后合成，wbgO基因片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，以该合成的基因为模板，以WbgO-F/R为引物，PCR扩增出wbgO基因片段，胶回收DNA片段；以大肠杆菌K-12(Escherichia coli)的基因组为模板，以WbgO-GalE-F/R为引物，PCR扩增出galE基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)，胶回收DNA片段；以WbgO-GalE-V1-F/R和WbgO-GalE-V2-F/R两对引物分别扩增出pCDFDuet-1的两个载体片段，并胶回收DNA片段。将上述获得的四个片段通过Gibson试剂盒(美国NEB试剂公司)连接，获得质粒pCD-wbgO-galE。
(3)Cvβ3GalT和galE基因片段的获得以及质粒pCD-cv-galE的构建：
Cvβ3GalT由州金唯智通过密码子优化后合成(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)，以该合成的基因为模板，以Cv-F/R为引物，PCR扩增出Cvβ3GalT基因片段，胶回收DNA片段；以大肠杆菌K-12(Escherichia coli)的基因组为模板，以Cv-GalE-F/R为引物，PCR扩增出galE基因片段，胶回收DNA片段；利用Cv-GalE-V1-F/R和Cv-GalE-V2-F/R两对引物，以pCDFDuet-1为模板，分别扩增出两个载体片段，并胶回收DNA片段。将上述得到的四个片段通过Gibson试剂盒(美国NEB试剂公司)连接，获得质粒pCD-cv-galE。
(4)Pf-β-1,3-GalT和galE基因片段的获得以及质粒pCD-pf-galE的构建：
Pf-β-1,3-GalT由苏州金唯智通过密码子优化后合成(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)，以该合成的基因为模板，以Pf-F/R为引物，PCR扩增出Pf-β-1,3-GalT基因片段，胶回收DNA片段；以大肠杆菌K-12(Escherichia coli)的基因组为模板，利用Pf-GalE-F/R为引物，PCR扩增出galE基因片段，胶回收DNA片段；以pCDFDuet-1载体为模板，利用Pf-GalE-V1-F/R和Pf-GalE-V2-F/R两对引物分别扩增出两个载体片段，并胶回收DNA片段。将上述得到的四个片段通过Gibson试剂盒(美国NEB试剂公司)连接，获得质粒pCD-pf-galE。
表1质粒构建引物
实施例2：重组菌株的构建
敲除大肠杆菌BL21中编码UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶WecB(NCBI序列号为YP_026253.1)的基因wecB、编码葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶NagB(NCBI序列号为NP_415204.1)的基因nagB以及编码β-半乳糖苷酶LacZ(NCBI序列号为NP_414878.1)的基因lacZ，并向此大肠杆菌中转入实施例1构建得到的重组质粒pRSF-(29)glmM-(29)glmU-glmS和pET-(T7)lgtA，基因的敲除和重组质粒的转入方法参见公开号为CN111979168A的专利，构建得到产乳酰-N-三糖II的重组大肠杆菌E10-WNL。
(1)将实施例1中构建得到的重组质粒pCD-wbgO-galE，转入大肠杆菌E10-WNL中，构建得到重组菌株EL01。
(2)将实施例1中构建得到的重组质粒pCD-pf-galE，转入大肠杆菌E10-WNL中，构建得到重组菌株EL02。
(3)将实施例1中构建得到的重组质粒pCD-cv-galE，转入大肠杆菌E10-WNL中，构建得到重组菌株EL03。
实施例3：重组菌株发酵生产乳酰-N-四糖
乳酰-N-四糖发酵过程：将实施例2中构建的3个重组菌株分别接种于LB液体培养基，37℃，200rpm，过夜培养12h，得到种子液，将种子液以2mL/100mL的接种量接入25mL发酵培养基(含20g/L甘油)，37℃，200rpm，培养至OD600为0.6，加入终浓度为0.2mM IPTG，同时加入终浓度为5g/L的乳糖，25℃，200rpm继续诱导培养96h。取1mL发酵液，10000rpm，离心10min，取上清，用于HPLC测定。
表达已报道的来源于E.coliO55:H7的β-1,3-半乳糖基转移酶的重组菌株的发酵结果如图2A所示，菌株发酵96h后生产的乳酰-N-四糖产量达到2.81g/L，伴随着残余的乳酰-N-三糖II产量为0.39g/L。
表达已报道的来源于C.violaceum的β-1,3-半乳糖基转移酶的重组菌株的发酵结果如图2C所示，菌株发酵96h后生产的乳酰-N-四糖产量达到0.77g/L，伴随着残余的乳酰-N-三糖II产量为0.77g/L。
表达新筛选得到的来源于P.ferrooxidans的β-1,3-半乳糖基转移酶的重组菌株的发酵结果如图2B所示，菌株发酵96h后生产的乳酰-N-四糖产量达到3.04g/L，伴随着残余的乳酰-N-三糖II产量为0.37g/L。
实施例4：高效生产工程菌发酵罐生产乳酰-N-四糖
为了进一步验证乳酰-N-四糖合成方法的有效性，提高乳酰-N-四糖的产量。将重组大肠杆菌EL02种子液以10％的接种量接种到工作体积为1L的发酵培养基中，发酵罐发酵温度37℃，搅拌转速800r/min，通气量1vvm，pH 7.0(补加氨水自动控制)。发酵11.5h(OD600约为14)，加入终浓度为10g/L乳糖和终浓度为0.2mM的IPTG，在25℃培养。期间手动补料甘油和乳糖，维持菌体的生长以及乳酰-N-四糖的合成：当反应体系中乳糖当乳糖低于6g/L时，补30mL乳糖母液(母液浓度200g/L)；当甘油低于10g/L时，补30mL甘油母液(母液浓度600g/L)。培养整个过程达到42h后，菌体OD600达到96.3，乳酰-N-四糖的产量达到最高，达到25.49g/L(图4)。
表2发酵过程中菌和乳酰-N-四糖合成量动态变化表
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> BAA211067A
<130> 一种高产乳酰-N-四糖的微生物的构建方法及应用
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgagtaatc gtaaatattt cggtaccgat gggattcgtg gtcgtgtagg ggatgcgccg 60
