JP7069007B2 - 取り込み/排出を改変した微生物宿主におけるヒトミルクオリゴ糖の生産 - Google Patents
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Description
大腸菌ラクト-N-トリオースII産生株の開発
大腸菌BL21(DE3)を使用して、ラクト-N-トリオースII(LNT-2)産生株を構築した。特定遺伝子の夫々突然変異誘発及び欠失と、異種遺伝子のゲノム取り込みにより、代謝改変を行った。Ellis et al.,“High efficiency mutagaenesis,repair,and engineering of chromosomal DNA using single-stranded oligonucleotides”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6742-6746(2001)に記載されているようなミスマッチオリゴヌクレオチドを使用して、突然変異誘発により遺伝子lacZ及びaraAを不活性化させた。
種々のβ-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをスクリーニングする大腸菌BL21(DE3)707のバッチ培養
Pasteurella multocida subsp.multocida株HN06に由来するβ-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼPmnagT(アクセッション番号PMCN06_0022)の遺伝子のコドン最適化及び合成を、GenScript社(Piscataway,米国)に委託した。配列及びライゲーション非依存性クローニングにより、プラスミドpET-DUET(Merck KGaA,Darmstadt,ドイツ)への遺伝子のクローニングを行った。クローニングに使用した全プライマーを下表3に示す。
同種糖排出トランスポーターを過剰発現する大腸菌ラクト-N-トリオースII産生株の作製
大腸菌で産生されたオリゴ糖の排出は、発酵工程中の制限因子となることが分かっている。一方、2’-フコシルラクトースやLNT-2等の三糖類は、ある程度まで培養上清中に転移するため、活動中の糖排出トランスポーターをコードしている可能性が高い。ラクト-N-トリオースII(LNT-II;GluNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc)の流出を改善するために、大腸菌BL21(DE3)株1326(下表2)を糖排出トランスポーター(SET)のライブラリーのスクリーニングに使用した。大腸菌に由来する推定SETタンパク質を大腸菌BL21(DE3)のゲノムDNAから増幅し、配列及びライゲーション非依存性クローニングによりベクターpINTに組み込んだ。遺伝子yjhBを代表例として使用し、プライマー2567、2568、2526及び2443を使用してプラスミドpINT-yjhBを作製した。クローニングに使用したプライマー配列を下表3に示す。
種々のβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼをスクリーニングする大腸菌BL21(DE3)724のバッチ発酵
β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼの遺伝子として、Aggregatibacter aphrophilus NJ8700に由来するIex1(アクセッション番号YP_003008647)、Pasteurella multocida subsp.multocida株HN06に由来するPmgalT7(アクセッション番号PMCN06_0021)、Myxococcus stipitatus DSM14675に由来するMsgalT8(アクセッション番号MYSTI_04346)、Kingella denitrificans ATCC 33394に由来するKdgalT10(アクセッション番号HMPREF9098_2407)、Pasteurella multocida M1404に由来するgatD(アクセッション番号GQ444331)、Bacterioidis fragilis NCTC9343に由来するBfgalT2(アクセッション番号BF9343_0585)、Haemophilus influenzaに由来するIsgD(アクセッション番号AAA24981)及びHelicobacter pyloriに由来するHpgalT(アクセッション番号AB035971)のコドン最適化及び合成を、GenScript社(Piscataway,米国)に委託した。配列及びライゲーション非依存性クローニングにより遺伝子のクローニングを行った(Li and Elledge,Nat Methods.2007 Mar;4(3):251-6.)。従って、アンヒドロテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にmalE遺伝子を導入したプラスミドpINTを使用し、β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子とmalEとのN末端融合体を作製した。Pectobacterium atrosepticum JG10-08に由来する遺伝子waaX(アクセッション番号ECA0154)をコードするβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼを単独でプラスミドpACYC-Duet(Merck KGaA,Darmstadt,ドイツ)にクローニングした。クローニングに使用した全プライマーを下表3に示す。
