EA046005B1 - НОВЫЙ БЕЛОК СУПЕРСЕМЕЙСТВА ОСНОВНЫХ ПЕРЕНОСЧИКОВ (MFS) (Fred) В ПРОИЗВОДСТВЕ ОГМ - Google Patents

НОВЫЙ БЕЛОК СУПЕРСЕМЕЙСТВА ОСНОВНЫХ ПЕРЕНОСЧИКОВ (MFS) (Fred) В ПРОИЗВОДСТВЕ ОГМ Download PDF

Info

Publication number
EA046005B1
EA046005B1 EA202292161 EA046005B1 EA 046005 B1 EA046005 B1 EA 046005B1 EA 202292161 EA202292161 EA 202292161 EA 046005 B1 EA046005 B1 EA 046005B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
genetically modified
gene
ogm
pglpf
mfs
Prior art date
Application number
EA202292161
Other languages
English (en)
Inventor
Маргит Педерсен
Изотта Д'Арриго
Катрине Бых Кампманн
Манос Пападакис
Original Assignee
Глюком А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Глюком А/С filed Critical Глюком А/С
Publication of EA046005B1 publication Critical patent/EA046005B1/ru

Links

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области рекомбинантного получения биологических молекул в генетически модифицированных клетках. Более конкретно, оно относится к способу рекомбинантного получения олигосахаридов грудного молока (ОГМ) с применением генетически модифицированных клеток, экспрессирующих белок суперсемейство основных посредников (MFS), экспрессируемый белок представляет собой Fred.
Уровень техники
Грудное молоко представляет собой сложную смесь углеводов, жиров, белков, витаминов, минералов и микроэлементов. Безусловно, наиболее преобладающая фракция представлена углеводами, которые можно далее разделить на лактозу и более сложные олигосахариды (олигосахариды грудного молока, ОГМ). В то время как лактозу применяют в качестве источника энергии, сложные олигосахариды не метаболизируются младенцем. Фракция сложных олигосахаридов составляет до 1/10 от общей углеводной фракции и состоит, вероятно, из более чем 150 различных олигосахаридов. Наличие и концентрация этих сложных олигосахаридов специфичны для человека и поэтому не могут быть обнаружены в больших количествах в молоке других млекопитающих, таких как, например, домашние молочные животные.
На сегодняшний день определена структура не менее 115 ОГМ (см. Urashima et al. Milk Oligosaccharides, Nova Biomedical Books, New York, 2011, ISBN: 978-1-61122-831-1), и, вероятно, значительно больше присутствует в грудном молоке (Kunz С. et al., (2014) Food Oligo-saccharides: Production, Analysis and Bioactivity, 1st Edition, p. 5-20, Eds. Moreno J. and Luz Sanz M., John Wiley & Sons, Ltd).
ОГМ вызвали большой интерес в последнее десятилетие в связи с открытием их важной функциональности в развитии человека. Помимо своих пребиотических свойств, ОГМ связаны с дополнительными положительными эффектами, что расширяет область их применения (Kunz С. et al., (2014) Food Oligosaccharides: Production, Analysis and Bioactivity, 1st Edition, p 5-20, Eds. Moreno J. and Luz Sanz M., John Wiley & Sons, Ltd). Польза ОГМ для здоровья позволила разрешить их применение в пищевых продуктах, таких как детские смеси и пищевые продукты, а также в потребительских товарах для здоровья.
Из-за ограниченной доступности ОГМ крайне желательно эффективное коммерческое, т.е. крупномасштабное производство. Разработаны химические маршруты к некоторым ОГМ. Однако производство ОГМ путем химического синтеза, ферментативного синтеза или ферментации оказалось сложной задачей. Производство в больших количествах, а также качества, необходимые для пищевых и медицинских целей, путем химического синтеза еще предстоит обеспечить. Кроме того, химические синтетические пути к ОГМ включают несколько вредных химических веществ, которые создают риск загрязнения конечного продукта.
Чтобы обойти недостатки, связанные с химическим синтезом ОГМ, были разработаны несколько этимологических способов и ферментативных подходов. Процессы на основе ферментации были разработаны для нескольких ОГМ, таких как 2'-фукозиллактоза, 3-фукозиллактоза, ласто-Ы-тетраоза, лакто-Nнеотетраоза, З'-сиалиллактоза и 6'-сиалиллактоза. В процессах, основанных на ферментации, обычно применяют генетически модифицированные бактериальные штаммы, такие как рекомбинантная кишечная палочка (E.coli).
Биотехнологическое производство ОГМ, такое как ферментативный способ, представляет собой ценный экономичный и масштабный подход к производству ОГМ. Оно основано на генетически модифицированных бактериях, сконструированных таким образом, чтобы экспрессировать гликозилтрансферазы, необходимые для синтеза желаемых олигосахаридов, и в нем применяют врожденный пул нуклеотидных Сахаров бактерий в качестве предшественников ОГМ.
Недавние разработки в биотехнологическом производстве ОГМ позволили преодолеть некоторые присущие бактериальным экспрессионным системам ограничения. Например, бактериальные клетки, продуцирующие ОГМ, могут быть генетически модифицированы для увеличения ограниченного внутриклеточного пула нуклеотидных сахаров в бактериях (WO 2012112777), для повышения активности ферментов, участвующих в продукции ОГМ (WO 2016040531), или для облегчения секреции синтезированных ОГМ во внеклеточную среду (WO 2010142305, WO 2017042382). Кроме того, экспрессию представляющих интерес генов в рекомбинантных клетках можно регулировать с помощью конкретных промоторов или других регуляторов экспрессии генов, таких как, например, те, что недавно были описаны в WO 2019123324.
Подход, описанный в WO 2010142305 и WO 2017042382, имеет то преимущество, что он позволяет снизить метаболическую нагрузку, воздействующую на продуцирующую клетку, за счет высоких уровней экспрессии рекомбинантных генов, т.е. с применением способов WO 2012112777, WO 2016040531 или WO 2019123324. Этот подход привлекает все большее внимание к конструированию рекомбинантных клеток, продуцирующих ОГМ, например, недавно были описаны также несколько новых генов переносчиков сахара, кодирующих белки, и процедуры ферментации, которые могут способствовать выведению рекомбинантно продуцируемой 2'-фукозиллактозы (2'-FL), самого распространенного ОГМ грудного молока (WO 2018077892, US 201900323053, US 201900323052).
Однако в настоящее время не существует алгоритма, который мог бы точно определить правильный белок-транспортер для оттока различных структур ОГМ, полученных рекомбинантно, среди многочис- 1 046005 ленных бактериальных белков с предсказанной функцией транспортера в нескольких базах данных белков, например, в UniProt, поскольку отношение структуры-функции, определяющие субстратную специфичность переносчиков сахаров, до сих пор недостаточно изучены и остаются крайне непредсказуемыми.
Раскрытие изобретения
Настоящее раскрытие показывает, что сверхэкспрессия в штаммах, продуцирующих ОГМ, гетерологичного гена fred, который кодирует белок Fred из суперсемейства основных переносчиков (MFS), увеличивает количество ОГМ, продуцируемого клетками. Выявление новых эффективных белковтранспортеров оттока сахаров, имеющих эффективность для различных рекомбинантно полученных ОГМ и разработка рекомбинантных клеток, экспрессирующих указанные белки, выгодны для крупномасштабного промышленного производства ОГМ.
Таким образом, в самом широком аспекте настоящее изобретение относится к генетически модифицированной клетке, способной продуцировать один или несколько олигосахаридов грудного молока (ОГМ), причем указанная генетически модифицированная клетка включает гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид главного облегчающего суперсемейства (MFS), показанный на SEQ ID NO: 1 или ее функциональный гомолог, аминокислотная последовательность которого более чем на 95,4% идентична SEQ ID NO: 1, например, по меньшей мере, на 95,5, например, по меньшей мере, на 96% идентична SEQ ID NO: 1.
Генетически модифицированная клетка по настоящему изобретению может дополнительно включать последовательность нуклеиновой кислоты, включающую регуляторный элемент для регуляции экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты. Указанный регуляторный элемент в одном аспекте регулирует экспрессию полипептида MFS, показанного в SEQ ID NO: 1, или его функционального гомолога, аминокислотная последовательность которого более чем на 95,4% идентична SEQ ID NO: 1.
Аминокислотная последовательность, обозначенная в настоящем документе как SEQ ID NO: 1, представляет собой аминокислотную последовательность, которая на 100% идентична аминокислотной последовательности, имеющей номер доступа GenBank ID WP_087817556.1. Белок-транспортер MFS, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, идентифицируется в настоящем документе как белок Fred или переносчик Fred или Fred, взаимозаменяемо; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок Fred, обозначена в настоящем документе как SEQ ID NO: 2 Fred, кодирующая нуклеиновую кислоту/ДНК, или ген fred, или fred.
Настоящее изобретение показывает, что применение рекомбинантных клеток, продуцирующих ОГМ, которые экспрессируют белок Fred, приводит к весьма отчетливым улучшениям процесса производства ОГМ как с точки зрения ферментации, так и очистки ОГМ. Описанные в настоящем документе рекомбинантные клетки и способы получения ОГМ обеспечивают как более высокие выходы всех произведенных ОГМ, сниженное образование побочных продуктов или отношение побочного продукта к продукту и облегченное извлечение ОГМ во время последующей обработки ферментационный бульон.
Неожиданно было обнаружено, что экспрессия последовательности ДНК, кодирующей Fred, в различных ОГМ-продуцирующих клетках связана с накоплением некоторых ОГМ во внеклеточной среде и других ОГМ внутри продуцирующих клеток, и с увеличением общей продукции ОГМ. Неожиданно оказалось, что увеличение выхода образующихся ОГМ характерно для ОГМ, состоящих либо из трех, либо из четырех звеньев моносахаридов, т.е. 2'-фукозиллактозы (2'-FL), 3-фукозиллактозы (3-FL), 3сиалиллактозы (3'SL), 6'-сиалиллактозы (6'SL), лакто-Ы-триозы 2, (LNT-2), лакто-Ы-неотетраозы (LNnT) и лакто-Н-тетраозы (LNT), особенно для 2'-фукозиллактозы (2'-FL), 3-фукозиллактозы (3-FL) и лакто-Nтетраозы (LNT), как видно из приведенных в настоящем документе примеров, но не для более крупных олигосахаридных структур, таких как пентасахариды и гексасахариды, которые накапливаются внутри продуцирующих клеток.
Неожиданно также обнаружено, что общая продукция основного ОГМ, например, 2'фукозиллактозы (2'-FL), 3-фукозиллактозы (3-FL), и лакто-М-тетраозы (LNT) в соответствующих ОГМпродуцирующих клетках, экспрессирующих ген fred, также увеличивается, в то время как образование побочных продуктов, например, например дифукозиллактозы (DFL), лакто-N-фукоπентаозы V (LNFP V) или паралактонеогексаозы-1 (pLNH-I) в этих клетках, соответственно, часто снижены, и указанные побочные олигосахариды обычно накапливаются внутри продуцирующих клеток.
Неожиданно было также обнаружено, что общая продукция основных ОГМ, т.е. 2'-фукозиллактозы (2'-FL), 3-фукозиллактозы (3-FL) и лакто-N-теΊраозы (LNT) в соответствующих ОГМ-продуцирующих клетках, экспрессирующих ген fred, также увеличивается, в то время как продукция побочных продуктов, т.е. дифукозиллактозы (DFL), лакто-N-фукопентаозы V (LNFP V) или паралактонеогексаозы-I (pLNH-I) в этих клетках, соответственно, часто снижается, и указанные побочные продукты олигосахаридов обычно накапливаются внутри продуцирующих клеток.
Генетически модифицированная клетка по настоящему изобретению обычно дополнительно включает последовательность нуклеиновой кислоты, включающую регуляторный элемент. Регуляторный элемент может регулировать экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид суперсемейст
- 2 046005 ва основных переносчиков (MFS), и может быть выбран из группы, состоящей из PglpF, PglpF_SD4 и PglpF_SD7.
Изобретение также относится к конструкции нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид суперсемейства основных переносчиков (MFS), где последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая полипептид суперсемейства основных переносчиков (MFS), имеет, по меньшей мере, 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2, также изобретение относится к генетически модифицированной клетке, включающей конструкцию нуклеиновой кислоты, которая представляет собой Escherichia coli.
В одном аспекте конструкция нуклеиновой кислоты, включающая последовательность(последовательности) нуклеиновой кислоты, кодирующую(кодирующие) полипептид, относящийся к суперсемейству основных переносчиков (MFS), в которой последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере, на 70% идентична SEQ ID NO: 2.
Изобретение также обеспечивает способ биосинтетического производства одного или нескольких олигосахаридов грудного молока (ОГМ), включающий следующие стадии:
(i) обеспечение генетически модифицированной клетки по настоящему изобретению;
(ii) культивирование генетически модифицированной клетки в соответствии с (i) в подходящей среде для культивирования клеток для экспрессии указанного полипептида, способного к транспортировке выходящего сахара и продуцированию одного или нескольких олигосахаридов грудного молока (ОГМ), и;
(iii) сбор одного или нескольких ОГМ, полученных на стадии (ii).
Изобретение также относится к применению генетически модифицированной клетки или конструкции нуклеиновой кислоты, включающей гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид суперсемейства основных посредников (MFS), причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты имеет, по меньшей мере, 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 2, для биосинтетического производства одного или нескольких олигосахаридов грудного молока (ОГМ).
Как упоминалось выше, при культивировании генетически модифицированных клеток, способных продуцировать один или несколько ОГМ и включающих последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок-транспортер Fred, неожиданно было обнаружено, что соответствующие один или несколько ОГМ продуцируются с высокими выходами, тогда как образование побочных продуктов и биомассы снижается. Это облегчает извлечение этих ОГМ в последующих процессах, например, общая процедура извлечения и очистки может включать меньше стадий, и общее время очистки сокращается.
Эти эффекты повышенного выхода продукта и облегчения извлечения продукта делают настоящее изобретение превосходящим раскрытия предшествующего уровня техники.
Другие аспекты и полезные признаки настоящего изобретения подробно описаны и проиллюстрированы приведенными ниже неограничивающими рабочими примерами.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показана относительная продукция 2'-FL модифицированным штаммом E.coli (штамм 1) с интеграцией и без интеграции гена fred в соответствии с SEQ ID NO: 2, кодирующего экспрессию белкатранспортера Fred MFS в соответствии с SEQ ID NO: 1, штамм 2 и штамм 1, соответственно. Данные получены анализом культуры с подпиткой способом с глубокими лунками.
На фиг. 2 показано относительное распределение 2'-FL внутри и снаружи клеток модифицированного штамма E.coli (штамм 1) с интеграцией и без интеграции гена fred в соответствии с SEQ ID NO: 2, кодирующего экспрессию белка-транспортера Fred MFS в соответствии с SEQ ID NO: 1, штамм 2 и штамм 1, соответственно. Данные получены анализом культуры с подпиткой способом с глубокими лунками.
На фиг. 3 показана относительная продукция 3-FL модифицированным штаммом E.coli (штамм 3) с интеграцией и без интеграции гена fred в соответствии с SEQ ID NO: 2, кодирующего экспрессию белкатранспортера Fred MFS в соответствии с SEQ ID NO: 1, штамм 4 и штамм 3, соответственно. Данные получены анализом культуры с подпиткой способом с глубокими лунками.