atcacacctg attttgtgct taagctgggt tgggccgcgg gtaaagtgct ggcgcgccac 120
ggctcccgta agattattat tggtaaagac acgcgtattt ctggctatat gctggagtca 180
gcactggaag cgggtctggc ggcagcgggc ctttccgcac tcttcactgg cccgatgcca 240
acaccggccg tggcttatct gacgcgtacc ttccgcgcag aggccggaat tgtgatatct 300
gcatcgcata acccgttcta cgataatggc attaaattct tctctatcga cggcaccaaa 360
ctgccggatg cggtagaaga ggccatcgaa gcggaaatgg aaaaggagat cagctgcgtt 420
gattcggcag aactgggtaa agccagccgt atcgttgatg ccgcgggtcg ctatatcgag 480
ttttgcaaag ccacgttccc gaacgaactt agcctcagtg aactgaagat tgtggtggat 540
tgtgcaaacg gtgcgactta tcacatcgcg ccgaacgtgc tgcgcgaact gggggcgaac 600
gttatcgcta tcggttgtga gccaaacggt gtaaacatca atgccgaagt gggggctacc 660
gacgttcgcg cgctccaggc tcgtgtgctg gctgaaaaag cggatctcgg tattgccttc 720
gacggcgatg gcgatcgcgt gattatggtt gaccatgaag gcaataaagt cgatggcgat 780
cagatcatgt atatcatcgc gcgtgaaggt cttcgtcagg gccagctgcg tggtggcgct 840
gtgggtacat tgatgagcaa catggggctt gaactggcgc tgaaacagtt aggaattcca 900
tttgcgcgcg cgaaagtggg tgaccgctac gtactggaaa aaatgcagga gaaaggctgg 960
cgtatcggtg cagagaattc cggtcatgtg atcctgctgg ataaaactac taccggtgac 1020
ggcatcgttg ctggcttgca ggtgctggcg gcgatggcac gtaaccatat gagcctgcac 1080
gacctttgca gcggcatgaa aatgttcccg cagattctgg ttaacgtacg ttacaccgca 1140
ggtagcggcg atccacttga gcatgagtca gttaaagccg tgaccgcaga ggttgaagct 1200
gcgctgggca accgtggacg cgtgttgctg cgtaaatccg gcaccgaacc gttaattcgc 1260
gtgatggtgg aaggcgaaga cgaagcgcag gtgactgaat ttgcacaccg catcgccgat 1320
gcagtaaaag ccgtttaa 1338
<210> 2
<211> 1371
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgttgaata atgctatgag cgtagtgatc cttgccgcag gcaaaggcac gcgcatgtat 60
tccgatcttc cgaaagtgct gcataccctt gccgggaaag cgatggttca gcatgtcatt 120
gatgctgcga atgaattagg cgcagcgcac gttcacctgg tgtacggtca cggcggcgat 180
ctgctaaaac aggcgctgaa agacgacaac cttaactggg tgcttcaggc agagcagctg 240
ggtacgggtc atgcaatgca gcaggccgca cctttctttg ccgatgatga agacatttta 300
atgctctacg gcgacgtgcc gctgatctct gtcgaaacac tccagcgtct gcgtgatgct 360
aaaccgcagg gtggcattgg tctgctgacg gtgaaactgg atgatccgac cggttatgga 420
cgtatcaccc gtgaaaacgg caaagttacc ggcattgttg agcacaaaga tgccaccgac 480
gagcagcgtc agattcagga gatcaacacc ggcattctga ttgccaacgg cgcagatatg 540
aaacgctggc tggcgaagct gaccaacaat aatgctcagg gcgaatacta catcaccgac 600
attattgcgc tggcgtatca ggaagggcgt gaaatcgtcg ccgttcatcc gcaacgttta 660
agcgaagtag aaggcgtgaa taaccgcctg caactctccc gtctggagcg tgtttatcag 720
tccgaacagg ctgaaaaact gctgttagca ggcgttatgc tgcgcgatcc agcgcgtttt 780
gatctgcgtg gtacgctaac tcacgggcgc gatgttgaaa ttgatactaa cgttatcatc 840
gagggcaacg tgactctcgg tcatcgcgtg aaaattggca ccggttgcgt gattaaaaac 900
agcgtgattg gcgatgattg cgaaatcagt ccgtataccg ttgtggaaga tgcgaatctg 960
gcagcggcct gtaccattgg cccgtttgcc cgtttgcgtc ctggtgctga gttgctggaa 1020
ggtgctcacg tcggtaactt cgttgagatg aaaaaagcgc gtctgggtaa aggctcgaaa 1080
gctggtcatc tgacttacct gggcgatgcg gaaattggcg ataacgttaa catcggcgcg 1140
