JP2023511524A - Hmo産生 - Google Patents
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Abstract
本発明の概念は、MFSスーパーファミリーのタンパク質をコードする組み換え核酸を含むオリゴ糖、好ましくはHMOの産生について可能にされた遺伝子改変細胞及びオリゴ糖、好ましくはHMOの産生のために前記細胞を使用する方法に関する。【選択図】なし
Description
[技術分野]
本発明は、宿主細胞における生物学的分子の組み換え産生の分野に関する。より特に、本発明は、主要ファシリテータースーパーファミリー(MFS)のタンパク質を発現する遺伝子改変細胞を用いるヒトミルクオリゴ糖(HMO)の組み換え産生のための方法に関する。
本発明は、宿主細胞における生物学的分子の組み換え産生の分野に関する。より特に、本発明は、主要ファシリテータースーパーファミリー(MFS)のタンパク質を発現する遺伝子改変細胞を用いるヒトミルクオリゴ糖(HMO)の組み換え産生のための方法に関する。
[発明の背景]
ヒトミルクオリゴ糖(HMO)は、ヒト母乳中の三番目に大きい固体成分を構成し、酵素的加水分解に対して高度に耐性である。結果として、HMOの実質的な画分は、殆どが未消化且つ未吸収のままで残留するため、それらの結腸への通過を可能にする。結腸内では、HMOは、特異的糖分解細菌の増殖を選択的に刺激することにより、腸内エコシステムを形作る基質として機能し得る。この選択性は、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)種の菌株が消化管の健康にプラスの効果を有すると考えられるため、乳児及び成人の両方にとって有益であると見なされている(Chichlowski M.et al.,(2012)J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.5:251-258;Elison E.et al.,(2016)Brit J.Nutr,116:1356-1368)。
ヒトミルクオリゴ糖(HMO)は、ヒト母乳中の三番目に大きい固体成分を構成し、酵素的加水分解に対して高度に耐性である。結果として、HMOの実質的な画分は、殆どが未消化且つ未吸収のままで残留するため、それらの結腸への通過を可能にする。結腸内では、HMOは、特異的糖分解細菌の増殖を選択的に刺激することにより、腸内エコシステムを形作る基質として機能し得る。この選択性は、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)種の菌株が消化管の健康にプラスの効果を有すると考えられるため、乳児及び成人の両方にとって有益であると見なされている(Chichlowski M.et al.,(2012)J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.5:251-258;Elison E.et al.,(2016)Brit J.Nutr,116:1356-1368)。
それらのプレバイオティクス特性の他に、HMOは、それらの適用分野を拡大する追加のプラスの効果と結び付けられている(Kunz C.et al.,(2014)Food Oligosaccharides:Production,Analysis and Bioactivity,1st Edition,p5-20,Eds.Moreno J.and Luz Sanz M.,John Wiley&Sons,Ltd)。
HMOの明白な健康上の利点は、例えば、乳児用調製粉乳及び乳児食等の食品における使用並びに消費者用健康食品のためのそれらの承認を可能にした。HMOの生物工学的産生は、HMO製造の貴重な費用効率的且つ大規模方法である。その方法は、所望のオリゴ糖の合成のために必要とされるグリコシルトランスフェラーゼを発現できるように構築された遺伝子操作細菌に依存し、HMO前駆体としてのヌクレオチド糖の細菌の固有のプールを利用する。HMOの生物工学的産生における最近の開発は、細菌発現系の所定の固有の限界を克服することを可能にしてきた。例えば、HMO産生細菌細胞は、細菌内でのヌクレオチド糖の制限された細胞内プールを増加させるため(国際公開第2012112777号パンフレット)、HMO産生に関与する酵素の活性を改良するため(国際公開第2016040531号パンフレット)又は合成されたHMOの細胞外培地中への分泌を促進するため(国際公開第2010142305号パンフレット、同第2017042382号パンフレット)に遺伝子改変され得る。さらに、組み換え細胞内の関心対象の遺伝子の発現は、例えば、近年、国際公開第2019123324号パンフレットに記載されているような特定のプロモーター又は他の遺伝子発現調節因子を用いて調節され得る。
国際公開第2010142305号パンフレット及び同第2017042382号パンフレットに記載されたアプローチは、例えば、国際公開第2012112777号パンフレット、同第2016040531号パンフレット又は同第2019123324号パンフレットの方法を用いて、高レベルの組み換え遺伝子発現によって産生細胞上に課される代謝負担を減少させることを可能にするという利点を有する。このアプローチは、組み換えHMO産生細胞の操作において一層多くの注目を集めており、例えば、最近では、糖トランスポータータンパク質をコードする数種の新規な遺伝子及びヒト母乳の最も富裕なHMOである組み換え産生した2’-フコシルラクトース(2’-FL)の排出を促進できる発酵手法について記載されている(国際公開第2018077892号パンフレット、米国特許出願公開第201900323053号明細書、同第201900323052号明細書)。しかしながら、現時点では、糖トランスポーターの基質特異性を定義する構造/因子は、依然として明確に研究されておらず、極めて予測不能なままであるため、例えば、UniProt等の複数のタンパク質データベースにおける予測されたトランスポーター機能を備える極めて多数の細菌タンパク質間で様々な組み換え産生したHMO構造の排出についての正しいトランスポータータンパク質を正確に特定できるアルゴリズムは、存在しない。
[発明の概要]
組み換え産生HMO及び前記タンパク質を発現する組み換え細胞を発生させるための効率的な糖排出トランスポータータンパク質は、大規模な工業的HMO製造にとって有利である。
組み換え産生HMO及び前記タンパク質を発現する組み換え細胞を発生させるための効率的な糖排出トランスポータータンパク質は、大規模な工業的HMO製造にとって有利である。
本発明は、ヒトミルクオリゴ糖(HMO)を産生することができる組み換え細胞であって、細菌エルニシア・ベルコビエリ(Yersinia bercovieri)を起源とする推定MFS(主要ファシリテータースーパーファミリー)トランスポータータンパク質をコードする異種遺伝子を発現する組み換え細胞を提供する。より特に、本発明は、オリゴ糖、特にHMOの産生のために最適化された遺伝子改変細胞であって、配列番号1のアミノ酸配列(図4)との少なくとも80%の配列同一性を有するタンパク質をコードする組み換え核酸を含む遺伝子改変細胞に関する。配列番号1として本明細書で同定されたアミノ酸配列は、GenBankアクセッションID EEQ08298.1(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/EEQ08298.1/)を有するアミノ酸配列と100%同一であるアミノ酸配列である。配列番号1のアミノ酸配列を有するMFSトランスポータータンパク質は、本明細書では、「YberCタンパク質」、又は「YberCトランスポーター」、又は「YberC」と互換的に同定され;YberCタンパク質をコードする核酸配列は、本明細書では、「YberCコーディング核酸/DNA」、又は「yberC遺伝子」、又は「yberC」であると同定される。
本発明は、YberCタンパク質を発現するHMO産生組み換え細胞の使用が、HMOの発酵及び精製の両方において、HMO製造プロセスの極めて顕著な改良を生じさせることを証明する。本明細書に開示したHMO産生のための組み換え細胞及び方法は、より高い収率の全産生HMO、より少ない副生成物形成又は副生成物対生成物比の両方、発酵毎のより低いバイオマス形成及び発酵ブロスの下流処理加工中のHMOの加速された回収を提供する。
驚くべきことに、種々のHMO産生細胞中における、YberCをコードするDNA配列の発現は、細胞外培地中での幾つかの特定HMOの蓄積及び産生細胞の内部での幾つかの他のHMOの蓄積並びに全HMO産生の増加と関連することが見出されている。驚くべきことに、産生したHMOの排出の増加は、3単位又は4単位の単糖の何れかから構成されるHMO、即ち三糖及び四糖であるHMO、例えば3’-シアリルラクトース(3’-SL)、6’-シアリルラクトース(6’-SL)、ラクト-N-トリオース2(LNT-2)、ラクト-N-ネオテトラオース(LNnT)及びラクト-N-テトラオース(LNT)について特徴的であるが、産生細胞の内部に蓄積する、五糖又は六糖等のより大きいオリゴ糖構造について特徴的でないことが見出されている。驚くべきことに、特にyberCを発現する対応するHMO産生細胞では、ラクト-N-トリオース2(LNT-2)、ラクト-N-テトラオース(LNT)及びラクト-N-ネオテトラオース(LNnT)等のHMOの総産生量が増加する一方、これらの細胞内での副生成物、例えばパラ-ラクト-N-ネオヘキサオース(pLNnH)又はパラ-ラクト-ネオ-ヘキサオースII(pLNH-II)の産生量がこれに対応して多くの場合に減少し、前記副生成物のオリゴ糖が典型的には産生細胞の内部に蓄積することも見出されている。さらに、非常に予想外であることに、HMO産生細胞内でのYberCタンパク質の発現は、例えば、発酵終了時における死細胞数の減少によって反映されるように、高細胞密度発酵中のバイオマス形成の減少及びより健康な細胞培養をもたらし、これは、バイオマス単位当たりでより多くの生成物が産生されるように製造プロセスをより効率的にさせる。
したがって、本発明の第1の態様は、3’-シアリルラクトース(3’-SL)、6’-シアリルラクトース(6’-SL)、ラクト-N-トリオース-2(LNT-2)、ラクト-N-テトラオース(LNT)、ラクト-N-ネオテトラオース(LNnT)、ラクト-N-フコペンタオースI(LNFP I)、ラクト-N-フコペンタオースII(LNFP II)、ラクト-N-フコペンタオースIII(LNFP III)、ラクト-N-フコペンタオースIV(LNFP IV)及びラクト-N-フコペンタオースV(LNFP V)、パラ-ラクト-N-ネオヘキサオース(pLNnH)並びにパラ-ラクト-ネオヘキサオースII(pLNH-II)のリストから選択される1種以上のヒトミルクオリゴ糖(HMO)を産生することができる遺伝子改変細胞であって、配列番号1のタンパク質をコードする組み換え核酸又は配列番号1と少なくとも80%同一である、好ましくは少なくとも85%同一である、より好ましくは少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを含む遺伝子改変細胞に関する。特に、本発明は、1種以上のヒトミルクオリゴ糖(HMO)を産生することができる前記遺伝子改変細胞であって、オリゴ糖は、ラクト-N-トリオース-2(LNT-2)、ラクト-N-テトラオース(LNT)、ラクト-N-ネオテトラオース(LNnT)、ラクト-N-フコペンタオースI(LNFP I)、ラクト-N-フコペンタオースII(LNFP II)、ラクト-N-フコペンタオースIII(LNFP III)、ラクト-N-フコペンタオースIV(LNFP IV)及びラクト-N-フコペンタオースV(LNFP V)、パラ-ラクト-N-ネオヘキサオース(pLNnH)並びにパラ-ラクト-ネオヘキサオースII(pLNH-II)のリストから選択される、前記遺伝子改変細胞に関する。
本発明の第2の態様は、MFSトランスポータータンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号2及びその核酸構築物を含む、例えば大腸菌(Escherichia coli)である遺伝子改変細胞との少なくとも70%、少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも99%の配列同一性を有する、核酸構築物に関する。
一態様では、MFSトランスポータータンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、核酸配列は、配列番号2と少なくとも70%同一である、核酸構築物である。
本発明の第3の態様は、1種以上のオリゴ糖の産生のための方法であって、
(i)HMOを産生することができる遺伝子改変細胞であって、配列番号1のタンパク質をコードする組み換え核酸又は配列番号1と少なくとも80%同一である、好ましくは少なくとも85%同一である、より好ましくは少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを含む遺伝子改変細胞を提供する工程;
(ii)前記組み換え核酸を発現するための好適な細胞培養培地中において、(i)に記載の細胞を培養する工程;
(iii)工程(ii)において産生された1種以上のHMOを採取する工程
を含む方法に関する。
(i)HMOを産生することができる遺伝子改変細胞であって、配列番号1のタンパク質をコードする組み換え核酸又は配列番号1と少なくとも80%同一である、好ましくは少なくとも85%同一である、より好ましくは少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを含む遺伝子改変細胞を提供する工程;
(ii)前記組み換え核酸を発現するための好適な細胞培養培地中において、(i)に記載の細胞を培養する工程;
(iii)工程(ii)において産生された1種以上のHMOを採取する工程
を含む方法に関する。