На фиг. 4 показано относительное распределение 3-FL внутри и снаружи клеток модифицированного штамма E.coli (штамм 3) с интеграцией гена fred и без нее в соответствии с SEQ ID NO: 2, кодирующего экспрессию белка-транспортера Fred MFS в соответствии с SEQ ID. NO: 1, штамм 4 и штамм 3, соответственно. Данные получены анализом культуры с подпиткой способом с глубокими лунками.
На фиг. 5 показана относительная продукция LNT модифицированным штаммом E.coli (штамм 5) с интеграцией и без интеграции гена fred в соответствии с SEQ ID NO: 2, кодирующего экспрессию белкатранспортера Fred MFS в соответствии с SEQ ID NO: 1, штаммы 6 и 7 по сравнению со штаммом 5, соответственно. Данные получены анализом культуры с подпиткой способом с глубокими лунками.
На фиг. 6 показано относительное распределение LNT внутри и снаружи клеток модифицированного штамма E.coli (штамм 5) с интеграцией и без интеграции гена fred в соответствии с SEQ ID NO: 2, ко
- 3 046005 дирующего экспрессию белка-транспортера Fred MFS. согласно SEQ ID NO: 1, штаммы 6 и 7 по сравнению со штаммом 5, соответственно. Данные получены анализом культуры с подпиткой способом с глубокими лунками.
На фиг. 7 показан процент (%) относительных концентраций LNnT в общих образцах для семи штаммов, которые экспрессируют гены GlcNacT и Gal4T и ген гетерологичного транспортера, yberC0001_9420, bad, fred, marc, vag, пес или yabM, соответственно. Штамм МР3672 экспрессирует гены гликозилтрансферазы и не экспрессирует гены транспортера;
На фиг. 8 показан процент (%) относительных концентраций LNnT в супернатанте клеток, экспрессирующих vag или yabM.
Осуществление изобретения
Далее воплощения изобретения будут описаны более подробно. Каждая конкретная вариация признаков может быть применена к другим воплощениям изобретения, если специально не указано иное.
Как правило, все применяемые в настоящем документе термины следует интерпретировать в соответствии с их обычным значением в технической области и как применимые ко всем аспектам и воплощениям изобретения, если явно не определено или не указано иное.
Все ссылки на [клетка, последовательность, ген, транспортер, стадия и т.д.] нужно интерпретировать открыто как относящиеся, по меньшей мере, к одному экземпляру указанной клетки, последовательности, гена, транспортера, стадии и т.д. если прямо не указано иное.
Этапы любого раскрытого в настоящем документе способа не обязательно выполнять в точном раскрытом порядке, если это не указано явно.
Настоящее изобретение в целом относится к генетически модифицированной клетке для эффективного производства олигосахаридов и к применению указанной генетически модифицированной клетки в способе получения олигосахаридов. В особенности, настоящее изобретение относится к генетически модифицированной клетке, способной синтезировать олигосахарид, предпочтительно, гетерологичный олигосахарид, в особенности, олигосахарид грудного молока (ОГМ).
Соответственно, генетически модифицированная клетка по изобретению модифицируют для экспрессии набора рекомбинантных нуклеиновых кислот, которые необходимы для синтеза клетками одного или нескольких ОГМ (которые позволяют клетке-хозяину синтезировать один или несколько ОГМ), таких как гены, кодирующие один или несколько ферментов с гликозилтрансферазной активностью, как описано ниже. Продуцирующую олигосахарид рекомбинантную клетку по изобретению дополнительно модифицируют для включения гетерологичной последовательности рекомбинантной нуклеиновой кислоты, предпочтительно, последовательности ДНК, кодирующей предположительный транспортный белок MFS (major facilitator superfamily, суперсемейство основных посредников), происходящий из бактерии Yersinia frederiksenii.
Более конкретно, изобретение относится к генетически модифицированной клетке, оптимизированной для продукции одного или нескольких конкретных олигосахаридов, в особенности, одного или нескольких конкретных ОГМ, включающей рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Fred.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок Fred, имеющая последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2, идентифицируют в настоящем документе как нуклеиновая кислота/ДНК, кодирующая Fred, или ген fred, или fred.
Белок-транспортер MFS, обозначенный в настоящем документе как белок Fred или транспортер Fred или Fred, взаимозаменяемо, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; Аминокислотная последовательность, обозначенная в настоящем документе как SEQ ID NO: 1, представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет 100% идентичность с аминокислотной последовательностью, имеющей номер доступа GenBank ID WP_087817556.1.
Соответственно, один аспект изобретения относится к генетически модифицированной клетке, способной продуцировать один или несколько олигосахаридов грудного молока (ОГМ), в котором указанная генетически модифицированная клетка включает гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, способный транспортировать сахар, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая, по меньшей мере, 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2.
Кроме того, изобретение относится к генетически модифицированной клетке, оптимизированной для продукции одного или нескольких конкретных олигосахаридов, в особенности, одной или нескольких конкретных ОГМ, включающей рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, содержащий более 95,4%, например, по меньшей мере, 95,5% идентичности последовательности, предпочтительно, по меньшей мере, на 96%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 97%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 98% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.
Соответственно, один аспект изобретения относится к генетически модифицированной клетке, способной продуцировать один или несколько олигосахаридов грудного молока (ОГМ), где указанная гене
- 4 046005 тически модифицированная клетка включает гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, способный транспортировать сахар, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая, по меньшей мере, 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, 75%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, например, на 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2.
Соответственно, другой аспект изобретения относится к генетически модифицированной клетке, способной продуцировать одну или несколько ОГМ, при этом указанная клетка включает рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок SEQ ID NO: 1, или его функциональный гомолог, аминокислотная последовательность которого идентична, по меньшей мере, на 95,4%, предпочтительно, по меньшей мере, на 96%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 97%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 99% идентична SEQ ID NO: 1.
Под термином функциональный гомолог в настоящем контексте подразумевается белок, аминокислотная последовательность которого более чем на 95,4%, например, на 95,5-99,9% идентична SEQ ID NO: 1, и имеет полезную функцию для достижения, по меньшей мере, одного полезного эффекта изобретения, т.е. увеличение общей продукции ОГМ или выборки ОГМ генетически модифицированной клеткой, облегчают восстановление продуцированного(продуцированных) ОГМ, эффективность продукции ОГМ и/или жизнеспособность клетки, продуцирующей ОГМ.
Под термином суперсемейства основных посредников (MFS) подразумевают большое и исключительно разнообразное семейство класса вторичных активных транспортеров, которые отвечают за транспорт ряда различных субстратов, включая сахара, лекарства, гидрофобные молекулы, пептиды, органические ионы и т.д. Специфичность белков-переносчиков сахара крайне непредсказуема, и идентификация нового белка-переносчика со специфичностью, например, в отношении олигосахаридов требует необременительных лабораторных экспериментов (более подробную информацию смотри в обзоре Reddy V.S. et al., (2012), FEBS J. 279(11): 2022-2035). Термин переносчик MFS в данном контексте означает белок, который облегчает транспорт олигосахарида, предпочтительно ОГМ, через клеточную мембрану, предпочтительно транспорт ОГМ/олигосахарида, синтезированного генетически модифицированной клеткой, из цитозоля клетки во внешнюю среду клетки, предпочтительно ОГМ/олигосахарида, включающего три или четыре звена сахара, например, 2'-FL, 3-FL, LNT-2, LNT, LNnT, 3'-SL или 6'-SL. Дополнительно или альтернативно переносчик MFS может также способствовать оттоку молекул, которые не считаются ОГМ или олигосахаридами согласно настоящему изобретению, таких как лактоза, глюкоза, клеточные метаболиты или токсины.
Термин идентичность последовательности [определенного]% в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислот означает, что две или более последовательностей имеют общие нуклеотиды или аминокислотные остатки в данном проценте при сравнении и выравнивании для максимального соответствие в окне сравнения или обозначенных последовательностях нуклеиновых кислот или аминокислот (т.е. последовательности имеют, по меньшей мере, 90-процентную (%) идентичность). Процентную идентичность последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислот можно определить с помощью алгоритма сравнения последовательностей BLAST 2.0 с параметрами по умолчанию или путем ручного выравнивания и визуального контроля (см., например, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Это определение также применимо к комплементу тестируемой последовательности и к последовательностям, которые имеют делеции и/или добавления, а также к тем, которые имеют замены. Примером алгоритма, подходящего для определения процента идентичности, сходства последовательностей и выравнивания, служит алгоритм BLAST 2.2.20+, описанный в Altschul et al. Nucl. Acids Res. 25, 3389 (1997). BLAST 2.2.20+ применяют для определения процента идентичности последовательностей нуклеиновых кислот и белков по изобретению. Программное обеспечение для проведения анализов BLAST общедоступно через Национальный центр биотехнологической информации, (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). CLUSTAL Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), EMBOSS Needle (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/), MAFFT (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) or MUSCLE (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/) представляют собой примеры алгоритмов выравнивания последовательностей.
В контексте изобретения термин олигосахарид означает сахаридный полимер, содержащий ряд моносахаридных звеньев. В некоторых воплощениях предпочтительными олигосахариды представляют собой полимеры сахаридов, состоящие из трех или четырех моносахаридных звеньев, т.е. трисахариды или тетрасахариды. Предпочтительные олигосахариды изобретения представляют собой олигосахариды грудного молока (ОГМ).
ОГМ.
Термин олигосахарид грудного молока или ОГМ в данном контексте означает сложный углевод, обнаруженный в грудном молоке человека (для отсылки смотри Urashima et al.: Milk Oligosaccharides. Nova Science Publisher (2011); или Chen, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)). ОГМ имеют структуру ядра, включающую единицу лактозы на восстанавливающем конце, которая может быть удлинена одной или несколькими единицами e-N-ацетиллактозаминила и/или одной или несколь
- 5 046005 кими единицами β-лакто-Н-биозила, и эта структура ядра может быть замещенный α-Lфукопиранозильной и/или α-Ν-ацетилнейраминильной (сиалильной) частью. В связи с этим некислотные (или нейтральные) ОГМ лишены остатка сиалила, а кислые ОГМ имеют в своей структуре хотя бы один остаток сиалила. Некислотный (или нейтральный) ОГМ может быть фукозилированным или нефукозилированным. Примеры таких нейтральных нефукозилированных ОГМ включают лакто-Н-триозу 2 (LNT2), лакто-Н-тетраозу (LNT), лакто-Н-неотетраозу (LNnT), лакто-Н-неогексаозу (LNnH), паралакто-Nнеогексаозу (pLNnH), паралакто-Н-гексаозу (pL-НН) и лакто-Н-гексаозу (L-НН). Примеры нейтральных фукозилированных ОГМ включают 2'-фукозиллактозу (2'-FL), лакто-Н-фукопентаозу I (LOTT-I), лактоН-дифукогексаозу I (LNDFH-I), 3-фукозиллактозу (3-FL), дифукозиллактозу (DFL), лакто-Нфукопентаозу II (LXER-II), лакто-Н-фукопентаозу III (LMEP-III), лакто-Н-дифукогексаозу III (LNDFHIII), фукозиллакто-Н-гексаозу II (FLNH-II), лакто-Н-фукопентаозу V (LOTT-V), лакто-Н-дифукогексаозу II (LНDFH-II), фукозил-лакто-Н-гексаозу I (ЕЕ-НН-!). фукозилпаралакто-Н-гексаозу I (ЕрЕНН-I). фукозилпаралакто-Н-неогексаозу II (Е-pLNnH II) и фукозиллакто-Н-неогексаозу (ЕLNnH). Примеры кислотных ОГМ включают З'-сиалиллактозу (3'-SL), 6'-сиалиллактозу (6'-SL), 3-фукозил-3'-сиалиллактозу (FSL), З'-О-сиалиллакто-Н-тетраозу a (LST а), фукозил-LST а (FLST а), 6'-О-сиалиллакто-Н-тетраозу b (LST b), фукозил-LST b (FLST b), 6'-О-сиалиллакто-Н-неотетраозу (LST c), фукозил-LST с (FLST c), З'-Осиалиллакто-Н-неотетраозу (LST d), фукозил-LST d (FLST d), сиалиллакто-Н-гексаозу (SLNH), сиалиллакто-Н-неогексаозу I (SLНH-I), сиалиллакто-Н-неогексаозу II (SLNH-II) и дисиалиллакто-Н-тетраозу (DSLNT). В контексте настоящего изобретения лактозу не рассматривают как разновидность ОГМ.
В некоторых воплощениях изобретения предпочтительными могут быть три-ОГМ и тетра-ОГМ, например, трисахариды 2'-FL, 3-FL, LOT^, З'-SL, 6'-SL, и тетрасахариды DFL, LNT, L^T, FSL.
В предпочтительном в настоящее время аспекте изобретения предпочтительные ОГМ представляют собой три-ОГМ, в особенности, трисахариды, выбранные из 2'-FL и 3-FL, и тетрасахариды, выбранные из DFL и LOT, такие как, в особенности, 3-FL.
2'-FL.
2'-Фукозиллактоза (2'-FL или 2'0-фукозиллактоза) представляет собой трисахарид, точнее, фукозилированный, нейтральный трисахарид, состоящий из единиц L-фукозы, D-галактозы и D-глюкозы (Fuca1-2Gaiei-4Glc). Это наиболее распространенный олигосахарид грудного молока (ОГМ), естественным образом присутствующий в человеческом грудном молоке, составляя около 30% всех ОГМ. В генетически модифицированной клетке или в ферментативной реакции 2'-FL продуцируется главным образом в результате ферментативной реакции а-1,2-фукозилтрансферазы с лактозой и донором фукозила.
3-FL.
З-Фукозиллактоза (3-FL) представляет собой трисахарид, точнее, фукозилированный, нейтральный трисахарид, состоящий из D-галактозы, L-фукозы и D-глюкозы (Gaiei-4(Fuca1-3)Glc). Он естественным образом присутствует в грудном молоке. В генетически модифицированной клетке или в ферментативной реакции 3-FL продуцируется, главным образом, ферментативной реакцией а-1,3-фукозилтрансферазы или а-1,3/4-фукозилтрансферазы с лактозой и донором фукозила.
LNT.
Лакто-Н-тетраоза (LOT) представляет собой тетрасахарид, точнее, нейтральный тетрасахарид, состоящий из галактозы, Н-ацетилглюкозамина, галактозы и глюкозы (GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc). Он естественным образом присутствует в грудном молоке.
DFL.
Дифукозиллактоза (DFL или 2',3-ди-О-фукозиллактоза) представляет собой олигосахарид, точнее, фукузилированный нейтральный тетрасахарид, состоящий из L-фукозы, D-галактозы, L-фукозы и Dглюкозы (Fuca1-2Gaiei-4(Fuca1-3)Glc). Он естественным образом присутствует в грудном молоке. В генетически модифицированной клетке или в ферментативной реакции DFL продуцируется, главным образом, ферментативной реакцией а-1,2-фукозилтрансферазы, а-1,3-фукозилтрансферазы и/или α1,З/4-фукозилтрансферазы с лактозой и двумя донорами фукозилов.
Функциональные ферменты.