ggaaccatta cctgcaacta cgatggtgcg aataaattta agaccattat cggcgacgat 1200
gtgtttgttg gttccgacac tcagctggtg gccccggtaa cagtaggcaa aggcgcgacc 1260
attgctgcgg gtacaactgt gacgcgtaat gtcggcgaaa atgcattagc tatcagccgt 1320
gtgccgcaga ctcagaaaga aggctggcgt cgtccggtaa agaaaaagtg a 1371
<210> 3
<211> 1830
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgtgtggaa ttgttggcgc gatcgcgcaa cgtgatgtag cagaaatcct tcttgaaggt 60
ttacgtcgtc tggaataccg cggatatgac tctgccggtc tggccgttgt tgatgcagaa 120
ggtcatatga cccgcctgcg tcgcctcggt aaagtccaga tgctggcaca ggcagcggaa 180
gaacatcctc tgcatggcgg cactggtatt gctcacactc gctgggcgac ccacggtgaa 240
ccttcagaag tgaatgcgca tccgcatgtt tctgaacaca ttgtggtggt gcataacggc 300
atcatcgaaa accatgaacc gctgcgtgaa gagctaaaag cgcgtggcta taccttcgtt 360
tctgaaaccg acaccgaagt gattgcccat ctggtgaact gggagctgaa acaaggcggg 420
actctgcgtg aggccgttct gcgtgctatc ccgcagctgc gtggtgcgta cggtacagtg 480
atcatggact cccgtcaccc ggataccctg ctggcggcac gttctggtag tccgctggtg 540
attggcctgg ggatgggcga aaactttatc gcttctgacc agctggcgct gttgccggtg 600
acccgtcgct ttatcttcct tgaagagggc gatattgcgg aaatcactcg ccgttcggta 660
aacatcttcg ataaaactgg cgcggaagta aaacgtcagg atatcgaatc caatctgcaa 720
tatgacgcgg gcgataaagg catttaccgt cactacatgc agaaagagat ctacgaacag 780
ccgaacgcga tcaaaaacac ccttaccgga cgcatcagcc acggtcaggt tgatttaagc 840
gagctgggac cgaacgccga cgaactgctg tcgaaggttg agcatattca gatcctcgcc 900
tgtggtactt cttataactc cggtatggtt tcccgctact ggtttgaatc gctagcaggt 960
attccgtgcg acgtcgaaat cgcctctgaa ttccgctatc gcaaatctgc cgtgcgtcgt 1020
aacagcctga tgatcacctt gtcacagtct ggcgaaaccg cggataccct ggctggcctg 1080
cgtctgtcga aagagctggg ttaccttggt tcactggcaa tctgtaacgt tccgggttct 1140
tctctggtgc gcgaatccga tctggcgcta atgaccaacg cgggtacaga aatcggcgtg 1200
gcatccacta aagcattcac cactcagtta actgtgctgt tgatgctggt ggcgaagctg 1260
tctcgcctga aaggtctgga tgcctccatt gaacatgaca tcgtgcatgg tctgcaggcg 1320
ctgccgagcc gtattgagca gatgctgtct caggacaaac gcattgaagc gctggcagaa 1380
gatttctctg acaaacatca cgcgctgttc ctgggccgtg gcgatcagta cccaatcgcg 1440
ctggaaggcg cattgaagtt gaaagagatc tcttacattc acgctgaagc ctacgctgct 1500
ggcgaactga aacacggtcc gctggcgcta attgatgccg atatgccggt tattgttgtt 1560
gcaccgaaca acgaattgct ggaaaaactg aaatccaaca ttgaagaagt tcgcgcgcgt 1620
ggcggtcagt tgtatgtctt cgccgatcag gatgcgggtt ttgtaagtag cgataacatg 1680
cacatcatcg agatgccgca tgtggaagag gtgattgcac cgatcttcta caccgttccg 1740
ctgcagctgc tggcttacca tgtcgcgctg atcaaaggca ccgacgttga ccagccgcgt 1800
aacctggcaa aatcggttac ggttgagtaa 1830
<210> 4
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgggccagc cgctggttag cgttctgatc tgcgcgtaca acgttgaaaa atatttcgcg 60
cagagcctgg cagctgttgt taaccagacc tggcgtaacc tggacattct gatcgttgat 120
gatggctcta ccgatggcac cctggcgatc gcgcagcgtt tccaggaaca ggacggtcgt 180
atccgtattc tggcgcagcc gcgtaactct ggtctgattc caagcctgaa catcggcctg 240
