EA046260B1

EA046260B1 - Получение огм

Info

Publication number: EA046260B1
Application number: EA202292179
Authority: EA
Inventors: Манос Пападакис; Катрине Бых Кампманн
Original assignee: Глюком А/С
Priority date: 2020-01-23
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2024-02-21

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области рекомбинантного получения биологических молекул в клетках-хозяевах. Более конкретно, оно относится к способу рекомбинантного получения олигосахаридов грудного молока (ОГМ) с применением генетически модифицированных клеток, экспрессирующих белок суперсемейство основных посредников (MFS).

Уровень техники

Олигосахариды грудного молока (ОГМ) составляют третий по величине твердый компонент грудного молока и обладают высокой устойчивостью к ферментативному гидролизу. Как следствие, значительная часть ОГМ остается в значительной степени непереваренной и неабсорбированной, что делает возможным их проникновение в толстую кишку. В толстой кишке ОГМ могут служить субстратами для формирования кишечной экосистемы путем избирательной стимуляции роста специфических сахаролитических бактерий. Эта избирательность считается полезной как для младенцев, так и для взрослых, поскольку считается, что штаммы видов Bifidobacterium положительно влияют на здоровье кишечника. (Chichiowski M. et al. (2012) J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 5:251-258; Elison E. et al. (2016) Brit J. Nutr, 116: 1356-1368).

Помимо своих пребиотических свойств ОГМ связаны с дополнительными положительными эффектами, что расширяет область их применения. (Kunz С. et al. (2014) Food Oligosaccharides: Production, Analysis and Bioactivity, 1st Edition, p 5-20, Eds. Moreno J. and Luz Sanz M., John Wiley & Sons, Ltd).

Очевидная польза ОГМ для здоровья позволила разрешить их применение в пищевых продуктах, таких как детские смеси и пищевые продукты, а также в потребительских товарах для здоровья. Биотехнологическое производство ОГМ представляет собой ценный экономичный и масштабный способ производства ОГМ. Оно основано на генетически модифицированных бактериях, сконструированных таким образом, чтобы экспрессировать гликозилтрансферазы, необходимые для синтеза желаемых олигосахаридов, и в нем применяют врожденный пул нуклеотидных сахаров бактерий в качестве предшественников ОГМ. Недавние разработки в биотехнологическом производстве ОГМ позволили преодолеть некоторые присущие бактериальным экспрессионным системам ограничения. Например, бактериальные клетки, продуцирующие ОГМ, могут быть генетически модифицированы для увеличения ограниченного внутриклеточного пула нуклеотидных сахаров в бактериях (WO 2012112777), для повышения активности ферментов, участвующих в продукции ОГМ (WO 2016040531), или для облегчения секреции синтезированных ОГМ во внеклеточную среду (WO 2010142305, WO 2017042382). Кроме того, экспрессию представляющих интерес генов в рекомбинантных клетках можно регулировать с помощью конкретных промоторов или других регуляторов экспрессии генов, таких как, например, те, что недавно были описаны в WO 2019123324.

Подход, описанный в WO 2010142305 и WO 2017042382, имеет то преимущество, что он позволяет снизить метаболическую нагрузку, воздействующую на продуцирующую клетку, за счет высоких уровней экспрессии рекомбинантных генов, т.е. с применением способов WO 2012112777, WO 2016040531 или WO 2019123324. Этот подход привлекает все большее внимание к рекомбинантным клеткам, продуцирующим ОГМ, например, недавно были описаны процедуры ферментации, а также несколько новых генов переносчиков сахара, кодирующих белки, которые могут способствовать выведению рекомбинантно продуцируемой 2'-фукозиллактозы (2'-FL), самого распространенного ОГМ грудного молока (WO 2018077892, US 201900323053, US 201900323052). Однако в настоящее время не существует алгоритма, который мог бы точно определить правильный белок-транспортер для оттока различных структур ОГМ, полученных рекомбинантно, среди многочисленных бакте риальных белков с предсказанной функцией транспортера в нескольких базах данных белков, например, в UniProt, поскольку структуры/факторы, определяющие субстратную специфичность переносчиков сахаров, до сих пор недостаточно изучены и остаются крайне непредсказуемыми.

Раскрытие изобретения

Эффективные белки-транспортеры оттока сахаров для различных рекомбинантно полученных ОГМ и разработка рекомбинантных клеток, экспрессирующих указанные белки, выгодны для крупномасштабного промышленного производства ОГМ.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным клеткам, способным продуцировать олигосахарид грудного молока (ОГМ), при этом клетки экспрессируют гетерологичный ген, кодирующий предполагаемый транспортный белок MFS (major facilitator superfamily, суперсемейство основных посредников), происходящий из бактерии Pantoea vagans. Более конкретно, изобретение относится к генетически модифицированной клетке, оптимизированной для продукции олигосахаридов, в особенности, ОГМ, содержащей рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, последовательность которого по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 (фиг. 4). Аминокислотная последовательность, обозначенная в настоящем документе как SEQ ID NO: 1, представляет собой аминокислотную последовательность, которая на 100% идентична аминокислотной последовательности, имеющей номер доступа в GenBank IDWP_048785139.1 (https://www.ncbi.nlm.nih.goV/protein/WP_048785139.1). Белок-транспортер MFS, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, идентифицируют в настоящем документе как белок Vag, или

- 1 046260 транспортер Vag, или Vag, взаимозаменяемо; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок Vag, идентифицируют в настоящем документе как кодирующая vag нуклеиновая кислота/ДНК, или ген vag, или vag.

Настоящее изобретение показывает, что применение рекомбинантных клеток, продуцирующих ОГМ, которые экспрессируют белок Vag, приводит к весьма отчетливым улучшениям процесса производства ОГМ как с точки зрения ферментации, так и очистки ОГМ. Описанные в настоящем документе рекомбинантные клетки и способы получения ОГМ обеспечивают как более высокие выходы всех произведенных ОГМ, более низкое образование побочных продуктов или отношение побочного продукта к продукту, более низкое образование биомассы за ферментацию, так и облегченное извлечение ОГМ во время последующей обработки ферментационный бульон.

Неожиданно было обнаружено, что экспрессия последовательности ДНК, кодирующей Vag, в различных ОГМ-продуцирующих клетках связана с накоплением одних ОГМ во внеклеточной среде и накоплением других ОГМ внутри продуцирующих клеток, а также с увеличением общей продукции ОГМ. Неожиданно оказалось, что увеличение выхода образующихся ОГМ характерно для ОГМ, состоящих либо из трех, либо из четырех звеньев моносахаридов, т.е. 2'-фукозиллактозы (2TL), 3-фукозиллактозы (3FL), 3-сиалиллактозы (3'SL), 6'-сиалиллактозы (6'SL), лакто-Н-триозы 2, (LNT-2), лакто-Н-неотетраозы (LNnT) и лакто-Н-тетраозы (LNT), но не для более крупных олигосахаридных структур, таких как пентасахариды и гексасахариды, которые накапливаются внутри продуцирующих клеток. Неожиданно также обнаружено, что общая продукция ОГМ лакто-Н-неотетраозы (LNnT) и лакто-Н-тетраозы (LNT) соответствующими ОГМ-продуцирующими клетками, экспрессирующими Vag, также увеличивается, в то время как образование побочных продуктов, например, пара-лакто-Н-неогексаозы (pLNnH) и пара-лактоН-гексаозы II (^НН-П) в этих клетках, соответственно, часто снижены, и указанные побочные олигосахариды обычно накапливаются внутри клеток в системе продукции ОГМ. Далее, весьма неожиданно, оказалось, что экспрессия белка Vag в клетках, продуцирующих ОГМ, приводит к снижению образования биомассы во время ферментации с высокой плотностью клеток и к более здоровым клеточным культурам, что, например, отражается в уменьшении количества мертвых клеток в конце ферментации, что делает производственный процесс более эффективным, поскольку на единицу биомассы производится больше продукта.

Соответственно, первый аспект изобретения относится к генетически модифицированной клетке, способной продуцировать один или несколько ОГМ, где указанная клетка включает рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок SEQ ID НО: 1, или его функциональный гомолог с аминокислотной последовательностью, идентичной, по меньшей мере, на 80%, предпочтительно идентичной, по меньшей мере, на 85%, более предпочтительно идентичной, по меньшей мере, на 90% последовательности SEQ ID НО: 1.

Второй аспект изобретения относится к конструкции нуклеиновой кислоты, включающей последовательность(последовательности) нуклеиновой кислоты, кодирующую(кодирующие) белок-транспортер MFS, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, имеет по меньшей мере 70% идентичности с последовательностью с SEQ ID НО: 2, например по меньшей мере, 80%, например, по меньшей мере 85%, например, по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 99%, а также к генетически модифицированной клетке, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты, которая представляет собой Escherichia coli.

В одном аспекте конструкция нуклеиновой кислоты включает последовательность(последовательности) нуклеиновой кислоты, кодирующую(кодирующие) белок-транспортер MFS, в которой последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID НО: 2.

Третий аспект изобретения относится к способу получения одного или нескольких олигосахаридов, включающему следующие стадии:

(i) получение генетически модифицированной клетки, способной продуцировать ОГМ, в котором указанная клетка включает рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок SEQ ID НО: 1, или его функциональный гомолог с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80%, предпочтительно идентичной по меньшей мере на 85%, более предпочтительно идентичной по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID НО: 1;

(ii) культивирование клеток в соответствии с (i) в подходящей среде культивирования клеток для экспрессии указанной рекомбинантной нуклеиновой кислоты;

(iii) сбор одного или нескольких ОГМ, полученных на стадии (ii).

Изобретение также относится к применению генетически модифицированной клетки или конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок суперсемейства основных посредников (MFS), причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты имеет по меньшей мере 70% идентичности последовательности с SEQ ID НО: 2 для производства одного или нескольких олигосахаридов грудного молока (ОГМ).

Как упоминалось выше, при культивировании генетически модифицированных клеток, способных продуцировать один или несколько ОГМ и содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белоктранспортер Vag, неожиданно было обнаружено, что соответствующие один или несколько ОГМ проду

- 2 046260 цируются с высокими выходами, тогда как образование побочных продуктов и биомассы снижается. Это облегчает извлечение этих ОГМ в последующих процессах, так как общая процедура извлечения и очистки включает меньше стадий, процедура в целом упрощается, общее время очистки сокращается, и, следовательно, извлечение продукта становится менее трудоемко и экономически более эффективно.

Эти эффекты повышенного выхода продукта и облегчения извлечения продукта делают настоящее изобретение превосходящим раскрытия предшествующего уровня техники.

Другие аспекты и полезные признаки настоящего изобретения подробно описаны и проиллюстрированы приведенными ниже неограничивающими рабочими примерами.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает (А) процент (%) относительных концентраций LNnT в общих образцах для семи штаммов, которые экспрессируют гены GlcNacT и Gal4T и гетерологичный ген транспортера, yberC0001_9420, bad, fred, marc, vag, пес или yabM, соответственно. Штамм МР3672 экспрессирует гены гликозилтрансферазы и не экспрессирует гены транспортера; (В) процент (%) относительных концентраций LNnT в супернатанте клеток, экспрессирующих vag или yabM.

На фиг. 2 показано процентное содержание (%) относительных концентраций LNnT и побочных продуктов для штаммов МР3020, МР4065 и МР4064 в общем образце, образцах супернатантах и образцах осадка. Хотя все три штамма демонстрируют оптимальную экспрессию необходимых генов гликозилтрансфераз, именно МР4065 и МР4064 экспрессируют ген гетерологичного переносчика vag под контролем элемента Plac или PglpF, соответственно.

Фиг. 3 показывает процент (%) относительных концентраций LNT и побочных продуктов для штаммов МР4473 и МР4546 в общем образце, образцах супернатанта и осадка. Хотя оба штамма демонстрируют оптимальную экспрессию необходимых генов гликозилтрансфераз, только МР4546 экспрессирует ген гетерологичного переносчика vag под контролем элемента PglpF.

На фиг. 4 представлена последовательность SEQ ID NO: 1.

Осуществление изобретения

Далее воплощения изобретения будут описаны более подробно. Каждая конкретная вариация признаков может быть применена к другим воплощениям изобретения, если специально не указано иное.

Как правило, все применяемые в настоящем документе термины следует интерпретировать в соответствии с их обычным значением в технической области и как применимые ко всем аспектам и воплощениям изобретения, если явно не определено или не указано иное. Все ссылки на a/an/the [клетка, последовательность, ген, транспортер, стадия и т.д.] нужно интерпретировать открыто как относящиеся по меньшей мере к одному экземпляру указанной клетки, последовательности, гена, транспортера, стадии и т.д. если прямо не указано иное. Этапы любого раскрытого в настоящем документе способа не обязательно выполнять в точном раскрытом порядке, если это не указано явно.