本発明は、主要ファシリテータースーパーファミリー(MFS)タンパク質をコードする異種核酸配列を含む遺伝子改変細胞又は核酸構築物であって、前記核酸配列は、配列番号2との少なくとも70%の配列同一性を有する、遺伝子改変細胞又は核酸構築物の、3’-シアリルラクトース(3’-SL)、6’-シアリルラクトース(6’-SL)、ラクト-N-トリオース-2(LNT-2)、ラクト-N-テトラオース(LNT)、ラクト-N-ネオテトラオース(LNnT)、ラクト-N-フコペンタオースI(LNFP I)、ラクト-N-フコペンタオースII(LNFP II)、ラクト-N-フコペンタオースIII(LNFP III)、ラクト-N-フコペンタオースIV(LNFP IV)及びラクト-N-フコペンタオースV(LNFP V)、パラ-ラクト-N-ネオヘキサオース(pLNnH)並びにパラ-ラクト-ネオヘキサオースII(pLNH-II)のリストから選択される、特にラクト-N-トリオース-2(LNT-2)、ラクト-N-テトラオース(LNT)、ラクト-N-ネオテトラオース(LNnT)、ラクト-N-フコペンタオースI(LNFP I)、ラクト-N-フコペンタオースII(LNFP II)、ラクト-N-フコペンタオースIII(LNFP III)、ラクト-N-フコペンタオースIV(LNFP IV)及びラクト-N-フコペンタオースV(LNFP V)、パラ-ラクト-N-ネオヘキサオース(pLNnH)並びにパラ-ラクト-ネオヘキサオースII(pLNH-II)のリストから選択される1種以上のヒトミルクオリゴ糖(HMO)の産生のための使用にも関する。
上述したように、1種以上のHMOを産生することができる、YberCトランスポータータンパク質をコードする核酸を含む遺伝子改変細胞の培養中、驚くべきことに、副生成物及びバイオマス形成を減少させながら、対応する1種以上のHMOが高収率で産生されることが見出されている。これは、下流プロセス中のHMOの回収にとって、例えば全体的な回収及び精製手法がより少ない工程を含む可能性があり、精製の全所要時間が短縮され得るため、したがって、生成物の回収は、より要する労力が少なくなり、経済的により効率的である。
これらの増加した生成物の収率及び生成物回収の促進の効果は、本発明を先行技術の開示に対して優れたものにする。
本発明の他の態様及び有利な特徴について、下記の非限定的な実施例によって詳細に記載し、例示する。
[詳細な説明]
下記では、本発明の実施形態についてさらに詳細に記載する。機能のそれぞれの特定の変形形態は、他に特に記載しない限り、本発明の他の実施形態に適用され得る。
下記では、本発明の実施形態についてさらに詳細に記載する。機能のそれぞれの特定の変形形態は、他に特に記載しない限り、本発明の他の実施形態に適用され得る。
一般に、本明細書で使用する全ての用語は、他に明示的に規定又は記載されない限り、当技術分野におけるそれらの通常の意味に従って解釈されるべきであり、本発明の全ての態様及び実施形態に適用することができる。「1つの(a)/1つの(an)/その[細胞、配列、遺伝子、トランスポーター、工程等]」についての全ての言及は、他のことが明示的に記載されない限り、前記細胞、配列、遺伝子、トランスポーター、工程等の少なくとも1つの例についての言及であると開放的に解釈されるべきである。本明細書に開示した任意の方法の工程は、明示的に規定されない限り、本明細書に開示した正確な順序で実施される必要はない。
本発明は、一般に、オリゴ糖の効率的な産生のための遺伝子改変細胞及びオリゴ糖を産生させる方法における前記遺伝子改変細胞の使用に関する。特に、本発明は、オリゴ糖、好ましくは異種オリゴ糖、特にヒトミルクオリゴ糖(HMO)を合成することを可能にされた遺伝子改変細胞に関する。したがって、本発明の細胞は、例えば、下記に記載するグリコシルトランスフェラーゼ活性を備える1種以上の酵素をコードする遺伝子等、(細胞が1種以上のHMOを合成することを可能にする)細胞による1種以上のHMOを合成するために必要な組み換え核酸の組を発現するように改変される。本発明のオリゴ糖産生組み換え細胞は、異種組み換え核酸配列、好ましくは細菌エルニシア・ベルコビエリ(Yersinia bercovieri)を起源とするMFS(主要ファシリテータースーパーファミリー)タンパク質をコードするDNA配列を含むようにさらに改変される。より詳細には、本発明は、1種以上の特定のオリゴ糖、特に1種以上の特定のHMOの産生のために最適化された遺伝子改変細胞であって、配列番号1(図4)のアミノ酸配列との少なくとも80%の配列類似性、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%及び一層より好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するタンパク質をコードする組み換え核酸を含む遺伝子改変細胞に関する。本明細書で配列番号1と同定されたアミノ酸配列は、GenBankアクセッションID:EEQ08298.1(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/EEQ08298.1/)を有するアミノ酸配列との100%同一性を有するアミノ酸配列である。
したがって、本発明の第1の態様は、1種以上のHMOを産生することができる遺伝子改変細胞であって、配列番号1のタンパク質をコードする組み換え核酸又は配列番号1と少なくとも80%同一である、好ましくは少なくとも85%同一である、より好ましくは少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを含む遺伝子改変細胞に関する。
配列番号1のアミノ酸配列を有するMFSトランスポータータンパク質は、本明細書では、「YberCタンパク質」、又は「YberCトランスポーター」、又は「YberC」であると互換的に同定され;YberCタンパク質をコードする核酸配列は、本明細書では、「YberCコーディング核酸/DNA」、又は「yberC遺伝子」、又は「yberC」であると同定される。
用語「主要ファシリテータースーパーファミリー(MFS)」は、糖、薬物、疎水性分子、ペプチド、有機イオン等の広範囲の様々な物質を輸送することを担っている第2の活性トランスポータークラスの大きく且つ並外れて広汎なファミリーを意味する。糖トランスポータータンパク質の特異性は、高度に予測不能であり、例えば、オリゴ糖に対する特異性を備える新規なトランスポータータンパク質の同定には、極めて負担の大きい検査室実験を必要とする(より詳細については、Reddy V.S.et al.,(2012),FEBS J.279(11):2022-2035によるレビューを参照されたい)。用語「MFSトランスポーター」は、これに関連して、オリゴ糖、好ましくはHMOの細胞膜を通した輸送、好ましくは特にLNT-2、LNT、LNnT、3’-SL又は6’-SLの3又は4糖単位を含むHMO/オリゴ糖の、細胞質から細胞外部への好ましくは宿主細胞により合成されたHMO/オリゴ糖の輸送を意味する。さらに又は代わりに、MFSトランスポーターは、例えば、ラクトース、グルコース、細胞代謝産物又は毒素等、本発明によるHMO又はオリゴ糖と見なされない分子の排出も促進し得る。
2つ以上の核酸又はアミノ酸配列に関連して、用語「[所定の]%の配列同一性」は、2つ以上の配列が、核酸又はアミノ酸の比較ウィンドウ又は指定された配列にわたって最大一致について比較及び整列されたとき、一定の%で共通するヌクレオチド又はアミノ酸残基を有する同一性を有することを意味する(即ち、配列は、少なくとも90パーセント(%)の同一性を有する)。核酸配列又はアミノ酸配列のパーセント同一性は、デフォルトパラメーターを用いるBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを使用して、又は手動によるアラインメント及び視覚的検査によって測定することができる(例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/を参照されたい)。この定義は、欠失及び/又は付加を有する試験配列の補体及び配列並びに置換を有する補体及び配列にも適用される。パーセント同一性、配列類似性を決定するために及びアラインメントのために好適なアルゴリズムの例は、Altschul et al.Nucl.Acids Res.25-3389(1997)に記載されているBLAST 2.2.20アルゴリズムである。BLAST 2.2.20は、本発明の核酸及びタンパク質に対するパーセント配列同一性を決定するために使用される。BLAST分析を実施するためのソフトウエアは、国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通して公的に入手可能である。配列アラインメントアルゴリズムの例は、CLUSTAL Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)、EMBOSS Needle(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)、MAFFT(http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/)又はMUSCLE(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)である。
本発明に関連して、用語「オリゴ糖」は、多数の単糖単位を含有する糖ポリマーを意味する。幾つかの実施形態では、好ましいオリゴ糖は、3又は4単糖単位、即ち三糖又は四糖からなる糖ポリマーである。本発明の好ましいオリゴ糖は、ヒトミルクオリゴ糖(HMO)である。
本発明に関連して、用語「ヒトミルクオリゴ糖」又は「HMO」は、ヒト母乳中で見出される複合糖質を意味する(参考のために、Urashima et al.:Milk Oligosaccharides.Nova Science Publisher(2011);又はChen,Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.72,113(2015)を参照されたい)。HMOは、1つ以上のβ-N-アセチル-ラクトサミニル及び/又は1つ以上のβ-ラクト-N-ビオシル単位によって伸長され得る還元末端でラクトース単位を含むコア構造を有し、このコア構造は、α-L-フコピラノシル及び/又はα-N-アセチル-ノイラミニル(シアリル)部分によって置換され得る。この点に関して、非酸性(又は中性)HMOは、シアリル残基を欠き、酸性HMOは、それらの構造内に少なくとも1つのシアリル残基を有する。非酸性(又は中性)HMOは、フコシル化されても又はされなくてもよい。そのような中性非フコシル化HMOの例としては、ラクト-N-トリオース2(LNT-2)、ラクト-N-テトラオース(LNT)、ラクト-N-ネオテトラオース(LNnT)、ラクト-N-ネオヘキサオース(LNnH)、パラ-ラクト-N-ネオヘキサオース(pLNnH)、パラ-ラクト-N-ヘキサオース(pLNH)及びラクト-N-ヘキサオース(LNH)が挙げられる。中性フコシル化HMOの例としては、2’-フコシルラクトース(2’-FL)、ラクト-N-フコペンタオースI(LNFP-I)、ラクト-N-ジフコヘキサオースI(LNDFH-I)、3-フコシルラクトース(3’-FL)、ジフコシルラクトース(DFL)、ラクト-N-フコペンタオースII(LNFP-II)、ラクト-N-フコペンタオースIII(LNFP-III)、ラクト-N-ジフコヘキサオースIII(LNDFH-III)、フコシル-ラクト-N-ヘキサオースII(FLNH-II)、ラクト-N-フコペンタオースV(LNFP-V)、ラクト-N-ジフコヘキサオースII(LNDFH-II)、フコシル-ラクト-N-ヘキサオースI(FLNH-I)、フコシル-パラ-ラクト-N-ヘキサオースI(FpLNH-I)、フコシル-パラ-ラクト-N-ネオヘキサオースII(F-pLNnH II)及びフコシル-ラクト-N-ネオヘキサオース(FLNnH)が挙げられる。酸性HMOの例としては、3’-シアリルラクトース(3’-SL)、6’-シアリルラクトース(6’-SL)、3-フコシル-3’-シアリルラクトース(FSL)、3’-O-シアリルラクト-N-テトラオースa(LST a)、フコシル-LST a(FLST a)、6’-O-シアリルラクト-N-テトラオースb(LST b)、フコシル-LST b(FLST b)、6’-O-シアリルラクト-N-ネオテトラオース(LST c)、フコシル-LST c(FLST c)、3’-O-シアリルラクト-N-ネオテトラオース(LST d)、フコシル-LST d(FLST d)、シアリル-ラクト-N-ヘキサオース(SLNH)、シアリル-ラクト-N-ネオヘキサオースI(SLNH-I)、シアリル-ラクト-N-ネオヘキサオースII(SLNH-II)及びジシアリル-ラクト-N-テトラオース(DSLNT)が挙げられる。本発明に関連して、ラクトースは、HMO種であると見なされない。
本発明の幾つかの実施形態では、トリ-HMO及びテトラ-HMO、例えば三糖であるLNT-2、3’-SL、6’-SL及び四糖であるLNT、LNnT、FSLが好ましい場合がある。