gatgaactgg cgaaaagcgg cggtggtggt gaatacatcg cgcgtaccga tgcggatgat 300
atcgcagctc cggattggat tgaaaaaatc gttggtgaaa tggaaaaaga tcgtagcatc 360
atcgcaatgg gcgcttggct ggaagtgctg tccgaagaaa aagatggcaa ccgtctggca 420
cgtcaccacg aacacggtaa aatctggaaa aaaccgaccc gtcacgaaga catcgcggat 480
ttcttcccat tcggcaaccc gattcacaac aacaccatga tcatgcgtcg ttccgtgatc 540
gatggcggcc tgcgttacaa caccgaacgt gattgggcag aagactatca gttctggtat 600
gatgtttcta aactgggtcg tctggcgtac tacccggaag cgctggttaa ataccgtctg 660
cacgctaacc aggttagctc caaatatagc atccgccagc acgaaatcgc tcagggtatc 720
cagaaaaccg cacgtaacga tttcctgcag tctatgggtt tcaaaacccg tttcgatagc 780
ctggaatacc gtcagattaa agcggttgcg tatgaactgc tggaaaaaca cctgccggaa 840
gaagattttg aactggcgcg tcgtttcctg taccagtgct tcaaacgtac cgataccctg 900
ccggcgggcg cttggctgga tttcgcggcg gatggccgta tgcgtcgtct gttcaccctg 960
cgtcagtact tcggtatcct gcaccgtctg ctgaaaaacc gttaa 1005
<210> 5
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atggataaaa tcaaacaggg tagcgctagc ctggttgttg gtgatcagca ggaaaaacac 60
ccggttgtta gcgttctgct gccggttaac cgtgttgatc gtttcttcat cccggcggtt 120
gaatctatcc tgacccagac cctgcaggat ttcgaactga tcattatcgc taacggttgc 180
agcaccgaac acctgaacaa aatccgtctg acctacggtg atcacaaccg cgttcgtatc 240
ctgaacaccg aaatcaaagg cctgccgttc gcgctgaacc tgggtgttca caacgcgcgt 300
ggcctgtaca tcgcgcgtat ggatgcggat gatatctcta tcccggaacg tctggaaaaa 360
cagctgaaca ccctggaaca gaacaagaaa atcggcgttg tttctagcgg tgttgatttc 420
atcgatgaaa acgatcaggc gatccgtgaa ggcaaattcc cggaactgac cgataaagat 480
caccgtcgtc tgctgccgct gatctgctgc atcgcgcacc cgaccgttat ggttcgtaaa 540
gaaatcatca acaaactggg tggttacagc ttcggcagct tcagcgaaga ttacgatctg 600
tggctgcgta tcatgcgtga actgccggaa gttgaattct accgtatccc ggaatccctg 660
ctgaaatacc gtcgtcacgg taaccaggct accagcagca aaaacatcaa aaagatccgt 720
gcgtacaact ctgcgctgaa aatccgtgaa ctgttcctga gccgtaaact gaaattcatc 780
atcggtatca tcctgccggc gcgtatggtg accctgtggc gtaaataa 828
<210> 6
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgagagttc tggttaccgg tggtagcggt tacattggaa gtcatacctg tgtgcaatta 60
ctgcaaaacg gtcatgatgt catcattctt gataacctct gtaacagtaa gcgcagcgta 120
ctgcctgtta tcgagcgttt aggcggcaaa catccaacgt ttgttgaagg cgatattcgt 180
aacgaagcgt tgatgaccga gatcctgcac gatcacgcta tcgacaccgt gatccacttc 240
gccgggctga aagccgtggg cgaatcggta caaaaaccgc tggaatatta cgacaacaat 300
gtcaacggca ctctgcgcct gattagcgcc atgcgcgccg ctaacgtcaa aaactttatt 360
tttagctcct ccgccaccgt ttatggcgat cagcccaaaa ttccatacgt tgaaagcttc 420
ccgaccggca caccgcaaag cccttacggc aaaagcaagc tgatggtgga acagatcctc 480
accgatctgc aaaaagccca gccggactgg agcattgccc tgctgcgcta cttcaacccg 540
gttggcgcgc atccgtcggg cgatatgggc gaagatccgc aaggcattcc gaataacctg 600
atgccataca tcgcccaggt tgctgtaggc cgtcgcgact cgctggcgat ttttggtaac 660
gattatccga ccgaagatgg tactggcgta cgcgattaca tccacgtaat ggatctggcg 720
gacggtcacg tcgtggcgat ggaaaaactg gcgaacaagc caggcgtaca catctacaac 780