Настоящее изобретение в целом относится к генетически модифицированной клетке для эффективного производства олигосахаридов и к применению указанной генетически модифицированной клетки в способе получения олигосахаридов. В особенности, настоящее изобретение относится к генетически модифицированной клетке, способной синтезировать олигосахарид, предпочтительно гетерологичный олигосахарид, в особенности олигосахарид грудного молока (ОГМ). Соответственно, клетки по изобретению модифицируют для экспрессии набора рекомбинантных нуклеиновых кислот, которые необходимы для синтеза клетками одного или нескольких ОГМ (которые позволяют клетке синтезировать один или несколько ОГМ), таких как гены, кодирующие один или несколько ферментов с гликозилтрансферазной активностью, описанных ниже. Продуцирующую олигосахарид рекомбинантную клетку по изобретению дополнительно модифицируют для включения гетерологичной последовательности рекомбинантной нуклеиновой кислоты, предпочтительно, последовательности ДНК, кодирующей белок MFS (major facilitator superfamily, суперсемейство основных посредников), происходящий из бактерии Pantoea vagans. Более конкретно, изобретение относится к генетически модифицированной клетке, оптимизированной для продукции одного или нескольких конкретных олигосахаридов, в особенности, одного или нескольких конкретных ОГМ, содержащей рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, имеющий по меньшей мере 80% сходства последовательности, предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере 95% сходства последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (фиг. 4). Аминокислотная последовательность, обозначенная в настоящем документе как SEQ ID NO: 1, представляет собой аминокислотную последовательность, которая на 100% идентична аминокислотной последовательности, имеющей номер доступа в GenBank: WP_048785139.1 (https://www.ncbi.nlm.nih.goV/protein/WP_048785139.1).

Соответственно, первый аспект изобретения относится к генетически модифицированной клетке, способной продуцировать один или несколько ОГМ, при этом указанная клетка включает рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок SEQ ID NO: 1, или его функциональный гомолог с аминокислотной последовательностью идентичной по меньшей мере на 80%, предпочтительно идентичной по меньшей мере на 85%, более предпочтительно идентичной по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 1.

Белок-транспортер MFS, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, идентифи

- 3 046260 цируют в настоящем документе как белок Vag, или транспортер Vag, или Vag, взаимозаменяемо; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок vag, идентифицируют в настоящем документе как кодирующую vag нуклеиновую кислоту/ДНК, или ген vag, или vag.

Под термином суперсемейства основных посредников (MFS) подразумевают большое и исключительно разнообразное семейство класса вторичных активных транспортеров, которые отвечают за транспорт ряда различных субстратов, включая сахара, лекарства, гидрофобные молекулы, пептиды, органические ионы и т.д. Специфичность белков-переносчиков сахара крайне непредсказуема, и идентификация нового белка-переносчика со специфичностью, например, в отношении олигосахаридов требует необременительных лабораторных экспериментов (более подробную информацию смотри в обзоре Reddy V.S. et al. (2012), FEBS J. 279(11): 2022-2035). Термин переносчик MFS в данном контексте означает белок, который облегчает транспорт олигосахарида, предпочтительно ОГМ, через клеточную мембрану, предпочтительно транспорт ОГМ/олигосахарида, синтезированного клеткой-хозяином, из цитозоля во внешнюю среду клетки, предпочтительно ОГМ/олигосахарида, содержащего три или четыре звена сахара, в особенности, 2'FL, 3FL, 6'SL, DFL, LNT, LNT-2 и LNnT. Дополнительно или альтернативно переносчик MFS может также способствовать оттоку молекул, которые не считаются ОГМ или олигосахаридами согласно настоящему изобретению, таких как лактоза, глюкоза, клеточные метаболиты или токсины.

Термин идентичность последовательности [определенного] % в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислот означает, что две или более последовательностей имеют общие нуклеотиды или аминокислотные остатки в данном проценте при сравнении и выравнивании для максимального соответствие в окне сравнения или обозначенных последовательностях нуклеиновых кислот или аминокислот (т.е. последовательности имеют по меньшей мере 90-процентную (%) идентичность). Процентную идентичность последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислот можно определить с помощью алгоритма сравнения последовательностей BLAST 2.0 с параметрами по умолчанию или путем ручного выравнивания и визуального контроля (см., например, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Это определение также применимо к комплементу тестируемой последовательности и последовательностям, которые имеют делеции и/или добавления, а также к тем, которые имеют замены. Примером алгоритма, подходящего для определения процента идентичности, сходства последовательностей и выравнивания, служит алгоритм BLAST 2.2.20, описанный в Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25, 3389 (1997). BLAST 2.2.20 применяют для определения процента идентичности последовательностей нуклеиновых кислот и белков по изобретению. Программное обеспечение для проведения анализов BLAST общедоступно через Национальный центр биотехнологической информации, (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). CLUSTAL Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), EMBOSS Needle (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/), MAFFT (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) or MUSCLE (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/) представляют собой примеры алгоритмов выравнивания последовательностей.

В контексте изобретения термин олигосахарид означает сахаридный полимер, содержащий ряд моносахаридных звеньев. В некоторых воплощениях предпочтительными олигосахариды представляют собой полимеры сахаридов, состоящие из трех или четырех моносахаридных звеньев, т.е. трисахариды или тетрасахариды. Предпочтительные олигосахариды изобретения представляют собой олигосахариды грудного молока (ОГМ).

Термин олигосахарид грудного молока или ОГМ в данном контексте означает сложный углевод, обнаруженный в грудном молоке человека (для отсылки смотри Urashima et al.: Milk Oligosaccharides. Nova Science Publisher (2011); или Chen, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)). ОГМ имеют структуру ядра, включающую единицу лактозы на восстанавливающем конце, которая может быть удлинена одной или несколькими единицами e-N-ацетиллактозаминила и/или одной или несколькими единицами в-лакто-Ы-биозила, и эта структура ядра может быть замещенный α-Lфукопиранозильной и/или a-N-ацетилнейраминильной (сиалильной) частью. В связи с этим некислотные (или нейтральные) ОГМ лишены остатка сиалила, а кислые ОГМ имеют в своей структуре хотя бы один остаток сиалила. Некислотный (или нейтральный) ОГМ может быть фукозилированным или нефукозилированным. Примеры таких нейтральных нефукозилированных ОГМ включают лакто-Ы-триозу 2 (LNT2), лакто-Н-тетраозу (LNT), лакто-Н-неотетраозу (LNnT), лакто-Н-неогексаозу (LNnH), пара-лакто-Nнеогексаозу (pLNnH), пара-лакто-М-гексаозу (pLNH) и лакто-М-гексаозу (LNH). Примеры нейтральных фукозилированных ОГМ включают 2'-фукозиллактозу (2'FL), лакто-N-фукопентаозу I (LNFP-I), лакто-Nдифукогексаозу I (LNDFH-I), 3-фукозиллактозу (3FL), дифукозиллактозу (DFL), лакто-N-фукопентаозу II (LNFP-II), лакто-N-фукопентаозу III (LNFP-III), лакто-N-дифукогексаозу III (LNDFH-III), фукозил-лактоN-гексаозу II (FLNH-II), лакто-N-фукопентаозу V (LNFP-V), лакто-N-дифукогексаозу II (LNDFH-II), фукозил-лакто-N-гексаозу I (FLNH-I), фукозил-пара-лакто-N-гексаозу I (FpLNH-I), фукозил-пара-лакто-Nнеогексаозу II (F-pLNnH II) и фукозил-лакто-К-неогексаозу (FLNnH). Примеры кислотных ОГМ включают 3'-сиалиллактозу (3'SL), 6'-сиалиллактозу (6'SL), 3-фукозил-3'-сиалиллактозу (FSL), 3'-Осиалиллакто-N-теmраозу а (LST а), фукозил-LST а (FLST а), 6'-О-сиалиллакто-N-тетраозу b (LST b), фу

- 4 046260 козил-LST b (FLST b), 6'-О-сиалиллакто-М-неотетраозу (LST c), фукозил-LST с (FLST с), 3'-Осиалиллакто-М-неотетраозу (LST d), фукозил-LST d (FLST d), сиалил-лакто-М-гексаозу (SLNH), сиалиллакто-М-неогексаозу I (SLNH-I), сиалил-лакто-М-неогексаозу II (SLNH-II) и дисиалил-лакто-М-тетраозу (DSLNT). В контексте настоящего изобретения лактозу не рассматривают как разновидность ОГМ.

В некоторых воплощениях изобретения предпочтительными могут быть три-ОГМ и тетра-ОГМ, например, трисахариды 2'FL, 3FL, 6'SL, LNT-2 и тетрасахариды DFL, LNT, LNnT.

Чтобы иметь возможность синтезировать один или несколько ОГМ, рекомбинантная клетка по изобретению включает по меньшей мере одну рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая кодирует функциональный фермент с гликозилтрансферазной активностью. Ген галактозилтрансферазы может быть интегрирован в геном (посредством хромосомной интеграции) клетки-хозяина, или, альтернативно, он может быть включен в плазмидную ДНК и экспрессироваться как переносимый плазмидой. Если для производства ОГМ необходимы две или более гликозилтрансфераз, например, LNT или LNnT, то две или более рекомбинантных нуклеиновых кислоты, кодирующих разные ферменты с гликозилтрансферазной активностью, могут быть интегрированы в геном и/или экспрессированы из плазмиды, например β-1,3N-ацетилглюкозаминилтрансферазу (первая рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая первую гликозилтрансферазу) в сочетании с в-1,4-галактозилтрансферазой (вторая рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая вторую гликозилтрансферазу) для продукции LNnT, где первая и вторая рекомбинантные нуклеиновые кислоты могут быть независимо друг от друга интегрированы в хромосому или клонированы на плазмиде. В одном предпочтительном воплощении как первая, так и вторая рекомбинантные нуклеиновые кислоты интегрированы в хромосому клетки-продуцента; в другом воплощении по меньшей мере одна из первой и второй гликозилтрансфераз представляет собой переносимую плазмидой. Белок/фермент с гликозилтрансферазной активностью (гликозилтрансфераза) может быть выбран в различных воплощениях из ферментов, обладающих активностью а-1,2-фукозилтрансферазы, α-1,3фукозилтрансферазы, а-1,3/4-фукозилтрансферазы, а-1,4-фукозилтрансферазы, а-2,3-сиалилтрансферазы, а-2,6-сиалилтрансферазы, в-1,3-М-ацетилглюкозаминилтрансферазы, в-1,6-М-ацетилглюкозаминилтрансферазы, в-1,3-галактозилтрансферазы и в-1,4-галактозилтрансферазы. Например, для производства LNnT требуется, чтобы модифицированная клетка экспрессировала активный фермент β-1,3N-ацетилглюкозаминилтрансферазу и активный фермент в-1,4-галактозилтрансферазу. Некоторые неограничивающие воплощения белков, обладающих гликозилтрансферазной активностью, которые могут кодироваться рекомбинантными генами, содержащимися в клетке-продуценте, могут быть выбраны из неограничивающих примеров табл. 1.