1種以上のHMOを合成することができるように、本発明の組み換え細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を備える機能的酵素をコードする少なくとも1つの組み換え核酸を含む。ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、宿主細胞のゲノム内に(染色体への統合によって)統合され得るか、又はプラスミドDNA内に含まれてプラスミド性と表現され得る。HMOの産生のために2種以上のグリコシルトランスフェラーゼ、例えばLNT又はLNnTが必要とされる場合、グリコシルトランスフェラーゼ活性を備える異なる酵素をコードする2つ以上の組み換え核酸、例えばLNTを産生するためにβ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ(第2のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第2の組み換え核酸と組み合わせたβ-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(第1のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第1の組み換え核酸)がゲノム内に組み込まれ得、且つ/又はプラスミドから発現され得、ここで、第1及び第2の組み換え核酸は、相互に独立して、染色体内又はプラスミド上に統合され得る。好ましい一実施形態では、第1及び第2の組み換え核酸は、産生細胞の染色体内に安定性で統合され;別の実施形態では、第1及び第2のグリコシルトランスフェラーゼの少なくとも一方は、プラスミド性である。グリコシルトランスフェラーゼ活性を備えるタンパク質/酵素(グリコシルトランスフェラーゼ)は、様々な実施形態では、α-1,2-フコシルトランスフェラーゼ、α-1,3-フコシルトランスフェラーゼ、α-1,3/4-フコシルトランスフェラーゼ、α-1,4-フコシルトランスフェラーゼ、α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ、α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ、β-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β-1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ及びβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼの活性を有する酵素から選択され得る。例えば、LNTの産生には、改変細胞が少なくとも2種のグリコシルトランスフェラーゼであるβ-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びβ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼを発現することを必要とし;LNnTの産生には、改変細胞が活性β-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及び活性β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼを発現することを必要とし;6’-SLの産生には、改変細胞は、活性α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ酵素を発現しなければならない。産生細胞に含まれる組み換え遺伝子によってコードされ得るグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質の幾つかの非限定的実施形態は、表1の非限定的例から選択され得る。
本発明の一態様は、配列番号1に示した主要ファシリテータースーパーファミリー(MFS)タンパク質又はそのアミノ酸配列が配列番号1と少なくとも80%同一であるその機能的ホモログである、糖輸送ができるタンパク質をコードする異種核酸配列を含む核酸構築物の提供であって、MFSタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号2との少なくとも70%の配列同一性を有する、核酸構築物の提供である。
用語「異種核酸配列」、「組み換え遺伝子/核酸/DNAコーディング」又は「コーディング核酸配列」は、適切な制御配列、即ちプロモーターの制御下に置かれた場合、mRNA内に転写されてポリペプチド内に翻訳される一連の連続的非重複三重項(コドン)を含む、人工的(即ち核酸配列を作成するために標準的な検査室方法を用いてインビトロで産生される)核酸配列を意味する。コーディング配列の境界は、一般に、mRNAの5’末端、翻訳開始コドン(AUG、GUG又はUUG)及び翻訳終止コドン(UAA、UGA又はUAG)のオープンリーディングフレームの直接上流に位置するリボソーム結合部位によって決定される。コーディング配列は、ゲノムDNA、cDNA、合成及び組み換え核酸配列を含み得るが、これらに限定されない。用語「核酸」には、RNA、DNA及びcDNA分子が含まれる。遺伝コードの縮重の結果として、所与のタンパク質をコードする複数のヌクレオチド配列が産生され得ると理解されている。用語「核酸」は、用語「ポリヌクレオチド」と互換的に使用される。「オリゴヌクレオチド」は、短鎖核酸分子である。「プライマー」は、プライマー伸長生成物の合成が誘導される条件(即ちヌクレオチド及びDNAポリメラーゼ等の誘導剤の存在下において且つ好適な温度及びpH)下に置かれた場合に合成の開始点として機能できる、精製制限消化物として自然に発生するか、又は核酸ストランドに対して相補的であるように合成的に生成されるかにかかわらず、オリゴヌクレオチドである。プライマーは、好ましくは、増幅における最大効率のための一本鎖であるが、代わりに二本鎖であり得る。二本鎖である場合、プライマーは、伸長生成物を調製するために使用される前に、最初にその鎖を分離するために処理される。好ましくは、プライマーは、デオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長生成物の合成を開始させるために十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源及び本方法の使用を含む多数の因子に依存するであろう。
本発明の組み換え核酸配列は、コーディングDNA配列、例えば遺伝子又は非コーディングDNA配列、例えばプロモーター配列等の調節DNAであり得る。本発明の一態様は、組み換え細胞であって、1種以上のHMOの産生のために必要な酵素をコードする組み換えDNA配列及びYberCトランスポーターをコードするDNA配列を含む組み換え細胞を提供することに関する。したがって、一実施形態では、本発明は、核酸構築物であって、コーディング核酸配列、即ち関心対象の遺伝子の組み換えDNA配列、例えばグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子若しくはyberC遺伝子及び非コーディングDNA配列、例えばプロモーターDNA配列、例えばlacオペロン若しくはglpオペロンのプロモーターに由来する組み換えプロモーター又は別のゲノムプロモーターDNA配列に由来するプロモーター配列或いは合成プロモーター配列を含む核酸構築物に関し、ここで、コーディング配列及びプロモーター配列は、作動可能に連結している。用語「作動可能に連結した」は、2個以上の核酸(例えば、DNA)断片間の機能的関係を指す。典型的には、それは、転写調節配列の転写配列との機能的関係を指す。例えば、プロモーター配列は、それが適切な宿主細胞又は他の発現系におけるコーディング配列の転写を刺激又は調節する場合、コーディング配列と作動可能に連結している。一般に、転写配列に作動可能に連結しているプロモーター転写調節配列は、転写配列に物理的に隣接しており、即ち、それらは、シス作用性である。
一実施形態では、本発明の核酸構築物は、ベクターDNAの一部であり得、別の実施形態では、構築物は、宿主細胞のゲノム内に統合されている発現カセット/カートリッジである。したがって、用語「核酸構築物」は、遺伝子の発現を改変するため又は構築物中に含まれ得る遺伝子/コーディングDNA配列を発現させるために、標的細胞、例えば細菌細胞内に「移植」されることが意図される、核酸の人工的に構築された断片、特に「DNA断片」を意味する。本発明に関連して、核酸構築物は、2つ以上の組み換えDNA配列:本質的に、プロモーターDNA配列を含む非コーディングDNA配列及び関心対象のタンパク質、例えばYberCタンパク質をコードするコーディングDNA配列、宿主細胞内のHMOの産生のために有用である別のタンパク質のグリコシルトランスフェラーゼを含む組み換えDNA配列を含有する。好ましくは、構築物は、構築物のコーディングDNAの転写又は翻訳の何れかを調節する非コーディングDNA配列、例えば転写産物へのリボソーム結合を促進するDNA配列、転写産物又は転写終結配列を安定化するリーディングDNA配列をさらに含む。
構築物(発現カセット)内に含まれる関心対象の組み換え核酸の細菌ゲノム内への統合は、従来方法により、例えばattTn7部位について記載されているように、染色体上の特異的部位に相同であるフランキング配列を含有する線状カートリッジを用いることにより(Waddell C.S.and Craig N.L.、Genes Dev.(1988)Feb;2(2):137-49.);組み換えがファージλのRedリコンビナーゼ機能又はRacプロファージのRecE/RecTリコンビナーゼ機能によって媒介される核酸配列のゲノム統合のための方法により(Murphy、J Bacteriol.(1998);180(8):2063-7;Zhang et al.、Nature Genetics(1998)20:123-128 Muyrers et al.、EMBO Rep.(2000)1(3):239-243);Red/ET組み換えに基づく方法により(Wenzel et al.、Chem Biol.(2005)、12(3):349-56.;Vetcher et al.、Appl Environ Microbiol.(2005);71(4):1829-35);又は陽性クローン、即ち例えばマーカー遺伝子又は遺伝子機能の損失若しくは獲得によって選択され得る発現カセットを運ぶクローンにより達成され得る。
関心対象の遺伝子を含む発現カセットの単一コピーは、本発明による所望のHMOの確実な産生及び所望の作用を達成するために十分であり得る。したがって、幾つかの好ましい実施形態では、本発明は、細胞のゲノムDNA内に統合された関心対象の遺伝子の1つ、2つ又は3つのコピーを含む組み換えHMO産生細胞に関する。幾つかの実施形態では、遺伝子の単一コピーが好ましい。
好ましい一実施形態では、本発明の核酸構築物の組み換えコーディング核酸配列は、プロモーターに関して異種であり、これは、起源の種のゲノム内の推定天然コーディング配列が別のプロモーター配列の制御下で転写されている(即ち構築物のプロモーター配列ではない)ことを意味する。さらに、宿主細胞に関して、コーディングDNAは、例えば、大腸菌(Escherichia coli)宿主細胞内で発現したYberCタンパク質をコードするDNA配列等の異種(即ち別の生物学的種若しくは属に由来する)又は例えばコラン酸オペロン(の遺伝子、GMAB遺伝子等の相同(即ち宿主細胞に由来する)であり得る。
用語「調節エレメント」、又は「プロモーター」、又は「プロモーター領域」、又は「プロモーターエレメント」は、転写の開始中にDNA依存性RNAポリメラーゼによって認識及び結合される核酸配列である。プロモーターは、他の転写及び翻訳調節核酸配列(「制御配列」とも呼ばれる)と一緒に、所与の遺伝子又は遺伝子の群(1つのオペロン)を発現するために必要である。一般に、転写及び翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列並びに転写エンハンサー又はアクチベーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。「転写開始部位」は、転写される第1ヌクレオチドを意味し、+1と指定される。開始部位の下流のヌクレオチドは、+2、+3、+4等とナンバリングされ、5’逆(上流)方向にあるヌクレオチドは、-1、-2、-3等とナンバリングされる。構築物のプロモーターDNA配列は、選択された種のゲノムの任意の遺伝子のプロモーター領域、好ましくは大腸菌(E.coli.)のゲノムDNAのプロモーター領域に由来し得る。したがって、RNAポリメラーゼに結合して転写を開始することができる任意のプロモーター領域DNA配列は、本発明を実施するために好適である。原則として、構築物の関心対象の組み換え核酸の転写を制御するために、任意のプロモーターDNA配列を使用することができ、宿主細胞のゲノム内又は発現ベクターDNA内に統合された関心対象の異なる遺伝子の転写を駆動するために、異なる又は同一のプロモーター配列を使用することができる。構築物中に含まれる組み換え遺伝子を最適に発現させるために、構築物は、さらなる調節配列、例えばリボソーム結合のための配列である大腸菌(E.coli)のglp遺伝子の5’非翻訳領域(5’UTR)に由来するDNA配列等、例えばリーディングDNA配列を含み得る。後者の配列の例は、国際公開第2019123324号パンフレット(参照により本明細書に組み込まれる)に記載され、本明細書の非限定的実施例に例示されている。
幾つかの好ましい実施形態では、本発明の構築物中に含まれる組み換え遺伝子の発現を調節するための調節エレメントは、glpFKXオペロンプロモーター、PglpFであり、他の好ましい実施形態では、プロモーターは、lacオペロンプロモーター、Placである。
さらなる態様では、本発明の構築物に含まれる組み換え遺伝子の発現を調節するための調節エレメントは、mglBACであり;ガラクトース/メチル-ガラクトシダーゼトランスポータープロモーターPmglB又は配列番号15のPmglB_70UTR又は配列番号16のPmglB_70UTR_SD4等のその変異体であるが、これらに限定されない。
さらなる態様では、本発明の構築物に含まれる組み換え遺伝子の発現を調節するための調節エレメントは、gatYZABCDであり;テガトース-1,6-ビスPアルドラーゼプロモーターPgatY又は配列番号17のPgatY_U70UTR等のその変異体であるが、これらに限定されない。
本発明の遺伝子改変細胞内及び/又は核酸構築物中に存在する好ましい調節エレメントは、PgatY_70UTR、PglpF、PglpF_SD1、PglpF_SD10、PglpF_SD2、PglpF_SD3、PglpF_SD4、PglpF_SD5、PglpF_SD6、PglpF_SD7、PglpF_SD8、PglpF_SD9、Plac_16UTR、Plac、PmglB_70UTR及びPmglB_70UTR_SD4からなる群から選択される。