ctcggcgctg gcgtaggcaa cagcgtgctg gacgtggtta atgccttcag caaagcctgc 840
ggcaaaccgg ttaattatca ttttgcaccg cgtcgcgagg gcgaccttcc ggcctactgg 900
gcggacgcca gcaaagccga ccgtgaactg aactggcgcg taacgcgcac actcgatgaa 960
atggcgcagg acacctggca ctggcagtca cgccatccac agggatatcc cgattaa 1017
<210> 7
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgatcatcg atgaagcgga aagcgcggaa agcacccacc cggtggttag cgtgatcctg 60
ccggtgaaca agaaaaaccc gttcctggat gaagcgatca acagcatcct gagccagacc 120
ttcagcagct tcgaaatcat catcgtggcg aactgctgca ccgacgactt ctacaacgaa 180
ctgaaacaca aagtgaacga taaaatcaaa ctgatccgta ccaacatcgc gtacctgccg 240
tacagcctga acaaagcgat cgacctgagc aacggcgaat tcatcgcgcg tatggattcc 300
gacgatatca gccacccgga tcgcttcacc aaacaggttg acttcctgaa aaacaacccg 360
tacgttgacg tggttggcac caacgcgatc ttcatcgacg ataaaggccg tgaaatcaac 420
aaaaccaaac tgccggaaga aaacctggac atcgtgaaaa acctgccgta caaatgctgc 480
atcgttcacc cgagcgttat gttccgtaaa aaagttatcg cgagcatcgg tggttacatg 540
ttcagcaact acagcgaaga ttacgaactg tggaaccgtc tgtctctggc gaaaatcaaa 600
ttccagaacc tgccggaata cctgttctac taccgtctgc acgaaggcca gagcaccgcg 660
aaaaagaacc tgtacatggt tatggttaac gatctggtta tcaaaatgaa atgcttcttc 720
ctgaccggca acatcaacta cctgttcggc ggcatccgta ccatcgcgag cttcatctac 780
tgcaaataca tcaaataa 798
<210> 8
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atggatacca tcatgatcaa acgtccgctg gttagcgtta tcctgccggt taacaaaaac 60
aacccgcacc tggaagaagc gatccagagc atcaaaaacc agacctacaa agaactggaa 120
ctgatcatca tcgctaacaa ctgcgaagat aacttctaca gcctgctgct gaaataccag 180
gatcagaaaa ccaaaatcat ccgtaccagc atcaaatacc tgccgttcag cctgaacctg 240
ggcgttcacc tgagccaggg cgaatacatc gcgcgtatgg attccgatga tatcagcgtt 300
ctggatcgta tcgaaaaaca ggttaaacgt ttcctgaaca ccccggaact gtccatcctg 360
ggttctaacg tggaatacat caacgaagcg tccgaaagca tcggttacag caactacccg 420
ctggatcact ctagcatcgt taactctttc ccgttccgtt gcaacctggc gcacccgacc 480
atcatggtta aaaaagaagt gatcaccacc ctgggcggct acatgtacgg tagcctgtcc 540
gaagattacg atctgtggat ccgcgcgtct cgccacggta acttcaaatt cagcaacatc 600
gatgaaccgc tgctgaaata ccgcatccac aaaggccagg cgaccaacaa atctaacgcg 660
tacaacatct tcgcgttcga tagctctctg aaaatccgtg aattcctgct gaacggtaac 720
gtgcagtacc tgctgggcgc ggcgcgtggc ttcttcgcgt tcctgtacgt tcgtttcatc 780
aaaaaataa 789
<210> 9
<211> 275
<212> PRT
<213> Pseudogulbenkiania ferrooxidans
<400> 9
Met Asp Lys Ile Lys Gln Gly Ser Ala Ser Leu Val Val Gly Asp Gln
1 5 10 15
Gln Glu Lys His Pro Val Val Ser Val Leu Leu Pro Val Asn Arg Val
20 25 30
Asp Arg Phe Phe Ile Pro Ala Val Glu Ser Ile Leu Thr Gln Thr Leu
35 40 45
Gln Asp Phe Glu Leu Ile Ile Ile Ala Asn Gly Cys Ser Thr Glu His
50 55 60
Leu Asn Lys Ile Arg Leu Thr Tyr Gly Asp His Asn Arg Val Arg Ile
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Ile Lys Gly Leu Pro Phe Ala Leu Asn Leu Gly Val
85 90 95
His Asn Ala Arg Gly Leu Tyr Ile Ala Arg Met Asp Ala Asp Asp Ile
100 105 110