種々のβ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼをスクリーニングする大腸菌BL21(DE3)534のバッチ培養
大腸菌K12 DH5αのゲノムDNAを鋳型として使用し、プライマー1163及び1162を使用してgalEを増幅した。PCR産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼNdeI及びXhoIで消化し、同一酵素で切断しておいたベクターpCDFDuet(Merck KGaA,Darmstadt,ドイツ)の第2のマルチクローニングサイトにライゲーションした。GalEはIPTG誘導性T7プロモーターから発現される。大腸菌K12遺伝子galTをゲノムDNAから増幅し、プライマー991~994を使用して配列及びライゲーション非依存性クローニングによりプラスミドpCDF-galEに組み込み、プラスミドpCDF-galT-galEを作製した。
改良型プラスミドフリー大腸菌ラクト-N-テトラオース産生株の開発
大腸菌BL21(DE3)724株を使用し、ラクト-N-テトラオース(LNT)産生株を構築した。pEcomar-wbdO-galEから挿入したマリナー様エレメントHimar1トランスポザーゼにより特異的に認識される末端逆向き反復配列を両端にもつトランスポゾンカセット<Ptet-wbdO-PT5-galE-FRT-cat-FRT>(配列番号5)のゲノム組み込みにより代謝改変を行った。得られた1353株を更に代謝改変させ、細胞内LNT-IIプールの増加を示し、LNTの産生を増加させるようにした。従って、メジャーファシリテータースーパーファミリートランスポーターyjhB(アクセッション番号YP_003001824)を大腸菌株のゲノムから欠失させ、1431株を作製した(下表2)。
糖排出トランスポーターを過剰発現する大腸菌ラクト-N-テトラオース産生株の作製
産生株では培地へのラクト-N-テトラオースの排出が少量しかないので、糖排出トランスポーターライブラリーのスクリーニングを行った。実施例3に準じて推定SETタンパク質を大腸菌ゲノムDNAから増幅させるか、又はGenScript社(Piscataway,米国)にコドン最適化及び合成を委託した。増幅後、配列及びライゲーション非依存性クローニングにより、遺伝子をベクターpINTに組み込んだ。大腸菌遺伝子のクローニング用のプライマーは実施例3に準じた。標準化ヌクレオチドオーバーハングを使用して合成遺伝子を合成し、同様にプライマー2527、2444、2526及び2443を使用して発現ベクターに組込んだ。クローニングに使用したプライマー配列を下表3に示す。
異種糖排出トランスポーターの過剰発現による大腸菌ラクト-N-トリオースII産生株の作製
実施例6に記載したLNTエクスポータースクリーニングでは、興味深いことに、Mannheimia succiniciproducens MBEL55Eに由来するTP11(proP,アクセッション番号AAU37785)及びCedecea neteri M006に由来するTP70(setA,アクセッション番号WP_039290253)の2種類のタンパク質の過剰発現の結果、LNT-IIの産生が著しく増加し、従って、LNT産生が低下することが判明した(データは示さず)。この結果を、実施例3に記載したような実験構成で確認した。糖排出トランスポーターYjhBの過剰発現を陽性対照とした。TP11とTP70の過剰発現の結果、LNT-II産生は約4倍となり、若干ではあるが、YjhBよりも増加した。図9は糖排出トランスポーターTP11(2)、YjhB(3)又はTP70(4)を過剰発現する大腸菌BL21(DE3)株の上清中のラクト-N-トリオースIIの濃度を示すグラフである。空の対照プラスミドを導入した1326株を対照(1)とした。こうして、LNT-IIを排出の標的とし、その過剰発現がLNT-II産生株を作製するのに有用であると思われる3種類の糖排出トランスポーターが同定された。
Claims (20)
- 遺伝子的に改変された微生物宿主細胞による所望のオリゴ糖の生産方法であって、前記所望のオリゴ糖が、ラクト-N-トリオースII(LNT-II;GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Gluc)をコア三糖として含むヒトミルクオリゴ糖であり、
-遺伝子的に改変された微生物宿主細胞を準備する工程と、
-前記遺伝子的に改変された微生物宿主細胞は、少なくとも2種の組換え型グリコシルトランスフェラーゼを含み、前記グリコシルトランスフェラーゼは、β-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ及びN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを含み、
-前記遺伝子的に改変された微生物宿主細胞は、少なくとも1種の内在性糖排出タンパク質の発現又は活性が、遺伝子的に改変されていない宿主細胞に比較して低下もしくは不活性化され、遺伝子的に改変されていない宿主細胞に比較して培地への前記所望のオリゴ糖の前駆体の排出が低下もしくは停止するように、前記糖排出タンパク質の発現又は活性が改変されており、前記前駆体は、ラクト-N-トリオースIIであり、
-前記所望のオリゴ糖の生産に許容される条件下で、前記宿主細胞を培地で培養し、前記所望のオリゴ糖を前記培地中に輸送させる工程と、
-前記培地から前記所望のオリゴ糖を取得する工程と