Чтобы иметь возможность синтезировать один или несколько ОГМ, рекомбинантная клетка по изобретению включает, по меньшей мере, одну рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая кодирует функциональный фермент с гликозилтрансферазной активностью. Ген галактозилтрансферазы может быть интегрирован в геном (посредством хромосомной интеграции) генетически модифицированной клетки, или, альтернативно, он может быть включен в плазмидную ДНК и экспрессироваться как переносимый плазмидой. Если для производства ОГМ необходимы две или более гликозилтрансфераз, например, LKT или LNriΓ, то две или более рекомбинантных нуклеиновых кислоты, кодирующих разные ферменты с гликозилтрансферазной активностью, могут быть интегрированы в геном и/или экспрессированы из плазмиды, например в-1,3-Нацетилглюкозаминилтрансферазу (первая рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая первую гликозилтрансферазу) в комбинации с в-1,3-галактозилтрансферазой (вторая рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая вторую гликозилтрансферазу) для продукции LKT, где первая и вторая рекомбинантные нуклеиновые кислоты могут быть независимо друг от друга интегрированы в хромосомно или на плазмиде.
- 6 046005
В одном предпочтительном воплощении, как первая, так и вторая рекомбинантные нуклеиновые кислоты интегрированы в хромосому клетки-продуцента; в другом воплощении, по меньшей мере, одна из первой и второй гликозилтрансфераз представляет собой переносимую плазмидой. Белок/фермент с гликозилтрансферазной активностью (гликозилтрансфераза) может быть выбран в различных воплощениях из ферментов, обладающих активностью а-1,2-фукозилтрансферазы, а-1,3-фукозилтрансферазы, α1,3/4-фукозилтрансферазы, α-1,4-фукозилтрансферазы, а-2,3-сиалилтрансферазы, а-2,6-сиалилтрансферазы, в-1,3-Л-ацетилглюкозаминилтрансферазы, в-1,6-Л-ацетилглюкозаминилтрансферазы, β-1,3галактозилтрансферазы и в-1,4-галактозилтрансферазы. Например, для производства 2'-FL требуется, чтобы модифицированная клетка экспрессировала активный фермент а-1,2-фукозилтрансферазу; для продукции 3-FL модифицированная клетка нуждается в экспрессии активного фермента α-1,3фукозилтрансферазы; для продукции LNT модифицированная клетка должна экспрессировать по меньшей мере две гликозилтрансферазы, в-1,3-Л-ацетилглюкозаминилтрансферазу и β-1,3галактозилтрансферазу; для продукции 6'-SL модифицированная клетка должна экспрессировать активный фермент а-2,6-сиалилтрансферазу и путь для синтеза СМР-сиаловой кислоты; для производства 3'SL модифицированная клетка должна экспрессировать активный фермент а-2,3-сиалилтрансферазу и путь для синтеза СМР-сиаловой кислоты. Некоторые неограничивающие воплощения белков, обладающих гликозилтрансферазной активностью, которые могут кодироваться рекомбинантными генами, включенными в клетку-продуцент, могут быть выбраны из неограничивающих примеров табл. 1.
Таблица 1
Ген ID белковой последовательности (GenBank) Описание Пример ОГМ
IgtANm WP 002248149.1 ββ-1,3-Ν- ацетилглюкозаминтрансфераза LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
lgtA_Nm_MC58 AAF42258.1 β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминтрансфераза LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
IgtAHd AAN05638.1 β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминтрансфераза LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
IgtANg_PID2 AAK70338.1 β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминтрансфераза LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
IgtANgNCCP 1 1945 ACF31229.1 β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминтрансфераза LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
IgtA Past AAKO2595.1 β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминтрансфераза LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
IgtANc EEZ72046.1 β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминтрансфераза LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
lgtA_Nm_87255 ELK60643.1 β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминтрансфераза LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
galT Hp/HP0826 NP 207619.1 ββ-1,4- галактозилтрансфераза LNnT, LNFP-III, LNFP-VI, pLNH I, F-pLNH I, pLNnH
- 7 046005
galTNm/ IgtB AAF42257.1 β-1,4- галактозилтрансфераза LNnT, LNFP-III, LNFP-VI, pLNH I, F-pLNH I, pLNnH
wbgO WP 000582563.1 β-1,3- галактозилтрансфераза LNT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-V, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNHI
cpsIBJ ABO50723.1 ββ-1,3 -галактозилтрансфераза LNT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-V, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNHI
Jhp0563 AEZ55696.1 β-1,3- галактозилтрансфераза LNT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-V, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNHI
galTK homologous to BD182026 β-1,3- галактозилтрансфераза LNT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-V, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNHI
fiitC WP 080473865.1 а-1,2- фукозилтрансфераза 2'-FL, DFL, LNFP-I, LNDFH-I
FucT2_HpUA802 AAC99764.1 а-1,2- фукозилтрансфераза 2'-FL, DFL, LNFP-I, LNDFH-I
FucT2_EcO126t ABE98421.1 а-1,2- фукозилтрансфераза 2'-FL, DFL, LNFP-I, LNDFH-I
FucT2_Hml2198 CBG40460.1 а-1,2- фукозилтрансфераза 2'-FL, DFL, LNFP-I, LNDFH-I
FucT2_Pm9515 ABM71599.1 а-1,2-фукозилтрансфераза 2'-FL, DFL, LNFP-I, LNDFH-I
FucT2_HpF57 BAJ59215.1 а-1,2- фукозилтрансфераза 2'-FL, DFL, LNFP-I, LNDFH-I
FucT6_3_Bf CAH09151.1 а-1,3- фукозилтрансфераза 2'-FL, 3-FL, DFL, LNFP-I, LNFPIII, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
FucT7_3_Bf CAH09495.1 а-1,3- фукозилтрансфераза 2'-FL, 3-FL, DFL, LNFP-I, LNFPIII, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
FucT_3_Am ACD04596.1 а-1,3- фукозилтрансфераза 2'-FL, 3-FL, DFL, LNFP-I, LNFPIII, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
MAMAR764 AGC02224.1 а-1,3- фукозилтрансфераза 2'-FL, 3-FL, DFL, LNFP-I, LNFPIII, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
Mg791 AEQ33441.1 а-1,3- фукозилтрансфераза 2'-FL, 3-FL, DFL, LNFP-I, LNFPIII, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
Moumou 00703 YP 007354660 а-1,3- фукозилтрансфераза 2'-FL, 3-FL, DFL, LNFP-I, LNFPIII, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
futA NP207177.1 а-1,3- фукозшпрансфераза 2'-FL, 3-FL, DFL, LNFP-I, LNFPIII, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
fucT AAB81031.1 а-1,3- фукозилтрансфераза 2'-FL, 3-FL, DFL, LNFP-I, LNFPIII, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
fucTIII AY450598.1 а-1,4- фукозилтрансфераза LNDFH-I, LNDFH-II
fucTa AFI 94963.1 а-1,3/4- фукозилтрансфераза LNFP-II, LNDFH-I, LNDFH-II
Pd2,6ST BAA25316.1 а-2,6- сиалилтрансфераза 6'-SL
PspST6 BAF92026.1 а-2,6- сиалилтрансфераза 6'-SL
PiST6_145 ВAF91416.1 а-2,6- сиалилтрансфераза 6'-SL
PiST6_119 BAI49484.1 а-2,6- сиалилтрансфераза 6'-SL
NST AAC44541.1 а-2,3- сиалилтрансфераза 3'-SL
Гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты.
Один из аспектов настоящего изобретения представляет собой обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты, включающей гетерологичную(гетерологичные) последовательность(последовательности) нуклеиновой кислоты, кодирующую(кодирующие) полипептид, способный к транспортировке сахара, который представляет собой полипептид суперсемейства основных посредников (MFS), как показано в SEQ ID NO: 1, или его функциональный гомолог, аминокислотная последовательность которого более чем на 95,4% идентична последовательности SEQ ID NO: 1, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид транспортер Сахаров, имеет, по меньшей мере, 70% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2.
Под термином гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая рекомби
- 8 046005 нантный ген/нуклеиновая кислота/ДНК или кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты подразумевают искусственную последовательность нуклеиновой кислоты (т.е. полученную in vitro с применением стандартных лабораторных способов получения последовательностей нуклеиновых кислот), которая включает набор последовательных, неперекрывающихся триплетов (кодонов), которые транскрибируются в мРНК и транслируются в полипептид, когда они находятся под контролем соответствующих контрольных последовательностей, т.е. промотора. Границы кодирующей последовательности обычно определяются сайтом связывания рибосомы, расположенным прямо перед открытой рамкой считывания на 5'-конце мРНК, стартовым кодоном транскрипции (AUG, GUG или UUG) и стоп-кодоном трансляции (UAA, UGA или UAG). Кодирующая последовательность может включать, но не ограничиваться ими, геномную ДНК, кДНК, синтетические и рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот.
Термин нуклеиновая кислота включает молекулы РНК, ДНК и кДНК. Понятно, что в результате вырождения генетического кода может быть получено множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих данный белок. Термин нуклеиновая кислота применяют взаимозаменяемо с термином полинуклеотид.
Олигонуклеотид представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты с короткой цепью.
Праймер представляет собой олигонуклеотид, встречающийся в природе в виде очищенного фрагмента рестрикции или полученный синтетическим путем, который способен действовать как точка инициации синтеза при помещении в условия, в которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, комплементарного цепи нуклеиновой кислоты (т.е. в присутствии нуклеотидов и индуцирующего агента, такого как ДНК-полимераза, и при подходящей температуре и рН). Праймер предпочтительно применяют одноцепочечный для максимальной эффективности амплификации, но альтернативно он может быть двухцепочечным. Если праймер двухцепочечный, то его сначала обрабатывают, чтобы разделить его нити, прежде чем применять для приготовления продуктов для удлинения. Предпочтительно праймер представляет собой дезоксирибонуклеотидную последовательность. Праймер должен быть достаточно длинным, чтобы инициировать синтез продуктов удлинения в присутствии индуцирующего агента. Точная длина праймеров будет зависеть от многих факторов, включая температуру, источник праймера и применение способа.
Рекомбинантная нуклеиновая последовательность по изобретению может представлять собой кодирующую последовательность ДНК, например, ген или некодирующая последовательность ДНК, например, регуляторную ДНК, такую как промоторная последовательность. Один аспект изобретения относится к получению рекомбинантной клетки, включающей последовательности рекомбинантной ДНК, кодирующие ферменты, необходимые для продукции одного или нескольких ОГМ, и последовательность ДНК, кодирующую переносчик Fred. Соответственно, в одном воплощении изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, включающей кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты, т.е. последовательность рекомбинантной ДНК представляющего интерес гена, например, гена гликозилтрансферазы или гена fred, и некодирующую последовательность ДНК, например, последовательность промоторной ДНК, например, рекомбинантную промоторную последовательность, полученную из промотора оперона lac или оперона glp, или промоторную последовательность, полученную из другой последовательности ДНК геномного промотора, или синтетическая промоторная последовательность, где кодирующая и промоторная последовательности функционально связаны. Термин функционально связанный относится к функциональной взаимосвязи между двумя или более сегментами нуклеиновой кислоты (например, ДНК). Как правило, это относится к функциональной связи регуляторной последовательности транскрипции с транскрибируемой последовательностью. Например, промоторная последовательность функционально связана с кодирующей последовательностью, если она стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине или другой системе экспрессии. Как правило, промоторные регуляторные последовательности транскрипции, которые функционально связаны с транскрибируемой последовательностью, физически примыкают к транскрибируемой последовательности, т.е. они представляют собой цис-действующие последовательности.
В одном воплощении конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению может представлять собой частью векторной ДНК, в другом воплощении конструкция представляет собой экспрессионную кассету/картридж, интегрированную в геном клетки-хозяина. Соответственно, термин конструкция нуклеиновой кислоты означает искусственно сконструированный сегмент нуклеиновой кислоты, в особенности, сегмент ДНК, который предназначен для трансплантации в клетку-мишень, например, в клеткумишень, например, в бактериальную клетку, для модификации экспрессии гена генома или экспрессии последовательности гена/кодирующей ДНК, которая может быть включена в конструкцию. В контексте изобретения конструкция нуклеиновой кислоты включает последовательность рекомбинантной ДНК, включающую две или более последовательностей рекомбинантной ДНК по существу, некодирующую последовательность ДНК, включающую последовательность промоторной ДНК, и кодирующую последовательность ДНК, кодирующую представляющий интерес ген, например белок Fred, гликозилтрансферазу или другой ген, пригодный для продукции ОГМ в клетке-хозяине. Предпочтительно конструкция включает дополнительные некодирующие последовательности ДНК, которые либо регулируют транс
- 9 046005 крипцию, либо трансляцию кодирующей ДНК конструкции, например, последовательность ДНК, облегчающую связывание рибосомы с транскриптом, лидирующую последовательность ДНК, которая стабилизирует транскрипт.
Интеграция интересующего рекомбинантной нуклеиновой кислоты, включенной в конструкции (в кассету экспрессии), в бактериальный геном может быть достигнута обычными способами, например, с помощью линейных картриджей, содержащих фланкирующие последовательности, гомологичные определенному участку на хромосоме, как описано для attTn7-сайта (Waddell C.S. and Craig N.L., Genes Dev. (1988) Feb;2(2):137-49); способами геномной интеграции последовательностей нуклеиновых кислот, в которых рекомбинация опосредована рекомбиназной функцией Red фага λ или рекомбиназной функцией RecE/RecT профага Rac (Murphy, J Bacteriol. (1998);180(8):2063-7; Zhang et al., Nature Genetics (1998)20: 123-128 Muyrers et al., EMBO Rep.(2000) 1(3): 239-243); способами, основанными на рекомбинации Red/ET (Wenzel et al., Chem Biol. (2005), 12(3):349-56.; Vetcher et al., Appl Environ Microbiol. (2005);71(4):1829-35); или с помощью положительных клонов, т.е. клонов, которые несут кассету экспрессии, могут быть отобраны, например, с помощью маркерного гена, или потери или усиления функции гена.
Одной копии кассеты экспрессии, включающей интересующий ген, может быть достаточно для обеспечения продукции желаемого ОГМ и достижения желаемых эффектов согласно изобретению. Соответственно, в некоторых предпочтительных воплощениях изобретение относится к рекомбинантной ОГМ-продуцирующей клетке, которая включает одну, две или три копии представляющего интерес гена, интегрированного в геномную ДНК клетки. В некоторых воплощениях предпочтительна единственная копия гена.
В одном предпочтительном воплощении рекомбинантная кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению представляет собой гетерологичную последовательность по отношению к промотору, что означает, что эквивалентная нативная кодирующая последовательность в геноме вида происхождения транскрибируется под контролем другой промоторной последовательности (т.е. не промоторной последовательности конструкции). Тем не менее, что касается клетки-хозяина, кодирующая ДНК может быть либо гетерологичной (т.е. полученной из другого биологического вида или рода), такой как, например, последовательность ДНК, кодирующая белок Fred, экспрессированная в клетках-хозяевах Escherichia coli, или гомологичной (т.е. полученной из клеткихозяина), такой как, например, гены оперона толстой кишки, гены wca.