本発明の遺伝子改変細胞内及び/又は核酸構築物中に存在する特に好ましい調節エレメントは、PglpF及びPlacからなる群から選択される。
幾つかの好ましい実施形態では、本発明の構築物中に含まれる組み換え遺伝子の発現を調節するための調節エレメントは、glpFKXオペロンプロモーター、PglpFであり、他の好ましい実施形態では、プロモーターは、lacオペロンプロモーター、Placである。しかしながら、宿主細胞内の1種以上のHMO、例えばグルコシルトランスフェラーゼの最適レベルの生合成産生を達成するために必要又は有益な何れかである1種以上のタンパク質(又は1種以上の調節核酸)、HMO若しくはHMO前駆体の膜貫通輸送に関係するタンパク質、遺伝子発現調節タンパク質等をコードする1種以上の組み換え核酸の転写及び/又は転写のレベルの調節を可能にし、且つ本発明による所望の作用を達成することを可能にする任意のプロモーターは、本発明を実施するために好適である。
好ましくは、宿主細胞中で発現した、HMO、プロモーターDNA配列及びリボソーム結合部位配列(例えば、シャイン・ダルガーノ(Shine-Dalgarno)配列等の他の調節配列の生合成産生に関連する遺伝子を含む本発明の構築物は、宿主細胞の懸濁液を含む1リットルの発酵培地の少なくとも0,03g/OD(光学密度)のレベル、例えばおよそ0.05g/l/OD、およそ0,1g/l/OD以上のレベルでのHMOの産生を可能にする。本発明のために、HMO産生の後者のレベルは、「十分である」又は「最適である」と見なされ、このレベルの所望のHMOを産生することができる宿主細胞は、「好適な宿主細胞」であると見なされ、即ち、細胞は、HMO産生のために有利である本明細書に記載した少なくとも1つの作用を達成するために、HMOトランスポータータンパク質、例えば「YberC」を発現するようにさらにさらに改変され得る。
遺伝子改変細胞(宿主細胞又は組み換え細胞)は、例えば、細菌細胞又は酵母細胞であり得る。好ましい一実施形態では、遺伝子改変細胞は、細菌細胞である。細菌宿主細胞に関して、原則としては、制限なく、それらが関心対象の遺伝子を挿入するために遺伝子操作を許容する限り、それらは、真正細菌(グラム陽性若しくはグラム陰性)又は古細菌であり得、製造規模で培養することができる。好ましくは、宿主細胞は、高細胞密度への培養を許容する特性を有する。本発明によるHMOの工業的組み換え産生のために好適である細菌宿主細胞の非限定的例は、エルウィニア・ヘルビコラ(Erwinia herbicola)(パントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans))、シトロバクター・フロインジイ(Citrobacter freundii)、パントエア・シトレア(Pantoea citrea)、ペクトバクテリウム・カロトボルム(Pectobacterium carotovorum)又はキサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)であり得る。枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・コアギュランス(Bacillus coagulans)、バチルス・サーモフィルス(Bacillus thermophilus)、バチルス・ラテロスポルス(Bacillus laterosporus)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・ミコイデス(Bacillus mycoides)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・レンツス(Bacillus lentus)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)及びバチルス・サーキュサンス(Bacillus circulans)を含むバチルス属(genus Bacillus)の細菌も使用することができる。同様に、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ヘルベチクス(Lactobacillus helveticus)、ラクトバチルス・デルブリュッキイ(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・ブルガリクス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトバチルス・クリスパツス(Lactobacillus crispatus)、ラクトバチルス・ガセリ(Lactobacillus gasseri)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、ラクトバチルス・ジェンセニイ(Lactobacillus jensenii)及びラクトバチルス・ラクティス(Lactococcus lactis)含むが、これらに限定されないラクトバチルス(Lactobacillus)属及びラクトコッカス(Lactococcus)属の細菌は、本発明の方法を用いて改変され得る。ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophiles)及びプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ(Proprionibacterium freudenreichii)も、本明細書に記載した本発明のための好適な細菌種である。本発明の一部としてさらに含まれるのは、エンテロコッカス属(genera Enterococcus)(例えば、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)及びエンテロコッカス・サーモフィルス(Enterococcus thermophiles))、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)(例えば、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis)及びビフィドバクテリウム・ビフィズム(Bifidobacterium bifidum))、スポロラクトバチルス種(Sporolactobacillus spp.)、ミクロモモスポラ種(Micromomospora spp.)、ミクロコッカス種(Micrococcus spp.)、ロドコッカス種(Rhodococcus spp.)及びシュードモナス種(Pseudomonas)(例えば、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)及び緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa))からの、本明細書に記載したように改変された菌株である。本明細書に記載した特徴を含む細菌は、ラクトース及び細胞によって産生されたHMO等のオリゴ糖の存在下で培養され、細菌自体又は細菌の培養上清の何れかから回収される。好ましい一実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞は、大腸菌(Escherichia coli)細胞である。
別の好ましい実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞、例えばサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセル・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、クルベロミセス・ラクティス(Kluveromyces lactis)、クルベロミセス・マルシアヌス(Kluveromyces marxianus)等である。
本発明の組み換え細胞によって産生されるHMOは、当技術分野において利用できる好適な手法を用いて精製することができる(例えば、国際公開第2015188834号パンフレット、同第2017182965号パンフレット又は同第2017152918号パンフレットに記載されている)。
本発明の遺伝子改変細胞は、例えば、Sambrook et al.,Wilson&Walker,“Maniatise et al.,and Ausubel et al.による要覧に記載されたもの等、当技術分野の標準方法を用いて提供され得る。
HMO産生のために好適である宿主細胞、例えば大腸菌(E.coli)は、内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子又は外因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子を含み得、例えば、大腸菌(E.coli)は、内因性lacZ遺伝子(例えば、GenBankアクセッション番号V00296(GI:41901))を含む。本発明のために、HMO産生細胞は、任意のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を含むか、又はこの遺伝子の不活性化バージョンを含むかの何れかであるように遺伝子操作されている。遺伝子は、細菌ゲノム由来の対応する核酸配列の完全若しくは部分欠失によって不活性化され得るか、又は遺伝子配列は、それが転写される方法で突然変異されるか、又は転写されると、転写産物は、翻訳されないか、又はタンパク質(即ちβ-ガラクトシダーゼ)に翻訳されると、そのタンパク質は、対応する酵素活性を有していない。このように、HMO産生細胞は、HMOの産生のために有益である増加した細胞内ラクトースプールを蓄積する。
幾つかの実施形態では、繁殖した細胞は、欠損性シアル酸異化経路を含有する。「シアル酸代謝経路」は、シアル酸の分解を生じさせる、通常、酵素によって制御され、触媒される一連の反応を意味する。本明細書に記載した典型的なシアル酸代謝経路は、大腸菌(E.coli)経路である。この経路において、シアル酸(Neu5Ac;N-アセチルノイラミン酸)は、全部がnanATEK-yhcHオペロンからコードされ、NanRによって抑制される酵素のNanA(N-アセチルノイラミン酸リアーゼ)及びNanK(N-アセチルマンノサミンキナーゼ)及びNanE(N-アセチルマンノサミン-6-リン酸エピメラーゼ)によって分解される(http://ecocyc.org/ECOLI)。欠損性シアル酸代謝経路は、内因性nanA(N-アセチルノイラミン酸リアーゼ)(例えば、GenBankアクセッション番号D00067.1(GL216588))及び/又はnanK(N-アセチルマンノサミンキナーゼ)遺伝子(例えば、参照により本明細書に組み込まれた、GenBankアクセッション番号(アミノ酸)BAE77265.1(GL85676015))及び/又はnanE(N-アセチルマンノサミン-6-リン酸エピメラーゼ、GI:947745)内に突然変異を導入することにより、大腸菌(E.coli)宿主内に提供される。任意選択的に、nanT(N-アセチルノイラミン酸塩トランスポーター)遺伝子も不活化又は突然変異される。シアル酸代謝作用の他の中間体としては、(ManNAc-6-P)N-アセチルマンノサミン-6-リン酸塩;(GlcNAc-6-P)N-アセチルグルコサミン-6-リン酸塩;(GlcN-6-P)グルコサミン-6-リン酸塩及び(Fruc-6-P)フルクトース-6-リン酸塩が挙げられる。幾つかの好ましい実施形態では、nanAは、突然変異している。他の好ましい実施形態では、nanA及びnanKは突然変異している一方、nanEは、機能的なままである。別の好ましい実施形態では、nanA及びnanEは突然変異している一方、nanKは、突然変異、不活化又は欠失していない。突然変異は、nanA、nanK、nanE及び/又はnanTの遺伝子産物をコードする核酸配列内の1つ以上の変化である。例えば、突然変異は、核酸配列内の1個、2個、5個まで、10個まで、25個まで、50個まで又は100個までの変化であり得る。例えば、nanA、nanK、nanE及び/又はnanT遺伝子は、ヌル突然変異によって突然変異している。本明細書に記載したヌル突然変異は、酵素の機能の消失(即ち活性の減少若しくは活性なし)又は酵素の消失(即ち遺伝子産物なし)の何れかを誘発する、アミノ酸の置換、付加、欠失又は挿入を含む。「欠失した」は、コーディング領域が、(機能的)遺伝子産物が産生しないように、完全に又は部分的に除去されていることを意味する。「不活化された」は、コーディング配列が、生じた遺伝子産物が機能的に不活性であるか、又は自然、天然型、内因性遺伝子産物の活性の100%未満、例えば90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%若しくは20%を備える遺伝子産物をコードするように変化されていることを意味する。「非突然変異」遺伝子又はタンパク質は、自然、天然型、内因性コーディング配列と1個、2個、5個まで、10個まで、20個まで、50個まで、100個まで、200個まで若しくは500個以上までのコドンから、又は対応するコードされたアミノ酸配列と相違しないことを意味する。
さらに、宿主細胞(例えば、大腸菌(E.coli))は、シアル酸合成能力も含む。例えば、この細菌は、外因性UDP-GlcNAc2-エピメラーゼ(例えば、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)のneuC(GenBank AAK91727.1;GL15193223)若しくは均等物(例えば、大腸菌(E.coli)S88のneuC(GenBank YP_002392936.1;GI:218560023)、Neu5Acシンターゼ(例えば、C.ジェジュニ(C.jejuni)のneuB(GenBank AAK91726.1;GI:15193222)若しくは均等物(例えば、フラボバクテリウム・リムノセディミニス(Flavobacterium limnosediminis)シアル酸シンターゼ、GenBank GL559220424)及び/又はCMP-Neu5Acシンテターゼ(例えば、C.ジェジュニ(C.jejuni)のneuA(GenBank AAK91728.1;GI:15193224)若しくは均等物(例えば、ビブリオ・ブラシリエンシス(Vibrio brasiliensis)CMP-シアル酸シンターゼ、GenBank GI:493937153)の提供を通してシアル酸合成能力を含む。
遺伝子操作した細菌及び酵母中での天然N-アセチルグルコサミン含有HMOの産生は、当技術分野において知られている(例えば、Gebus C et al.(2012)Carbohydrate Research 363 83-90;米国特許第10,519,475号明細書を参照されたい)。
例えば、ラクト-N-トリオース2(LNT-2)、ラクト-N-テトラオース(LNT)、ラクト-N-ネオテトラオース(LNnT)、ラクト-N-フコペンタオースI(LNFP-I)、ラクト-N-フコペンタオースII(LNFP-II)、ラクト-N-フコペンタオースIII(LNFP-III)、ラクト-N-フコペンタオースV(LNFP-V)、ラクト-N-ジフコヘキサオースI(LDFH-I)、ラクト-N-ジフコヘキサオースII(LDFH-II)及びラクト-N-ネオジフコヘキサオースII(LNDFH-III)等のN-アセチルグルコサミン含有HMOの産生のために、この細菌は、上述したような機能性lacY及び機能不全性lacZ遺伝子を含むが、これは、外因性UDP-GlcNAc:Galα/β-R β-3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子又はその機能的変異体若しくは断片を含むように遺伝子操作されている。この外因性UDP-GlcNAc:Galα/β-R β-3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子は、多数の供給源(表1を参照されたい)の何れか1つ、例えば髄膜炎菌(N.meningitidis)(Genbankタンパク質アクセッション番号AAF42258.1)又は淋菌(N.gonorrhoeae)(Genbankタンパク質アクセッション番号ACF31229.1)から記載されたlgtA遺伝子から得ることができる。任意選択的に、追加の外因性グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、外因性UDP-GlcNAc:Galα/β-R β-3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを含む細菌内で共発現することができる。例えば、β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ((Gal4T)遺伝子は、UDP-GlcNAc:Galα/β-R β-3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子と共発現する。この外因性β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、多数の供給源の任意の1つ、例えば髄膜炎菌(N.meningitidis)から記載された1種であるlgtB遺伝子(Genbankタンパク質アクセッション番号AAF42257.1)又はH.ピロリ(H.pylori)から記載された1種であるHP0826/galT遺伝子(Genbankタンパク質アクセッション番号NP_207619.1)から得ることができる。任意選択的に、外因性UDP-GlcNAc:Galα/β-R β-3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(Gal3T)遺伝子を含む細菌内で共発現した追加の外因性グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、例えば、大腸菌(E.coli)055:H7から記載された、wbgO遺伝子(Genbankタンパク質アクセッション番号WP_000582563.1)、P-l,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、又はH.ピロリ(H.pylori)からのjhp0563遺伝子(Genbankタンパク質アクセッション番号AEZ55696.1)、又はストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)からのIb型OI2のcpslBJ遺伝子(Genbankタンパク質アクセッション番号AB050723)である。上述した酵素の何れかの機能的変異体及び断片も、開示した本発明に含まれる。
N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子及び/又はガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子もPglpに作動可能に連結することができ、対応するゲノム統合カセットから発現され得る。一実施形態では、ゲノム統合されている遺伝子は、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、例えばH.ピロリ(H.pylori)(Genbankタンパク質アクセッション番号NP_207619.1)由来のGalT酵素をコードするHP0826遺伝子であり;別の実施形態では、ゲノム統合されている遺伝子は、β-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、例えば髄膜炎菌(N.meningitidis)(Genbankタンパク質アクセッション番号AAF42258.1)由来のlgtA遺伝子である。これらの実施形態では、第2の遺伝子、即ち対応するβ-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ又はガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、ゲノム統合又はプラスミド性カセットの何れかから発現され得る。第2の遺伝子は、任意選択的に、glpプロモーターの制御下又は発現系にとって好適である任意の他のプロモーター、例えばPlacの制御下の何れかで発現させることができる。
他に規定されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。Singleton et al.(1994)Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,second edition,John Wiley and Sons(New York)は、当業者に、本発明において使用する多数の用語の一般的辞書を提供する。本明細書に記載したものと類似の又は均等な任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用できるが、以下では、好ましい材料及び方法について記載する。本出願において必要とされる殆どの命名法及び一般的検査手法は、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(2012);Wilson K.and Walker J.,Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology(2010),Cambridge University Press;又はManiatise et al.,Molecular Cloning A laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(2012);又はAusubel et al.,Current protocols in molecular biology,John Wiley and Sohns(2010)に見出すことができる。これらの手引書は、以下では、それぞれ対応して「Sambrook et al.」、「Wilson&Walker」、「Maniatise et al.」、「Ausubel et al.」と呼ぶ。
本発明の第2の態様は、1種以上のHMOの産生のための方法であって、
(i)HMOを産生することができる遺伝子改変細胞であって、配列番号1のタンパク質をコードする組み換え核酸又は配列番号1と少なくとも80%同一である、好ましくは少なくとも85%同一である、より好ましくは少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを含む遺伝子改変細胞を提供する工程;
(ii)前記組み換え核酸を発現するための好適な細胞培養培地中において、(i)の細胞を培養する工程;
(iii)工程(ii)において産生された1種以上のHMOを採取する工程
を含む方法に関する。
(i)HMOを産生することができる遺伝子改変細胞であって、配列番号1のタンパク質をコードする組み換え核酸又は配列番号1と少なくとも80%同一である、好ましくは少なくとも85%同一である、より好ましくは少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを含む遺伝子改変細胞を提供する工程;
(ii)前記組み換え核酸を発現するための好適な細胞培養培地中において、(i)の細胞を培養する工程;
(iii)工程(ii)において産生された1種以上のHMOを採取する工程
を含む方法に関する。
本発明によると、用語「培養する(culturing)」(又は「培養する(cultivating)」、又は「培養」、又は「発酵」とも呼ばれる)は、当産業において知られている方法に従った制御されたバイオリアクター内での細菌発現細胞の増殖に関する。
1種以上のHMOを産生させるために、本明細書に記載したHMO産生細菌は、当技術分野において知られている手法に従い、好適な炭素源、例えばグルコース、グリセロール、ラクトース等の存在下で培養され、産生したHMOは、培養培地及び培養プロセス中に形成される微生物バイオマスから採取される。その後、HMOは、当技術分野において知られている手法、例えば国際公開第2015188834号パンフレット、同第2017182965号パンフレット又は同第2017152918号パンフレットに記載されている等の手法に従って精製され、精製されたHMOは、その後、栄養補助食品、医薬品として又は例えば研究用等の任意の他の目的に使用される。HMOの製造は、典型的には、大量で培養を実施することによって実施される。本発明の意味における用語「製造する工程」及び「製造規模」は、最小体積が5Lの培養ブロスを用いた発酵を規定する。通常、「製造規模」プロセスは、関心対象の1種以上のHMOを含有する大量の調製を処理でき、例えば治療用化合物又は組成物の場合、臨床試験並びに市場供給の需要を満たす量の対象のタンパク質を産生することができることによって規定される。大量に加えて、製造規模の方法は、振とうフラスコによる培養のような単純な検査室規模の方法とは対照的に、撹拌、通気、栄養素供給、プロセスパラメーター(pH、温度、溶存酸素圧、背圧等)のモニタリング及び制御のための機器を装備しているバイオリアクター(発酵槽)の技術システムの使用を特徴とする。大体において、例えば、本開示の実施例において記載した振とうフラスコ、卓上バイオリアクター又はディープウエルフォーマット等の検査室規模の方法における発現系の挙動は、バイオリアクターの複雑な環境におけるそのシステムの挙動の予測することを許容する。
発酵プロセスにおいて使用される好適な培養培地に関しては、制限がない。培養培地は、半規定、即ち複雑な培地化合物(例えば、酵母抽出物、大豆ペプトン、カザミノ酸等)であり得るか、又は何の複雑な化合物も含めずに化学的に規定され得る。
用語「1種以上のHMO」は、HMO産生細胞が単一のHMO構造(第1のHMO)又は複数のHMO構造(第2、第3等のHMO)を産生することができる可能性があることを意味する。幾つかの実施形態では、単一のHMOを産生する宿主細胞が好ましい可能性があり、他の好ましい実施形態では、複数のHMO構造を産生する宿主細胞が好ましい可能性がある。単一のHMO構造を産生する宿主細胞についての非限定的例は、3’-SL、6’-SL又はLNT-2産生細胞である。複数のHMO構造を産生することができる宿主細胞の非限定的例は、FSL、LNT、LNnT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP IV、LNFP V、pLNnH、pLNH-II産生細胞であり得る。
本発明に関連して、用語「採取する」は、発酵の終了に続いて産生したHMOを収集することに関する。異なる実施形態では、それは、バイオマス(即ち宿主細胞)及び培養培地の両方に含まれる、即ちバイオマスからの発酵ブロスの分離前に/分離せずにHMOを収集することを含み得る。他の実施形態では、産生したHMOは、バイオマス及び発酵ブロスから個別に、即ち培養培地(即ち発酵ブロス)からの分離後/分離に続いて収集され得る。培地からの細胞の分離は、当業者に周知の方法、例えば任意の好適なタイプの遠心又は濾過の何れかを用いて実施することができる。培地からの細胞の分離は、発酵ブロスの採取直後に実施することができるか、又は適切な条件で発酵ブロスを貯蔵した後の段階に実施することができる。残留しているバイオマス(又は全発酵)からの産生したHMOの回収には、バイオマス(即ち産生細胞)からの抽出が含まれる。これは、当技術分野の任意の好適な方法により、例えば音波処理、沸騰、均質化、リゾチームを用いる酵素的溶解又は凍結及び破砕により実施することができる。
発酵からの回収後、HMOは、さらなる加工処理及び精製のために利用できる。
発酵によって産生したHMOの精製は、国際公開第2016095924号パンフレット、同第2015188834号パンフレット、同第2017152918号パンフレット、同第2017182965号パンフレット、同第20190119314号パンフレット(全部が参照により組み込まれる)に記載された好適な手法を用いて実施することができる。