を含む、方法。 - 前記オリゴ糖が、ラクト-N-テトラオース、ラクト-N-ネオテトラオース、ラクト-N-フコペンタオースI、ラクト-N-フコペンタオースII、ラクト-N-フコペンタオースIII、ラクト-N-フコペンタオースV、ラクト-N-ジフコシルヘキソースI、ラクト-N-ジフコシルヘキサオースII、ラクト-N-シアリルペンタオースLSTa、LSTb、LSTc、ジシアリルラクト-N-テトラオース、ジシアリルラクト-N-ネオテトラオースから構成される群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、
-前記培地への所望のオリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする少なくとも1種の同種もしくは異種核酸配列をさらに含み、前記同種もしくは異種核酸配列の発現が過剰発現となるように、前記宿主細胞が改変されており;及び/又は
-前記所望のオリゴ糖の前駆体を前記宿主細胞の外側に排出するエクスポータータンパク質をコードする少なくとも1種の内在性核酸配列の欠失、破壊、機能低下もしくは不活性をさらに含み;及び/又は
-前記宿主細胞への所望のオリゴ糖の前駆体の取り込みに介在するタンパク質をコードする少なくとも1種の同種もしくは異種配列の過剰発現をさらに含む、請求項1又は2に記載の方法。 - 所望のオリゴ糖の排出を可能にする前記タンパク質が、二次性能動輸送体のクラスに属する、請求項3に記載の方法。
- 所望のオリゴ糖の排出を可能にする前記タンパク質が、少なくとも3部分、好ましくはラクト-N-トリオースII(LNT-II;GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Gluc)をコア三糖として含むオリゴ糖の排出を行う、請求項3又は4に記載の方法。
- 所望のオリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする前記少なくとも1種の核酸配列が、内在性核酸又は組換え型核酸である、請求項3~5のいずれか一項に記載の方法。
- 所望のオリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする前記核酸配列が、細菌、古細菌、植物、酵母又は動物に由来する請求項3~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記所望のオリゴ糖がラクト-N-テトラオースであり、前記前駆体がラクト-N-トリオースIIであり、前記宿主細胞はラクト-N-トリオースIIを前記宿主細胞の外側に排出することが可能なエクスポータータンパク質をコードする少なくとも1種の核酸配列を欠失、破壊又は不活性化されており、好ましくはラクト-N-テトラオースの排出を可能にする前記タンパク質が大腸菌BL21(DE3)に由来するYebQ、バチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)のSpoVB、エルウィニア・ピリフォリア(Erwinia pyrilfolia)のYabM、大腸菌MG1655のBcr、大腸菌MG1655のYdeA、パラインフルエンザ菌(Haemophilus parainfluenzae)のProP2、ペクトバクテリウム・カロトボラム(Pectobacterium carotovorum)のSetA、大腸菌MG1655のFucP、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Bmb9393のMdeA、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)のImrA、シュードモナス属種(Pseudomonas sp.)MT-1のSetA及びボーベリア・バシアーナ(Beauveria bassiana)D1-5のSetAから選択される、請求項3~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換え型グリコシルトランスフェラーゼが、β-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びβ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼを含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記β-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが、髄膜炎菌(Neisseria meningitides)のLgtA又はパスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)のPmnagTのクラス又はその変異体に属する、請求項9に記載の方法。
- 前記β-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼが、ラクト-N-テトラオースを生成するβ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼであり、WbdO又はその機能的変異体である、請求項10に記載の方法。