Предпочтительно конструкция по настоящему изобретению, включающая ген, связанный с биосинтетической продукцией ОГМ, промоторную последовательность ДНК и другие регуляторные последовательности, такие как последовательность сайта связывания рибосомы (например, последовательность Шайна-Дальгарно), экспрессируемая в генетически модифицированной клетке, обеспечивает ОГМ на уровне не менее 0,03 г /OD (оптическая плотность) на 1 л ферментационной среды, включающей суспензию генетически модифицированных клеток, например, на уровне от около 0,05 г/л/OD до около 0,5 г/л/OD. Для целей изобретения последний уровень продукции ОГМ считается достаточным, а генетически модифицированная клетка, способная продуцировать желаемый уровень ОГМ, считается подходящей генетически модифицированной клеткой, т.е. клетка может быть дополнительно модифицирована для экспрессии белка-переносчика ОГМ, например, Fred, для достижения хотя бы одного из описанных в настоящем документе эффектов, выгодных для производства ОГМ.
Генетически модифицированная клетка или конструкция нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает последовательность нуклеиновой кислоты, такую как гетерологичный ген, кодирующий предполагаемый белок-переносчик MFS (суперсемейство основных посредников).
Белок Fred - это MFS-транспортер, представляющий особый интерес в настоящем изобретении. Таким образом, конструкция нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичности последовательности с геном, fred, SEQ ID NO: 2.
Последовательность нуклеиновой кислоты, содержащаяся в генетически модифицированной клетке или в конструкции нуклеиновой кислоты, кодирует белок последовательности SEQ ID NO: 1 или его функциональный гомолог, аминокислотная последовательность которого, по меньшей мере, на более чем 95,4% идентична SEQ ID NO: 1.
Функциональный гомолог белка последовательности SEQ ID NO: 1 может быть получен путем мутагенеза. Функциональный гомолог должен иметь оставшуюся функциональность не менее 50%, такую как 60%, 70%, 80%, 90% или 100% по сравнению с функциональностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Функциональный гомолог может иметь более высокую функциональность по сравнению с функциональностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Функциональный гомолог последовательности SEQ ID NO: 1 должен быть способен усиливать продукцию ОГМ генетически модифицированной клетки по изобретению.
Генетически модифицированная клетка.
Термин генетически модифицированная клетка, применяемый в настоящем документе, понимают как клетку, которая была трансформирована или трансфицирована гетерологичной полинуклеотидной
- 10 046005 последовательностью. В данном контексте термины генетически модифицированная клетка и клеткахозяин применяют взаимозаменяемо.
Соответственно, термин генетически модифицированная клетка или генетически модифицированная клетка в данном контексте понимают как клетку-хозяина, которая была трансформирована или трансфицирована экзогенной полинуклеотидной последовательностью.
Генетически модифицированная клетка предпочтительно представляет собой прокариотическую клетку. Подходящие микробные клетки, которые могут функционировать в качестве клетки-хозяина, включают дрожжевые клетки, бактериальные клетки, клетки архебактерий, клетки водорослей и клетки грибов.
Клетка-хозяин.
Генетически модифицированная клетка (клетка-хозяин или рекомбинантная клетка) может представлять собой, например, бактериальную или дрожжевую клетку. В одном предпочтительном воплощении генетически модифицированная клетка представляет собой бактериальную клетку.
Что касается бактериальных клеток-хозяев, то, в принципе ограничений нет; они могут представлять собой эубактерии (грамм-положительные или грамм-отрицательные) или архебактерий, если они допускают генетические манипуляции для вставки интересующего гена и их можно культивировать в производственных масштабах. Предпочтительно клетка-хозяин обладает свойством культивирования до высокой плотности клеток. Неограничивающими примерами бактериальных клеток-хозяев, подходящих для рекомбинантного промышленного производства ОГМ согласно изобретению, могут представлять собой Erwinia herbicola (Pantoea agglomerans), Citrobacter freundii, Pantoea citrea, Pectobacterium carotovorum или Xanthomonas campestris. Также могут быть применены бактерии рода Bacillus, в том числе Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus thermophilus, Bacillus laterosporus, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus pumilus, Bacillus lentus, Bacillus cereus и Bacillus circulans. Аналогично, бактерии родов Lactobacillus и Lactococcus могут быть модифицированы с применением способов по данному изобретению, включая, но не ограничиваясь ими, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus jensenii и Lactococcus lactis. Streptococcus thermophiles и Proprionibacterium freudenreichii также представляют собой подходящие виды бактерий для описанного в настоящем документе изобретения. Также часть этого изобретения представляют собой штаммы, модифицированные, как описано в настоящем документе, из родов Enterococcus (например, Enterococcus faecium и Enterococcus thermophiles), Bifidobacterium (например, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis и Bifidobacterium bijidum), Sporolactobacillus spp., Micromomospora spp., Micrococcus spp., Rhodococcus spp. и Pseudomonas (например, Pseudomonas fluorescens и Pseudomonas aeruginosa).
Бактерии, включающие характеристики, описанные в настоящем документе, культивируют в присутствии лактозы, и олигосахарид, такой как ОГМ, продуцируемый клеткой, выделяют либо из самой бактерии, либо из культурального супернатанта бактерии. В одном предпочтительном воплощении генетически модифицированная клетка по изобретению представляет собой клетку Escherichia coli.
В другом предпочтительном воплощении клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку, например, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Kluveromyces lactis, Kluveromyces marxianus и т.п.
Генетически модифицированные клетки по изобретению могут быть получены с применением стандартных способов в данной области техники, например, описанных в руководствах Sambrook et al., Wilson & Walker, Maniatise et al. и Ausubel et al.
Хозяин, подходящий для производства ОГМ, например E.coli, может включать эндогенный ген β-галактозидазы или экзогенный ген β-галактозидазы, например, E.coli включает эндогенный ген lacZ (например, номер доступа в GenBank V00296 (GL41901)). Для целей изобретения клетка-хозяин, продуцирующая ОГМ, подвергается генетическим манипуляциям либо для включения любого гена β-галактозидазы, либо для включения гена, который инактивирован. Ген может быть инактивирован путем полной или частичной делеции соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты из бактериального генома, или последовательность гена может быть мутирована так, как она транскрибируется, или, если транскрибируется, транскрипт не транслируется, или если транслируется в белок (т.е. β-галактозидазу), то белок не обладает соответствующей ферментативной активностью. Таким образом, бактерия, продуцирующая ОГМ, накапливает повышенный внутриклеточный пул лактозы, что полезно для продукции ОГМ.
В некоторых воплощениях сконструированная бактерия включает дефицитный катаболический путь сиаловой кислоты. Под катаболическим путем сиаловой кислоты подразумевается последовательность реакций, обычно контролируемая и катализируемая ферментами, которая приводит к разложению сиаловой кислоты. Примерный путь катаболизма сиаловой кислоты, описанный в настоящем документе, представляет собой путь E.coli. В этом пути сиаловая кислота (Neu5Ac; N-ацетилнейраминовая кислота) расщепляется ферментами NanA (лиаза N-ацетилнейраминовой кислоты), NanK (N-ацетилман
- 11 046005 нозаминкиназа) и NanE (N-ацетилманнозамин-б-фосфатэпимераза), все кодируемые из оперона nanATEK-yhcH, и подавляется NanR (http://ecocyc.org/ECOLI). Недостаточный катаболический путь сиаловой кислоты воспроизводится у хозяина E.coli путем внесения мутации в эндогенные гены nanA (Nацетилнейраминалиаза) (например, номер доступа в GenBank D00067.1(GL216588)) и/или nanK (Nацетилманнозаминкиназа) (например, номер доступа в GenBank (аминокислота) ВАЕ77265.1 (GL85676015)), и/или nanE (N-ацетилманнозамин-б-фосфатэпимераза, GI: 947745, включена сюда посредством отсылки). Необязательно, ген nanT (транспортер N-ацетилнейрамината) также инактивируют или мутируют. Другие промежуточные продукты метаболизма сиаловой кислоты включают: (ManNAc-6P) N-ацетилманнозамин-б-фосфат; (GlcNAc-6-P) N-ацетилглюкозамин-б-фосфат; (GlcN-6-P) глюкозамин6-фосфат и (Fruc-6-P) фруктозо-6-фосфат. В некоторых предпочтительных воплощениях, nanA мутирован. В других предпочтительных воплощениях, nanA и nanK мутированы, тогда как nanE остается функциональным. В другом предпочтительном воплощении, nanA и nanE мутированы, тогда как nanK не был мутирован, инактивирован или удален. Мутация представляет собой одно или несколько изменений в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт гена nanA, nanK, nanE и/или nanT. Например, мутация может представлять собой 1, 2, до 5, до 10, до 25, до 50 или до 100 изменений в последовательности нуклеиновой кислоты. Например, nanA, nanK, nanE и/или nanT гены мутируют путем нулевой мутации. Нулевые мутации, как описано в настоящем документе, включают аминокислотные замены, добавления, делеции или вставки, которые либо вызывают потерю функции фермента (т.е. снижение или отсутствие активности), либо потерю фермента (т.е. отсутствие генного продукта). Под удаленными подразумевают, что кодирующая область удалена полностью или частично, так что не образуется (функциональный) продукт гена. Под инактивацией подразумевается, что кодирующая последовательность была изменена таким образом, что полученный генный продукт будет функционально неактивным или будет кодировать генный продукт с активностью, менее чем на 100%, например, на 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% или 20% по сравнению с активностью нативного, встречающегося в природе, эндогенного генного продукта. Немутированный ген или белок не отличается от нативной, встречающейся в природе или эндогенной кодирующей последовательности на 1, 2, вплоть до 5, вплоть до 10, вплоть до 20, вплоть до 50, вплоть до 100, вплоть до от 200 или вплоть до 500 или более кодонов или до соответствующей закодированной аминокислотной последовательности.
Кроме того, бактерия (например, E.coli) также обладает способностью к синтезу сиаловой кислоты. Например, бактерия обладает способностью синтезировать сиаловую кислоту за счет экзогенной UDPGlcNAc 2-эпимеразы (например, neuC из Campylobacter jejuni (GenBank AAK91727.1) или ее эквивалента (например, (GenBank CAR04561.1), синтазы Neu5Ac (например, neuB из С. jejuni (GenBank AAK91726.1) или ее эквивалента (например, синтазы сиаловой кислоты из Flavobacterium limnosediminis, GenBank WP_023580510.1), и/или синтазы CMP-Neu5Ac (например, neuA из С. jejuni (GenBank AAK91728.1) или ее эквивалента (например, СМР-синтазы сиаловой кислоты из Vibrio brasiliensis, GenBank WP_006881452.1).
Получение нейтрального ОГМ, содержащего N-ацетилглюкозамин, в модифицированных бактериях также известно в данной области техники (смотри, например, Gebus С. et al. (2012) Carbohydrate Research 363 83-90).
Для производства ОГМ, содержащих N-ацетилглюкозамин, таких как лакто-Ы-триоза 2 (LNT-2), лакто-Ы-тетраоза (LNT), лакто-Н-неотетраоза (LNnT), лакто-Н-фукопентаоза I (LNFP-I), лакто-Nфукопентаоза II (LNFP-II), лакто-М-фукопентаоза III (LNFP-III), лакто-М-фукопентаоза V (LNFP-V), лакTO-N-дифукогексаоза I (LDFH-I), лaкто-N-дифукогексаоза II (LDFH-II) и лαкто-N-неодифукогексаоза II (LNDFH-III), как описано выше, и она модифицирована так, чтобы включать экзогенный ген UDPGlcNAc:Gala/e-R в-3-\-ацетилглюкозаминилтрансферазы или его функциональный вариант или фрагмент. Этот экзогенный ген UDP-GlcNAc:Gala/e-R β-3-N-ацетилглюкозаминилтрaнсферaзы может быть получен из любого из ряда источников, например, из гена lgtA, описанного в N. meningitides (номер доступа белка в GenBank AAF42258.1) или N. gonorrhoeae (номер доступа белка в GenBank ACF31229.1). Необязательно дополнительный ген экзогенной гликозилтрансферазы может быть коэкспрессирован в бактерии, включающей экзогенный ген UDP-GlcNAc:Gala/e-R в-3-\-ацетилглюкозаминилтрансферазы. Например, ген в-1,4-галактозилтрансферазы коэкспрессируется с геном UDP-GlcNAc:Gala/e-R β-3-Nацетилглюкозаминилтрансферазы. Этот экзогенный ген в-1,4-галактозилтрансферазы может быть получен из любого источника, например, описанного в N. meningitidis, ген lgtB (номер доступа белка в GenBank AAF42257.1) или из Н. pylori, ген HP0826lgalT (номер доступа белка в GenBank NP_207619.1). Необязательно дополнительный ген экзогенной гликозилтрансферазы, коэкспрессируемый в бактерии, включающей экзогенный ген UDP-GlcNAc:Gala/e-R в-3-\-ацетилглюкозаминилтрансферазы, представляет собой ген в-1,3-галактозилтрансферазы, например, тот, что описан из E.coli 055:Н7, ген wbgO (номер доступа белка в GenBank WP_000582563.1), или из Н. pylori, ген jhp0563 (номер доступа белка в GenBank AEZ55696.1), или из Streptococcus agalactiae тип Ib OI2 ген cpslBJ g (номер доступа белка в GenBank АВ050723).Раскрытое изобретение также охватывает функциональные варианты и фрагменты любого из ферментов, описанных выше.
- 12 046005
Ген N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и/или ген галактозилтрансферазы также может быть функционально связан с Pglp и экспрессироваться из соответствующей интегрированной в геном кассеты. В одном воплощении ген, интегрированный в геном, представляет собой ген, кодирующий галактозилтрансферазу, например, ген НР0826, кодирующий фермент GalT из Н. pylori (номер доступа белка в GenBank NP_207619.1); в другом воплощении ген, интегрированный в геном, представляет собой ген, кодирующий в-1,3-Н-ацетилглюкозаминилтрансферазу, например, ген lgtA из N. meningitidis (номер доступа белка в GenBank AAF42258.1). В этих воплощениях второй ген, т.е. ген, кодирующий p-1,3-Nацетилглюкозаминилтрансферазу или галактозилтрансферазу, соответственно, может экспрессироваться либо из интегрированной в геном, либо из переносимой плазмидой кассеты. Второй ген необязательно может экспрессироваться либо под контролем промотора glp или под контролем любого другого промотора, подходящего для системы экспрессии, например, Plac.
Клетки-хозяева, продуцирующие ОГМ, обычно включают функциональный ген lacY и дисфункциональный ген lacZ.
ОГМ, продуцируемые рекомбинантными клетками по изобретению, могут быть очищены с применением подходящей процедуры, доступной в данной области техники (например, такой, как описана в WO 2015188834, WO 2017182965 или WO 2017152918).
Кодируемый полипептид, способный транспортировать сахар.
Транспорт сахара относится к транспорту сахара, такого как, но не ограничиваясь этим, олигосахарида, а в связи с изобретением к транспорту притока и/или оттока одного и/или нескольких ОГМ из цитоплазмы или периплазмы генетически модифицированной клетки в продукционную среду и/или из продукционной среды в цитоплазму или периплазму генетически модифицированной клетки. Таким образом, экспрессируемый в генетически модифицированной клетке полипептид, способный транспортировать ГМО из цитоплазмы или периплазмы в продукционную среду и/или из продукционной среды в цитоплазму или периплазму генетически модифицированной клетки, представляет собой полипептид, способный к транспорту сахара. Таким образом, в настоящем изобретении транспортировка сахара может означать транспортировку оттока и/или притока сахара, такого как, но, не ограничиваясь этим, олигосахарида.