Таблица 1

Ген	ID белковой последовательности (GenBank)	Описание	Пример ОГМ
IgtANm	WP 002248149.1	ββ-1,3-Ν- ацетилглюкозаминтрансфераза	LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
lgtA_Nm_MC58	AAF42258.1	β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминтрансфераза	LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
IgtAHd	AAN05638.1	β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминтрансфераза	LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
IgtA Ng PID2	AAK70338.1	β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминтрансфераза	LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH

- 5 046260

IgtANgNCCP 1 1945	ACF31229.1	β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминтрансфераза	LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
IgtAPast	AAKO2595.1	β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминтрансфераза	LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
IgtANc	EEZ72046.1	β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминтрансфераза	LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
lgtA_Nm_87255	ELK60643.1	β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминтрансфераза	LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
galT Hp/HP0826	NP 207619.1	ββ- 1,4-галактозилтрансфераза	LNnT, LNFP-III, LNFP-VI, pLNH I, F-pLNH I, pLNnH
galTNm/ IgtB	AAF42257.1	β-1,4-галактозилтрансфераза	LNnT, LNFP-III, LNFP-VI, pLNH I, F-pLNH I, pLNnH
wbgO	WP 000582563.1	β-1,3 -галактозилтрансфераза	LNT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-V, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNHI
cpsIBJ	ABO50723.1	ββ-1,3 -галактозилтрансфераза	LNT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-V, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNHI
Jhp0563	AEZ55696.1	β-1,3 -галактозилтрансфераза	LNT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-V, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNHI
galTK	homologous to BD182026	β-1,3 -галактозилтрансфераза	LNT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-V, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNHI
fiitC	WP 080473865.1	а-1,2-фукозилтрансфераза	2'-FL, DFL, LNFP-I, LNDFH-I
FucT2_HpUA802	AAC99764.1	а-1,2-фукозилтрансфераза	2'-FL, DFL, LNFP-I, LNDFH-I
FucT2_EcO126t	ABE98421.1	а-1,2-фукозилтрансфераза	2'-FL, DFL, LNFP-I, LNDFH-I
FucT2_Hml2198	CBG40460.1	а-1,2-фукозилтрансфераза	2'-FL, DFL, LNFP-I, LNDFH-I
FucT2_Pm9515	ABM71599.1	а-1,2-фукозилтрансфераза	2'-FL, DFL, LNFP-I, LNDFH-I
FucT2 HpF57	BAJ59215.1	а-1,2-фукозилтрансфераза	2'-FL, DFL, LNFP-I, LNDFH-I
FucT6 3 Bf	CAH09151.1	а-1,3-фукозилтрансфераза	2'-FL, З'-FL, DFL, LNFP-I, LNFPIII, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
FucT7_3_Bf	CAH09495.1	а-1,3-фукозилтрансфераза	2'-FL, З'-FL, DFL, LNFP-I, LNFPIII, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
FucT_3_Am	ACD04596.1	а-1,3-фукозилтрансфераза	2'-FL, З'-FL, DFL, LNFP-I, LNFPIII, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I

- 6 046260

MAMAR764	AGC02224.1	а-1,3-фукозилтрансфераза	2'-FL, З'-FL, DFL, LNFP-I, LNFPIII, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
Mg791	AEQ33441.1	а-1,3-фукозилтрансфсраза	2'-FL, З'-FL, DFL, LNFP-I, LNFPIII, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
Моитои_00703	YP 007354660	а-1,3-фукозилтрансфераза	2'-FL, З'-FL, DFL, LNFP-I, LNFPIII, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
fiitA	NP207177.1	а-1,3-фукозилтрансфераза	2'-FL, З'-FL, DFL, LNFP-I, LNFPIII, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
fucT	AAB81031.1	а-1,3-фукозилтрансфераза	2'-FL, З'-FL, DFL, LNFP-I, LNFPIII, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
fucTIII	AY450598.1	а-1,4-фукозилтрансфераза	LNDFH-I, LNDFH-II
fucTa	AFI 94963.1	а-1,3/4-фукозилтрансфераза	LNFP-II, LNDFH-I, LNDFH-II
Pd2,6ST	BAA25316.1	а-2,6- сиалилтрансфераза	6'-SL
PspST6	BAF92026.1	а-2,6- сиалилтрансфераза	6'-SL
Pi ST6 145	BAF91416.1	а-2,6- сиалилтрансфераза	6'-SL
Pi ST6 119	BAI49484.1	а-2,6- сиалилтрансфераза	6'-SL
NST	AAC44541.1	а-2,3- сиалилтрансфераза	3'-SL

Один из аспектов настоящего изобретения представляет собой обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты, включающей гетерологичную (гетерологичные) последовательность(последовательности) нуклеиновой кислоты, кодирующую(кодирующие) белок, способный к транспортировке сахара, который представляет собой белок суперсемейства основных посредников (MFS), как показано в SEQ ID NO: 1, или его функциональный гомолог, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 1, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок MFS, имеет по меньшей мере 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 2.

Под термином гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая рекомбинантный ген/нуклеиновая кислота/ДНК или кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты подразумевают искусственную последовательность нуклеиновой кислоты (т.е. полученную in vitro с применением стандартных лабораторных способов получения последовательностей нуклеиновых кислот), которая включает набор последовательных, неперекрывающихся триплетов (кодонов), которые транскрибируются в мРНК и транслируются в полипептид, когда их помещают под контроль соответствующих контрольных последовательностей, т.е. промотора. Границы кодирующей последовательности обычно определяются сайтом связывания рибосомы, расположенным прямо перед открытой рамкой считывания на 5'-конце мРНК, стартовым кодоном трансляции (AUG, GUG или UUG) и стоп-кодоном трансляции (UAA, UGA или UAG). Кодирующая последовательность может включать, но не ограничиваться ими, геномную ДНК, кДНК, синтетические и рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот. Термин нуклеиновая кислота включает молекулы РНК, ДНК и кДНК. Понятно, что в результате вырождения генетического кода может быть получено множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих данный белок. Термин нуклеиновая кислота применяют взаимозаменяемо с термином полинуклеотид. Олигонуклеотид представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты с короткой цепью. Праймер представляет собой олигонуклеотид, встречающийся в природе в виде очищенного фрагмента рестрикции или полученный синтетическим путем, который способен действовать как точка инициации синтеза при помещении в условия, в которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, комплементарного цепи нуклеиновой кислоты (т.е. в присутствии нуклеотидов и индуцирующего агента, такого как ДНК-полимераза, и при подходящей температуре и pH). Праймер предпочтительно применяют одноцепочечный для максимальной эффективности амплификации, но альтернативно он может быть двухцепочечным. Если праймер двухцепочечный, то его сначала обрабатывают, чтобы разделить его нити, прежде чем применять для приготовления продуктов для удлинения. Предпочтительно праймер представляет собой дезоксирибонуклеотид. Праймер должен быть достаточно длинным, чтобы инициировать синтез продуктов удлинения в присутствии индуцирующего агента. Точная длина праймеров будет зависеть от многих факторов, включая температуру, источник праймера и применение способа.

Рекомбинантная нуклеиновая последовательность по изобретению может представлять собой кодирующую последовательность ДНК, например, ген или некодирующая последовательность ДНК, например, регуляторную ДНК, такую как промоторная последовательность. Один аспект изобретения относится к получению рекомбинантной клетки, включающей последовательности рекомбинантной ДНК, кодирующие ферменты, необходимые для продукции одного или нескольких ОГМ, и последовательность ДНК, кодирующую переносчик Vag. Соответственно, в одном воплощении изобретение относится к кон

- 7 046260 струкции нуклеиновой кислоты, включающей кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты, т.е. последовательность рекомбинантной ДНК представляющего интерес гена, например, гена гликозилтрансферазы или гена vag, и некодирующую последовательность ДНК, например, последовательность промоторной ДНК, например, рекомбинантную промоторную последовательность, полученную из промотора оперона lac или оперона glp, или промоторную последовательность, полученную из другой последовательности ДНК геномного промотора, или синтетическая промоторная последовательность, где кодирующая и промоторная последовательности функционально связаны. Термин функционально связанный относится к функциональной взаимосвязи между двумя или более сегментами нуклеиновой кислоты (например, ДНК). Как правило, это относится к функциональной связи регуляторной последовательности транскрипции с транскрибируемой последовательностью. Например, промоторная последовательность функционально связана с кодирующей последовательностью, если она стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине или другой системе экспрессии. Как правило, промоторные регуляторные последовательности транскрипции, которые функционально связаны с транскрибируемой последовательностью, физически примыкают к транскрибируемой последовательности, т.е. они представляют собой цис-действующие последовательности.

В одном воплощении конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению может представлять собой частью векторной ДНК, в другом воплощении конструкция представляет собой экспрессионную кассету/картридж, интегрированную в геном клетки-хозяина. Соответственно, термин конструкция нуклеиновой кислоты означает искусственно сконструированный сегмент нуклеиновой кислоты, в особенности, сегмент ДНК, который предназначен для трансплантации в клетку-мишень, например, в клеткумишень, например, в бактериальную клетку, для модификации экспрессии гена-хозяина или экспрессии последовательности гена/кодирующей ДНК, которая может быть включена в конструкцию. В контексте изобретения конструкция нуклеиновой кислоты включает последовательность рекомбинантной ДНК, включающую две или более последовательностей рекомбинантной ДНК: по существу, некодирующую последовательность ДНК, включающую последовательность промоторной ДНК, и кодирующую последовательность ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, например белок Vag, гликозилтрансферазу или другой белок, пригодный для продукции ОГМ в клетке-хозяине. Предпочтительно конструкция включает дополнительные некодирующие последовательности ДНК, которые либо регулируют транскрипцию, либо трансляцию кодирующей ДНК конструкции, например, последовательность ДНК, облегчающую связывание рибосомы с транскриптом, лидирующую последовательность ДНК, которая стабилизирует транскрипт, или последовательность терминатора транскрипции.

Интеграция интересующего рекомбинантного гена, включенного в конструкции (т.е. в кассету экспрессии), в бактериальный геном может быть достигнута обычными способами, например, с помощью линейных картриджей, содержащих фланкирующие последовательности, гомологичные определенному участку на хромосоме, как описано для attTn7-сайта (Waddell C.S. and Craig N.L., Genes Dev. (1988) Feb; 2(2):137-49.); способами геномной интеграции последовательностей нуклеиновых кислот, в которых рекомбинация опосредована рекомбиназной функцией Red фага λ или рекомбиназной функцией RecE/RecT профага Rac (Murphy, J Bacteriol. (1998); 180(8):2063-7; Zhang et al., Nature Genetics (1998)20: 123-128 Muyrers et al., EMBO Rep.(2000) 1(3):239-243); способами, основанными на рекомбинации Red/ET (Wenzel et al., Chem Biol. (2005), 12(3):349-56; Vetcher et al., Appl Environ Microbiol. (2005);71(4):1829-35); или с помощью положительных клонов, т.е. клонов, которые несут кассету экспрессии, могут быть отобраны, например, с помощью маркерного гена, или потери или усиления функции гена.

Одной копии кассеты экспрессии, включающей интересующий ген, может быть достаточно для обеспечения продукции желаемого ОГМ и достижения желаемых эффектов согласно изобретению. Соответственно, в некоторых предпочтительных воплощениях изобретение относится к рекомбинантной ОГМ-продуцирующей клетке, которая включает одну, две или три копии представляющего интерес гена, интегрированного в геномную ДНК клетки. В некоторых воплощениях предпочтительна единственная копия гена.

В одном предпочтительном воплощении рекомбинантная кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению представляет собой гетерологичную последовательность по отношению к промотору, что означает, что эквивалентная нативная кодирующая последовательность в геноме вида происхождения транскрибируется под контролем другой промоторной последовательности (т.е. не промоторной последовательности конструкции). Тем не менее, что касается клетки-хозяина, кодирующая ДНК может быть либо гетерологичной (т.е. полученной из другого биологического вида или рода), такой как, например, последовательность ДНК, кодирующая белок Vag, экспрессированная в клетках-хозяевах Escherichia coli, или гомологичной (т.е. полученной из клеткихозяина), такой как, например, гены оперона толстой кишки, гены GMAB.

Термин регуляторный элемент, или промотор, или промоторная область, или промоторный элемент представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая распознается и связывается ДНК-зависимой РНК-полимеразой во время инициации транскрипции. Промотор вместе с другими последовательностями нуклеиновых кислот, регулирующими транскрипцию и трансляцию (также называемыми контрольными последовательностями), необходим для экспрессии данного гена или

- 8 046260 группы генов (т.е. оперона). Как правило, транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности включают, но не ограничиваются ими, промоторные последовательности, сайты связывания рибосом, последовательности начала и остановки транскрипции, последовательности начала и остановки трансляции, последовательности терминатора транскрипции и последовательности энхансера или активатора. Сайт старта транскрипции означает первый транскрибируемый нуклеотид и обозначен как +1. Нуклеотиды ниже стартового сайта пронумерованы +2, +3, +4 и т.д., а нуклеотиды в 5' противоположном (выше) направлении пронумерованы -1, -2, -3 и т.д. Последовательность промоторной ДНК конструкции может происходить из промоторной области любого гена генома выбранного вида, предпочтительно, из промоторной области геномной ДНК E.coli. Соответственно, любая промоторная последовательность ДНК, которая может связываться с РНК-полимеразой и инициировать транскрипцию, подходит для осуществления изобретения. В принципе, любая промоторная последовательность ДНК может быть применена для контроля транскрипции интересующего рекомбинантного гена конструкции, разные или одинаковые промоторные последовательности могут быть применены для управления транскрипцией различных представляющих интерес генов, интегрированных в геном клетки-хозяина или в ДНК вектора экспрессии. Для обеспечения оптимальной экспрессии рекомбинантного гена(рекомбинантных генов), включенного(включенных) в конструкцию, конструкция может содержать дополнительные регуляторные последовательности, например, лидирующую последовательность ДНК, такую как последовательность ДНК, полученную из 5'-нетранслируемой области (5'UTR) гена glp E.coli, последовательность для рибосомного связывания. Примеры последних последовательностей описаны в WO 2019123324 (включена в настоящий документ в качестве отсылки) и проиллюстрированы в настоящем документе в неограничивающих рабочих примерах.