Ser Ile Pro Glu Arg Leu Glu Lys Gln Leu Asn Thr Leu Glu Gln Asn
115 120 125
Lys Lys Ile Gly Val Val Ser Ser Gly Val Asp Phe Ile Asp Glu Asn
130 135 140
Asp Gln Ala Ile Arg Glu Gly Lys Phe Pro Glu Leu Thr Asp Lys Asp
145 150 155 160
His Arg Arg Leu Leu Pro Leu Ile Cys Cys Ile Ala His Pro Thr Val
165 170 175
Met Val Arg Lys Glu Ile Ile Asn Lys Leu Gly Gly Tyr Ser Phe Gly
180 185 190
Ser Phe Ser Glu Asp Tyr Asp Leu Trp Leu Arg Ile Met Arg Glu Leu
195 200 205
Pro Glu Val Glu Phe Tyr Arg Ile Pro Glu Ser Leu Leu Lys Tyr Arg
210 215 220
Arg His Gly Asn Gln Ala Thr Ser Ser Lys Asn Ile Lys Lys Ile Arg
225 230 235 240
Ala Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ile Arg Glu Leu Phe Leu Ser Arg Lys
245 250 255
Leu Lys Phe Ile Ile Gly Ile Ile Leu Pro Ala Arg Met Val Thr Leu
260 265 270
Trp Arg Lys
275
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cggaattcgt tcacacagga aacctataat g 31
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cggaattcaa gaaggagata taatg 25

Claims (10)

1. 一种重组大肠杆菌，其特征在于，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的β-1,3-半乳糖基转移酶和核苷酸序列如SEQ ID NO .6所示的UDP-葡萄糖4差向异构酶基因galE，过表达葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶和β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶，并敲除编码UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的基因、编码葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶的基因和编码β-半乳糖苷酶的基因；编码葡萄糖胺合成酶的基因为glmM，编码UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶的基因为glmU，编码葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的基因为glmS，glmM，glmU和glmS核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1~3所示；所述UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶WecB的NCBI序列号为YP_026253.1，葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶 NagB的NCBI序列号为NP_415204.1，β-半乳糖苷酶LacZ的NCBI序列号为NP_414878.1。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌中含有表达载体pCDFDuet-1，所述表达载体含有编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因和UDP-葡萄糖4差向异构酶基因galE。
3. 根据权利要求1或2所述的大肠杆菌，其特征在于，含有表达载体pRSFDuet-1和pETDuet-1；所述表达载体pRSFDuet-1上含有编码葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶；所述表达载体pETDuet-1上含有β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因；所述pRSFDuet-1上的核糖体结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述pETDuet-1的核糖体结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
4.一种生产乳酰-N-四糖的方法，其特征在于，利用权利要求1~3任一所述的重组大肠杆菌为发酵菌株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌培养12~14h得到种子液，将种子液按反应体系体积的2~5%加入含有甘油的反应体系中，35~40℃震荡培养至OD600为0.6-0.8，向反应体系中加入终浓度为0.1~0.2mM的IPTG，在22~25℃诱导培养不低于90h。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌培养12~14h得到种子液，将种子液按反应体系体积的2~5%加入反应体系中，35~40℃震荡培养至OD600为14±3，向反应体系中加入终浓度为0.1~0.2mM的IPTG，和终浓度为5~10g/L的乳糖，在22~25℃诱导培养不低于40h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，反应过程中维持乳糖浓度不低于6g/L。
8. 氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的β-1,3-半乳糖基转移酶在生产乳酰-N-四糖中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，以乳酰-N-三糖II和UDP-半乳糖为底物，利用所述β-1,3-半乳糖基转移酶，生产乳酰-N-四糖。