В этом отношении полипептид, способный транспортировать сахар, представляет собой полипептид, принадлежащий к суперсемейству основных переносчиков (MFS). В особенности, полипептид имеет более чем 95,4%, например, по меньшей мере, 95,5%, например, по меньшей мере, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1, или он представляет собой его функциональный вариант, как описано в настоящем документе. SEQ ID NO: 1 представляет собой аминокислотную последовательность белка Fred.
Генетически модифицированная клетка или конструкция нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает последовательность нуклеиновой кислоты, такую как гетерологичный ген, кодирующий белок Fred. Указанная последовательность нуклеиновой кислоты имеет, по меньшей мере, 70% идентичности последовательности с геном fred, как показано в SEQ ID NO: 2, например, по меньшей мере, 75/, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%.
Конструкция последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок SEQ ID NO: 1 или его функциональный гомолог, аминокислотная последовательность которого более чем на 95,4%, например, по меньшей мере, на 95,5%, 96%, 97%, 98 или 99% идентична SEQ ID NO: 1.
Функциональный гомолог белка SEQ ID NO: 1 может быть получен путем мутагенеза. Функциональный гомолог должен иметь остаточную функциональность по меньшей мере 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%, по сравнению с функциональностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Функциональный гомолог может иметь более высокую функциональность по сравнению с функциональностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Функциональный гомолог SEQ ID NO: 1 должен быть способен усиливать продукцию ОГМ генетически модифицированной клеткой согласно изобретению.
Генетически модифицированная клетка или конструкция нуклеиновой кислоты может содержать одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид, способный к транспортировке сахара. Чаще генетически модифицированная клетка или конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению кодирует единственную копию полипептида, способного транспортировать сахар.
Одной копии экспрессионной кассеты, включающей интересующий ген, может быть достаточно для обеспечения продукции желаемого ОГМ и достижения желаемых эффектов согласно изобретению. Соответственно, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретение относится к клетке, продуцирующей рекомбинантный ОГМ, которая включает одну, две или три копии интересующего гена или генов, интегрированных в геномную ДНК клетки. В некоторых воплощениях предпочтительна единственная копия гена или генов.
Генетически модифицированная клетка или конструкция нуклеиновой кислоты может также содержать один или несколько регуляторных элементов для регуляции экспрессии последовательности
- 13 046005 нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, транспортирующий сахар, и при этом указанная последовательность нуклеиновой кислоты имеет, по меньшей мере, 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 2.
Регуляторный элемент.
Как указано выше, генетически модифицированная клетка или конструкция нуклеиновой кислоты могут дополнительно включать последовательность нуклеиновой кислоты, включающую регуляторный элемент для регуляции экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей, по меньшей мере, 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 2. Последовательность нуклеиновой кислоты регуляторной области может быть гетерологичной или гомологичной.
Термин регуляторный элемент, или промотор, или промоторная область, или промоторный элемент представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая распознается и связывается ДНК-зависимой РНК-полимеразой во время инициации транскрипции. Промотор вместе с другими последовательностями нуклеиновых кислот, регулирующими транскрипцию и трансляцию (также называемыми контрольными последовательностями), необходим для экспрессии данного гена или группы генов (оперона). Как правило, транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности включают, но не ограничиваются ими, промоторные последовательности, сайты связывания рибосом, последовательности начала и остановки транскрипции, последовательности начала и остановки трансляции и энхансерные или активаторные последовательности. Сайт начала транскрипции означает первый транскрибируемый нуклеотид и обозначен как +1. Нуклеотиды ниже стартового сайта пронумерованы +2, +3, +4 и т.д., а нуклеотиды в 5' противоположном (выше) направлении пронумерованы -1, -2, -3 и т.д. Промотор конструкции может происходить из промоторной области любого гена, закодированного в геноме вида. Предпочтительна промоторная область геномной ДНК E.coli. Соответственно, любой промотор, способный связываться с РНК-полимеразой и инициировать транскрипцию, подходит для осуществления изобретения. В принципе, для контроля транскрипции рекомбинантного гена можно применять любой промотор, такой как транспортер MFS или гликозилтрансферазы по изобретению. При осуществлении изобретения могут быть применены разные или идентичные промоторные последовательности для запуска транскрипции различных представляющих интерес генов, интегрированных в геном клетки-хозяина или в ДНК вектора экспрессии. В одном примере промоторная последовательность А способствует экспрессии переносчика MFS, а другая промоторная последовательность В, или идентичная промоторная последовательность А, способствует экспрессии гликозилтрансферазы.
Для оптимальной экспрессии рекомбинантных генов, включенных в конструкцию, конструкция может включать дополнительные регуляторные последовательности, например ведущая последовательность ДНК, такая как последовательность ДНК, полученная из 5'-нетранслируемой области (5'UTR) гена glp E.coli, последовательность для рибосомного связывания. Примеры более поздних последовательностей описаны в WO 2019123324 (включена в настоящий документ в качестве отсылки) и проиллюстрированы в настоящем документе в неограничивающих рабочих примерах.
В одном аспекте изобретения один или несколько регуляторных элементов могут быть вставлены в конструкцию ДНК, кодирующую ген fred согласно SEQ ID NO: 2, и/или в конструкцию ДНК, кодирующую одну или несколько гликозилтрансфераз согласно изобретению. В другом аспекте изобретения одна или несколько копий гена fred в соответствии с SEQ ID NO: 2 могут быть встроены в конструкцию ДНК согласно изобретению. В еще одном аспекте изобретения ген fred в соответствии с SEQ ID NO: 2 может быть встроен в одну или несколько идентичных или неидентичных конструкций ДНК согласно изобретению.
В одном аспекте изобретения регуляторным элементом для регуляции экспрессии рекомбинантного гена, включенного в конструкцию по изобретению, представляет собой промотор оперона glpFKX, PglpF. В другом аспекте изобретения промотор представляет собой промотор оперона lac, Plac. И в еще одном аспекте изобретения регуляторный элемент представляет собой PglpF_SD4 и/или PglpF_SD7, которые представляют собой модифицированную версию последовательности PglpF, включающую модифицированную последовательность сайта связывания рибосомы ниже последовательности промотора. Однако любой промотор, обеспечивающий транскрипцию и/или регуляцию уровня транскрипции одной или нескольких рекомбинантных нуклеиновых кислот, кодирующих один или несколько полипептидов по изобретению, представляет собой подходящий промотор для практического применения изобретения.
Как правило, промоторы для экспрессии гетерологичного гена по настоящему изобретению выбирают из табл. 2.
- 14 046005
Таблица 2
Название промотора Описание Ссылка SEQ ID NO:
PgatY_70UTR Промотор E. coll для gatYZABCD; тагатозо1,6-бисР-альдолаза NA 3
PglpF Промотор E. coli для glpFKX; поглощение глицерина WO2019123324 4
PglpFSDl Промотор Е. coll для оперона glpFKX; поглощение глицерина WO2019123324
PglpFSDlO Промотор Е. coli для оперона glpFKX; поглощение глицерина WO2019123324
PglpF_SD2 Промотор Е. coli для оперона glpFKX; поглощение глицерина WO2019123324
PglpF SD3 Промотор Е. coli для оперона glpFKX; WO2019123324
поглощение глицерина
PglpF_SD4 Промотор Е. coli для оперона glpFKX; поглощение глицерина WO2019123324 5
PglpF_SD5 Промотор Е. coli для glpFKX; поглощение глицерина WO2019123324
PglpF_SD6 Промотор Е. coli для оперона glpFKX; поглощение глицерина WO2019123324
PglpF_SD7 Промотор Е. coli для оперона glpFKX; поглощение глицерина WO2019123324 6
PglpF_SD8 Промотор Е. coli для оперона glpFKX; поглощение глицерина WO2019123324
PglpF_SD9 Промотор Е. coli для оперона glpFKX; поглощение глицерина WO2019123324
Plac_16UTR Промотор Е. coli для оперона lacZYA: 1асоперон WO2019123324
Plac Промотор Е. coli для оперона lacZYA: 1асоперон WO2019123324 19
PmglB_70UTR Промотор Е. coli для mglBAC; транспортер галактозы/метилгалактозидазы NA 7
PmglB_70UTR SD4 Промотор Е. coli для mglBAC·, транспортер галактозы/метилгалактозидазы NA 8
Предпочтительные регуляторные элементы, присутствующие в генетически модифицированной клетке или в конструкции нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, выбирают из группы, состоящей из: PgatY_70UTR, PglpF, PglpF_SD1, PglpF_SD10, PglpF_SD2, PglpF_SD3, PglpF_SD4, PglpF_SD5, PglpF_SD6, PglpF_SD7, PglpF_SD8, PglpF_SD9, Plac_16UTR, Plac, PmglB_70UTR и PmglB_70UTR_SD4.
Особенно предпочтительные регуляторные элементы, присутствующие в генетически модифицированной клетке или в конструкции нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, выбирают из группы, состоящей из PglpF, PglpF_SD4 и PglpF_SD7.
Г енетически модифицированные клетки для биосинтетического производства.
В настоящем изобретении промоторы могут быть либо необходимыми, либо полезными для достижения оптимального уровня биосинтетического производства одной или нескольких ОГМ в генетически модифицированной клетке и обеспечения желаемых эффектов согласно изобретению. Таким образом, промоторная последовательность по настоящему изобретению обеспечивает транскрипцию и/или регулирует экспрессию полипептида, способного к транспорту сахара, и/или гликозилтрансфераз по изобретению, что приводит к оптимизации биосинтеза и транспорта ОГМ или предшественников ОГМ и/или деградации побочных продуктов получения ОГМ.
В генетически модифицированной клетке по изобретению конструкция нуклеиновой кислоты включена в генетически модифицированную клетку, которая кодирует, по меньшей мере, один ген, связанный с биосинтетическим продуцированием одной или нескольких ОГМ, последовательность промоторной ДНК и другие регуляторные последовательности, такие как последовательность сайта связывания рибосомы (например, последовательность Шайна-Дальгарно). Экспрессия гена или генов, связанных с биосинтетической продукцией одной или нескольких ОГМ в генетически модифицированной клетке, делает возможным продуцирование ОГМ, делая клетку-хозяина подходящей клеткой-хозяином для осуществления изобретения, как описано. В генетически модифицированной клетке экспрессия гена или генов, связанных с биосинтетическим производством ОГМ, как упоминалось выше, позволяет производить одно или несколько ОГМ на уровне 0,03 г/л/OD (оптическая плотность) из 1 литра ферментационной среды, включавшей суспензию генетически модифицированных клеток. Таким образом, уровень ОГМ может быть от около 0,05 г/л/OD до около 0,5 г/л/OD, например, по меньшей мере, 0,4 г/л/OD. Для целей изобретения уровень продукции ОГМ рассматривают как достаточный, и генетически модифицированная клетка, способная продуцировать желаемый уровень ОГМ или смеси ОГМ, считается подходящей генетически модифицированной клеткой для осуществления изобретения.
Таким образом, в свете изобретения подходящая генетически модифицированная клетка может быть дополнительно модифицирована, как описано выше, для экспрессии полипептида сахара, способного к транспортировке сахара семейства MFS, например, fred, для достижения, тем или иным образом,
- 15 046005 выгодного производства ОГМ, такого как, помимо прочего, более высокий уровень ОГМ в биосинтетическом производстве, более высокий уровень чистоты в биосинтетическом производстве, сокращение длительности производства и/или более эффективное биосинтетическое производство ГМО.
Способ получения.
Второй аспект изобретения относится к способу получения одного или нескольких ОГМ, включающему следующие этапы:
(i) обеспечение генетически модифицированной клетки, способной продуцировать ОГМ, причем указанная клетка включает рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок последовательности SEQ ID NO: 1, или ее функциональный гомолог, аминокислотная последовательность которого идентична более чем на 95,4%, идентична, по меньшей мере, на 95,5%, предпочтительно идентична, по меньшей мере, на 96%, более предпочтительно идентична, по меньшей мере, на 99,9% последовательности SEQ ID NO: 1;
(ii) культивирование клетки (i) в подходящей среде для культивирования клеток для обеспечения продукции ОГМ и экспрессии последовательности ДНК с получением белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, или его функциональную аминокислоту последовательность более чем на 95,4% идентична, например, по меньшей мере, на 95,5% идентична, предпочтительно, по меньшей мере, на 96% идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, на 99,9% идентична SEQ ID NO: 1;
(iii) сбор ОГМ, полученного на этапе (ii).
Согласно изобретению термин культивирование (или культивирование или культивирование, также называемое ферментация) относится к размножению бактериальных экспрессирующих клеток в контролируемом биореакторе в соответствии со способами, известными в промышленности.
Для получения одного или нескольких ОГМ бактерии, продуцирующие ОГМ, как описано в настоящем документе, культивируют в соответствии с процедурами, известными в данной области техники, в присутствии подходящего источника углерода, например глюкозы, глицерина, лактозы и т.д., и полученный ОГМ собирают из сред культивирования и микробной биомассы, образующейся в процессе культивирования. После этого ОГМ очищают в соответствии с процедурами, известными в данной области техники, например, такими, как описаны в WO 2015188834, WO 2017182965 или WO 2017152918, и очищенный ОГМ применяют в качестве нутрицевтиков, фармацевтических препаратов или для любых других целей, например, для исследований.
Производство ОГМ обычно осуществляется путем культивирования в больших объемах. Термин производство и производственный масштаб в значении изобретения определяет ферментацию с минимальным объемом 5 л культурального бульона. Обычно процесс в производственном масштабе определяют способностью обрабатывать большие объемы препарата, содержащего продукт, и производить такие количества представляющего интерес белка, которые соответствуют, например, в случае терапевтического соединения или композиции, требованиям для клинических испытаний, а также для предложения на рынке. Помимо большого объема, способ в производственных масштабах, в отличие от простых способов в лабораторных масштабах, таких как культивирование во встряхиваемых колбах, характеризуется применением технической системы биореактора (ферментера), оснащенного устройствами для перемешивания, аэрации, подачи питательных веществ, слежения за параметрами процесса и контроля параметров процесса (рН, температура, давление растворенного кислорода, обратное давление и др.). В значительной степени поведение системы экспрессии в лабораторном масштабе, например, во встряхиваемых колбах, настольных биореакторах или формате глубоких лунок, описанных в примерах настоящего раскрытия, позволяет предсказать поведение этой системы этой системы в сложной среде биореактора.
Что касается подходящей среды для клеток, применяемой в процессе ферментации, ограничений нет. Культуральная среда может быть полуопределенной, то есть содержащей комплексные соединения среды (например, дрожжевой экстракт, соевый пептон, казаминовые кислоты и т.д.), или она может быть химически определенной, без каких-либо комплексных соединений.
Под термином один или несколько ОГМ подразумевают, что производственная ячейка ОГМ может быть способна производить одну структуру ОГМ (первый ОГМ) или несколько структур ОГМ (второй, третий и т.д. ОГМ). В некоторых воплощениях может быть предпочтительной генетически модифицированная клетка, которая продуцирует один ОГМ, в других предпочтительных воплощениях может быть предпочтительной генетически модифицированная клетка, продуцирующая несколько структур ОГМ. Клетки, продуцирующие 2'-FL, 3-FL, 3'-SL, 6'-SL или LNT-2 представляют собой неограничивающие примеры генетически модифицированных клеток, продуцирующих ОГМ единственной структуры. Неограничивающие примеры генетически модифицированных клеток, способных продуцировать несколько структур ОГМ, могут представлять собой клетки-продуценты DFL, FSL, LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-Ш, LNFP-IV, LNFP-V, pLNnH, pLNH2.
В особенности, настоящее изобретение относится к генетически модифицированным клеткам, продуцирующим одну или несколько одиночных структур ОГМ, которые выбирают из группы, состоящей из клеток, продуцирующих 2'-FL, 3-FL, DFL и LNT.
- 16 046005
Термин сбор в контексте изобретения относится к сбору полученных ОГМ после прекращения ферментации. В различных воплощениях это может включать сбор ОГМ, включенных как в биомассу (т.е. генетически модифицированные клетки), так и в среду культивирования, т.е. до/без отделения ферментационного бульона от биомассы. В других воплощениях полученный ОГМ можно собирать отдельно от биомассы и ферментационного бульона, т.е. после отделения /следом за отделением биомассы от среды культивирования (т.е. ферментационного бульона). Отделение клеток от среды может быть осуществлено любым из способов, хорошо известных специалисту в данной области техники, например, любым подходящим типом центрифугирования или фильтрации. Отделение клеток от среды может следовать сразу за сбором ферментационного бульона или осуществляться на более позднем этапе после хранения ферментационного бульона в соответствующих условиях. Извлечение произведенных ОГМ из оставшейся биомассы (или полная ферментация) включает их извлечение из биомассы (клетокпродуцентов). Это можно осуществить любыми подходящими способами в данной области техники, например, обработкой ультразвуком, кипячением, гомогенизацией, ферментативным лизисом с применением лизоцима или замораживанием и измельчением.
После восстановления после ферментации ОГМ (доступен)доступны для дальнейшей обработки и очистки.
Очистку ОГМ, полученных ферментацией, можно проводить с применением подходящей процедуры, описанной в WO 2016095924, WO 2015188834, WO 2017152918, WO 2017182965, US 20190119314 (все включены посредством отсылки).
В некоторых воплощениях изобретения генетически модифицированная клетка может продуцировать несколько ОГМ, где один ОГМ представляет собой ОГМ-продукт, а некоторые/все прочие ОГМ представляют собой ОГМ-побочный продукт. Как правило, побочные ОГМ представляют собой либо основных предшественников ОГМ, либо продукты дальнейшей модификации основных ОГМ. В некоторых воплощениях может быть желательно производить продукт ОГМ в больших количествах и побочный продукт ОГМ в малых количествах. Клетки и способы получения ОГМ, описанные в настоящем документе, обеспечивают контролируемое производство продукта ОГМ с заданным профилем ОГМ, например, в одном воплощении полученная смесь ОГМ, в которой продукт ОГМ представляет собой доминирующим ОГМ по сравнению с другими ОГМ (т.е. побочными ОГМ) смеси, т.е. ОГМ-продукт производится в большем количестве, чем другие ОГМ-побочные продукты; в других воплощениях клетка, производящая одну и ту же смесь ОГМ, может быть настроена на производство одного или нескольких побочных продуктов ОГМ в большем количестве, чем ОГМ-продукт. Например, при производстве 2'-FL и/или 3-FL, ОГМ-продукта, часто образуется значительное количество DFL, ОГМ-побочного продукта. С генетически модифицированными клетками по настоящему изобретению уровень DFL в 2'-FL и/или 3-FL -продукте может быть значительно снижен.
Преимущественно изобретение обеспечивает как снижение отношения побочного продукта к продукту, так и увеличение общего выхода продукта (и/или ОГМ в целом). Это, сниженное образование побочных продуктов по сравнению с образованием продукта, способствует повышенному образованию продукта и повышает эффективность как производства, так и процесса извлечения продукта, обеспечивая превосходную технологию производства ОГМ.
В различных предпочтительных воплощениях могут быть выбраны различные генетически модифицированные клетки, продуцирующие 2'-FL, 3-FL, DFL и/или LNT, в качестве ОГМ продукта или побочного продукта. В одном предпочтительном воплощении продукт представляет собой 3-FL. В другом предпочтительном воплощении продукт представляет собой 2'-FL, а побочный продукт представляет собой DFL. В другом предпочтительном воплощении продукт представляет собой LNT-2, а побочный продукт представляет собой LNT and LNFP I.
2'-FL, LNT и 3-FL представляют собой предпочтительные ОГМ-продукты по изобретению, как описано.
Применение.
Настоящее изобретение также относится к применению клетки-хозяина, описанной в настоящем документе, для получения одного или нескольких олигосахаридов грудного молока (ОГМ). В особенности, изобретение относится к применению клетки-хозяина, как описано в настоящем документе, для продукции конкретного ОГМ, при этом клетка-хозяин выбирают с целью получения большей части одного конкретного ОГМ, предпочтительно выбранного из 2'-FL, 3-FL и LNT, в настоящее время наиболее предпочтителен, 3-FL.
Общее.
Следует понимать, что любой признак и/или аспект, рассмотренный выше в связи с описываемым изобретением, применим по аналогии с описанными в настоящем документе способами.
Следующие фигуры и примеры представлены ниже для иллюстрации настоящего изобретения. Они предназначены для иллюстрации и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие.
Примеры.
Материалы и методы.
Если не указано иное, для манипулирования с нуклеиновыми кислотами, трансформации и экспрессии нуклеиновых кислот применяют стандартные методики, векторы, элементы контрольной последова
- 17 046005 тельности и другие элементы системы экспрессии, известные в области молекулярной биологии. Такие стандартные техники, векторы и элементы можно найти, например, в руководствах: Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (1995) (John Wiley & Sons); Sambrook, Fritsch, & Maniatis (eds.), Molecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Berger & Kimmel, Methods in Enzymology 152: Guide to Molecular Cloning Techniques (1987) (Academic Press); Bukhari et al. (eds.), DNA Insertion Elements, Plasmids and Episomes (1977) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Miller, J.H. Experiments in molecular genetics (1972.) (Cold spring Harbor Laboratory Press, NY)
Описанные ниже воплощения выбраны для иллюстрации изобретения и никоим образом не ограничивают изобретение.
Штаммы.
Штаммы, примененные в настоящих примерах, описаны в приведенной ниже табл. 3.
Таблица 3
ID штаммов Продукт Соответствующий генотип
DH1 - 1·' /. endA IrecA IrelA IgvrA96thi-IglnV44hsdRI 7(гк тк)
MDO - Е coli DH1 AlacZ AlacA, АпапКЕТА, AmelA, AwcaJ, AmdoH wcaF::Plac
Штамм 1 2’-FL MDO PglpF-CA PglpF-futC Alaci
Штамм 2 MDO PglpF-CA PglpF-futC Alaci PglpF-fred
Штамм 3 3-FL MDO PglpF-CA PglpF-futA Alaci
Штамм 4 MDO PglpF-CA PglpF-futA Alaci PglpF-fred
Штамм 5 LNT MDO PglpF-lgtA PglpF-galTK
Штамм 6 MDO PglpF-lgtA PglpF-galTK PglpF SD4-fred
Штамм 7 MDO PglpF-lgtA PglpF-galTKPglpF SD7-fred
MP3 672 LNnT MDOPglpF-GlcNAcTPglpF-Gal4T (version 1)*
МР3708 MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal4TPlac-yberC000I 9420
MP3 972 MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal4TPlac-bad
MP3 979 MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal4TPlac-fred
МР4011 MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal4TPlac-marc
MP3 994 MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal4TPlac-vag(version 1) **
МР3984 MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal4TPlac-nec
МР4362 MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal4T Plac-yabM
MP3 020 MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal4T(version 2) *
МР4064 MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal4TPglpF-vag
МР4065 MDOPglpF-GlcNAcTPglpF-Gal4TPlac-vag(version 2)**
МР4473 LNT MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal3T
МР4546 MDO PglpF-GlcNAcT PglpF-Gal3T PglpF-vag
СА = gmd-wcaG-wcaH-wcaI-manC-manB.
*Штаммы МР3672 и МР3020 несут одни и те же гетерологичные GlcNAcT и Gal4T, но отличаются количеством копий соответствующего гена, кодирующего GlcNAcT.
**Штаммы МР3994 и МР4065 несут одни и те же гетерологичные GlcNAcT и Gal4T, но отличаются числом копий соответствующего гена, кодирующего GlcNAcT.
Культивирование.
Если не указано иное, штаммы E.coli размножали в среде базовой минимальной среде, содержавшей 0,2% глюкозы, при 37°C при перемешивании. Чашки с агаром инкубировали при 37°C в течение ночи.
Базовая минимальная среда имела следующий состав: NaOH (1 г/л), KOH (2,5 г/л), KH2PO4 (7 г/л), NH4H2PO4 (7 г/л), лимонная кислота (0,5 г/л), раствор микроэлементов (5 мл/л). Исходный раствор микроэлементов содержал: ZnSO4-7H2O 0,82 г/л, лимонную кислоту 20 г/л, MnSO4-H2O 0,98 г/л, FeSO4-7H2O 3,925 г/л, CuSO4-5H2O 0,2 г/л. рН базовой минимальной среды доводили до 7,0 с помощью 5н. NaOH и автоклавировали.
Перед инокуляцией в базовую минимальную среду добавляли 1 мМ MgSO4, 4 мкг/мл тиамина, 0,5% заданного источника углерода (глицерин (Carbosynth)). Тиамин, антибиотики стерилизовали фильтрованием. Все процентные концентрации для глицерина выражены как объем/объем, а для глюкозы - масса/объем.
Химически компетентные клетки и трансформации E.coli инокулировали из чашек LB в 5 мл LB, содержащего 0,2% глюкозы, при 37°C при встряхивании до OD600 ~0,4. 2 мл культуры собирали центрифугированием в течение 25 с при 13000 g. Супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в 600 мкл холодных растворов ТВ (10 мМ PIPES, 15 мМ CaCl2, 250 мМ KCl). Клетки инкубировали на льду в течение 20 мин с последующим осаждением в течение 15 с при 13000 g. Супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в 100 мкл холодного раствора ТВ. Трансформацию плазмид проводили с применением 100 мкл компетентных клеток и 1-10 нг плазмидной ДНК. Клетки и ДНК инкубировали на льду в течение 20 мин, а затем подвергали тепловому шоку при 42°C в течение 45 с. После 2минутной инкубации на льду добавляли 400 мкл SOC (20 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 0,5 г/л NaCl, 0,186 г/л KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4 и 20 мМ глюкозы) и культуру клеток инкубировали при 37 °C при встряхивании в течение 1-го часа перед посевом на селективные чашки.
- 18 046005
Плазмиду трансформировали в химически компетентные клетки ТОР10 в условиях, рекомендованных поставщиком (ThermoFisher Scientific).
ДНК-технологии.
Плазмидную ДНК из E.coli выделяли с применением набора QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). Хромосомную ДНК из E.coli выделяли с применением набора QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen). Продукты ПНР очищали с применением набора QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Мастер-микс для ПНР DreamTaq (Thermofisher), мастер-микс для ПНР с горячим стартом Phusion U (Thermofisher), USER Enzyme (New England Biolab) применяли в соответствии с рекомендациями поставщика. Праймеры были поставлены компанией Eurofins Genomics, Германия. Фрагменты ПЦР и плазмиды были секвенированы компанией Eurofins Genomics. ПНР колоний проводили с применением DreamTaq PCR Master Mix в термоциклере Т100ТМ (Bio-Rad).
Гетерологичные белки, экспрессированные в генетически модифицированных клетках, продуцирующих ОГМ, по данному изобретению, описаны в табл. 4, промоторные элементы, которые применяли в приведенных ниже примерах изобретения, описаны в табл. 5, а олигонуклеотиды, примененные для амплификации остовов плазмиды, промотора, элементов и fred, описаны в табл. 6.
Таблица 4
Гетерологичные белки, экспрессированные в генетически модифицированных клетках, продуцирующих ОГМ
Ген Происхождение гена Номер доступа белка Функция белка
fiitC Helicobacter pylori 26695 WP_080473865.1 a-1,2-фукозилтрансфераза
fiitA Helicobacter pylori 26695 WP_000487428.1 a-1,3- фукозилтрансфераза
IgtA Neisseria meningitidis 053442 WP_002248149.1 β-1,3- ацетилглюкозаминилтрансфераза
galTK Helicobacter pylori 43504 BD182026 β-1,3- галактозилтрансфераза
fred Yersinia frederiksenii WP_087817556.1 MFS-транспортер
yberC0001_9420 Yersinia bercovieri EEQ08298.1 Суперсемейство основных переносчиков MFS 1
пес* Rosenbergiella nectarea WP 092672081.1 MFS-транспортер
marc* Serratia marcescens WP 060448169.1 MFS-транспортер
bad* Rouxiella badensis WP_017489914.1 MFS-транспортер
vag* Pantoea vagans WP 048785139.1 MFS-транспортер
yabM Erwinia pyrifoliae CAY73138.1 Предполагаемый транспортер сахаров MFS
*Название гена дано для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую номеру доступа в GenBank, для целей настоящего изобретения.
Таблица 5
Элементы синтетической ДНК, примененные для экспрессии fred
Название последовательности SEQ ID NO Последовательность (5 ’ -3 ’) Описание
PglpF 4 GCGGCACGCCTTGCAGATTACGGTTTG CCACACTTTTCATCCTTCTCCTGGTGAC ATAATCCACATCAATCGAAAATGTTAA TAAATTTGTTGCGCGAATGATCTAACA AACATGCATCATGTACAATCAGATGGA ATAAATGGCGCGATAACGCTCATTTTA TGACGAGGCACACACATTTTAAGTTCG atatttctcgtttttgctcgttaacgat AAGTTTACAGCATGCCTACAAGCATCG TGGAGGTCCGTGACTTTCACGCATACA ACAAACATTAACCAAGGAGGAAACAG CT Элемент экспрессии ДНК из 300 нуклеотидов
PglpF SD4 5 GCGGCACGCCTTGCAGATTACGGTTTG CCACACTTTTCATCCTTCTCCTGGTGAC ATAATCCACATCAATCGAAAATGTTAA TAAATTTGTTGCGCGAATGATCTAACA AACATGCATCATGTACAATCAGATGGA ATAAATGGCGCGATAACGCTCATTTTA TGACGAGGCACACACATTTTAAGTTCG ATATTTCTCGTTTTTGCTCGTTAACGAT Элемент экспрессии ДНК из 300 нуклеотидов
- 19 046005
AAGTTTACAGCATGCCTACAAGCATCG TGGAGGTCCGTGACTTTCACGCATACA ACAAACATTAACCAACTAGGAAACAG CT
PglpF_SD7 6 GCGGCACGCCTTGCAGATTACGGTTTG CCACACTTTTCATCCTTCTCCTGGTGAC ATAATCCACATCAATCGAAAATGTTAA TAAATTTGTTGCGCGAATGATCTAACA AACATGCATCATGTACAATCAGATGGA ATAAATGGCGCGATAACGCTCATTTTA TGACGAGGCACACACATTTTAAGTTCG atatttctcgtttttgctcgttaacgat AAGTTTACAGCATGCCTACAAGCATCG TGGAGGTCCGTGACTTTCACGCATACA ACAAACATTAACCAAGAGCAAAACAG CT Элемент экспрессии ДНК из 300 нуклеотидов
fred 2 ATGAAGAGCGCGCTGACCTTCAGCCGT CGTATTAACCCGGTTTTTCTGGCGTTCT TTGTGGTTGCGTTCCTGAGCGGTATTGC GGGTGCGCTGCAGGCGCCGACCCTGAG CCTGTTCCTGAGCACCGAGGTGAAAGT TCGTCCGCTGTGGGTGGGCCTGTTCTA CACCGTTAACGCGATTGCGGGTATCAC CGTGAGCTTTGTTCTGGCGAAGCGTAG CGACCTGCGTGGCGATCGTCGTAAACT GATCCTGGTGTGCTACCTGATGGCGGT TGGTAACTGCCTGCTGTTCGCGTTTAAC CGTGACTATCTGACCCTGATTACCGCG GGCGTGCTGCTGGCGGCGGTTGCGAAC ACCGCGATGCCGCAGATTTTCGCGCTG GCGCGTGAGTACGCGGATAACAGCGC GCGTGAAGTGGTTATGTTTAGCAGCAT TATGCGTGCGCAACTGAGCCTGGCGTG GGTTATCGGTCCGCCGCTGAGCTTCAT GCTGGCGCTGAACTATGGCTTCACCCT GATGTTTTGCATTGCGGCGGGTATCTTC GTGCTGAGCGCGCTGGTTGTGTGGTTT ATTCTGCCGAGCGTGCAGCGTGCGGAA CCGGTTATGGATGCGCCGACCGTGGCG CAAGGCAGCCTGTTCGCGGACAAGGAT GTTCTGCTGCTGTTTATTGCGAGCATGC TGATGTGGACCTGCAACACCATGTACA TCATTGATATGCCGCTGTATATCACCG CGAGCCTGGGTCTGCCGGAGCGTCTGG CGGGTCTGCTGATGGGCACCGCGGCGG GTCTGGAAATCCCGATTATGCTGCTGG CGGGCTACAGCGTGCGTCGTTTTGGCA AGCGTAAAATCATGCTGTTCGCGGTGC TGGCGGGCGTTCTGTTTTATACCGGTCT GGTTCTGTTCAAGTTTAAAAGCGCGCT GATGCTGCTGCAGATTTTCAACGCGAT CTTTATTGGTATCGTGGCGGGTATCGG CATGCTGTACTTCCAAGACCTGATGCC GGGTCGTGCGGGTGCGGCGACCACCCT GTTTACCAACAGCATTAGCACCGGCGT TATCCTGGCGGGCGTGCTGCAAGGTGT TCTGACCGAAACCTGGGGTCACAACAG ДНК, кодирующая транспортер MFS
Plac 19 CGTGTATGTTATGGCGATGATTCTGGC GATCCTGAGCCTGATCATTTGCGCGCG TGTGCGTGAAGCGTAA ATGCGCAAATTGTGAGTTAGCTCACTC ATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTA TGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAAT TGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGG AAACAGCTATGACCATGATTACGCCAA GCGCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGA ACAAAAGCTGGGTACCTAAGGAGGAA ACAGCT Элемент экспрессии ДНК из 195 нуклеотидов
- 20 046005
Таблица 6 Олигонуклеотиды, применяемые для амплификации остова плазмиды, промоторных элементов и представляющих интерес генов, включая fred
Название SEQ ID NO Олигонуклеотидная последовательность 5’-3’ Описание
040 9 ATTAACCCUCCAGGCATCAAATAAAAC GAAAGGC Остов, прямой
079 10 ATTTGCGCAUCACCAATCAAATTCACG CGGCC Остов, обратный
0261 11 ATGCGCAAAUGCGGCACGCCTTGCAGA TTACG PglpF.прямой
0262 12 AGCTGTTUCCTCCTTGGTTAATGTTTGT TGTATGCG PglpF.o6parHbm
0459 13 AGCTGTTUCCTAGTTGGTTAATGTTTGT TGTATGCG PglpF SD 4
0462 14 AGCTGTTUTGCTCTTGGTTAATGTTTGT TGTATGCG PglpF SD7
KABY733 15 AAACAGCUATGAAGAGCGCGCTGACCT TCAG fred. прямой
KABY734 16 AGGGTTAAUTTACGCTTCACGCACACG CG fred. обратный
048 17 CCCAGCGAGACCTGACCGCAGAAC до/К.прямой
049 18 CCCCAGTCCATCAGCGTGACTACC galK. обратный
068 20 ATGCGCAAAUTGTGAGTTAGCTCACTC ATTAG Plac. прямой
0113 21 AGCTGTTUCCTCCTTAGGTACCCAGCTT TTGTTCCC Plac. обратный
KABY745 22 AAACAGCUATGAAGAGCCTGCTGACCC GTAAAC vag.прямой
KABY746 23 AGGGTTAAUTTAAACGTTTTTCACACGC GCG vag.обратный
KABY721 24 AAACAGCUATGAAGAGCGCGCTGACCT TTAGC уЬегС0001_9420.прям ой
KABY722 25 AGGGTTAAUTTACGCCTCACGCACACG CG уЬегС0001_9420.обра тный
KABY729 26 AAACAGCUATGAGCAGCCGTCGTCTGA GC bad.прямой
KABY730 27 AGGGTTAAUTTACACGTTTTTAACACG GGTCATCAG bad.обратный
KABY741 28 AAACAGCUATGCAGAGCTTCACCCCGC C пес.прямой
KABY742 29 AGGGTTAAUTTACGCCTGCTCTTTAACA CGCAGC пес.обратный
KABY737 30 AAACAGCUATGCAGCGTCTGAGCCGTC TGAG marc.прямой
KABY738 31 AGGGTTAAUTTAAACTTCACGCACTTTC GCGC marc.обратный
МР1217 32 AAACAGCUATGAAGGCGCTGTGGAGCC GTCG уаЬМ.прямой
МР1218 33 AGGGTTAAUCGCCAGCGGAACGCTCTT CACG уаЬМ.обратный
Конструирование плазмид.
Были синтезированы плазмидные скелеты, содержащие два эндонуклеазных сайта I-SceI, разделенных двумя фрагментами ДНК, приспособленными для гомологичной рекомбинации в геном E.coli, и последовательностью терминатора транскрипции Т1. Например, в одной плазмидной основе (pUC57::gal) был синтезирован оперон gal (необходимый для гомологичной рекомбинации в galK) и последовательность терминатора транскрипции T1 (GeneScript). Последовательности ДНК, примененные для гомологичной рекомбинации в гал-опероне, охватывают пары оснований 3.628.621-3.628.720 и 3.627.5723.627.671 в последовательности Escherichia coli K-12 MG155, полный геном GenBank: ID: СР014225.1. Вставка путем гомологичной рекомбинации привела бы к делеции 949 пар оснований galK и фенотипа galK-. Подобным образом могут быть синтезированы скелеты на основе pUC57 (GeneScript) или любого другого подходящего вектора, содержащего два сайта эндонуклеазы I-Scel, разделенных двумя фрагментами ДНК, приспособленными для гомологичной рекомбинации в геном E.coli, и последовательностью терминатора транскрипции Т1. Для конструирования праймеров и амплификации специфических последовательностей ДНК хромосомной ДНК Escherichia coli K-12 DH1 применяли стандартные методики, хорошо известные в области молекулярной биологии. Такие стандартные приемы, векторы и элементы можно найти, например, в руководствах: Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (1995) (John Wiley & Sons); Sambrook, Fritsch, & Maniatis (eds.), Molecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Berger & Kimmel, Methods in Enzymology 152: Guide to Molecular Cloning Techniques (1987) (Academic Press); Bukhari et al. (eds.).
Хромосомную ДНК, полученную из E.coli DH1, применяли для амплификации фрагмента ДНК размером 300 п.н., содержащего промотор PglpF, с применением олигонуклеотидов 0261 и 0262,
- 21 046005
PglpF_SD4 применяя олигонуклеотиды 0261 и 0459, nPglpF_SD7 применяя олигонуклеотиды 0261 м 0462 (табл. 6).
Фрагмент ДНК длиной 1.182 п.н., содержащий кодоноптимизированную версию гена fred, SEQ ID NO: 2, происходящего из Yersinia frederiksenii синтезировали с помощью GeneScript (табл. 4). Ген fred амплифицировали с применением олигонуклеотидов KABY733 and KABY734.
Все ПЦР-фрагменты (основы плазмиды, элементы, содержащие промотор, и ген fred) очищали и собирали основы плазмиды, элементы промотора (Plac, PglpF или PglpF_SD4 или PglpF_SD7), и содержащий fred (или другой представляющий интерес ген, смотри табл. 4) фрагмент ДНК. Плазмиды клонировали с помощью стандартного клонирования USER. Клонирование в любой подходящей плазмиде может быть осуществлено с помощью любых стандартных способов клонирования ДНК. Плазмиды трансформировали в клетки ТОР10 и отбирали на чашках LB, содержащих 100 мкг/мл ампициллина (или любого подходящего антибиотика) и 0,2% глюкозы. Сконструированные плазмиды очищали, а последовательность промотора и 5'-конец гена fred подтверждали секвенированием ДНК (MWG Eurofins Genomics). Таким образом конструировали генетическую кассету, содержавшую любой представляющий интерес промотор, связанный с геном fred (или другим представляющим интерес геном, смотри табл. 4).
Конструирование штаммов.
Примененный бактериальный штамм, MDO, был сконструирован из Escherichia coli K-12 DHL Гентип E.coli K-12 DH1 представлял собой: F-, λ-, gyrA96, recA1, relA1, endA1, thi-1, hsdR17, supE44. В дополнение к генотипу E.coli K-12 DH1 MDO имеет следующие модификации: lacZ: делеция, размером 1,5 т.п.н., lacA: делеция, размером 0,5 т.п.н., nanKETA: делеция, размером 3,3 т.п.н., melA: делеция, размером 0,9 т.п.н., wcaJ: делеция, размером 0,5 т.п.н., mdoH: делеция, размером 0,5 т.п.н., и вставка промотора Plac выше гена gmd.
Вставку кассеты экспрессии, содержавшей промотор, связанный с геном fred Вставку кассеты экспрессии, содержавшей промотор, связанный с геном Т1 в хромосомной ДНК E.coli K-12 DH1 MDO осуществляли с помощью Gene Gorging по существу, как описано в работе Herring et al. (Herring, CD., Glasner, J.D. and Blattner, F.R. (2003). Gene (311). 153-163). Вкратце, донорную плазмиду и хелперную плазмиду котрансформировали в MDO и отбирали на чашках с LB, содержавших 0,2% глюкозы, ампициллин (100 мкг/мл) или канамицин (50 мг/мл) и хлорамфеникол (20 мкг/мл). Одиночную колонию инокулировали в 1 мл LB, содержащего хлорамфеникол (20 мкг/мл) и 10 мкл 20% L-арабинозы, и инкубировали при 37°C при встряхивании в течение 7-8 ч. Для интеграции в локусы galK клеток E.coli затем высевали на чашки M9-DOG и инкубировали при 37°C в течение 48 ч. Отдельные колонии, сформированные на чашках MM-DOG, повторно высевали штрихом на чашки с LB, содержавшие 0,2% глюкозы, и инкубировали в течение 24-х часов при 37°C. Ожидалось, что колонии, которые выглядели белыми на чашках с агаром MacConkey-галактоза и были чувствительны как к ампициллину, так и к хлорамфениколу, потеряли донорную и вспомогательную плазмиду и содержали вставку в локусах galK. Отдельные колонии, сформированные на чашках MM-DOG, повторно высевали штрихом на чашки с LB, содержавшие 0,2% глюкозы, и инкубировали в течение 24-х часов при 37°C. Ожидалось, что колонии, которые выглядели белыми на чашках с агаром MacConkey-галактоза и были чувствительны как к ампициллину, так и к хлорамфениколу, потеряли донорную и вспомогательную плазмиду и содержали вставку в локусах galK. 17) и 049 (SEQ ID NO: 18) а вставленную ДНК проверяли секвенированием (Eurofins Genomics, Германия).
Встраивание генетических кассет в другие локусы хромосомной ДНК E.coli осуществляли аналогичным образом с применением различных маркерных генов селекции.
Анализ в глубоких лунках.
Анализ в глубоких лунках выполняли, как первоначально описано в работе Lv et al. (Bioprocess Biosyst Eng (2016) 39:1737-1747) и оптимизировали для целей настоящего изобретения.
Более конкретно, штаммы, раскрытые в примерах, подвергали скринингу в 24 планшетах с глубокими лунками с применением 4-дневного протокола. В течение первых 24-х часов клетки культуры на шейкере выращивали при 34°C при встряхивании со скоростью 700 об/мин до высокой плотности, в то время как в следующие 48 ч для клеток, продуцирующих 2'-FL и 3-FL, и 72 ч для клеток, продуцирующих LNT, клетки переносили в среду, которая позволяла индуцировать экспрессию генов и образование продукта. В особенности, в течение 1 дня готовили свежие инокуляты с применением базовой минимальной среды с добавлением сульфата магния, тиамина и глюкозы. Через 24 ч инкубации клетки переносили на новую базовую минимальную среду (2 мл) с добавлением сульфата магния и тиамина с добавлением исходного болюса, состоящего из 20% раствора глюкозы (1 мкл) и 10% раствора лактозы (0,1 мл). Затем к клеткам добавляли 50% раствор сахарозы (0,04 мл) в качестве источника углерода, сопровождаемый добавлением сахарозогидролазы (инвертазы, 5 мкл раствора 0,1 г/л), так что глюкоза поступала с медленной скоростью для роста за счет расщепление сахарозы инвертазой. После инокуляции новой среды клетки встряхивали при 700 об/мин при 28°C в течение 48 ч. После денатурации и последующего центрифугирования супернатанты анализировали с помощью HPLC. Для анализа общих образцов клеточный лизат, приготовленный кипячением, осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 4700 об/мин. Концентрацию ОГМ в супернатанте определяли с помощью HPLC или НРАС.
- 22 046005
Пример 1. Получение 2'-FL.
Разработка Escherichia coli для производства 2'-FL, экспрессирующих ген fred.
Штамм Escherichia coli K-12 (DH1) MDO) можно изменять для экспрессии представляющих интерес гетерологичных генов. Например, штамм 1 представляет собой штамм, продуцирующий 2'-FL, со сверхэкспрессией гена а-1,2-фукозилтрансферазы, futC, и генов колановой кислоты (gmd-wcaG-wcaH-wcaImanC-manB). Вставка экспрессионной кассеты, содержащей промоторный элемент (PglpF), связанный с fred в единственной копии, в фоновый штамм 1 привела к штамму 2. Результаты анализов в глубоких лунках показали, что экспрессия гена fred применением PglpF i) увеличивает продукцию 2'-FL в 1,5 раза (увеличение общей продукции 2'-FL на 15%) и ii) улучшает распределение продукта 2'-FL за счет снижения количества 2'-FL в клеточной фракции и увеличения количества продукцию в среде.
Пример 2. Получение 3-FL.