- 前記遺伝子的に改変された宿主細胞において、内在性β-ガラクトシダーゼ遺伝子及びグルコサミン-6-リン酸デアミナーゼ遺伝子が、不活性化又は欠失しており、前記遺伝子的に改変された宿主細胞が、機能的ラクトースパーミアーゼタンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子的に改変された宿主細胞は、UDP-N-アセチルグルコサミン産生能と、UDP-ガラクトース又はGDP-フコース又はCMP-N-アセチルノイラミン酸産生能が遺伝子的に改変されていない宿主細胞に比較して増加しており、好ましくは、前記UDP-N-アセチルグルコサミン産生能とUDP-ガラクトース産生能の増加が、L-グルタミン:D-フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ/グルコサミン-1-リン酸アセチルトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、UDP-ガラクトース-4-エピメラーゼ、ホスホグルコムターゼ、グルコース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの活性を含むタンパク質をコードする1種以上の遺伝子の過剰発現を含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- グルコース、スクロース、グリセロール又はその組み合わせの存在下で、且つN-アセチルグルコサミンもしくはガラクトース、又はその組み合わせの不添加下又は非存在下に、前記遺伝子的に改変された宿主細胞を培養する、請求項12又は13に記載の方法。
- 所望のオリゴ糖の生産のための遺伝子的に改変された微生物宿主細胞であって、前記オリゴ糖が、ラクト-N-トリオースII(LNT-II;GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Gluc)をコア三糖として含み、前記宿主細胞が、
-少なくとも2種の組換え型グリコシルトランスフェラーゼを含み、前記グリコシルトランスフェラーゼが、β-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ及びN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを含み、
-少なくとも1種の内在性糖輸送タンパク質の発現又は活性が、前記所望のオリゴ糖の前駆体の排出に関して機能的に不活性化されるように前記内在性糖輸送タンパク質の発現又は活性が改変されており、前記前駆体が、ラクト-N-トリオースIIである、
前記微生物宿主細胞。 - グリコシルトランスフェラーゼとして、(i)発現された異種β-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼと、(ii)発現された異種β-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼを含む、請求項15に記載の微生物宿主細胞。
- -前記宿主細胞を培養する培地への前記オリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする少なくとも1種の同種もしくは異種核酸配列をさらに含み、前記所望のオリゴ糖の排出を可能にする前記タンパク質は、二次性能動輸送体のクラスに属し、所望のオリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする前記同種もしくは異種核酸配列は、過剰発現されているか、もしくは前記核酸配列の過剰発現を可能にするプロモーター配列の制御下にあり;及び/又は
-前記所望のオリゴ糖の前駆体を前記宿主細胞の外側に排出するエクスポータータンパク質をコードする少なくとも1種の内在性核酸配列の欠失、破壊、機能低下もしくは不活性化をさらに含み;及び/又は
-前記宿主細胞への所望のオリゴ糖の前駆体の取り込みに介在するタンパク質をコードする少なくとも1種の同種又は異種核酸配列の過剰発現をさらに含む、
請求項15又は16に記載の微生物宿主細胞。 - 所望のオリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする前記核酸配列が、細菌、古細菌、植物、酵母又は動物に由来する、請求項17に記載の微生物宿主細胞。
- 所望のオリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする前記少なくとも1種の核酸配列が、内在性又は組換え型核酸配列である、請求項17又は18に記載の微生物宿主細胞。
- 前記所望のオリゴ糖がラクト-N-テトラオースであり、前記前駆体がラクト-N-トリオースIIであり、前記宿主細胞はラクト-N-トリオースIIを前記宿主細胞の外側に排出することが可能なエクスポータータンパク質をコードする少なくとも1種の核酸配列を欠失、破壊又は不活性化されており、好ましくはラクト-N-テトラオースの排出を可能にする前記タンパク質が大腸菌BL21(DE3)に由来するYebQ、バチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)のSpoVB、エルウィニア・ピリフォリア(Erwinia pyrilfolia)のYabM、大腸菌MG1655のBcr、大腸菌MG1655のYdeA、パラインフルエンザ菌(Haemophilus parainfluenzae)のProP2、ペクトバクテリウム・カロトボラム(Pectobacterium carotovorum)のSetA、大腸菌MG1655のFucP、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Bmb9393のMdeA、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)のImrA、シュードモナス属種(Pseudomonas sp.)MT-1のSetA及びボーベリア・バシアーナ(Beauveria bassiana)D1-5のSetAから選択される、請求項18又は19に記載の微生物宿主細胞。
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