本発明の幾つかの実施形態では、宿主細胞は、数種のHMOを産生することができ、ここで、1種のHMOは、「生成物」HMOであり、幾つか/全部の他のHMOは、「副生成物」HMOである。典型的には、副生成物HMOは、主要HMOの前駆体又は主要HMOのさらなる改変の生成物の何れかである。幾つかの実施形態では、富裕な量で生成物HMOを、且つ少量で副生成物HMOを産生することが望ましい。本明細書に記載したHMO産生のための細胞及び方法は、規定のHMOプロファイルを備えるHMO生成物の制御された産生、例えば、一実施形態では、生成物HMOは、混合物の他のHMO(即ち副生成物HMO)と比較して優勢なHMOであるHMO混合物の産生を許容し、即ち、生成物HMOは、他の副生成物HMOより多量で産生し;他の実施形態では、同一HMO混合物を産生する細胞は、生成物HMOより多量である1つ又は複数の副生成物HMOを産生するように調整することができる。例えば、生成物HMOであるLNnTの産生中、副生成物HMO、多くの場合に有意な量のpLNnHが産生する。本発明の遺伝子改変細胞について、LNnT生成物中のpLNnHのレベルは、有意に減少させることができる。
有利には、本発明は、副生成物対生成物の減少した比率及び生成物(及び/又は総計でのHMO)の増加した全収率の両方を提供する。この生成物形成と比較して少ない副生成物形成は、生成物産生の増加を促進し、産生及び生成物回収プロセスの両方の効率を上昇させ、HMOの優れた製造手法を提供する。
異なる好ましい実施形態では、生成物HMO又は副生成物HMOとして、3’-SL、6’-SL、LNT-2、FSL、LNT、LNnT、DFL、FSL、LNT、LNnT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP IV、LNFP V、pLNnH、pLNH-IIの何れか/両方を産生する様々な宿主細胞を選択することができる。好ましい一実施形態では、生成物は、LNT-2であり、副生成物は、pLNnHである。別の好ましい実施形態では、生成物は、LNnTであり、副生成物は、pLNnHである。別の好ましい実施形態では、生成物は、LNTであり、副生成物は、pLNH-IIである。別の好ましい実施形態では、生成物は、LNT2であり、副生成物は、pLNH-IIである。
本発明は、1種以上のオリゴ糖、好ましくは1種以上のヒトミルクオリゴ糖の産生のための、本発明による遺伝子改変細胞及び/又は核酸構築物の使用にさらに関する。
一実施形態では、本発明による遺伝子改変細胞及び/又は核酸構築物は、3’-シアリルラクトース(3’-SL)、6’-シアリルラクトース(6’-SL)、ラクト-N-トリオース-2(LNT-2)、ラクト-N-テトラオース(LNT)、ラクト-N-ネオテトラオース(LNnT)、ラクト-N-フコペンタオースI(LNFP I)、ラクト-N-フコペンタオースII(LNFP II)、ラクト-N-フコペンタオースIII(LNFP III)、ラクト-N-フコペンタオースIV(LNFP IV)及びラクト-N-フコペンタオースV(LNFP V)、パラ-ラクト-N-ネオヘキサオース(pLNnH)並びにパラ-ラクト-ネオヘキサオースII(pLNH-II)からなる群から選択される特異的HMOの産生に使用される。
好ましい実施形態では、本発明による遺伝子改変細胞及び/又は核酸構築物は、ラクト-N-トリオース-2(LNT-2)、ラクト-N-テトラオース(LNT)、ラクト-N-ネオテトラオース(LNnT)、ラクト-N-フコペンタオースI(LNFP I)、ラクト-N-フコペンタオースII(LNFP II)、ラクト-N-フコペンタオースIII(LNFP III)、ラクト-N-フコペンタオースIV(LNFP IV)及びラクト-N-フコペンタオースV(LNFP V)、パラ-ラクト-N-ネオヘキサオース(pLNnH)並びにパラ-ラクト-ネオヘキサオースII(pLNH-II)からなる群から選択される特異的HMOの産生に使用される。
さらに好ましい実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞及び/又は核酸構築物は、ラクト-N-トリオース-2(LNT-2)、ラクト-N-テトラオース(LNT)、ラクト-N-ネオテトラオース(LNnT)及びパラ-ラクト-ネオヘキサオースII(pLNH-II)からなる群から選択されるHMOの産生に使用される。
特に好ましい実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞及び/又は核酸構築物は、ラクト-N-トリオース-2(LNT-2)、ラクト-N-テトラオース(LNT)及びラクト-N-ネオテトラオース(LNnT)からなる群から選択される特異的HMOの産生に使用される。
以下では、本発明を非限定的実施例及び実施形態によってさらに例示する。
[実施例]
[材料及び方法]
他に明記しない限り、分子生物学の分野において知られている標準的な技術、ベクター、制御配列エレメント及び他の発現系エレメントは、核酸の操作、形質転換及び発現のために使用される。そのような標準的な技術、ベクター及びエレメントは、例えば、Ausubel et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology(1995)(John Wiley&Sons);Sambrook,Fritsch,&Maniatis(eds.),Molecular Cloning(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY);Berger&Kimmel,Methods in Enzymology 152:Guide to Molecular Cloning Techniques(1987)(Academic Press);Bukhari et al.(eds.),DNA Insertion Elements,Plasmids and Episomes(1977)(Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY);Miller,J.H.Experiments in molecular genetics(1972.)(Cold spring Harbor Laboratory Press,NY)に見出すことができる。
[材料及び方法]
他に明記しない限り、分子生物学の分野において知られている標準的な技術、ベクター、制御配列エレメント及び他の発現系エレメントは、核酸の操作、形質転換及び発現のために使用される。そのような標準的な技術、ベクター及びエレメントは、例えば、Ausubel et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology(1995)(John Wiley&Sons);Sambrook,Fritsch,&Maniatis(eds.),Molecular Cloning(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY);Berger&Kimmel,Methods in Enzymology 152:Guide to Molecular Cloning Techniques(1987)(Academic Press);Bukhari et al.(eds.),DNA Insertion Elements,Plasmids and Episomes(1977)(Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY);Miller,J.H.Experiments in molecular genetics(1972.)(Cold spring Harbor Laboratory Press,NY)に見出すことができる。
以下に記載する実施形態は、本発明を例示するために選択されたものであり、決して本発明を限定するものではない。
[菌株]
使用した細菌株であるMDOは、大腸菌(Escherichia coli)K12 DH1から構築した。大腸菌(E.coli)K12 DH1の遺伝子型は、F-、人-、gyrA96、recA1、relA1、endA1、thi-1、hsdR17、supE44である。本実施例で利用した菌株は、表2に記載した。
使用した細菌株であるMDOは、大腸菌(Escherichia coli)K12 DH1から構築した。大腸菌(E.coli)K12 DH1の遺伝子型は、F-、人-、gyrA96、recA1、relA1、endA1、thi-1、hsdR17、supE44である。本実施例で利用した菌株は、表2に記載した。
[培地]
ルリアブロス(LB)培地は、LBブロス粉末、Millers(Fisher Scientific)を用いて作成し、LB寒天プレートは、LB寒天粉末、Millers(Fisher Scientific)を用いて作成した。適切な場合、アンピシリン((100μg/mL)若しくは任意の適切な抗生物質)及び/又はクロラムフェニコール(20μg/ml)を添加した。
ルリアブロス(LB)培地は、LBブロス粉末、Millers(Fisher Scientific)を用いて作成し、LB寒天プレートは、LB寒天粉末、Millers(Fisher Scientific)を用いて作成した。適切な場合、アンピシリン((100μg/mL)若しくは任意の適切な抗生物質)及び/又はクロラムフェニコール(20μg/ml)を添加した。
基礎最少培地は、以下の組成を有していた:NaOH(1g/L)、KOH(2.5g/L)、KH2PO4(7g/L)、NH4H2PO4(7g/L)、クエン酸(0.5g/l)、微量ミネラル溶液(5mL/L)。微量ミネラルストック液は、ZnSO4
*7H2O 0.82g/L、クエン酸 20g/L、MnSO4
*H2O 0.98g/L、FeSO4
*7H2O 3.925g/L、CuSO4
*5H2O 0.2g/Lを含有していた。基礎最少培地のpHは、5NのNaOHを用いて7.0に調整し、オートクレーブにかけた。接種前に、基礎最少培地に1mMのMgSO4、4μg/mlのチアミン、0.5%の所与の炭素源(グリセロール(Carbosynth))を供給し、適切な場合、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)(0.2mM)を添加した。チアミン、抗生物質及びIPTGは、濾過により滅菌した。全てのパーセンテージでの濃度は、グリセロールについて体積/体積として、グルコースについて重量/体積として表示した。
2-デオキシ-ガラクトースを含有するM9プレートは、以下の組成を有していた:15g/Lの寒天(Fisher Scientific)、2.26g/Lの5×M9最小塩(Sigma-Aldrich)、2mMのMgSO4、4μg/mLのチアミン、0.2%のグリセロール及び0.2%の2-デオキシ-D-ガラクトース(Carbosynth)。
MacConkeyインジケータープレートは、以下の組成を有していた:40g/LのMacConkey寒天ベース(BD Difco(商標))及び最終濃度1%の炭素源。
[培養]
他に明記しない限り、大腸菌(E.coli)菌株は、0.2%のグルコースを含有する37℃のルリア・ベルターニ(Luria-Bertani)(LB)培地中で撹拌しながら増殖させた。寒天プレートは、37℃で一晩インキュベートした。
他に明記しない限り、大腸菌(E.coli)菌株は、0.2%のグルコースを含有する37℃のルリア・ベルターニ(Luria-Bertani)(LB)培地中で撹拌しながら増殖させた。寒天プレートは、37℃で一晩インキュベートした。
[化学的コンピテント細胞及び形質転換]
大腸菌(E.coli)は、LBプレートから、OD600が約0.4になるまで37℃で振とうしながら、0.2%のグルコースを含有する5mLのLB内で接種した。13000gで25秒間にわたる遠心分離により、2mLの培養を採取した。上清を除去し、細胞ペレットを600μLの低温TB溶液(10mMのPIPES、15mMのCaCl2、250mMのKCl)に再懸濁させた。細胞を氷上で20分間インキュベートし、その後、13000gで15秒間、ペレット化した。上清を除去し、細胞ペレットを100μLの低温TB溶液に再懸濁させた。プラスミドの形質転換は、100μLのコンピテント細胞及び1~10ngのプラスミドDNAを用いて実施した。細胞及びDNAは、氷上で20分間インキュベートし、その後、42℃で45秒間、熱ショックを与えた。氷上での2分間のインキュベーション後、400μLのSOC(20g/Lのトリプトン、5g/Lの酵母抽出物、0.5g/LのNaCl、0.186g/LのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4及び20mMのグルコース)を添加し、細胞培養を1時間にわたり振とうしながら37℃でインキュベートし、その後、選択プレート上にプレーティングした。
大腸菌(E.coli)は、LBプレートから、OD600が約0.4になるまで37℃で振とうしながら、0.2%のグルコースを含有する5mLのLB内で接種した。13000gで25秒間にわたる遠心分離により、2mLの培養を採取した。上清を除去し、細胞ペレットを600μLの低温TB溶液(10mMのPIPES、15mMのCaCl2、250mMのKCl)に再懸濁させた。細胞を氷上で20分間インキュベートし、その後、13000gで15秒間、ペレット化した。上清を除去し、細胞ペレットを100μLの低温TB溶液に再懸濁させた。プラスミドの形質転換は、100μLのコンピテント細胞及び1~10ngのプラスミドDNAを用いて実施した。細胞及びDNAは、氷上で20分間インキュベートし、その後、42℃で45秒間、熱ショックを与えた。氷上での2分間のインキュベーション後、400μLのSOC(20g/Lのトリプトン、5g/Lの酵母抽出物、0.5g/LのNaCl、0.186g/LのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4及び20mMのグルコース)を添加し、細胞培養を1時間にわたり振とうしながら37℃でインキュベートし、その後、選択プレート上にプレーティングした。
プラスミドは、供給業者(ThermoFisher Scientific)によって推奨された条件において、TOP10化学的コンピテント細胞に形質転換させた。
[DNA技術]
大腸菌(E.coli)由来のプラスミドDNAは、QIAprepスピンミニプレップキット(Qiagen)を用いて単離した。大腸菌(E.coli)由来の染色体DNAは、QIAmp DNAミニキット(Qiagen)を用いて単離した。PCR産物は、QIAquick PCR精製キット(Qiagen)を用いて精製した。DreamTaq PCRマスターミックス(Thermofisher)、Phusion UホットスタートPCRマスターミックス(Thermofisher)、USER酵素(New England Biolab)は、供給業者によって推奨されたとおりに使用した。プライマーは、Eurofins Genomics、Germanyによって供給された。PCR断片及びプラスミドは、Eurofins Genomicsによってシーケンシングされた。コロニーPCRは、T100(商標)サーマルサイクラー(Bio-Rad)内のDreamTaq PCRマスターミックスを用いて実施した。
大腸菌(E.coli)由来のプラスミドDNAは、QIAprepスピンミニプレップキット(Qiagen)を用いて単離した。大腸菌(E.coli)由来の染色体DNAは、QIAmp DNAミニキット(Qiagen)を用いて単離した。PCR産物は、QIAquick PCR精製キット(Qiagen)を用いて精製した。DreamTaq PCRマスターミックス(Thermofisher)、Phusion UホットスタートPCRマスターミックス(Thermofisher)、USER酵素(New England Biolab)は、供給業者によって推奨されたとおりに使用した。プライマーは、Eurofins Genomics、Germanyによって供給された。PCR断片及びプラスミドは、Eurofins Genomicsによってシーケンシングされた。コロニーPCRは、T100(商標)サーマルサイクラー(Bio-Rad)内のDreamTaq PCRマスターミックスを用いて実施した。
[プラスミドの構築]
大腸菌(E.coli)ゲノム内への相同組み換えのために適切な2個のDNA断片によって分離された2つのI-SceIエンドヌクレアーゼ部位及びT1転写終結配列を含有するプラスミド主鎖を合成した。例えば、1本のプラスミド主鎖では、galオペロン(galKにおける相同組み換えのために必要とされる)及びT1転写終結配列(pUC57::gal)を合成した(GeneScript)。galオペロン内の相同組み換えのために使用されるDNA配列は、配列の大腸菌(Escherichia coli)K-12 MG155完全ゲノム(GenBank:ID:CP014225.1)内で塩基対3.628.621~3.628.720及び3.627.572~3.627.671をカバーした。相同組み換えによる挿入は、galK及びgalK-表現型の949塩基対の欠失を生じさせるであろう。同様の方法で、pUC57(GeneScript)に基づく主鎖又は大腸菌(E.coli)ゲノム内への相同組み換えのために適切な2個のDNA断片によって分離された2つのI-SceIエンドヌクレアーゼ部位及びT1転写終結配列を含有する任意の他の適切なベクターを合成することができるであろう。大腸菌(Escherichia coli)K-12 DH1染色体DNAの特異的DNA配列のプライマーの設計及び増幅のために、分子生物学の分野において周知の標準技術を使用した。そのような標準的な技術、ベクター及びエレメントは、例えば、Ausubel et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology(1995)(John Wiley&Sons);Sambrook,Fritsch,&Maniatis(eds.),Molecular Cloning(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY);Berger&Kimmel,Methods in Enzymology 152:Guide to Molecular Cloning Techniques(1987)(Academic Press);Bukhari et al.(eds.)に見出すことができる。
大腸菌(E.coli)ゲノム内への相同組み換えのために適切な2個のDNA断片によって分離された2つのI-SceIエンドヌクレアーゼ部位及びT1転写終結配列を含有するプラスミド主鎖を合成した。例えば、1本のプラスミド主鎖では、galオペロン(galKにおける相同組み換えのために必要とされる)及びT1転写終結配列(pUC57::gal)を合成した(GeneScript)。galオペロン内の相同組み換えのために使用されるDNA配列は、配列の大腸菌(Escherichia coli)K-12 MG155完全ゲノム(GenBank:ID:CP014225.1)内で塩基対3.628.621~3.628.720及び3.627.572~3.627.671をカバーした。相同組み換えによる挿入は、galK及びgalK-表現型の949塩基対の欠失を生じさせるであろう。同様の方法で、pUC57(GeneScript)に基づく主鎖又は大腸菌(E.coli)ゲノム内への相同組み換えのために適切な2個のDNA断片によって分離された2つのI-SceIエンドヌクレアーゼ部位及びT1転写終結配列を含有する任意の他の適切なベクターを合成することができるであろう。大腸菌(Escherichia coli)K-12 DH1染色体DNAの特異的DNA配列のプライマーの設計及び増幅のために、分子生物学の分野において周知の標準技術を使用した。そのような標準的な技術、ベクター及びエレメントは、例えば、Ausubel et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology(1995)(John Wiley&Sons);Sambrook,Fritsch,&Maniatis(eds.),Molecular Cloning(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY);Berger&Kimmel,Methods in Enzymology 152:Guide to Molecular Cloning Techniques(1987)(Academic Press);Bukhari et al.(eds.)に見出すことができる。
大腸菌(E.coli)DH1から得られた染色体DNAを使用して、オリゴO261及びO262を用いてプロモーターPglpFを含有する300bpのDNA断片並びにオリゴO68及びO113を用いてPlacを含有する195bpのDNA断片を増幅させた(表3)。
エルニシア・ベルコビエリ(Yersinia bercovieri)に由来するyberC0001_9420遺伝子のコドン最適化バージョンを含有する1.182bpのDNA断片は、GeneScriptによって合成した(表5)。yberC0001_9420遺伝子は、オリゴであるKABY721及びKABY722遺伝子を用いてPCRによって増幅させた。
全てのPCR断片(プラスミド主鎖、エレメントを含有するプロモーター及びvag遺伝子)を精製し、プラスミド主鎖、プロモーターエレメント(PglpF又はPlac)及びDNA断片を含有するvagを組み立てた。プラスミドは、標準USERクローニングによってクローン化した。任意の適切なプラスミドにおけるクローニングは、任意の標準のDNAクローニング技術を用いて実施することができるであろう。プラスミドは、TOP10細胞内に形質転換させ、100μg/mLのアンピシリン(又は任意の適切な抗生物質)及び0.2%のグルコースを含有するLBプレート上で選択した。構築したプラスミドを精製し、プロモーター配列及びYberC遺伝子の5’末端は、DNAシーケンシング(MWG Eurofins Genomics)によって検証した。この方法で、YberC遺伝子に結合した関心対象の任意のプロモーターを含有する遺伝子カセットを構築した。
関心対象のトランスポーター又はグリコシルトランスフェラーゼをコードする異種遺伝子のDNA配列は、コドン最適化し、GenScriptによって合成した。トランスポータータンパク質であるYberCをコードする関心対象の遺伝子(表4)は、遺伝子の開始コドンであるATG及び停止コドンであるTAA(表3)をカバーする適切なプライマーを用いるPCRによって増幅させた。関心対象の任意の異種遺伝子を備えるドナープラスミドを構築するために、関連プラスミド主鎖の精製PCR断片、プロモーターエレメント及び関心対象の遺伝子を結合するために標準USERクローニングを利用した。適切なプラスミドにおけるクローニングは、任意の標準DNAクローニング技術を用いて実施することができた。クローニング後、DNAは、TOP10細胞内に形質転換させ、100μg/mLのアンピシリン(又は適用された主鎖に依存して50mg/mLのカナマイシン)及び0.2%のグルコースを含有するLBプレート上で選択した。構築したプラスミドを精製し、関心対象の遺伝子のプロモーター配列及び5’末端をDNAシーケンシング(MWG Eurofins Genomics)によって検証した。
[菌株の構築]
使用した細菌株であるMDOは、大腸菌(Escherichia coli)K-12 DH1から構築した。大腸菌(E.coli)K-12 DH1の遺伝子型は、F-、人-、gyrA96、recA1、relA1、endA1、thi-1、hsdR17、supE44である。大腸菌(E.coli)K-12 DH1に加えて、遺伝子型MDOは、以下の改変:lacZ:1.5kbpの欠失、lacA:0.5kbpの欠失、nanKETA:3.3kbpの欠失、melA:0.9kbpの欠失、wcaJ:0.5kbpの欠失、mdoH:0.5kbpの欠失及びgmd遺伝子の上流のPlacプロモーターの挿入を有する。
使用した細菌株であるMDOは、大腸菌(Escherichia coli)K-12 DH1から構築した。大腸菌(E.coli)K-12 DH1の遺伝子型は、F-、人-、gyrA96、recA1、relA1、endA1、thi-1、hsdR17、supE44である。大腸菌(E.coli)K-12 DH1に加えて、遺伝子型MDOは、以下の改変:lacZ:1.5kbpの欠失、lacA:0.5kbpの欠失、nanKETA:3.3kbpの欠失、melA:0.9kbpの欠失、wcaJ:0.5kbpの欠失、mdoH:0.5kbpの欠失及びgmd遺伝子の上流のPlacプロモーターの挿入を有する。
yberC0001_9420遺伝子及びT1転写終結配列に結合したプロモーターを含有する発現カセットの挿入は、Herring et al.(Herring,C.D.,Glasner,J.D.and Blattner,F.R.(2003)Gene(311).153-163)によって記載されたように、本質的には、遺伝子ゴージング(Gene Gorging)によって実施し、本出願に提示した菌株を構築するために使用したヘルパー及びドナープラスミドの例は、表6に提供した。手短には、ドナープラスミド及びヘルパープラスミドは、MDOに共形質転換させ、0.2%のグルコース、アンピシリン(100μg/mL)又はカナマイシン(50mg/mL)及びクロラムフェニコール(20μg/mL)を含有するLBプレート上で選択した。単一コロニーは、クロラムフェニコール(20μg/mL)及び10μLの20%のL-アラビノースを含有する1mLのLB中に接種し、7~8時間にわたり振とうしながら37℃でインキュベートした。大腸菌(E.coli)細胞のgalK遺伝子座内へ統合するために、次にM9-DOGプレート上にプレーティングし、37℃で48時間インキュベートした。MM-DOGプレート上に形成された単一コロニーは、0.2%のグルコースを含有するLBプレート上で再画線化し、37℃で24時間インキュベートした。MacConkey-ガラクトース寒天プレート上で白く出現し、アンピシリン及びクロラムフェニコールの両方に感受性であったコロニーは、ドナープラスミド及びヘルパープラスミドを消失しており、galK遺伝子座での挿入を含有すると予測された。galK部位での挿入は、プライマーO48(配列番号13)及びO49(配列番号14)を用いるコロニーPCRによって同定し、挿入されたDNAは、シーケンシング(Eurofins Genomics、Germany)によって検証した。
大腸菌(E.coli)染色体DNA内の他の遺伝子座での遺伝子カセットの挿入は、異なる選択マーカー遺伝子を用いて類似の方法で実施した。
[ディープウェルアッセイ(DWA)]
DWAは、最初にLv et al(Bioprocess Biosyst Eng(2016)39:1737-1747)によって記載され、本発明の目的に合わせて最適化して実施した。
DWAは、最初にLv et al(Bioprocess Biosyst Eng(2016)39:1737-1747)によって記載され、本発明の目的に合わせて最適化して実施した。
より詳細には、実施例に開示した菌株は、4日間プロトコルを用いて24ディープウェルプレート内でスクリーニングした。最初の24時間中に細胞を高密度に増殖させる一方、次の72時間では、細胞を遺伝子発現の誘導及び生成物形成を許容する培地に移した。詳細には、1日間中に、硫酸マグネシウム、チアミン及びグルコースが補給された基礎最少培地を用いて新鮮接種材料を調製した。700rpmで振とうしながら34℃で調製した培養を24時間培養した後、細胞は、硫酸マグネシウム及びチアミンを補給した新規な基礎最少培地(2ml)へ移し、そこに20%のグルコース溶液(1μl)及び10%のラクトース溶液(0.1ml)の初期ボーラスを添加し、次に炭素源としての50%のスクロース溶液を細胞に提供した。新規培地の接種後、細胞は、72時間にわたり28℃、700rpmで振とうした。変性及びその後の遠心分離後、上清をHPLCによって分析した。