Конструирование Escherichia coli, экспрессирующих ген fred, для получения 3-FL Штамм Escherichia coli K-12 (DH1) MDO) можно изменять для экспрессии представляющих интерес гетерологичных генов. Например, штамм представляет собой штамм-продуцент 3-FL со сверхэкспрессией гена альфа-1,3-фукозилтрансферазы, futA и генов колановой кислоты (gmd-wcaG-wcaH-wcaI-manC-manB). Вставка экспрессионной кассеты, содержащей промоторный элемент (PglpF) связанный с геном fred в единственной копии, в остов штамма 3 привела к штамму 4. Результаты анализов в глубоких лунках показали, что экспрессия гена fred с применением PglpF i) увеличивает продукцию 3-FL почти в 2 раза (увеличение общей продукции 3-FL на 90%) и ii) улучшает распределение продуктов 3-FL за счет снижения количества 3-FL в клеточной фракции и увеличения количества 3-FL в среде.
Пример 3. Получение LNT.
Конструирование Escherichia coli, экспрессирующих ген fred, для получения LNT Штаммы Escherichia coli K-12 (DH1) MDO) можно изменять для экспрессии представляющих интерес гетерологичных генов. Например, штамм 5 представляет собой штамм-продуцент LNT со сверхэкспрессией гена β1,3-И-ацетилглюкозаминилтрансферазы, lgtA, и в-1,3-галактозилтрансферазы, galTK. Вставка экспрессионной кассеты, содержащей промоторный элемент (PglpF_SD4) связанный с геном fred, в единственной копии в остов штамма 5 привела к штамму 6. Вставка экспрессионной кассеты, содержащей промоторный элемент (PglpF_SD7), связанный с геном fred, в единственной копии в остов штамма 5 привела к штамму 7. Результаты анализов в глубоких лунках показали, что экспрессия гена fred с применением PglpF_SD4 или PglpF_SD7: i) увеличение продукции LNT в 1,2-1,3 раза (увеличение общей продукции LNT на 20-30%) и ii) небольшое улучшение распределения продукта LNT за счет снижения количества LNT в клеточной фракции и увеличение количества LNT в среде.
Резюме примеров 1-3.
Хромосомная экспрессия fred в штамме-продуценте 2'-FL, LNT или 3-FL увеличивала продукцию ОГМ, а в случае 2'-FL и 3-FL экспрессия fred снижала количество ОГМ внутри клеток (фракция осадка).
Следовательно, экспорт ОГМ белками суперсемейства основных посредников fred увеличивает способность штаммов-продуцентов продуцировать ОГМ.
Таблица 7
Исходный штамм* ID нового штамма, экспрессирующего fred ОГМ Продукция ОГМ Снижение ОГМ в осадках
Штамм 1 Штамм 2 2’- FL 115% да
Штамм 3 Штамм 4 3-FL 190 % да
Штамм 5 Штамм 6 Штамм 7 LNT 130% 120% нет нет
* Основа штамма для продукции ОГМ.
Пример 4. Транспортер Vag представляет собой новый переносчик ядра LNT-2 с высокой селективностью в отношении LNnT.
Таблица 6а
Примеры хелперных и донорных плазмид, применяемых для конструирования штаммов
Плазмида Соответствующий генотип Маркерный ген
pACBSR Para-I-SceI-λ Red, р!5А on, cam* cam
pUC57 pMBl, Ыа Bia
pUC57::ga/ pUC57::galTK’/ Tl-galKM’ Bia
Последовательности ДНК гетерологичных генов, кодирующих представляющие интерес транспортеры или гликозилтрансферазы, были оптимизированы по кодонам и синтезированы с помощью GenScript. Интересующие гены, кодирующие белки-транспортеры, как показано в табл. 4, амплифицировали с помощью ПЦР с применением подходящих праймеров, охватывающих стартовый кодон ATG и стопкодон ТАА гена (табл. 3). Для конструирования донорных плазмид с любым представляющего интерес гетерологичного гена, применяли стандартное клонирование USER для объединения очищенных ПЦРфрагментов соответствующего скелета плазмиды, промоторного элемента и представляющего интерес гена. Клонирование в соответствующей плазмиде может быть осуществлено с применением любого стандартного способа клонирования ДНК. После клонирования ДНК трансформировали в клетки ТОР10
- 23 046005 и отбирали на чашках LB, содержащих 100 мкг/мл ампициллина (или 50 мг/мл канамицина в зависимости от применяемой основы) и 0,2% глюкозы.
Сконструированные плазмиды очищали, а последовательность промотора и 5'-конец интересующего гена подтверждали секвенированием ДНК (MWG Eurofins Genomics).
Конструирование штаммов.
Применяемые бактериальный штамм, MDO, был сконструирован из Escherichia coli K-12 DHL Генотип E.coli K-12 DH1 представляет собой: F-, λ-, gyrA96, recA1, relA1, endA1, thi-1, hsdR17, supE44. В дополнение к генотипу E.coli K-12 DH1 MDO имеет следующие модификации: lacZ: делеция, размером 1,5 т.п.н., lacA: делеция, размером 0,5 т.п.н., nanKETA: делеция, размером 3,3 т.п.н., melA: делеция, размером 0,9 т.п.н., wcaJ: делеция, размером 0,5 т.п.н., mdoH: делеция, размером 0,5 т.п.н., и вставка промотора Plac выше гена gmd.
Вставку кассеты экспрессии, содержавшей промотор, связанный с геном Fred и последовательностью терминатора транскрипции Т1, осуществляли с помощью Gene Gorging, по существу, как описано Herring et al. (Herring, C.D., Glasner, J.D. and Blattner, F.R. (2003) 311) 153-163), а примеры хелперной и донорной плазмид, примененных для конструирования штаммов, представленных в настоящей заявке, приведены в табл. 6. Вкратце, донорную плазмиду и хелперную плазмиду котрансформировали в MDO и отбирали на чашках с LB, содержавших 0,2% глюкозы, ампициллин (100 мкг/мл) или канамицин (50 мг/мл) и хлорамфеникол (20 мкг/мл). Одиночную колонию инокулировали в 1 мл LB, содержащего хлорамфеникол (20 мкг/мл) и 10 мкл 20% L-арабинозы, и инкубировали при 37°C при встряхивании в течение 7-8 ч. Для интеграции в локусы galK клеток E.coli затем высевали на чашки M9-DOG и инкубировали при 37°C в течение 48 ч. Отдельные колонии, сформированные на чашках MM-DOG, повторно высевали штрихом на чашки с LB, содержавшие 0,2% глюкозы, и инкубировали в течение 24 ч при 37°C. Колонии, которые выглядели белыми на чашках с агаром MacConkey-галактоза и были чувствительны как к ампициллину, так и к хлорамфениколу, потеряли донорную и вспомогательную плазмиду и содержали вставку в локусах galK. Вставки в сайт galK идентифицировали с помощью ПНР колоний с применением праймеров 048 (SEQ ID NO: 23) и 049 (SEQ ID NO: 24), а вставленную ДНК проверяли секвенированием (Eurofins Genomics, Германия).
Встраивание генетических кассет в другие локусы хромосомной ДНК E.coli осуществляли аналогичным образом с применением различных маркерных генов селекции.
Выравнивание последовательности.
Эвристическое парное выравнивание последовательностей, реализованное в BLAST 2.1.2 (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al. 1990) в базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), выполняли для проверки гомологии последовательностей белков-транспортеров, упомянутых в настоящем изобретении. Все параметры сохраняли со значениями по умолчанию для каждого выравнивания BLAST.
В настоящем изобретении мы проверили способность выбранных гетерологичных транспортеров MFS экспортировать LNnT из клетки-хозяина с применением эталонного штамма, а именно МР3672. Штамм имеет одну PglpF-управляемую копию каждой гетерологичной гликозилтрансферазы, которая необходима для образования продукта.
Одна копия каждого из выбранных гетерологичных генов-транспортеров, т.е. vag, yberC0001_9420, marc, bad, пес, yabM и fred (табл. 4), индивидуально интегрировали в геном штамма МР3672 под контролем промотора Plac, который, как известно, обеспечивает умеренные уровни транскриптов. Сайт связывания рибосом промотора Plac (т.е. 16 п.н. выше сайта начала трансляции) был модифицирован (см. табл. 5) для усиления рибосомного связывания с синтезированными транскриптами и, таким образом, позитивно регулирует управляемую Plac экспрессию на уровне трансляции.
Следуя описанному выше подходу к конструированию штамма и тестируя эффективность штамма в DWA, мы сообщаем в настоящем документе, что только Vag-экспрессирующие клетки, продуцирующие LNnT, демонстрируют относительное увеличение как оттока продуцируемого LNnT, так и общей продукции LNnT по сравнению с эталонным штаммом.
Как показано на фиг. 7, Plac- управляемая экспрессия большинства генов-транспортеров (marc, fred, bad, пес, yabM, yberC0001-9420) либо не оказывает существенного влияния, либо снижает продукцию LNnT (до 45%). Напротив, введение гена vag в генетический фон штамма МР3672 приводит к заметному увеличению титра LNnT (фиг. 7).
Выравнивание аминокислотных последовательностей семи протестированных предполагаемых переносчиков MSF показало, что переносчик Vag имеет очень высокий охват последовательностей (от 99 до 100%) по сравнению с остальными шестью транспортерами, протестированными в настоящем изобретении, с идентичностью последовательностей от 65 до 75%. Самая высокая идентичность последовательности (75%) была оценена для последовательности Vag и последовательности транспортера MFS, кодируемого геном yabM (табл. 8). Интересно, что транспортер MFS YabM, описанный в WO 2017042382 в качестве предполагаемого эффективного экспортера LNT, не оказывал существенного влияния ни на окончательный общий титр LNnT, ни на отток LNnT (фиг. 7, 8). Таким образом, вопреки относительно высокому сходству его белковой последовательности с Vag, транспортер YabM, повидимому, неэффективен в отношении транспорта LNnT, что ясно отражается в концентрациях продук
-

Claims (8)

  1. та, обнаруженных во внеклеточной фракции соответствующих культур клеток-хозяев (фиг. 8). В особенности, как показал анализ супернатантов фракций бактериальных культур, внеклеточные концентрации LNnT были намного выше для штамма МР3994 (клетки, экспрессирующие vag), чем для штаммов МР4362 (клетки, экспрессирующие yabM) и МР3672 (клетки сравнения, не экспрессирующие гетерологичный транспортер) (фиг. 8).
    В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что транспортер Vag представляет собой эффективный переносчик LNnT. Этот вывод основан как на результатах процедуры скрининга семи геновтранспортеров, геномно экспрессированных в одном и том же эталонном штамме, в тех же условиях культивирования и под контролем одного и того же промотора, Plac, так и на анализе последовательностей белков-транспортеров, который показал, что белки-транспортеры с относительно высокой гомологией к Vag, такие как YabM и Marc (75% и 71%), вообще не экспортируют LNnT или если экспортируют, то с очень низкой эффективностью.
    Таблица 8
    Г омология между различными гетерологичными транспортерами по настоящему изобретению
    Название белка Идентификация Из организма Идентичен VagWP_048785139.1 (покрытие)
    YberC0001_94 20 EEQ08298.1 Суперсемейство основных переносчиков MFS 1 Yersinia bercovieri 68% (99%)
    Fred WP_087817556.1 транспортер MFS Yersinia frederiksenii 69% (99%)
    Bad WP_017489914.1 транспортер MFS Rouxiella badensis 65% (99%)
    Nee WP 092672081.1 транспортер MFS Rosenbergiella nectarea 66% (99%)
    Marc WP_060448169.1 транспортер MFS Serratia marcescens 71% (99%)
    YabM CAY73138.1 Предполагаемый переносчик оттока сахара MFS Erwinia pyrifoliae 75% (99%)
    ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Генетически модифицированная клетка, способная продуцировать один или несколько олигосахаридов грудного молока (ОГМ), где указанная генетически модифицированная клетка включает последовательность гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид суперсемейства основных переносчиков (MFS), показанный в SEQ ID NO: 1, или его функциональный гомолог, аминокислотная последовательность которого более чем на 97% идентична SEQ ID NO: 1.
  2. 2. Генетически модифицированная клетка по п.1, где регуляторный элемент регулирует экспрессию полипептида MFS, показанного в SEQ ID NO: 1, или его функционального гомолога, аминокислотная последовательность которого более чем на 97% идентична SEQ ID NO: 1.
  3. 3. Генетически модифицированная клетка по п.2, где регуляторный элемент выбран из группы, состоящей из PglpF, PglpF_SD4 и PglpF_SD7.
  4. 4. Генетически модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, где указанная генетически модифицированная клетка дополнительно содержит по меньшей мере одну рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая кодирует функциональный фермент с активностью гликозилтрансферазы, выбранный из группы, состоящей из а-1,2-фукозилтрансферазы, а-1,3-фукозилтрансферазы, α-1,3/4-фукозилтрансферазы, α-1,4-фукозилтрансферазы, а-2,3-сиалилтрансферазы, а-2,6-сиалилтрансферазы, в-1,3-И-ацетилглюкозаминилтрансферазы, в-1,6-И-ацетилглюкозаминилтрансферазы, β-1,3галактозилтрансферазы и в-1,4-галактозилтрансферазы.
  5. 5. Генетически модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, где генетически модифицированная клетка представляет собой Escherichia coli.
  6. 6. Генетически модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, где олигосахарид грудного молока выбирают из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы (2'-FL), 3-фукозиллактозы (3-FL), дифукозиллактозы (DFL) и лакто-И-тетраоза (LNT).
  7. 7. Генетически модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, где клетка содержит активный фермент а-1,3-фукозилтрансферазу и продуцирует 3'FL, предпочтительно фермент а-1,3-фукозилтрансфераза представляет собой FutA.
  8. 8. Генетически модифицированная клетка по пп.1-6, где клетка содержит в-1,3-И-ацетилглюкозаминилтрансферазу и в-1,3-галактозилтрансферазу и продуцирует LNT, предпочтительно фермент в-1,3-И-ацетилглюкозаминилтрансфераза представляет собой lgtA, а фермент в-1,3-галактозилтрансфераза представляет собой galTK.
    -
EA202292161 2020-01-23 2021-01-22 НОВЫЙ БЕЛОК СУПЕРСЕМЕЙСТВА ОСНОВНЫХ ПЕРЕНОСЧИКОВ (MFS) (Fred) В ПРОИЗВОДСТВЕ ОГМ EA046005B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA202000087 2020-01-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA046005B1 true EA046005B1 (ru) 2024-01-31

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230072639A1 (en) New major facilitator superfamily (mfs) protein (bad) in hmo production
US20230193335A1 (en) Hmo production
US20230227876A1 (en) Hmo production
US20230109661A1 (en) Hmo production
US20240102063A1 (en) New major facilitator superfamily (mfs) protein (fred) in production of sialylated hmos
US20240043891A1 (en) A dfl-producing strain
US20230109937A1 (en) New major facilitator superfamily (mfs) protein (fred) in hmo production
EA046005B1 (ru) НОВЫЙ БЕЛОК СУПЕРСЕМЕЙСТВА ОСНОВНЫХ ПЕРЕНОСЧИКОВ (MFS) (Fred) В ПРОИЗВОДСТВЕ ОГМ
EA046260B1 (ru) Получение огм
EA046248B1 (ru) Получение огм
EA046241B1 (ru) Получение огм
CN116802302A (zh) 唾液酸化hmo生产中的新主要易化子超家族（mfs）蛋白（fred）