10.权利要求1~3任一所述重组大肠杆菌在食品、生物、化工领域中生产乳酰-N-四糖中的应用。
CN202110900124.5A 2021-08-06 2021-08-06 一种高产乳酰-n-四糖的微生物的构建方法及应用 Active CN113652385B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110900124.5A CN113652385B (zh) 2021-08-06 2021-08-06 一种高产乳酰-n-四糖的微生物的构建方法及应用
PCT/CN2022/110181 WO2023011576A1 (zh) 2021-08-06 2022-08-04 一种高产乳酰-n-四糖的微生物的构建方法及应用
US18/485,501 US12049655B2 (en) 2021-08-06 2023-10-12 Construction method and application of microorganism capable of realizing high production of lacto-N-tetrose

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110900124.5A CN113652385B (zh) 2021-08-06 2021-08-06 一种高产乳酰-n-四糖的微生物的构建方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113652385A CN113652385A (zh) 2021-11-16
CN113652385B true CN113652385B (zh) 2023-10-03

Family

ID=78490409

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110900124.5A Active CN113652385B (zh) 2021-08-06 2021-08-06 一种高产乳酰-n-四糖的微生物的构建方法及应用

Country Status (3)

Country Link
US (1) US12049655B2 (zh)
CN (1) CN113652385B (zh)
WO (1) WO2023011576A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113652385B (zh) 2021-08-06 2023-10-03 江南大学 一种高产乳酰-n-四糖的微生物的构建方法及应用
CN114990037B (zh) * 2022-05-24 2024-03-26 江南大学 一种高产乳酰-n-四糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用
CN117586937B (zh) * 2024-01-18 2024-04-12 天津合生领航生物科技有限公司 一种提高乳酰-n-四糖产量的重组大肠杆菌构建及应用
CN117586938B (zh) * 2024-01-18 2024-03-29 天津合生领航生物科技有限公司 一种合成乳酰-n-新四糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108410787A (zh) * 2018-03-13 2018-08-17 光明乳业股份有限公司 一种合成乳酰-n-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
CN109735480A (zh) * 2019-02-27 2019-05-10 光明乳业股份有限公司 一种合成乳酰-n-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
CN109825465A (zh) * 2019-02-27 2019-05-31 光明乳业股份有限公司 基于平衡udp-糖供给合成乳酰-n-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
CN111548979A (zh) * 2020-05-25 2020-08-18 江南大学 合成乳酰n-新四糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN111979168A (zh) * 2020-08-17 2020-11-24 江南大学 一种提高乳酰-n-三糖ii产量的基因工程菌及生产方法
CN112280727A (zh) * 2020-11-09 2021-01-29 江南大学 合成乳酰-n-三糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN113136357A (zh) * 2021-04-25 2021-07-20 江南大学 一种产乳酰-n-新四糖的基因工程菌及生产方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3853372A1 (en) * 2018-09-21 2021-07-28 Universiteit Gent Method for the production of amino sugar containing products
EP4192946A1 (en) * 2020-08-10 2023-06-14 Inbiose N.V. Cellular production of di- and/or oligosaccharides
EP4192970A1 (en) * 2020-08-10 2023-06-14 Inbiose N.V. Production of alpha-1,3 glycosylated form of fuc-a1,2-gal-r
CN113684164B (zh) * 2021-08-06 2023-08-25 江南大学 一种高产乳酰-n-新四糖的微生物的构建方法及应用
CN113652385B (zh) * 2021-08-06 2023-10-03 江南大学 一种高产乳酰-n-四糖的微生物的构建方法及应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108410787A (zh) * 2018-03-13 2018-08-17 光明乳业股份有限公司 一种合成乳酰-n-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