試料全体の分析のために、沸騰によって調製した細胞溶解液は、4.700rpmで10分間にわたる遠心分離によってペレット化した。上清中のHMO濃度は、HPLC又はHPAC法によって決定した。
[結果]
[実施例1.yberC0001_9420遺伝子を用いるLNT-2産生のための大腸菌(Escherichia coli)の遺伝子操作]
大腸菌(Escherichia coli)のK-12(DH1)MDO菌株は、関心対象の異種遺伝子を発現するように操作することができる。例えば、菌株MP3941は、表1の非限定的実施例から遺伝子選択されたβ-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、例えば、lgtAを最適に過剰発現するLNT-2産生菌株である。
[実施例1.yberC0001_9420遺伝子を用いるLNT-2産生のための大腸菌(Escherichia coli)の遺伝子操作]
大腸菌(Escherichia coli)のK-12(DH1)MDO菌株は、関心対象の異種遺伝子を発現するように操作することができる。例えば、菌株MP3941は、表1の非限定的実施例から遺伝子選択されたβ-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、例えば、lgtAを最適に過剰発現するLNT-2産生菌株である。
試料全体の分析(図3)は、yberC0001_9420遺伝子に結合したプロモーターエレメント(PglpF)を含有する発現カセットが菌株MP3940を生成するために単一コピー内で菌株MP3941の染色体DNAに統合されるとLNT-2力価が顕著に改良され得ることを証明した(表2)。興味深いことに、LNT-2の細胞外画分も、菌株MP3941についてよりも菌株MP3940についてのほうがはるかに大きく、これは、菌株MP3941を発現する非トランスポーターにおける対応するベルと比較してyberC0001_9420-発現菌株MP3940のペレット画分において検出されるより低い三糖レベルにおいても反映されている事実である(図1)。
[実施例2.yberC0001_9420遺伝子を用いるLNnT産生のための大腸菌(Escherichia coli)の遺伝子操作]
大腸菌(Escherichia coli)のK-12(DH1)MDO菌株は、関心対象の異種遺伝子を発現するように操作することができる。例えば、菌株MP4436は、表1の非限定的例から選択されるβ-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子及びβ-1,3-ガラクトース遺伝子を最適レベルで過剰発現するLNnT産生菌株、例えば、lgtA及びgalTである。
大腸菌(Escherichia coli)のK-12(DH1)MDO菌株は、関心対象の異種遺伝子を発現するように操作することができる。例えば、菌株MP4436は、表1の非限定的例から選択されるβ-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子及びβ-1,3-ガラクトース遺伝子を最適レベルで過剰発現するLNnT産生菌株、例えば、lgtA及びgalTである。
試料全体のHPLC分析から証明されたように、菌株MP3863を生成するためのyberC0001_9420遺伝子に結合したプロモーターエレメントPlacを含有する発現カセットの単一コピーの菌株MP4436の染色体DNA内への挿入(表2)は、i)より低い全LNnT力価、ii)わずかに高い全LNT-2濃度、及びiii)はるかに低い全pLNnH形成を生じさせた(図2)。
yberC0001_9420-発現菌株MP3863における全LNnT力価は、参照菌株MP4436と比較して改良されてはいないが、細胞外LNnT画分が顕著に増加していることは、上清試料の分析から明白である。同様の観察は、MP3863培養における培地中のLNT-2の濃度についても当てはまり、ここで、LNT-2画分は、菌株MP4436についての対応する画分と比較して少なくとも2倍増加している(図2)。後者の観察は、前駆体糖分子LNT-2がYberC0001_9420トランスポーターの存在下で細胞からより効率的に輸送されるため、菌株MP4436と比較して菌株MP3863を用いて達成されるより低いLNnT力価をより容易に説明することができるであろう。したがって、yberC0001_9420-発現菌株MP3863のペレット試料内のLNnT及びLNT-2の濃度は、顕著に減少する。上述したように、pLNnHの形成は、菌株MP4436と比較して菌株MP3863内では大きく減少する。興味深いことに、pLNnHは、菌株MP3863の細胞ペレット内でのみ見出されると思われるため、したがって、任意の特定の理論によって拘束されなくとも、YberC0001_9420トランスポーターのための基質であるとは思われない(図2)。
[実施例3.yberC0001_9420遺伝子を用いるLNT産生のための大腸菌(Escherichia coli)の遺伝子操作]
大腸菌(Escherichia coli)のK-12(DH1)MDO菌株は、関心対象の異種遺伝子を発現するように操作することができる。例えば、菌株MP4473は、表1の非限定的例から選択されるβ-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子及びβ-1,3-ガラクトース遺伝子を最適レベルで発現するLNT産生菌株、例えば、lgtA及びgalTである。
大腸菌(Escherichia coli)のK-12(DH1)MDO菌株は、関心対象の異種遺伝子を発現するように操作することができる。例えば、菌株MP4473は、表1の非限定的例から選択されるβ-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子及びβ-1,3-ガラクトース遺伝子を最適レベルで発現するLNT産生菌株、例えば、lgtA及びgalTである。
菌株MP4462を生成するために単一コピーで菌株MP4473の染色体DNA内へのyberC0001_9420遺伝子に結合したプロモーターエレメントPlacを含有する発現カセットの挿入(表2)は、全HMO力価並びに細胞培養の上清及びペレット画分間のHMO分布に強力な影響を及ぼした(図3)。
試料全体の分析から証明されたように、yberC0001_9420遺伝子のPlac駆動発現は、全LNT力価に劇的なプラスの効果を及ぼし、これには全LNT-2の力価の2倍を超える増加及び全pLNH-II形成における顕著な減少が付随した。
最適なグリコシルトランスフェラーゼ発現を備えるLNT産生菌株の遺伝的背景において、中等度の強度の発現エレメント、例えば、Placの制御下でyberC0001_9420遺伝子を導入することの有意な影響は、上清試料の分析に注目することによってさらに強調されている。菌株MP4462の培養の上清画分におけるLNT濃度は、MP4473培養の培地中で測定されたLNT濃度と比較して大きく増加する(図3)。参照菌株MP4473と比較して、トランスポーター発現菌株MP4462において観察されたより高い全LNT-2力価と一致して、前者の菌株の上清試料中のLNT-2濃度は、後者の菌株におけるより少なくとも2倍高い。したがって、yberC0001_9420-発現菌株MP4462のペレット内のLNTの濃度は顕著に低下したが、LNT-2の濃度は、低下しなかった。上述したように、pLNH-IIの形成は、菌株MP4462において大きく減少している。興味深いことに、pLNH-IIは、菌株MP4462の細胞ペレット内でのみ見出されると思われるため、したがって、任意の特定の理論によって拘束されなくとも、YberC0001_9420トランスポーターのための基質であるとは思われない(図3)。
Claims (13)
- 3’-シアリルラクトース(3’-SL)、6’-シアリルラクトース(6’-SL)、ラクト-N-トリオース-2(LNT-2)、ラクト-N-テトラオース(LNT)、ラクト-N-ネオテトラオース(LNnT)、ラクト-N-フコペンタオースI(LNFP I)、ラクト-N-フコペンタオースII(LNFP II)、ラクト-N-フコペンタオースIII(LNFP III)、ラクト-N-フコペンタオースIV(LNFP IV)及びラクト-N-フコペンタオースV(LNFP V)、パラ-ラクト-N-ネオヘキサオース(pLNnH)並びにパラ-ラクト-ネオヘキサオースII(pLNH-II)のリストから選択される1種以上のヒトミルクオリゴ糖(HMO)を産生することができる遺伝子改変細胞であって、配列番号1のタンパク質をコードする組み換え核酸又は配列番号1と少なくとも80%同一である、好ましくは少なくとも85%同一である、より好ましくは少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを含む遺伝子改変細胞。
- 前記オリゴ糖は、ラクト-N-トリオース-2(LNT-2)、ラクト-N-テトラオース(LNT)、ラクト-N-ネオテトラオース(LNnT)、ラクト-N-フコペンタオースI(LNFP I)、ラクト-N-フコペンタオースII(LNFP II)、ラクト-N-フコペンタオースIII(LNFP III)、ラクト-N-フコペンタオースIV(LNFP IV)及びラクト-N-フコペンタオースV(LNFP V)、パラ-ラクト-N-ネオヘキサオース(pLNnH)並びにパラ-ラクト-ネオヘキサオースII(pLNH-II)のリストから選択される、請求項1に記載の遺伝子改変細胞。
- 大腸菌(Escherichia coli)である、請求項1又は2に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記組み換え核酸の発現を調節するための調節エレメントを含む組み換えDNA配列をさらに含む、請求項1~3の何れか一項に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記組み換え核酸の発現を調節するための前記調節エレメントは、lacプロモーター、Plac又はglpプロモーター、PglpF等のプロモーターエレメントである、請求項4に記載の遺伝子改変細胞。
- 配列番号1のタンパク質又は配列番号1との少なくとも80%の配列同一性を有するその機能的ホモログをコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、配列番号1のタンパク質をコードする前記核酸配列は、配列番号2との少なくとも70%の配列同一性を有し、前記構築物は、lacプロモーター、Plac又はglpプロモーター、PglpFからなるリストから選択される調節エレメントを含む核酸配列をさらに含む、核酸構築物。
- 前記調節エレメントは、配列番号2との少なくとも70%の配列同一性を有する前記核酸配列の発現を調節する、請求項6に記載の核酸構築物。
- オリゴ糖の産生のための方法であって、
(i)HMOを産生することができる遺伝子改変細胞であって、配列番号1のタンパク質をコードする組み換え核酸又はその機能的ホモログであって、そのアミノ酸配列は、配列番号1と少なくとも80%同一である、好ましくは少なくとも85%同一である、より好ましくは少なくとも90%同一である、その機能的ホモログを含む遺伝子改変細胞を提供する工程;
(ii)前記組み換え核酸を発現するための好適な細胞培養培地中において、(i)に記載の前記細胞を培養する工程;
(iii)工程(ii)において産生された1種以上のHMOを採取する工程
を含む方法。 - 1種以上のオリゴ糖、好ましくは1種以上のヒトミルクオリゴ糖の産生のための、請求項1~5の何れか一項に記載の遺伝子改変細胞又は請求項6若しくは7に記載の核酸構築物の使用。
- 3’-シアリルラクトース(3’-SL)、6’-シアリルラクトース(6’-SL)、ラクト-N-トリオース-2(LNT-2)、ラクト-N-テトラオース(LNT)、ラクト-N-ネオテトラオース(LNnT)、ラクト-N-フコペンタオースI(LNFP I)、ラクト-N-フコペンタオースII(LNFP II)、ラクト-N-フコペンタオースIII(LNFP III)、ラクト-N-フコペンタオースIV(LNFP IV)及びラクト-N-フコペンタオースV(LNFP V)、パラ-ラクト-N-ネオヘキサオース(pLNnH)並びにパラ-ラクト-ネオヘキサオースII(pLNH-II)のリストから選択される特異的HMOの産生のための、請求項1~5の何れか一項に記載の遺伝子改変細胞又は請求項6若しくは7に記載の核酸構築物の使用。
- ラクト-N-トリオース-2(LNT-2)、ラクト-N-テトラオース(LNT)、ラクト-N-ネオテトラオース(LNnT)、ラクト-N-フコペンタオースI(LNFP I)、ラクト-N-フコペンタオースII(LNFP II)、ラクト-N-フコペンタオースIII(LNFP III)、ラクト-N-フコペンタオースIV(LNFP IV)及びラクト-N-フコペンタオースV(LNFP V)、パラ-ラクト-N-ネオヘキサオース(pLNnH)並びにパラ-ラクト-ネオヘキサオースII(pLNH-II)のリストから選択される特異的HMOの産生のための、請求項1~5の何れか一項に記載の遺伝子改変細胞又は請求項6若しくは7に記載の核酸構築物の使用。
- ラクト-N-トリオース-2(LNT-2)、ラクト-N-テトラオース(LNT)、ラクト-N-ネオテトラオース(LNnT)及びパラ-ラクト-ネオヘキサオースII(pLNH-II)からなる群から選択されるもののリストから選択される特異的HMOの産生のための、請求項1~5の何れか一項に記載の遺伝子改変細胞又は請求項6若しくは7に記載の核酸構築物の使用。
- ラクト-N-トリオース-2(LNT-2)、ラクト-N-テトラオース(LNT)及びラクト-N-ネオテトラオース(LNnT)からなる群から選択される特異的HMOの産生のための、請求項1~5の何れか一項に記載の遺伝子改変細胞又は請求項6~9の何れか一項に記載の核酸構築物の使用。
Applications Claiming Priority (3)
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