В некоторых предпочтительных воплощениях регуляторный элемент для регуляции экспрессии рекомбинантного гена, включенного в конструкцию по изобретению, представляет собой промотор оперона glpFKX, PglpF, в других предпочтительных воплощениях промотор представляет собой промотор оперона lac, Plac.

В еще одном аспекте регуляторный элемент для регуляции экспрессии рекомбнантного гена, включенного в конструкцию по изобретению, представляет собой mglBAC; промотор транспортера галактозы/метилгалактозидазы PmglB или их варианты, такие как, но не ограничиваясь ими, PmglB_70UTR последовательности SEQ ID NO: 27 или PmglB_70UTR_SD4 последовательности SEQ ID NO: 28.

В еще одном аспекте регуляторный элемент для регуляции экспрессии рекомбинантного гена, включенного в конструкцию по изобретению, представляет собой gatYZABCD; промотор тагатозо-1,6бисР-альдолазы PgatY или его варианты, такие как, но, не ограничиваясь ими, PgatY_U70UTR последовательности SEQ ID NO: 29.

Предпочтительный в настоящее время регуляторный элемент, присутствующий в генетически модифицированной клетке и/или в конструкции нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, выбирают из группы, состоящей из

PgatY 7OUTR, PglpF,

PglpF SD1, PglpF SD10, PglpF SD 2, PglpF SD3, PglpF SD 4, PglpF SD 5, PglpF SD 6, PglpF SD7, PglpF SD8, PglpF SD9, Plac 16UTR, Plac, PmglB 7OUTR и PmglB 7OUTR SD4.

Особенно предпочтительные регуляторные элементы, присутствующие в генетически модифицированной клетке и/или в конструкции нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, выбирают из группы, состоящей из PglpF и Plac.

Однако любой промотор, обеспечивающий транскрипцию и/или регуляцию уровня транскрипции одной или нескольких рекомбинантных нуклеиновых кислот, кодирующих один или несколько белков (или одну или несколько регуляторных нуклеиновых кислот), которые либо необходимы, либо полезны для достижения оптимального уровня биосинтетического производства одного или нескольких ОГМ в клетке-хозяине, например, глюкозилтрансферазы, белков, участвующих в трансмембранном транспорте ОГМ или предшественника ОГМ, белков, регулирующих экспрессию генов, и т.д., и позволяющих достичь желаемых эффектов по изобретению, подходят для практического применения изобретения.

Предпочтительно конструкция по настоящему изобретению, включающая ген, связанный с биосинтетическим продуцированием ОГМ, промоторную последовательность ДНК и другие регуляторные последовательности, такие как последовательность сайта связывания рибосомы (например, последовательность Шайна-Дальгарно), экспрессируемая в клетке-хозяине, обеспечивает ОГМ на уровне не менее 0,03 г/OD (оптическая плотность) на 1 л ферментационной среды, содержащей суспензию клеток-хозяев, например, на уровне около 0,05 г/л/OD, около 0,1 г/л/OD и более. Для целей изобретения последний уровень продукции ОГМ считается достаточным или оптимальным, а клетка-хозяин, способная продуцировать желаемый уровень ОГМ, считается подходящей клеткой-хозяином, т.е. клетка может быть дополнительно модифицирована для экспрессии белка-переносчика ОГМ, например Vag, для достижения хотя бы одного из описанных в настоящем документе эффектов, выгодных для производства ОГМ.

- 9 046260

Генетически модифицированная клетка и/или конструкция нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает последовательность нуклеиновой кислоты, такую как гетерологичный ген, кодирующий предполагаемый белок-переносчик MFS (суперсемейство основных посредников).

Белок Vag - это транспортный белок MFS, представляющий особый интерес в настоящем изобретении. Таким образом, конструкция нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичности последовательности с геном, vag, SEQ ID NO: 2.

Последовательность нуклеиновой кислоты, содержащаяся в генетически модифицированной клетке или в конструкции нуклеиновой кислоты, кодирует белок последовательности SEQ ID NO: 1 или его функциональный гомолог, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 1.

Функциональный гомолог белка последовательности SEQ ID NO: 1 может быть получен путем мутагенеза. Функциональный гомолог должен иметь оставшуюся функциональность не менее 50%, такую как 60%, 70%, 80%, 90% или 100% по сравнению с функциональностью аминокислотной последовательности последовательности SEQ ID NO: 1. Функциональный гомолог может иметь более высокую функциональность по сравнению с функциональностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Функциональный гомолог последовательности SEQ ID NO: 1 должен быть способен усиливать продукцию ОГМ генетически модифицированной клетки по изобретению.

Генетически модифицированная клетка (клетка-хозяин или рекомбинантная клетка) может представлять собой, например, бактериальную или дрожжевую клетку. В одном предпочтительном воплощении генетически модифицированная клетка представляет собой бактериальную клетку. Что касается бактериальных клеток-хозяев, то в принципе ограничений нет; они могут представлять собой эубактерии (грамм-положительные или грамм-отрицательные) или архебактерии, если они допускают генетические манипуляции для вставки интересующего гена и их можно культивировать в производственных масштабах. Предпочтительно клетка-хозяин обладает свойством культивирования до высокой плотности клеток. Неограничивающими примерами бактериальных клеток-хозяев, подходящих для рекомбинантного промышленного производства ОГМ согласно изобретению, могут представлять собой

Erwinia herbicola (Pantoea agglomerans), Citrobacter freundii, Pantoea citrea, Pectobacterium carotovorum или Xanthomonas campe str is.

Также могут быть применены бактерии рода Bacillus, в том числе

Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus thermophilus, Bacillus laterosporus, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus pumilus, Bacillus lentus, Bacillus cereus и Bacillus circulans.

Аналогично, бактерии родов Lactobacillus и Lactococcus могут быть модифицированы с применением способов по данному изобретению, включая, но не ограничиваясь ими,

Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus jensenii и Lactococcus lactis. Streptococcus thermophiles и Proprionibacterium freudenreichii также представляют собой подходящие виды бактерий для описанного в настоящем документе изобретения. Также часть этого изобретения представляют собой штаммы, модифицированные, как описано в настоящем документе, из родов

Enterococcus (например, Enterococcus faecium и

Enterococcus thermophiles), Bifidobacterium (например, Bifidobacterium longum,

Bifidobacterium inf antis и Bifidobacterium bifidum), Sporolactobacillus spp., Micromomospora spp., Micrococcus spp., Rhodococcus spp. и Pseudomonas (например, Pseudomonas fluorescens и Pseudomonas aeruginosa).

Бактерии, обладающие характеристиками, описанными в настоящем документе, культивируют в присутствии лактозы, и олигосахарид, такой как ОГМ, продуцируемый клеткой, выделяют либо из самой бактерии, либо из культурального супернатанта бактерии. В одном предпочтительном воплощении генетически модифицированная клетка по изобретению представляет собой клетку Escherichia coli.

В другом предпочтительном воплощении клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку, например

- 10 046260

Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe,

Pichiapastoris, Kluveromyces lactis, Kluveromyces marxianus и т.п.

ОГМ, продуцируемый рекомбинантными клетками по изобретению, может быть очищен с применением подходящей процедуры, доступной в данной области техники (например, такой, как описан в WO 2015188834, WO 2017182965 или WO 2017152918). Генетически модифицированные клетки по изобретению могут быть получены с применением стандартных способов в данной области техники, например описанных в руководствах Sambrook et al., Wilson & Walker, Maniatise et al. и Ausubel et al.

Клетка-хозяин, подходящая для производства ОГМ, например Е.соН, может включать эндогенный ген β-галактозидазы или экзогенный ген β-галактозидазы, например E.coli, включает эндогенный ген lacZ (например, номер доступа в GenBank V00296 (GL41901)). Для целей изобретения клетка, продуцирующая ОГМ, подвергается генетическим манипуляциям либо для включения любого гена βгалактозидазы, либо для включения инактивированной версии гена. Ген может быть инактивирован путем полной или частичной делеции соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты из бактериального генома, или последовательность гена может быть мутирована так, как она транскрибируется, или, если транскрибируется, транскрипт не транслируется, или если транслируется в белок (т.е. βгалактозидазу), то белок не обладает соответствующей ферментативной активностью. Таким образом, клетка, продуцирующая ОГМ, накапливает повышенный внутриклеточный пул лактозы, что полезно для продукции ОГМ.

В некоторых воплощениях зародышевая клетка включает дефицитный катаболический путь сиаловой кислоты. Под катаболическим путем сиаловой кислоты подразумевается последовательность реакций, обычно контролируемая и катализируемая ферментами, которая приводит к разложению сиаловой кислоты. Примерный путь катаболизма сиаловой кислоты, описанный в настоящем документе, представляет собой путь E. coli. В этом пути сиаловая кислота (Neu5Ac; N-ацетилнейраминовая кислота) расщепляется ферментами NanA (лиаза N-ацетилнейраминовой кислоты), NanK (N-ацетилманнозаминкиназа) и NanE (№ацетилманнозамин-6-фосфатэпимераза), все кодируемые из оперона nanATEK-yhcH, и подавляется NanR (http://ecocyc.org/ECOLI). Недостаточный катаболический путь сиаловой кислоты воспроизводится у хозяина E.coli путем внесения мутации в эндогенные гены nanA (N-ацетилнейраминалиаза) (например, номер доступа в GenBank D00067.1 (GL216588)) и/или nanK (N-ацетилманнозаминкиназа) (например, номер доступа в GenBank (аминокислота) ВАЕ77265.1 (GL85676015)), и/или папЕ (Nацетилманнозамин-6-фосфатэпимераза, GI: 947745, включена сюда посредством отсылки). Необязательно ген nanT (транспортер N-ацетилнейрамината) также инактивируют или мутируют. Другие промежуточные продукты метаболизма сиаловой кислоты включают: (ManNAc-6-P) №ацетилманнозамин-6фосфат; (GlcNAc-6-P) №ацетилглюкозамин-6-фосфат; (GlcN-6-P) глюкозамин-6-фосфат и (Fruc-6-P) фруктозо-6-фосфат. В некоторых предпочтительных воплощениях nanA мутирован. В других предпочтительных воплощениях nanA и nanK мутированы, тогда как nanE остается функциональным. В другом предпочтительном воплощении nanA и nanE мутированы, тогда как nanK не был мутирован, инактивирован или удален. Мутация представляет собой одно или несколько изменений в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт гена nanA, nanK, nanE и/или nanT. Например, мутация может представлять собой 1, 2, до 5, до 10, до 25, до 50 или до 100 изменений в последовательности нуклеиновой кислоты. Например, nanA, nanK, nanE и/или nanT гены мутируют путем нулевой мутации. Нулевые мутации, как описано в настоящем документе, включают аминокислотные замены, добавления, делеции или вставки, которые либо вызывают потерю функции фермента (т.е. снижение или отсутствие активности), либо потерю фермента (т.е. отсутствие генного продукта). Под удаленными подразумевают, что кодирующая область удалена полностью или частично, так что не образуется (функциональный) продукт гена. Под инактивацией подразумевается, что кодирующая последовательность была изменена таким образом, что полученный генный продукт будет функционально неактивным или будет кодировать генный продукт с активностью менее чем на 100%, например на 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% или 20% по сравнению с активностью нативного, встречающегося в природе, эндогенного генного продукта. Немутированный ген или белок не отличается от нативной, встречающейся в природе или эндогенной кодирующей последовательности на 1, 2, вплоть до 5, вплоть до 10, вплоть до 20, вплоть до 50, вплоть до 100, вплоть до от 200 или вплоть до 500 или более кодонов или до соответствующей закодированной аминокислотной последовательности.

Кроме того, клетка-хозяин (например, Е.соН) также обладает способностью к синтезу сиаловой кислоты. Например, бактерия обладает способностью синтезировать сиаловую кислоту за счет экзогенной UDP-GlcNAc 2-эпимеразы (например, neuC из Campyiobacter jejuni (GenBank AAK91727.1; GL15193223) или ее эквивалентов (например neuC из E.coli S88 (GenBank YP_002392936.1; GI:218560023), синтазы Neu5Ac (например, neuB из С. jejuni (GenBank AAK91726.1; GI:15193222) или ее эквивалентов, (например, синтазы сиаловой кислоты из Flavobacterium limnosediminis, GenBank GL559220424), и/или синтазы CMP-Neu5Ac (например, neuA из С. jejuni (GenBank AAK91728.1; GI:15193224) или ее эквивалентов, (например, СМР-синтазы сиаловой кислоты Vibrio brasiliensis, GenBank GI:493937153).

Получение нейтрального ОГМ, содержащего N-ацетилглюкозамин, в сконструированных бактериях

- 11 046260 и дрожжах известно в данной области техники (смотри, например, Gebus С et al. (2012) Carbohydrate Research 363 83-90; US 10519475).

Для производства ОГМ, содержащих Ы-ацетилглюкозамин, таких как лакто-Ы-триоза 2 (LNT-2), лакто-Ы-тетраоза (LNT), лакто-Ы-неотетраоза (LNnT), лакто-Ы-фукопентаоза I (LNFP-I), лакто-Ыфукопентаоза II (LNFP-II), лакто-Ы-фукопентаоза III (LNFP-III), лакто-Ы-фукопентаоза V (LNFP-V), лакто-Ы-дифукогексаоза I (LDFH-I), лакто-Ы-дифукогексаоза II (LDFH-II) и лакто-Ы-неодифукогексаоза II (LNDFH-III), бактерия включает функциональный ген lacY и дисфункциональный ген lacZ, как описано выше, и он сконструирован так, чтобы включать экзогенный ген UDP-GlcЫAc:Galα/β-R-β-3-Ыацетилглюкозаминилтрансферазы или его функциональный вариант или фрагмент. Этот экзогенный ген UPD-GlcNAc:Galα/β-Rβ-3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (ОсЫАсТ) может быть получен из любого из ряда источников (см. табл. 1), например, из гена lgtA, описанного в Ы. meningitidis (номер доступа белка в GenBank AAF42258.1) или Ы. gonorrhoeae (номер доступа белка в GenBank ACF31229.1). Необязательно дополнительный ген экзогенной гликозилтрансферазы может быть коэкспрессирован в бактерии, включающей экзогенный ген UDP-GlcЫAc:Galα/β-R-β-3-Ы-ацетилглюкозаминилmрансферазы. Например, ген в-1,4-галактозилтрансферазы (Gal4T) коэкспрессируется с геном UPD-GlcЫAc:Galα/β-R-βЫ-ацетилглюкозаминилтрансферазы. Этот экзогенный ген в-1,4-галактозилтрансферазы может быть получен из любого источника, например, описанного в Ы. meningitidis, ген lgtB (номер доступа белка в GenBank AAF42257.1) или из Н. pylori, ген HP0826/galT (номер доступа белка в GenBank ЫР207619.1). Необязательно дополнительный ген экзогенной гликозилтрансферазы, коэкспрессируемый в бактерии, включающей экзогенный ген UDP-GlcЫAc:Galα/β-R-β-3-Ы-ацетилглюкозаминилmрансферазы, представляет собой ген в-1,3-галактозилтрансферазы (Gal3T), например, тот, что описан из E.coli 055:Н7, ген wbgO (номер доступа белка в GenBank WP000582563.1), или из Н. pylori, ген jhp0563 (номер доступа белка в GenBank AEZ55696.1), или из Streptococcus agalactiae type Ib OI2 ген cpslBJ g (номер доступа белка в GenBank AB050723.1). Раскрытое изобретение также охватывает функциональные варианты и фрагменты любого из ферментов, описанных выше.

Ген Ы-ацетилглюкозаминилтрансферазы и/или ген галактозилтрансферазы также может быть функционально связан с Pglp и экспрессироваться из соответствующей интегрированной в геном кассеты. В одном воплощении ген, интегрированный в геном, представляет собой ген, кодирующий галактозилтрансферазу, например, ген НР0826, кодирующий фермент GalT из Н. pylori (номер доступа белка в GenBank ЫР207619.1); в другом воплощении ген, интегрированный в геном, представляет собой ген, кодирующий в-1,3-Ы-ацетилглюкозаминилтрансферазу, например, ген lgtA из Ы. meningitidis (номер доступа белка в GenBank AAF42258.1). В этих воплощениях второй ген, т.е. ген, кодирующий в-1,3-Ыацетилглюкозаминилтрансферазу или галактозилтрансферазу, соответственно, может экспрессироваться либо из интегрированной в геном, либо из переносимой плазмидой кассеты. Второй ген необязательно может экспрессироваться либо под контролем промотора glp или под контролем любого другого промотора, подходящего для системы экспрессии, например, Plac.

Если не указано иное, все технические и научные термины, применяемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области, к которой относится данное изобретение. Singleton et al. (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, second edition, John Wiley and Sons (№w York) предоставляет специалисту общий словарь многих терминов, применяемых в этом изобретении. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут быть применены на практике или тестировании настоящего изобретения, описаны предпочтительные способы и материалы. Большую часть номенклатуры и общих лабораторных процедур, необходимых для этого приложения, можно найти в руководствах Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ыew York (2012); Wilson K. and Walker J., Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology (2010), Cambridge University Press; или в Maniatis et al., Molecular Cloning A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2012); или в Ausubel et al., Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sohns (2010). Руководства далее именуют Sambrook et al., Wilson & Walker, Maniatis et al., Ausubel et al., соответственно.

Второй аспект изобретения относится к способу получения одного или нескольких ОГМ, включающему следующие этапы:

(i) обеспечение генетически модифицированной клетки, способной продуцировать ОГМ, причем указанная клетка включает рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок последовательности SEQ ID ЫО: 1, или ее функциональный гомолог, аминокислотная последовательность которого идентична по меньшей мере на 80%, предпочтительно идентична по меньшей мере на 85%, более предпочтительно идентична по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID ЫО: 1;

(ii) культивирование клетки (i) в подходящей среде для культивирования клеток для экспрессии указанной рекомбинантной нуклеиновой кислоты;

(iii) сбор ОГМ, полученного на этапе (ii).

Согласно изобретению термин культивирование (или культивирование или культивирование,

- 12 046260 также называемое ферментация) относится к размножению бактериальных экспрессирующих клеток в контролируемом биореакторе в соответствии со способами, известными в промышленности.

Для получения одного или нескольких ОГМ бактерии, продуцирующие ОГМ, как описано в настоящем документе, культивируют в соответствии с процедурами, известными в данной области техники, в присутствии подходящего источника углерода, например глюкозы, глицерина, лактозы и т.д., и полученный ОГМ собирают из сред культивирования и микробной биомассы, образующейся в процессе культивирования. После этого ОГМ очищают в соответствии с процедурами, известными в данной области техники, например, такими, как описаны в WO 2015188834, WO 2017182965 или WO 2017152918, и очищенный ОГМ применяют в качестве нутрицевтиков, фармацевтических препаратов или для любых других целей, например, для исследований. Производство ОГМ обычно осуществляется путем культивирования в больших объемах. Термин производство и производственный масштаб в значении изобретения определяет ферментацию с минимальным объемом 5 л культурального бульона. Обычно процесс в производственном масштабе определяют способностью обрабатывать большие объемы препарата, содержащего ОГМ или представляющий интерес ОГМ, и производить такие количества представляющего интерес белка, которые соответствуют, например, в случае терапевтического соединения или композиции, требованиям для клинических испытаний, а также для предложения на рынке. Помимо большого объема способ в производственных масштабах, в отличие от простых способов в лабораторных масштабах, таких как культивирование во встряхиваемых колбах, характеризуется применением технической системы биореактора (ферментера), оснащенного устройствами для перемешивания, аэрации, подачи питательных веществ, слежения за параметрами процесса и контроля параметров процесса (pH, температура, давление растворенного кислорода, обратное давление и др.). В значительной степени поведение системы экспрессии в лабораторном масштабе, например во встряхиваемых колбах, настольных биореакторах или формате глубоких лунок, описанных в примерах настоящего раскрытия, позволяет предсказать поведение этой системы этой системы в сложной среде биореактора.

Что касается подходящей среды для культивирования, применяемой в процессе ферментации, ограничений нет. Культуральная среда может быть полуопределенной, то есть содержащей комплексные соединения среды (например, дрожжевой экстракт, соевый пептон, казаминовые кислоты и т.д.), или она может быть химически определенной, без каких-либо комплексных соединений.

Под термином один или несколько ОГМ подразумевают, что производственная ячейка ОГМ может быть способна производить одну структуру ОГМ (первый ОГМ) или несколько структур ОГМ (второй, третий и т.д. ОГМ). В некоторых воплощениях может быть предпочтительной клетка-хозяин, которая продуцирует один ОГМ, в других предпочтительных воплощениях может быть предпочтительной клетка-хозяин, продуцирующая несколько структур ОГМ. Клетки, продуцирующие 2'FL, 3FL, 3'SL, 6'SL или LNT-2 представляют собой неограничивающие примеры клеток-хозяев, продуцирующих ОГМ единственной структуры. Неограничивающие примеры клеток-хозяев, способных продуцировать несколько структур ОГМ, могут представлять собой клетки-продуценты DFL, FSL, LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-Ш, LNFP-IV, LNFP-V, pLNnHor-II.

Термин сбор в контексте изобретения относится к сбору полученных ОГМ после прекращения ферментации. В различных воплощениях это может включать сбор ОГМ, включенных как в биомассу (т.е. клетки-хозяева), так и в среду культивирования, т.е. до/без отделения ферментационного бульона от биомассы. В других воплощениях полученный ОГМ можно собирать отдельно от биомассы и ферментационного бульона, т.е. после отделения/следом за отделением биомассы от среды культивирования (т.е. ферментационного бульона). Отделение клеток от среды может быть осуществлено любым из способов, хорошо известных специалисту в данной области техники, например, любым подходящим типом центрифугирования или фильтрации. Отделение клеток от среды может следовать сразу за сбором ферментационного бульона или осуществляться на более позднем этапе после хранения ферментационного бульона в соответствующих условиях. Извлечение произведенных ОГМ из оставшейся биомассы (или полная ферментация) включает их извлечение из биомассы (т.е. клеток-продуцентов). Это можно осуществить любыми подходящими способами в данной области техники, например, обработкой ультразвуком, кипячением, гомогенизацией, ферментативным лизисом с применением лизоцима или замораживанием и измельчением.

После восстановления после ферментации ОГМ доступны для дальнейшей обработки и очистки.

Очистку ОГМ, полученных ферментацией, можно проводить с применением подходящей процедуры, описанной в WO 2016095924, WO 2015188834, WO 2017152918, WO 2017182965, US 20190119314 (все включены посредством отсылки).

В некоторых воплощениях изобретения клетка-хозяин может продуцировать несколько ОГМ, где один ОГМ представляет собой ОГМ-продукт, а некоторые/все прочие ОГМ представляют собой ОГМпобочный продукт. Как правило, побочные ОГМ представляют собой либо основных предшественников ОГМ, либо продукты дальнейшей модификации основных ОГМ. В некоторых воплощениях может быть желательно производить продукт ОГМ в больших количествах и побочный продукт ОГМ в малых количествах. Клетки и способы получения ОГМ, описанные в настоящем документе, обеспечивают контролируемое производство продукта ОГМ с заданным профилем ОГМ, например в одном воплощении

- 13 046260 полученная смесь ОГМ, в которой продукт ОГМ представляет собой доминирующим ОГМ по сравнению с другими ОГМ (т.е. побочными ОГМ) смеси, т.е. ОГМ-продукт производится в большем количестве, чем другие ОГМ-побочные продукты; в других воплощениях клетка, производящая одну и ту же смесь ОГМ, может быть настроена на производство одного или нескольких побочных продуктов ОГМ в большем количестве, чем ОГМ-продукт. Например, при производстве LNnT, ОГМ-продукта, часто образуется значительное количество pLNnH, ОГМ-побочного продукта. В другом примере при производстве LNT образуется значительное количество побочного продукта pLNH-II. С генетически модифицированными клетками по настоящему изобретению уровень pLNnH в LNnT-продукте может быть значительно снижен.

Преимущественно изобретение обеспечивает как снижение отношения побочного продукта к продукту, так и увеличение общего выхода продукта (и/или ОГМ в целом). Это сниженное образование побочных продуктов по сравнению с образованием продукта, способствует повышенному образованию продукта и повышает эффективность как производства, так и процесса извлечения продукта, обеспечивая превосходную технологию производства ОГМ.

В различных предпочтительных воплощениях могут быть выбраны различные клетки-хозяева, продуцирующие один/оба 2'FL, 3FL, 3'SL, 6'SL, LNT-2, DFL, FSL, LNT, LNnT, DFL, FSL, LNT, LNnT, LNFPI, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-IV, LNFP-V, pLNnH, pLNH-II, в качестве ОГМ продукта или побочного продукта. В одном предпочтительном воплощении продукт представляет собой LNnT, а побочный продукт представляет собой pLNnH. В другом предпочтительном воплощении продукт представляет собой LNT, a побочный продукт представляет собой pLNH-II.

Изобретение также относится к применению генетически модифицированной клетки и/или конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению для продукции одного или нескольких олигосахаридов, предпочтительно, одного или нескольких олигосахаридов грудного молока. В одном воплощении генетически модифицированную клетку и/или конструкцию нуклеиновой кислоты по изобретению применяют для получения конкретного ОГМ, выбранного из группы, состоящей из 2'-FL, 3-FL, DLF, LNT, LNT-II, LNnT, pLNH-II и pLNnH.

В особенно предпочтительном воплощении генетически модифицированную клетку и/или конструкцию нуклеиновой кислоты по изобретению применяют для получения конкретного ОГМ, выбранного из группы, состоящей из LNT, LNT-II, LNnT и pLNH-II и pLNnH.

Изобретение дополнительно проиллюстрировано приведенными ниже неограничивающими примерами и воплощениями.

Примеры

Материалы и методы

Если не указано иное, для манипулирования с нуклеиновыми кислотами, трансформации и экспрессии нуклеиновых кислот применяют стандартные методики, векторы, элементы контрольной последовательности и другие элементы системы экспрессии, известные в области молекулярной биологии. Такие стандартные техники, векторы и элементы можно найти, например, в руководствах:

Ausubel et al. (eds.), Current

Protocols in Molecular Biology (1995) (John Wiley & Sons); Sambrook, Fritsch, & Maniatis (eds.), Molecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Berger & Kimmel, Methods in Enzymology 152: Guide to Molecular Cloning Techniques (1987) (Academic Press); Bukhari et al. (eds.), DNA Insertion Elements, Plasmids andEpisomes (1977) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Miller, J.H. Experiments in molecular genetics (1972.) (Cold spring Harbor Laboratory Press, NY)

Описанные ниже воплощения выбраны для иллюстрации изобретения и никоим образом не ограничивают изобретение.

Штаммы

Применяемый бактериальный штамм, MDO, был сконструирован из Escherichia coli K12 DHL Генотип E.coli K12 DH1 представлял собой: F^-, λ^-, gyrA96, recA1, relA1, endA1, thi-1, hsdR17, supE44. Штаммы, примененные в настоящих примерах, описаны в табл. 2.

- 14 046260

Таблица 2

in та мм о в	11 ро 1\ к'	( оо вс к· । в\ louuiii । ено ι ни
DH1	-	F λ endA 1 recA 1 relA 1 gyrA96thi-1 glnV44hsdRl 7(гк тк )
MDO	-	E coli DH1 AlacZ, AlacA, ΔηαηΚΕΤΑ, AmelA, AwcaJ, AmdoH
МР3672	LNnT	MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal4T (version 1) *
МР3708	MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal4TPlac-yberC0001 9420
МР3972	MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal4TP lac-bad
МР3979	MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal4TPlac-fred
МР4011	MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal4TPlac-marc
МР3994	MDO PglpF-GlcNAcTPglpF-Gal4TPlac-vag (версия 1) **
МР3984	MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal4TPlac-nec
МР4362	MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal4T Plac-yabM
МР3020	MDO PglpF-GlcNAcTPglpF-Gal4T (версия 2) *
МР4064	MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal4TPglpF-vag
МР4065	MDOPglpF-GlcNAcTPglpF-Gal4TPlac-vag (версия 2)**
МР4473	LNT	MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal3T
МР4546	MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal3T PglpF-vag

*Штаммы МР3672 и МР3020 несут одни и те же гетерологичные GlcNAcT и Gal4T, но отличаются количеством копий соответствующего гена, кодирующего GlcNAcT.

**Штаммы МР3994 и МР4065 несут одни и те же гетерологичные GlcNAcT и Gal4T, но отличаются числом копий соответствующего гена, кодирующего GlcNAcT.

Среда

Среду для бульона Луриа (LB) готовили с применением порошка бульона LB, Millers (Fisher Scientific), а чашки с агаром LB готовили с применением порошка агара LB, Millers (Fisher Scientific). При необходимости добавляли ампициллин ((100 мкг/мл) или любой подходящий антибиотик) и/или хлорамфеникол (20 мкг/мл).

Базовая минимальная среда имела следующий состав: NaOH (1 г/л), КОН (2,5 г/л), KH2PO4 (7 г/л), NH4H2PO4 (7 г/л), лимонная кислота (0,5 г/л), раствор микроэлементов (5 мл/л). Исходный раствор микроэлементов содержал: ZnSO₄-7H₂O 0,82 г/л, лимонную кислоту 20 г/л, MnSO₄-H₂O 0,98 г/л, FeSO₄-7H₂O 3,925 г/л, CuSO₄-5H₂O 0,2 г/л. pH базовой минимальной среды доводили до 7,0 с помощью 5 н NaOH и автоклавировали. Перед инокуляцией в базовую минимальную среду добавляли 1 мМ MgSO₄, 4 мкг/мл тиамина, 0,5% заданного источника углерода (глицерин (Carbosynth)) и при необходимости добавляли изопропил-e-D-тиогалактозид (IPTG) (0,2 мМ). Тиамин, антибиотики и IPTG стерилизовали фильтрованием. Все процентные концентрации для глицерина выражены как об./об., а для глюкозы - мас./об.

Чашки М9, содержащие 2-дезоксигалактозу, имели следующий состав: 15 г/л агара (Fisher Scientific), 2,26 г/л 5\\\М9 Minimal Salt (Sigma-Aldrich), 2 мМ MgSO₄, 4 мкг/мл тиамина, 0,2% глицерина и 0,2% 2-дезокси-0-галактозы (Carbosynth).

Индикаторные планшеты МакКонки имели следующий состав: 40 г/л агаровая основа МакКонки (BD Difco™) и источник углерода в конечной концентрации 1%.

Культивирование

Если не указано иное, то штаммы E.coli размножали в среде Луриа-Бертани (LB), содержащей 0,2% глюкозы, при 37°С при перемешивании. Чашки с агаром инкубировали при 37°С в течение ночи.

Химически компетентные клетки и трансформации

E. coli инокулировали из чашек LB в 5 мл LB, содержащего 0,2% глюкозы, при 37°С при встряхивании до CD₆oo ~0,4. 2 мл культуры собирали центрифугированием в течение 25 с при 13000 g. Супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в 600 мкл холодных растворов ТВ (10 мМ PIPES, 15 мМ CaCl₂, 250 мМ KCl). Клетки инкубировали на льду в течение 20 мин с последующим осаждением в течение 15 с при 13000 g. Супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в 100 мкл холодного раствора ТВ. Трансформацию плазмид проводили с применением 100 мкл компетентных клеток и 1-10 нг плазмидной ДНК. Клетки и ДНК инкубировали на льду в течение 20 мин, а затем подвергали тепловому шоку при 42°С в течение 45 с. После 2-минутной инкубации на льду добавляли 400 мкл SOC (20 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 0,5 г/л NaCl, 0,186 г/л KCl, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ MgSO₄ и 20 мМ глюкозы) и культуру клеток инкубировали при 37°С при встряхивании в течение 1 ч перед посевом на селективные чашки.

Плазмиду трансформировали в химически компетентные клетки ТОР10 в условиях, рекомендованных поставщиком (ThermoFisher Scientific).

ДНК методы

Плазмидную ДНК из E.coli выделяли с применением набора QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). Хромосомную ДНК из E.coli выделяли с применением набора QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen). Продукты ПЦР очищали с применением набора QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Мастер-микс для ПЦР DreamTaq (Thermofisher), мастер-микс для ПЦР с горячим стартом Phusion U (Thermofisher), USER Enzyme (New England Biolab) применяли в соответствии с рекомендациями поставщика. Праймеры

- 15 046260 были поставлены компанией Eurofins Genomics, Германия. Фрагменты ПЦР и плазмиды были секвенированы компанией Eurofins Genomics. ПЦР колоний проводили с применением DreamTaq PCR Master Mix в термоциклере Т100ТМ (Bio-Rad).

Таблица 3. Олигонуклеотиды, применяемые для амплификации остова плазмиды, промоторных элементов и представляющих интерес генов

I кивание	SEQ II) ХО	О.пп онукмео гпднам пос.тедова ге.тыюсгь 5' - 3'	Описание
040	5	ATTAACCCUCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGG С	Остов, прямой
068	6	ATGCGCAAAUTGTGAGTTAGCTCACTCATTAG	Р1 ас. прямой
079	7	ATTTGCGCAUCACCAATCAAATTCACGCGGCC	Остов, обратный
0113	8	AGCTGTTUCCTCCTTAGGTACCCAGCTTTTGTTCC С	Р1ас. обратный
0261	9	ATGCGCAAAUGCGGCACGCCTTGCAGATTACG	Pgl pF. прямой
0262	10	AGCTGTTUCCTCCTTGGTTAATGTTTGTTGTATGC G	Pgl pF. обратный
kaby745	И	AAACAGCUATGAAGAGCCTGCTGACCCGTAAAC	vag .прямой
kaby746	12	AGGGTTAAUTTAAACGTTTTTCACACGCGCG	vag .обратный
kaby721	13	AAACAGCUATGAAGAGCGCGCTGACCTTTAGC	yberC0001_9420.n рямой
kaby722	14	AGGGTTAAUTTACGCCTCACGCACACGCG	yberC0001_9420.o братный
kaby733	15	AAACAGCUATGAAGAGCGCGCTGACCTTCAG	fred.прямой
kaby734	16	AGGGTTAAUTTACGCTTCACGCACACGCG	fred.обратный
kaby729	17	AAACAGCUATGAGCAGCCGTCGTCTGAGC	bad. прямой
kaby730	18	AGGGTTAAUTTACACGTTTTTAACACGGGTCATC AG	bad. обратный
kaby741	19	AAACAGCUATGCAGAGCTTCACCCCGCC	пес. прямой
kaby742	20	AGGGTTAAUTTACGCCTGCTCTTTAACACGCAGC	пес. обратный
kaby737	21	AAACAGCUATGCAGCGTCTGAGCCGTCTGAG	marc, прямой
kaby738	22	AGGGTTAAUTTAAACTTCACGCACTTTCGCGC	marc, обратный
048	23	CCCAGCGAGACCTGACCGCAGAAC	galK. прямой
049	24	CCCCAGTCCATCAGCGTGACTACC	galK. обратный
МР1217	25	AAACAGCUATGAAGGCGCTGTGGAGCCGTCG	уаЬМ.прямой
МР1218	26	AGGGTTAAUCGCCAGCGGAACGCTCTTCACG	уаЬМ.обратный

Таблица 4. Гетерологичные гены транспортеров MFS, протестированные на микробных хозяевах по настоящему изобретению

	Происхождение ИИиИИИИИИИ·	Помер лоси na	Фу iik'uiih белка
yberCOOOl 9420	Yersinia bercovieri	EEQ08298.1	Суперсемейство основных посредников MFS 1
fred*	Yersinia frederiksenii	WP 087817556.1	Транспортер MFS
пес*	Rosenbergiella nectarea	WP_092672081.1	Транспортер MFS
marc*	Serratia marcescens	WP 060448169.1	Транспортер MFS
bad*	Rouxiella badensis	WP 017489914.1	Транспортер MFS
vag *	Pantoea vag ans	WP 048785139.1	Транспортер MFS
yabM	Erwinia pyrifoliae	CAY73138.1	Предполагаемый переносчик оттока сахара MFS

*название гена дано для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, имеющий ами нокислотную последовательность, соответствующую номеру доступа в GenBank, для целей настоящего изобретения

- 16 046260

Таблица 5. Элементы синтетической ДНК, примененные для прямой экспрессии vag

Iкивание после 1оваic. ii.hoc in	SEQ II) \()	Последовательность (5'-3')	Описание
PglpF	3	GCGGCACGCCTTGCAGATTACGGTTTGCC ACACTTTTCATCCTTCTCCTGGTGACATAA TCCACATCAATCGAAAATGTTAATAAATTT GTTGCGCGAATGATCTAACAAACATGCAT CATGTACAATCAGATGGAATAAATGGCGC GATAACGCTCATTTTATGACGAGGCACAC ACATTTTAAGTTCGATATTTCTCGTTTTTGC TCGTTAACGATAAGTTTACAGCATGCCTAC AAGCATCGTGGAGGTCCGTGACTTTCACG CATACAACAAACATTAACCAAGGAGGAAA CAGCT	Элемент экспрессии ДНК из 300 нуклеотидов
Plac	4	ATGCGCAAATTGTGAGTTAGCTCACTCATT AGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTC CGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCG GATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTAT GACCATGATTACGCCAAGCGCGCAATTAA CCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGGTA CCTAAGGAGGAAACAGCT	Элемент экспрессии ДНК из 195 нуклеотидов
vag	2	ATGAAGAGCCTGCTGACCCGTAAACGTCG TATTAACCCGGTGTTCCTGGCGTTTATGGC GGCGAGCTTCATGATCGGTGTTGCGGGTG CGCTGCAGGCGCCGACCCTGAGCCTGTTTC TGACCCGTGAGGTGCAAGCGCGTCCGCTG TGGGTGGGCCTGTTCTTTACCGTTAACGCG ATCGCGGGTATTGTGGTTAGCATGCTGGTT GCGAAGCGTAGCGACAGCCGTGGCGATCG TCGTACCCTGATTCTGTTCTGCTGCGCGAT GGCGTTTTGCAACGCGCTGCTGTTCGCGTT TACCCGTCACTACCTGACCCTGATTACCCT GGGTGTGCTGCTGAGCGCGCTGGCGAGCG TTAGCATGCCGCAGATTTTCGCGCTGGCGC GTGAGTATGCGGACCAAAGCGCGCGTGAA GCGGTGATGTTTAGCAGCGTTATGCGTGC GCAGCTGAGCCTGGCGTGGGTGATTGGCC CGCCGCTGAGCTTCGCGCTGGCGCTGAAC TTCGGTTTTGTGACCCTGTTCCTGGTTGCT GCGGCGCTGTTTCTGGTGTGCATCCTGCTG ATTAAGTTTACCCTGCCGAGCGTTCCGCGT GCGGAACCGCTGATGCGTAGCGGTGGCAT GCCGCTGAGCGGTTGGCGTGACCGTGATG TGCGTCTGCTGTTCATTGCGAGCGTTACCA TGTGGACCTGCAACACCATGTACATCATTG ACATGCCGCTGTATATCAGCGTTACCCTGG GTCTGCCGGAGAAACTGGCGGGTCTGCTG ATGGGCACCGCGGCGGGTCTGGAAATTCC GGTGATGCTGCTGGCGGGTCACTATGCGA AGCGTGTTGGTAAACGTAACCTGATGCTG ATTGCGGTGGCGGCGGGCGTTCTGTTCTAT GCGGGTCTGGCGATGTTTGCGAGCCAGAC CGCGCTGATGGCGCTGCAACTGTTCAACG CGGTGTTTATTGGCATCATTGCGGGTATCG GCATGCTGTGGTTCCAGGATCTGATGCCG GGTCGTCCGGGTGCGGCGACCACCATGTT TACCAACAGCATCAGCACCGGTATGATTC TGGCGGGCGTTATCCAAGGCACCCTGAGC GAGCGTTTCGGCCACATTGCGGTGTATTGG CTGGCGCTGGGTCTGGCGGTTGCGGCGTTT GCGATGAGCGCGCGTGTGAAAAACGTTTA A	ДНК, кодирующая транспортер MFS

Конструирование плазмид

Были синтезированы плазмидные скелеты, содержащие два эндонуклеазных сайта I-SceI, разделенных двумя фрагментами ДНК, приспособленными для гомологичной рекомбинации в геном E. coli, и последовательностью терминатора транскрипции Т1. Например, в одной плазмидной основе был синтезирован оперон gal (необходимый для гомологичной рекомбинации в galK) и последовательность терминатора транскрипции Т1 (pUC57::garl) (GeneScript). Последовательности ДНК, примененные для гомологичной рекомбинации в гал-опероне, охватывают пары оснований 3.628.621-3.628.720 и 3.627.5723.627.671 в последовательности Escherichia coli K-12 MG155, полный геном GenBank: ID: СР014225.1.

Вставка путем гомологичной рекомбинации привела бы к делеции 949 пар оснований galK и фенотипа galK-. Подобным образом могут быть синтезированы скелеты на основе pUC57 (GeneScript) или любого другого подходящего вектора, содержащего два сайта эндонуклеазы I-SceI, разделенных двумя фрагментами ДНК, приспособленными для гомологичной рекомбинации в геном E.coli, и последовательностью терминатора транскрипции Т1. Для конструирования праймеров и амплификации специфических последовательностей ДНК хромосомной ДНК Escherichia coli K-12 DH1 применяли стандартные методики, хорошо известные в области молекулярной биологии. Такие стандартные приемы, векторы и элементы можно найти, например, в руководствах: Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology

- 17 046260 (1995) (John Wiley & Sons); Sambrook, Fritsch, & Maniatis (eds.), Molecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Berger & Kimmel, Methods in Enzymology 152: Guide to Molecular Cloning Techniques (1987) (Academic Press); Bukhari et al. (eds.).

Хромосомную ДНК, полученную из E.coli DH1, применяли для амплификации фрагмента ДНК размером 300 п.н., содержащего промотор PglpF, с применением олигонуклеотидов 0261 и 0262, и фрагмента ДНК длиной 195 п.н., содержащего Plac, с применением олигонуклеотидов 068 и 0113 (табл. 3).

Фрагмент ДНК длиной 1179 п.н., содержащий кодон-оптимизированную версию гена vag, происходящего из Pantoea vagans синтезировали с помощью GeneScript (табл. 5). Ген vag амплифицировали методом ПНР с применением олигонуклеотидов KABY745 и KABY746.

Все ПЦР-фрагменты (основы плазмиды, элементы, содержащие промотор, и ген vag) очищали и собирали основы плазмиды, элементы промотора (PglpF или Plac) и фрагмент ДНК, содержащий vag. Плазмиды клонировали с помощью стандартного клонирования USER. Клонирование в любой подходящей плазмиде может быть осуществлено с помощью любых стандартных способов клонирования ДНК. Плазмиды трансформировали в клетки ТОР10 и отбирали на чашках LB, содержащих 100 мкг/мл ампициллина (или любого подходящего антибиотика) и 0,2% глюкозы. Сконструированные плазмиды очищали, а последовательность промотора и 5'-конец гена vag подтверждали секвенированием ДНК (MWG Eurofins Genomics). Таким образом конструировали генетическую кассету, содержавшую любой представляющий интерес промотор, связанный с геном vag.

Таблица 6. Примеры хелперных и донорных плазмид, применяемых для конструирования штаммов

	( ooi itcici louuiii i enoimi	Маркерный ген
pACBSR	Para-I-SceI-λ Red, pl5A ori, cam *	cam
pUC57	pMBl, bla	Bla
pUC57::#a7	pUC57::galTK’ / Tl-galKM’	Bla

Последовательности ДНК гетерологичных генов, кодирующих представляющие интерес транспортеры или гликозилтрансферазы, были оптимизированы по кодонам и синтезированы с помощью GenScript. Интересующие гены, кодирующие белки-транспортеры, как показано в табл. 4, амплифицировали с помощью ПЦР с применением подходящих праймеров, охватывающих стартовый кодон ATG и стопкодон ТАА гена (табл. 3). Для конструирования донорных плазмид с любым представляющего интерес гетерологичного гена, применяли стандартное клонирование USER для объединения очищенных ПЦРфрагментов соответствующего скелета плазмиды, промоторного элемента и представляющего интерес гена. Клонирование в соответствующей плазмиде может быть осуществлено с применением любого стандартного способа клонирования ДНК. После клонирования ДНК трансформировали в клетки ТОР10 и отбирали на чашках LB, содержащих 100 мкг/мл ампициллина (или 50 мг/мл канамицина в зависимости от применяемой основы) и 0,2% глюкозы. Сконструированные плазмиды очищали, а последовательность промотора и 5'-конец интересующего гена подтверждали секвенированием ДНК (MWG Eurofins Genomics).

Конструирование штаммов

Применяемые бактериальный штамм, MDO, был сконструирован из Escherichia coli K-12 DHL Генотип E.coli K-12 DH1 представляет собой F-,λ^-, gyrA96, recA1, relA1, endA1, thi-1, hsdR17, supE44. В дополнение к генотипу E. coli K-12 DH1 MDO имеет следующие модификации: lacZ: делеция, размером 1,5 т.п.н., lacA: делеция, размером 0,5 т.п.н., nanKETA: делеция, размером 3,3 т.п.н., melA: делеция, размером 0,9 т.п.н., wcaJ: делеция, размером 0,5 т.п.н., mdoH: делеция, размером 0,5 т.п.н., и вставка промотора Plac выше гена gmd.

Вставку кассеты экспрессии, содержавшей промотор, связанный с геном vag и последовательностью терминатора транскрипции Т1, осуществляли с помощью Gene Gorging, по существу, как описано Herring et al. (Herring, CD., Glasner, J.D. and Blattner, F.R. (2003). 311). 153-163), а примеры хелперной и донорной плазмид, примененных для конструирования штаммов, представленных в настоящей заявке, приведены в табл. 6. Вкратце, донорную плазмиду и хелперную плазмиду ко-трансформировали в MDO и отбирали на чашках с LB, содержавших 0,2% глюкозы, ампициллин (100 мкг/мл) или канамицин (50 мг/мл) и хлорамфеникол (20 мкг/мл). Одиночную колонию инокулировали в 1 мл LB, содержащего хлорамфеникол (20 мкг/мл) и 10 мкл 20% L-арабинозы, и инкубировали при 37°С при встряхивании в течение 7-8 ч. Для интеграции в локусы galK клеток E.coli затем высевали на чашки M9-DOG и инкубировали при 37°С в течение 48 ч. Отдельные колонии, сформированные на чашках MM-DOG, повторно высевали штрихом на чашки с LB, содержавшие 0,2% глюкозы, и инкубировали в течение 24 ч при 37°С. Ожидалось, что колонии, которые выглядили белыми на чашках с агаром MacConkey-галактоза и были чувствительны как к ампициллину, так и к хлорамфениколу, потеряли донорную и вспомогательную плазмиду и содержали вставку в локусах galK. Вставки в сайт galK идентифицировали с помощью ПЦР колоний с применением праймеров 048 (SEQ ID NO: 23) и 049 (SEQ ID NO: 24), а вставленную ДНК проверяли секвенированием (Eurofins Genomics, Германия).

Встраивание генетических кассет в другие локусы хромосомной ДНК E. coli осуществляли аналогичным образом с применением различных маркерных генов селекции.

- 18 046260

Анализ в глубоких лунках (DWA)

DWA выполняли, как первоначально описано в работе Lv et al. (Bioprocess BiosystEng (2016) 39:1737-1747), и оптимизировали для целей настоящего изобретения.

Более конкретно, штаммы, раскрытые в примерах, подвергали скринингу в 24 планшетах с глубокими лунками с применением 4-дневного протокола. В течение первых 24 ч клетки выращивали до высокой плотности, а в следующие 72 ч клетки переносили в среду, которая позволяла индуцировать экспрессию генов и образование продукта. В особенности, в течение 1-го дня готовили свежие инокуляты с применением базовой минимальной среды с добавлением сульфата магния, тиамина и глюкозы. После 24-часовой инкубации приготовленных культур при 34°С при встряхивании со скоростью 700 об/мин клетки переносили на новую базальную минимальную среду (2 мл) с добавлением сульфата магния и тиамина, к которой вводили начальный болюс 20% раствора глюкозы (1 мкл) и 10% раствор лактозы (0,1 мл), затем к клеткам подавали 50% раствор сахарозы в качестве источника углерода. После инокуляции новой среды клетки встряхивали при 700 об/мин при 28°С в течение 72 ч. После денатурации и последующего центрифугирования супернатанты анализировали с помощью HPLC.

Для анализа общих образцов клеточный лизат, приготовленный кипячением, осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 4700 об/мин. Концентрацию ОГМ в супернатанте определяли с помощью HPLC или HPAC.

Выравнивание последовательности

Эвристическое парное выравнивание последовательностей, реализованное в BLAST 2.1.2 (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1990) в базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), выполняли для проверки гомологии последовательностей белков-транспортеров, упомянутых в настоящем изобретении. Все параметры сохраняли со значениями по умолчанию для каждого выравнивания BLAST.

Результаты

Пример 1. Транспортер Vag представляет собой новый переносчик ядра LNT-2 с высокой селективностью в отношении LNnT

В настоящем изобретении мы проверили способность выбранных гетерологичных переносчиков MFS экспортировать LNnT из клетки-хозяина, применяя эталонный штамм, а именно МР3672. Штамм имеет по одной PglpF-управляемой копии каждой гетерологичной гликозилтрансферазы, необходимой для образования продукта.

Одна копия каждого из выбранных гетерологичных генов-транспортеров, т.е. vag, yberC0001_9420, marc, bad, пес, yabM и fred (табл. 4), была индивидуально интегрирована в геном штамма МР3672 под контролем промотора Plac, который, как известно, обеспечивает умеренные уровни транскриптов. Сайт связывания рибосом промотора Plac (т.е. 16 п.н. выше сайта начала трансляции) был модифицирован (смотри табл. 5), для усиления связывания рибосом с синтезированными транскриптами и, таким образом, позитивного регулирования Plac-управляемой экспрессии на трансляционном уровне.

Следуя описанному выше подходу к конструированию штамма и тестируя эффективность штамма в DWA, мы сообщаем, что только Vag-экспрессирующие клетки, продуцирующие LNnT, демонстрируют относительное увеличение как оттока продуцируемого LNnT, так и общей продукции LNnT по сравнению с эталонным штаммом.

Как показано на фиг. 1А, Plac-управляемая экспрессия большинства генов-транспортеров (marc, fred, bad, пес, yabM, yberC0001_9420) либо не оказывает существенного влияния, либо снижает продукцию LNnT (до 45%). Напротив, введение гена vag в генетический фон штамма МР3672 приводит к заметному увеличению титра LNnT (фиг. 1А).

Выравнивание аминокислотных последовательностей семи протестированных предполагаемых транспортеров MSF показало, что переносчик Vag имеет очень высокое покрытие последовательностей (от 99 до 100%) по сравнению с остальными шестью транспортерами, протестированными в настоящем изобретении, с идентичностью последовательностей в диапазоне от 65 до 75%. Самая высокая идентичность последовательности (75%) была отмечена для последовательности Vag и последовательности транспортера MFS, кодируемого геном yabM (табл. 7). Интересно, что транспортер MFS YabM, описанный в WO 2017042382 как предполагаемый эффективный экспортер LNT, не оказывал существенного влияния ни на конечный общий титр LNnT, ни на отток LNnT (фиг. 1А, 1В). Таким образом, вопреки его относительно высокому сходству белковой последовательности с Vag, транспортеры YabM, повидимому, неэффективны в отношении транспорта LNnT, что четко отражается в концентрациях продуктов, обнаруживаемых во внеклеточной фракции соответствующих культур клеток-хозяев (фиг. 1В). В особенности, как показал анализ супернатантов фракций бактериальных культур, внеклеточные концентрации LNnT были значительно выше для штамма МР3994 (клетки, экспрессирующие vag), чем для штаммов МР4362 (клетки, экспрессирующие yabM) и МР3672 (клетки сравнения, не экспрессирующие какой-либо гетерологичный транспортер) (фиг. 1В).

- 19 046260

Таблица 7. Гомология между различными гетерологичными транспортерами ___________________по настоящему изобретению___________________

Название белка	Идентификация	Из организма	Идентичен Vag WP_048785139J (покрытие)
YberC0001_9420	EEQ08298.1 Суперсемейство основных посредников MFS 1	Yersinia bercovieri	68% (99%)
Fred	WP_087817556.1 транспортер MFS	Yersinia frederiksenii	69% (99%)
Bad	WP 017489914.1 транспортер MFS	Rouxiella badensis	65% (99%)
Nec	WP_09267208El транспортер MFS	Rosenbergiella nectarea	66% (99%)
Marc	WP 060448169.1 транспортер MFS	Serratia marcescens	71% (99%)
YabM	CAY73138.1 Предполагаемый переносчик оттока сахаров MFS	Erwinia pyrifoliae	75% (99%)

В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что транспортер Vag представляет собой эффективный переносчик LNnT. Этот вывод основан как на результатах процедуры скрининга этих семи генов-транспортеров, геномно экспрессированных в одном и том же эталонном штамме, в тех же условиях культивирования и под контролем одного и того же промотора, Plac, так и на анализе последовательностей белков-транспортеров, который показал, что белки-транспортеры с относительно высокой гомологией с Vag, такие как YabM и Marc (75 и 71%), либо вообще не экспортируют LNnT, либо, если экспортируют, то с очень низкой эффективностью.

Пример 2. Конструирование Escherichia coli для производства LNnT с применением гена vag

Штаммы Escherichia coli K-12 (DH1) MDO можно изменять для экспрессии представляющих интерес гетерологичных генов. Например, штамм МР3020 представляет собой штамм-продуцент LNnT со сверхэкспрессией гена в-1,3-М-ацетилглюкозаминилтрансферазы и гена в-1,3-галактозилтрансферазы, выбранных из неограничивающих примеров табл. 1.

Как показал HPLC-анализ всех образцов, вставка экспрессионной кассеты, содержащей промоторный элемент PglpF или Plac, связанный с геном vag, в хромосомную ДНК штамма МР3020 в единственной копии для получения штаммов МР4064 и МР4065 соответственно (табл. 2), привела к i) более высоким общим титрам LNnT, ii) аналогичным или немного более высоким общим концентрациям LNT-2 и iii) аналогичному или значительно более низкому общему образованию pLNnH (фиг. 2). По-видимому, уровень экспрессии гена-транспортера оказывает влияние на образование побочных продуктов у штаммов-продуцентов LNnT: Plac-управляемая экспрессия (относительно умеренная) гена vag оказывала положительное влияние на общий титр LNnT, который сопровождался незначительным увеличение общих титров pLNnH, но не LNT-2. PglpF-управляемая экспрессия (относительно высокая) гена vag также приводила к более высокому титру LNnT, чем эталонный штамм, но этот штамм (МР4064) показал несколько более высокие общие титры LNT-2 и заметно снизил общее образование pLNnH (фиг. 2).

Однако значительное влияние введения гена vag в штамм-продуцент LNnT более четко более отчетливо проявляется при анализе образцов надосадочной жидкости. Концентрация LNnT в супернатантной фракции культур штаммов МР4064 и МР4065 была повышена более чем в 2 раза по сравнению с таковой, измеренной в среде культур МР3020 (фиг. 2). Хотя в клетках, экспрессирующих транспортер, не наблюдается значительно более высоких общих титров LNT-2, LNT-2 во фракции супернатанта, повидимому, выше у штаммов МР4064 и МР4065, чем у штамма МР3020. Как упоминалось выше, образование pLNnH либо слегка повышено у штамма МР4065, либо заметно снижено у штамма МР4064. Интересно, что pLNnH обнаруживается только в осадке клеток обоих штаммов МР4064 и МР4065, что свидетельствует о том, что экспрессия переносчика Vag не влияет на экспорт продуцируемых pLNnH (фиг. 2).

Пример 3. Конструирование Escherichia coli для производства LNT с применением гена vag

Штаммы Escherichia coli K-12 (DH1) MDO можно изменять для экспрессии представляющих интерес гетерологичных генов. Например, штамм МР4473 представляет собой штамм-продуцент LNT со сверхэкспрессией гена в-1,3-М-ацетилглюкозаминилтрансферазы и гена в-1,3-галактозилтрансферазы, выбранных из табл. 1.

Как показал HPLC-анализ всех образцов, вставка экспрессионной кассеты, содержащей промоторный элемент (PglpF), связанный с геном vag, в хромосомную ДНК штамма МР4473 в единственном экземпляре для получения штамма МР4546 (табл. 2), привела к: i) увеличению общего титра LNT (общая концентрация LNT почти на 50% выше, чем у эталонного штамма), ii) примерно 6-кратному увеличению общей концентрации LNT-2 и iii) примерно в 2,5 раза более высокому общему образованию pLNH-II ( фиг. 3).

В соответствии с вышеизложенными наблюдениями анализ образцов супернатантов показал, что концентрация LNT в супернатантной фракции культур штамма МР4546 заметно повышена по сравнению с таковой, измеренной в среде культур МР4473 (фиг. 3). Гораздо более высокий общий титр LNT-2, из

-

Claims

меренный в vag-экспрессирующих клетках, сопровождается 5-кратно более высокой концентрацией LNT-2, обнаруженной во фракции супернатантов культур МР4546. Напротив, продуцируемый pLNH-II, по-видимому, находится исключительно в клеточном осадке штамма МР4546, возможно, из-за того, что Vag обладает либо низкой субстратной специфичностью к pLNH-II, либо вообще не обладает ею, либо он не способен транспортировать крупные сахара, такие как гексосахариды (фиг. 3). Это отсутствие возможностей кажется выгодным, поскольку оно позволяет упростить последующую обработку pLNHII, продуцируемого клетками, экспрессирующими vag, поскольку несколько различных ОГМ, продуцируемых в ходе одной ферментации, могут быть отделены от смеси ОГМ на самом первом этапе процедуры очистки.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Генетически модифицированная клетка, способная продуцировать один или несколько олигосахаридов грудного молока (ОГМ), где указанная клетка включает рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок-транспортер MFS с последовательностью SEQ ID NO: 1 или его функциональный гомолог, аминокислотная последовательность которого идентична по меньшей мере на 85% последовательности SEQ ID NO: 1.
2. Генетически модифицированная клетка по п.1, где олигосахарид выбирают из 2'-фукозиллактозы (2'FL), 3'-фукозиллактозы (3FL), дифукозиллактозы (DFL), 3'-сиалиллактозы (3'SL), 6'-сиалиллактозы (6'SL), лакто-Н-триозы-2 (LNT-2), лакто-Н-неотетраозы (LNnT), лакто-Н-тетраозы (LNT), лакто-Nфукопентаозы I (LNFP-I), лакто-N-фукопентаозы II (LNFP-II), лакто-Ы-фукопентаозы III (LNFP-III), лакTO-N-фукопентаозы IV (LNFP-IV) и лакто-М-фукопентаозы V (LNFP-V) и/или пара-лакто-М-неогексаозы (pLNnH).
3. Генетически модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, где генетически модифицированная клетка представляет собой Escherichia coli.
4. Генетически модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, где генетически модифицированная клетка дополнительно содержит по меньшей мере одну рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая кодирует функциональный фермент с гликозилтрансферазной активностью, выбранный из группы, состоящей из а-1,2-фукозилтрансферазы, а-1,3-фукозилтрансферазы, α-1,3/4фукозилтрансферазы, а-1,4-фукозилтрансферазы, а-2,3-сиалилтрансферазы, а-2,6-сиалилтрансферазы, β -1,3 -N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, β -1,6-N-aцеτилглюкозаминилтрaнсферазы, β- 1,3-галактозилтрансферазы и в-1,4-галактозилтрансферазы.
5. Генетически модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, где клетка дополнительно включает последовательность рекомбинантной ДНК, содержащую регуляторный элемент для регуляции экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты.
6. Генетически модифицированная клетка по п.5, где регуляторный элемент для регуляции экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты представляет собой промоторный элемент, выбранный из /аспромотора или glp-промотора.
7. Конструкция нуклеиновой кислоты, включающая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок-транспортер MFS с последовательностью SEQ ID NO: 1 или его функциональный гомолог, имеющая более чем 85% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок последовательности SEQ ID NO: 1, имеет по меньшей мере 85% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 2 и где конструкция включает последовательность нуклеиновой кислоты, включающую регуляторный элемент.
8. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.7, где регуляторный элемент регулирует экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 85% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 2.
9. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из пп.7, 8, где регуляторный элемент для регуляции экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты представляет собой элемент экспрессии, выбранный из lac-промотора или glp-промотора.
10. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.7 или 8, где конструкция нуклеиновой кислоты является частью векторной ДНК или кассеты/картриджа экспрессии, интегрированной в геном клетки-хозяина.
11. Способ получения одного или нескольких олигосахаридов, включающий стадии:

(i) обеспечение генетически модифицированной клетки, способной продуцировать ОГМ, по любому из пп.1-6;

(ii) культивирование клетки в соответствии с (i) в подходящей среде для культивирования клеток для экспрессии указанной рекомбинантной нуклеиновой кислоты;

(iii) сбор одного или нескольких ОГМ, полученных на этапе (ii).
12. Способ по п.11, где полученный ОГМ собирают из среды культивирования и микробной биомассы, образующейся в процессе культивирования.
13. Применение генетически модифицированной клетки по любому из пп.1-6 или конструкции нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-10 для получения одного или нескольких олигосахаридов грудного

-