CN109735480A (zh) * 2019-02-27 2019-05-10 光明乳业股份有限公司 一种合成乳酰-n-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
CN109825465A (zh) * 2019-02-27 2019-05-31 光明乳业股份有限公司 基于平衡udp-糖供给合成乳酰-n-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
CN111548979A (zh) * 2020-05-25 2020-08-18 江南大学 合成乳酰n-新四糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN111979168A (zh) * 2020-08-17 2020-11-24 江南大学 一种提高乳酰-n-三糖ii产量的基因工程菌及生产方法
CN112280727A (zh) * 2020-11-09 2021-01-29 江南大学 合成乳酰-n-三糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN113136357A (zh) * 2021-04-25 2021-07-20 江南大学 一种产乳酰-n-新四糖的基因工程菌及生产方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Bacterial β1−3-Galactosyltransferase Enables Multigram-Scale Synthesis of Human Milk Lacto‑N‑tetraose (LNT) and Its Fucosides;John B. McArthur等;《ACS Catal. 》;第10721-10726页 *
Yingying Zhu等.Metabolic Engineering of Escherichia coli for Efficient Biosynthesis of Lacto‑N‑tetraose Using a Novel β‑1,3-Galactosyltransferase from Pseudogulbenkiania ferrooxidans.《J. Agric. Food Chem. 》.2021,第69卷第11342-11349页. *
母乳寡糖的生物合成研究进展;陈坚等;《中国食品学报》;第16卷(第11期);第1-8页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113652385A (zh) 2021-11-16
WO2023011576A1 (zh) 2023-02-09
US12049655B2 (en) 2024-07-30
US20240035057A1 (en) 2024-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113652385B (zh) 一种高产乳酰-n-四糖的微生物的构建方法及应用
CN110804577B (zh) 一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌的构建方法及其应用
CN111712570B (zh) 一种生产阿洛酮糖及其衍生物的工程菌株及其构建方法和应用
JP7069007B2 (ja) 取り込み／排出を改変した微生物宿主におけるヒトミルクオリゴ糖の生産
CN113684164B (zh) 一种高产乳酰-n-新四糖的微生物的构建方法及应用
CN113186142B (zh) 一种高效生产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株
CN109402158A (zh) 一种产岩藻糖基乳糖的重组表达质粒载体、代谢工程菌及生产方法
CN114107152B (zh) 一种高产3-岩藻糖基乳糖微生物的构建方法及应用
CN114874964B (zh) 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用
CN110373370B (zh) 一种耦合atp再生系统的催化体系及其在生产谷胱甘肽过程中的应用
CN104232595A (zh) 鞘氨醇单胞菌的虾青素合成酶及其编码基因和鞘氨醇单胞菌遗传操作的方法
KR20230129172A (ko) 타가토스를 생산하기 위한 바실러스 서브틸리스 유전자조작된 박테리아 및 타가토스 제조 방법
CN115873886B (zh) 生物合成麦角硫因的方法及载体
CN116286562B (zh) 一种基因工程菌及其制备方法和应用
CN113832092B (zh) 一种提高乳酰-n-岩藻五糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN113151133B (zh) 一种产唾液酸乳糖的重组宿主菌及其构建方法和应用
KR100922085B1 (ko) Ｃｍｐ-ｎ-아세틸뉴라민산의 제조 방법
CN116555147A (zh) 一种高产n-乙酰神经氨酸的重组大肠杆菌的构建方法及应用
CN114480461B (zh) 生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物及构建方法和应用
CN108424943B (zh) 一种生产2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖腺苷酸的方法
CN116355820A (zh) 一种高产麦角硫因工程菌株及其生产麦角硫因的方法
CN113684163B (zh) 一种提高乳酰-n-四糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN113957027B (zh) 一种提高乳酰-n-岩藻六糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN115404226A (zh) 一种蔗糖合成酶及其在催化糖基化反应中的应用
CN115725535B (zh) 一种n-脱氧核糖转移酶及其在脱氧核苷制备中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant