JP7331278B1 - 3’slのインビボ合成のための新規なシアリルトランスフェラーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖(HMO)の生成、特に3’-シアリルラクトース(3’SL)の生合成生成及び前記生成に使用するのに適した遺伝的に操作された細胞に関する。
シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖(HMO)、とりわけより複雑なシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖(HMO)を生成するための細菌細胞工場の設計及び構築は、将来のより複雑な生成物のための革新的且つスケーラブルな解決策を提供するうえで最も重要である。
[特許文献]
[特許文献1]国際公開第2007/101862号パンフレット
[特許文献2]国際公開第2019/020707号パンフレット
[特許文献3]国際公開第2021/123113号パンフレット
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[特許文献8]国際公開第2020/255054号パンフレット
[特許文献9]国際公開第2015/197082号パンフレット
[特許文献10]国際公開第2017/182965号パンフレット
[特許文献11]国際公開第2017/152918号パンフレット
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本開示は、シアル酸付加HMO、特に3’SLを高収量で産生する一方、大規模での産生株の安定した増殖を維持することができる、α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む遺伝的に修飾された細胞に関する。特に、安定した増殖は、生成物形成中、より広い範囲の増殖速度の全体にわたって観察され、これは、したがって、発酵中の炭素源の供給のより速い変動及びより大きい変動を可能にする。
本開示は、特に少なくとも1つのシアリル単糖、例えばシアル酸付加HMO 3’SL、FSL及びLST-aを含有するシアル酸付加HMOのインビボHMO生成の生物工学的課題に取り組むものである。本開示は、ラクトース上の末端ガラクトース部分に向かう基質特異性及び本開示のα-2,3-シアリルトランスフェラーゼの活性を利用することにより、特定のシアル酸付加HMO、特に3’SLを生成するための具体的な株操作の解決策を提供し、これは、大規模な発酵における株安定性及び生成収量の増大の両方に関して、シアル酸付加HMOの生成を向上させる。
これに関連して、用語「オリゴ糖」は、少なくとも3つの単糖ユニットを含有する糖ポリマー、即ちトリ-、テトラ-、ペンタ-、ヘキサ-又はより高次のオリゴ糖を意味する。オリゴ糖は、グリコシド間結合によって互いに連結される単糖ユニットを含有する直鎖状構造又は分枝状構造を有し得る。特に、オリゴ糖は、還元末端においてラクトース残基を、且つアルドース(例えば、グルコース、ガラクトース、リボース、アラビノース、キシロースなど)、ケトース(例えば、フルクトース、ソルボース、タガトースなど)、デオキシ糖(例えば、ラムノース、フコースなど)、デオキシアミノ糖(例えば、N-アセチル-グルコサミン、N-アセチル-マンノサミン、N-アセチルガラクトサミンなど)、ウロン酸及びケトアルドン酸(例えば、N-アセチルノイラミン酸)から選択される5~9つの炭素原子の1つ以上の天然に存在する単糖を含む。好ましくは、オリゴ糖は、HMOである。
本開示の好ましいオリゴ糖は、ヒトミルクオリゴ糖(HMO)である。
本開示に従う遺伝的に修飾された細胞は、シアル酸を活性化糖からアクセプタオリゴ糖の終端のガラクトースに転移させることができる、α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む。
本開示に従う遺伝的に修飾された細胞は、シアリル残基をシアリルドナーからアクセプタオリゴ糖に転移させて、シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖生成物、即ちシアリルトランスフェラーゼを合成することができる少なくとも1つのグリコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも1つの組換え核酸配列を含む。
アルファ-2,3-シアリルトランスフェラーゼは、ドナー基質、例えばCMP-N-アセチルノイラミン酸からアルファ-2,3-結合内のアクセプタ分子へのシアリルの転移を触媒するグリコシルトランスフェラーゼを指す。好ましくは、本明細書中で用いられるアルファ-2,3-シアリルトランスフェラーゼは、遺伝的に操作された細胞の種に由来しない。即ち、アルファ-2,3-シアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、異種起源のものであり、表1において特定されるアルファ-2,3-シアリルトランスフェラーゼから選択される。ラクトース上にシアリル部分を転移させることができる異種アルファ2,3-シアリルトランスフェラーゼは、当技術分野において知られており、その3つが表1に特定されている。
本開示の方法を実行する場合、好ましくは、活性化糖ヌクレオチドがグリコシルドナーとして機能するグリコシルトランスフェラーゼ媒介グリコシル化反応が起こる。活性化糖ヌクレオチドは、一般に、リン酸化されたグリコシル残基がヌクレオシドに取り付けられている。特定のグリコシルトランスフェラーゼ酵素が特定の糖ヌクレオチドのみを受け取る。したがって、好ましくは、以下の活性化糖ヌクレオチドがグリコシル転移に関与する:グルコース-UDP-GlcNAc、UDP-ガラクトース、UDP-グルコース、UDP-N-アセチルグルコサミン、UDP-N-アセチルガラクトサミン(GlcNAc)及びCMP-N-アセチルノイラミン酸。本開示に従う遺伝的に修飾された細胞は、グルコース-UDP-GlcNAc、GDP-フコース、UDP-ガラクトース、UDP-グルコース、UDP-N-アセチルグルコサミン、UDP-N-アセチルガラクトサミン及びCMP-N-アセチルノイラミン酸からなる群から選択されるヌクレオチド活性化糖を産生する1つ以上の経路を含み得る。
好ましくは、本開示に従う遺伝的に修飾された細胞は、シアル酸糖ヌクレオチド合成能力を含む。即ち、遺伝的に修飾された細胞は、シアラート糖ヌクレオチド、例えば本開示のアルファ-2,3-シアリルトランスフェラーゼのためのグリコシルドナーとしてのCMP-N-アセチルノイラミン酸を作成するための生合成経路を含む。例えば、遺伝的に修飾された細胞は、外因性UDP-GlcNAc2-エピメラーゼ(例えば、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)のNeuC(GenBank AAK91727.1)若しくは均等物(例えば、(GenBank CAR04561.1)、Neu5Acシンターゼ(例えば、C.ジェジュニ(C.jejuni)のNeuB(GenBank AAK91726.1)若しくは均等物(例えば、フラボバクテリウム・リムノセディミニス(Flavobacterium limnosediminis)シアル酸シンターゼ、GenBank WP_023580510.1)及び/又はCMP-Neu5Acシンテターゼ(例えば、C.ジェジュニ(C.jejuni)のNeuA(GenBank AAK91728.1)若しくは均等物(例えば、ビブリオ・ブラシリエンシス(Vibrio brasiliensis)CMP-シアル酸シンターゼ、GenBank WP_006881452.1)の提供によるシアル酸合成能力を含む。
本開示の遺伝的に修飾された細胞は、好ましくは、欠損性シアル酸代謝経路を有する。「シアル酸代謝経路」は、シアル酸の分解を生じさせる、通常、酵素によって制御及び触媒される一連の反応を意味する。以降に記載される例示的なシアル酸代謝経路は、大腸菌(E.coli)経路である。この経路において、シアル酸(Neu5Ac;N-アセチルノイラミン酸)は、全てnanATEK-yhcHオペロンによってコードされ、且つNanRによって抑制される酵素NanA(N-アセチルノイラミン酸リアーゼ)及びNanK(N-アセチルマンノサミンキナーゼ)及びNanE(N-アセチルマンノサミン-6-リン酸エピメラーゼ)によって分解される(http://ecocyc.org/ECOLI)。欠損性シアル酸代謝経路は、内因性nanA(N-アセチルノイラミン酸リアーゼ)(例えば、GenBank受託番号D00067.1(GL216588))及び/又はnanK(N-アセチルマンノサミンキナーゼ)遺伝子(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、GenBank受託番号(アミノ酸)BAE77265.1(GL85676015))及び/又はnanE(N-アセチルマンノサミン-6-リン酸エピメラーゼ、GI:947745)内に変異を導入することにより、大腸菌(E.coli)宿主内に与えられる。任意選択的に、nanT(N-アセチルノイラミナートトランスポータ)遺伝子も不活化されるか又は変異する。シアル酸代謝の他の中間体として、(ManNAc-6-P)N-アセチルマンノサミン-6-ホスファート;(GlcNAc-6-P)N-アセチルグルコサミン-6-ホスファート;(GlcN-6-P)グルコサミン-6-ホスファート及び(Fruc-6-P)フルクトース-6-ホスファートが挙げられる。一部の好ましい実施形態において、nanAは、変異している。他の好ましい実施形態において、nanA及びnanKは、変異している一方、nanEは、機能的なままである。別の好ましい実施形態において、nanA及びnanEは、変異している一方、nanKは、変異、不活化又は欠失されていない。変異は、nanA、nanK、nanE及び/又はnanTの遺伝子産物をコードする核酸配列内の1つ以上の変化である。例えば、変異は、核酸配列内の1つ、2つ、最大5つ、最大10個、最大25個、最大50個又は最大100個の変化であり得る。例えば、nanA、nanK、nanE及び/又はnanT遺伝子は、ヌル変異によって変異している。本明細書中に記載されるヌル変異は、酵素の機能の消失(即ち活性の引下げ又は活性なし)又は酵素の消失(即ち遺伝子産物なし)の何れかを誘発するアミノ酸の置換、付加、欠失又は挿入を含む。「欠失した」は、(機能的)遺伝子産物が産生されないように、コーディング領域が完全に又は部分的に除去されていることを意味する。「不活化された」は、結果として生じる遺伝子産物が機能的に不活性であるか、又は固有の天然に存在する内因性遺伝子産物の活性の100%未満、例えば90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%若しくは20%の遺伝子産物をコードするようにコーディング配列が変更されていることを意味する。したがって、本開示において、nanA、nanK、nanE及び/又はnanT遺伝子は、好ましくは、不活化されている。
細胞によって産生されるオリゴ糖生成物、HMOは、細胞内マトリックス及び細胞外マトリックスの両方において蓄積され得る。生成物は、受動的に上清にトランスポートされ得、即ち細胞膜を横断して外側に拡散する。代わりに、HMOトランスポートは、細胞から上清への糖誘導体の放出を促進するメジャーファシリテータスーパーファミリートランスポータタンパク質によって促進され得る。メジャーファシリテータスーパーファミリートランスポータは、外生的又は内生的に存在し得、発酵の条件下で過剰発現されて、産生されるオリゴ糖誘導体(HMO)の輸送を増強する。分泌される生成物の糖部分に対する特異性は、既知の組換えDNA技術による変異によって変更させることができる。
一実施形態において、本開示の遺伝的に修飾された細胞は、シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖生成物、例えば3’SLを細胞外培地中に輸送することができる排出トランスポータタンパク質をコードする核酸配列を含む。これに関連して、前記排出トランスポータタンパク質は、好ましくは、細菌ローゼンベルギエラ・ネクタレア(Rosenbergiella nectarea)に由来する、推定のMFS(メジャーファシリテータスーパーファミリー)トランスポータタンパク質をコードする異種遺伝子である。より具体的には、本開示は、GenBank受託ID WP_092672081.1又は配列番号38のアミノ酸配列のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%又は100%の配列同一性を有するタンパク質をコードする組換え核酸を含む、オリゴ糖、特にシアル酸付加HMOを産生するように最適化された遺伝的に修飾された細胞に関する。
実施形態において、本開示の遺伝的に修飾された細胞は、単純なシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖生成物、例えば3’SL及び6’SLを細胞外培地中に輸送することができる排出トランスポータタンパク質をコードする核酸配列を含む。これに関連して、前記排出トランスポータタンパク質は、好ましくは、細菌エルシニア・フレデリクセニ(Yersinia frederiksenii)及び/又は細菌エルシニア・ベルコヴィエリ(Yersinia bercovieri)に由来する、推定のMFS(メジャーファシリテータスーパーファミリー)トランスポータタンパク質をコードする異種遺伝子である。より具体的には、本開示は、GenBank受託ID WP_087817556.1(配列番号40)又はGenBank受託EEQ08298(配列番号39)のアミノ酸配列のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%又は100%の配列同一性を有するタンパク質をコードする組換え核酸を含む、オリゴ糖、特にシアル酸付加HMOを産生するように最適化された遺伝的に修飾された細胞に関する。
これに関連して、用語「遺伝的に修飾された細胞」及び「遺伝的に操作された細胞」は、互換的に用いられる。本明細書中で用いられる「遺伝的に修飾された細胞」は、遺伝物質が遺伝的工学技術を用いてヒト干渉によって変更されている宿主細胞であり、そのような技術は、例えば、以下に限定されないが、例えば異種ポリヌクレオチド配列、Crisper/Cas編集及び/又はランダム変異誘発による形質転換又は形質移入である。一実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、組換え核酸配列により形質転換又は形質移入されている。
細菌宿主細胞に関して、原則として、限定されないが、それらは、対象の遺伝子を挿入するための遺伝的操作を可能にする限り、真正細菌(グラム陽性又はグラム陰性)又は古細菌であり得、製造規模で培養することができる。好ましくは、宿主細胞は、高細胞密度への培養を可能にする特性を有する。本開示に従うHMOの産業的組換え生成に適した細菌宿主細胞の非限定的な例として、エルウィニア・ヘルビコラ(Erwinia herbicola)(パントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans))、シトロバクター・フロインジイ(Citrobacter freundii)、カンピロバクター(Campylobacter)属種、パントエア・シトレア(Pantoea citrea)、ペクトバクテリウム・カロトボルム(Pectobacterium carotovorum)又はキサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)があり得る。枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・コアギュランス(Bacillus coagulans)、バチルス・サーモフィルス(Bacillus thermophilus)、バチルス・ラテロスポルス(Bacillus laterosporus)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・ミコイデス(Bacillus mycoides)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・レンツス(Bacillus lentus)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)及びバチルス・サーキュサンス(Bacillus circulans)が挙げられるバチルス属(genus Bacillus)の細菌も用いられ得る。同様に、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ヘルベチクス(Lactobacillus helveticus)、ラクトバチルス・デルブリュッキイ(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・ブルガリクス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトバチルス・クリスパツス(Lactobacillus crispatus)、ラクトバチルス・ガセリ(Lactobacillus gasseri)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、ラクトバチルス・ジェンセニイ(Lactobacillus jensenii)及びラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)が挙げられるが、これらに限定されないラクトバチルス(Lactobacillus)属及びラクトコッカス(Lactococcus)属の細菌が本開示の方法を用いて操作され得るストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophiles)及びプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ(Proprionibacterium freudenreichii)も、本明細書中に記載される本開示に適した細菌種である。本発明の一部として挙げられるのは、エンテロコッカス(Enterococcus)属(例えば、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)及びエンテロコッカス・サーモフィルス(Enterococcus thermophiles))、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属(例えば、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis)及びビフィドバクテリウム・ビフィドゥム(Bifidobacterium bifidum))、スポロラクトバチルス(Sporolactobacillus)属種、ミクロモモスポラ(Micromomospora)属種、ミクロコッカス(Micrococcus)属種、ロドコッカス(Rhodococcus)属種及びシュードモナス(Pseudomonas)属(例えば、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)及び緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa))由来の、本明細書中に記載されるように操作された菌株でもある。
本開示は、α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、例えばClari1、Neigon、Poral及びPmNからなる群から選択される酵素をコードする組換え核酸配列を含む遺伝的に修飾された細胞に関し、前記細胞は、ヒトミルクオリゴ糖(HMO)、特にシアル酸付加HMO、好ましくは3’SLを産生する。
本明細書中で用いられる用語「配列同一性」は、ペアワイズアラインメントに基づく、2つのアミノ酸配列間又は2つのヌクレオチド配列間、即ち候補配列(例えば、本開示の配列)と基準配列(例えば、先行技術配列)との間の相関性を説明する。本開示のために、2つのアミノ酸配列間の配列同一性は、Needleman-Wunschアルゴリズム(非特許文献12)を用いて判定される(EMBOSSパッケージ(非特許文献13)、好ましくはバージョン5.0.0以後のNeedleプログラムにより実行される((非特許文献14)で入手可能))。用いられるパラメータは、10のギャップオープンペナルティ、0.5のギャップエクステンションペナルティ及びEBLOSUM62(30 BLOSUM62のEMBOSSバージョン)置換マトリックスである。Needle標識「最長同一性」(-nobriefオプションを用いて得られる)の出力が同一性パーセントとして用いられ、以下のように算出される:(同一の残基×100)/(アラインメントの長さ-アラインメント内のギャップの総数)。
本明細書中に記載されるタンパク質/核酸配列の機能的相同体又は機能的バリアントは、その元々の機能性を保持する、変更を遺伝コード内に有するタンパク質/核酸配列である。機能的相同体は、変異誘発によって得ることができるか、又は同じ若しくは他の種由来の天然に存在するバリアントであり得る。機能的相同体は、タンパク質/核酸配列の機能性と比較して、少なくとも50%、例えば少なくとも60%、70%、80%、90%又は100%の存続する機能性を有するべきである。
本開示は、例えば、以下に限定されないが、シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖(HMO)を生成する方法における、本明細書中で開示される遺伝的に修飾された細胞又は核酸構築体のあらゆる商用利用にも関する。
本開示は、シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖(HMO)を生成する方法にも関し、前記方法は、本開示に従う遺伝的に修飾された細胞を培養することを含む。本開示の実施例1は、産生株において発現された場合に3’SLを生成して、Nstアルファ-2,3-シアリルトランスフェラーゼと比較した場合に安定した増殖を示す異種アルファ-2,3-シアリルトランスフェラーゼClari1、Neigon、Poral及びPmN(それぞれ配列番号1、2、3及び4)を特定した。
a.配列番号1のアミノ酸配列又は配列番号1に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%若しくは例えば少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるClari1、
b.配列番号2のアミノ酸配列又は配列番号2に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%若しくは例えば少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるNeigon、
c.配列番号3のアミノ酸配列又は配列番号3に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%若しくは例えば少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるPoral、及び
d.配列番号4のアミノ酸配列又は配列番号4に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%若しくは例えば少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるPmN
からなる群から選択される。
a)i.好ましくはPglpFプロモータ制御下の、α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列であって、前記酵素は、配列番号1のアミノ酸配列又は配列番号1に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%若しくは例えば少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるClari1、配列番号2のアミノ酸配列又は配列番号2に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%若しくは例えば少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるNeigon、配列番号3のアミノ酸配列又は配列番号3に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%若しくは例えば少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるPoral及び配列番号4のアミノ酸配列又は配列番号4に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%若しくは例えば少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるPmN
からなる群から選択される、組換え核酸配列;
ii.任意選択的に、好ましくはPglpFプロモータの制御下の、ピロリ菌(Helicobacter pylori)由来のGalTK等の異種β-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列、
iii.任意選択的に、好ましくはPglpFプロモータの制御下の、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)由来のLgtA等のβ-1,3-N-アセチル-グルコサミニル-トランスフェラーゼをコードする核酸配列、
iv.任意選択的に、好ましくはPglpF又はPlacプロモータの制御下の、限定されないが、Fred、Nec及び/又はYberC等のMFSトランスポータをコードする核酸配列
を含む遺伝的に修飾された細胞を得ることと、
b)前記遺伝的に修飾された細胞を炭素源含有培地中及びラクトースの存在下で培養することと、
c)前記遺伝的に修飾された細胞により、前記シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖(HMO)、特に3’SL及び/又はLST-aを生成することと、
d)培地及び/又は遺伝的に修飾された細胞からシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖(HMO)、特に3’SL及び/又はLST-aを回収することと
を含む。
a)i.α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列であって、前記酵素は、配列番号1のアミノ酸配列又は配列番号1に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%若しくは例えば少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるClari1である、組換え核酸配列、及び
ii.好ましくはPglpF又はPlacプロモータの制御下の、限定されないが、Fred、Nec及び/又はYberC等のMFSトランスポータをコードする核酸配列
を含む遺伝的に修飾された細胞を得ることと、
b)前記遺伝的に修飾された細胞を炭素源含有培地中及びラクトースの存在下で培養することと、
c)前記遺伝的に修飾された細胞により、前記シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖(HMO)、特に3’SLを生成することと、
d)培地及び/又は遺伝的に修飾された細胞からシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖(HMO)、特に3’SLを回収することと
を含む。
a)i.α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列であって、前記酵素は、配列番号2のアミノ酸配列又は配列番号2に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%若しくは例えば少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるPoralである、組換え核酸配列、及び
ii.好ましくはPglpF又はPlacプロモータの制御下の、限定されないが、Fred、Nec及び/又はYberC等のMFSトランスポータをコードする核酸配列
を含む遺伝的に修飾された細胞を得ることと、
b)前記遺伝的に修飾された細胞を炭素源含有培地中及びラクトースの存在下で培養することと、
c)前記遺伝的に修飾された細胞により、3’SLを生成することと、
d)培地及び/又は遺伝的に修飾された細胞から3’SLを回収することと
を含む。
a)i.α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列であって、前記酵素は、配列番号3のアミノ酸配列又は配列番号3に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%若しくは例えば少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるPoralである、組換え核酸配列、及び
ii.好ましくはPglpF又はPlacプロモータの制御下の、限定されないが、Fred、Nec及び/又はYberC等のMFSトランスポータをコードする核酸配列
を含む遺伝的に修飾された細胞を得ることと、
b)前記遺伝的に修飾された細胞を炭素源含有培地中及びラクトースの存在下で培養することと、
c)前記遺伝的に修飾された細胞により、3’SLを生成することと、
d)培地及び/又は遺伝的に修飾された細胞から3’SLを回収することと
を含む。
a)i.α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列であって、前記酵素は、配列番号4のアミノ酸配列又は配列番号4に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%若しくは例えば少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるPmNである、組換え核酸配列、及び
ii.好ましくはPglpF又はPlacプロモータの制御下の、限定されないが、Fred、Nec及び/又はYberC等のMFSトランスポータをコードする核酸配列
を含む遺伝的に修飾された細胞を得ることと、
b)前記遺伝的に修飾された細胞を炭素源含有培地中及びラクトースの存在下で培養することと、
c)前記遺伝的に修飾された細胞により、3’SLを生成することと、
d)培地及び/又は遺伝的に修飾された細胞から3’SLを回収することと
を含む。
シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖(HMO)は、培地及び/又は遺伝的に修飾された細胞から回収される。これに関連して、用語「回収」は、用語「収集」と互換的に用いられる。これに関連して、「回収」及び「収集」の両方は、発酵の終了後、培養物/ブロスから、産生されたHMOを集めることに関する。1つ以上の例示的な実施形態において、これは、バイオマス(即ち宿主細胞)及び培地の両方に含まれる、即ちバイオマスからの発酵ブロスの分離前に/分離をせずにHMOを集めることを含み得る。他の実施形態において、産生されたHMOは、バイオマス及び発酵ブロスから別個に、即ち培地(即ち発酵ブロス)からのバイオマスの分離後に集められ得る。
遺伝的に操作された細胞又は核酸構築体の使用に従う用語「製造された生成物」は、1つ以上の生成物HMOとして意図される1つ以上のHMOを指す。種々の生成物は、先に記載されている。
本出願は、参照によって本明細書に組み込まれるテキストフォーマット及び電子フォーマットの配列表を含有する。
本開示の種々の実施形態が以下の条項に記載される:
1.α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む遺伝的に修飾された細胞であって、前記酵素は、
a.配列番号3のアミノ酸配列又は配列番号3に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるPoral、
b.配列番号1のアミノ酸配列又は配列番号1に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるClari1、
c.配列番号4のアミノ酸配列又は配列番号4に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるPmN、及び
d.配列番号2のアミノ酸配列又は配列番号2に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるNeigon
からなるシアリルトランスフェラーゼの群から選択され、前記細胞は、シアル酸付加HMOを産生する、遺伝的に修飾された細胞。
2.シアル酸付加HMOは、3’SL、FSL、DSLNT及びLST-aからなる群から選択される、条項1に従う遺伝的に修飾された細胞。
3.シアル酸付加HMOは、3’SLである、条項1又は2のいずれかに従う遺伝的に修飾された細胞。
4.3’SLは、遺伝的に修飾された細胞によって産生される唯一のHMOである、先の条項のいずれか1つに従う遺伝的に修飾された細胞。
5.α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸配列は、配列番号12~22又は41~54に従う、好ましくは配列番号13、18、19、20、21、22、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50及び51からなる群から選択される核酸配列を有する、PglpF、PglpA_70UTR、PglpT_70UTR、Plac_70UTR、PmglB_70UTR及びそれらのバリアントからなる群から選択されるプロモータの制御下にある、先の条項のいずれか1つに従う遺伝的に修飾された細胞。
6.β-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ、β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ及びβ-1,3-N-アセチル-グルコサミニル-トランスフェラーゼからなる群から選択される1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする1つ以上の核酸配列を更に含む、先の条項のいずれか1つに従う遺伝的に修飾された細胞。
7.細胞外培地中にシアル酸付加HMOを輸送することができるMFSトランスポータタンパク質をコードする核酸配列を更に含む、先の条項のいずれか1つに従う遺伝的に修飾された細胞。
8.MFSトランスポータタンパク質は、Fred、YberC又はNecタンパク質である、条項7に従う遺伝的に修飾された細胞。
9.シアル酸糖ヌクレオチドを作成するための生合成経路を含む、先の条項のいずれか1つに従う遺伝的に修飾された細胞。
10.シアル酸糖ヌクレオチドは、CMP-Neu5Acであり、前記シアル酸糖ヌクレオチド経路は、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)由来のNeuBCAをコードする核酸配列(配列番号35)によってコードされる、条項9に従う遺伝的に修飾された細胞。
11.シアル酸糖ヌクレオチド経路は、neuBCAオペロンを有する高コピープラスミドによってコードされる、条項9又は10に従う遺伝的に修飾された細胞。
12.微生物である、先の条項のいずれかに従う遺伝的に修飾された細胞。
13.細菌又は真菌である、先の条項のいずれかに従う遺伝的に修飾された細胞。
14.前記真菌は、コマガタエラ(Komagataella)属、クルイベロマイセス(Kluyveromyce)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ピキア(Pichia)属、サッカロマイセス(Saccaromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属若しくはハンゼヌラ(Hansenula)属の酵母細胞から又はアスペルギルス(Aspergillus)属、フザリウム(Fusarium)属若しくはトリコデルマ(Tricoderma)属の糸状菌から選択される、条項13に従う遺伝的に修飾された細胞。
15.前記細菌は、エシェリキア(Escherichia)属種、バチルス(Bacillus)属種、ラクトバチルス(lactobacillus)属種及びカンピロバクター(Campylobacter)属種からなる群から選択される、条項13に従う遺伝的に修飾された細胞。
16.前記細菌は、大腸菌(E.coli)である、条項15に従う遺伝的に修飾された細胞。
17.シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖(HMO)を生成する方法であって、α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む遺伝的に修飾された細胞を培養することを含み、前記酵素は、
a.配列番号3のアミノ酸配列又は配列番号3に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるPoral、
b.配列番号1のアミノ酸配列又は配列番号1に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるClari1、
c.配列番号4のアミノ酸配列又は配列番号4に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるPmN、及び
d.配列番号2のアミノ酸配列又は配列番号2に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるNeigon
からなる群から選択され、前記遺伝的に修飾された細胞は、任意選択的に、条項4~11に従う少なくとも1つの追加の修飾を含む、方法。
18.生成されるシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖(HMO)は、3’SLである、条項17に従う方法。
19.3’SLは、生成される唯一のヒトミルクオリゴ糖(HMO)である、条項17又は18に従う方法。
20.遺伝的に操作された細胞を、グルコース、スクロース、フルクトース、キシロース及びグリセロールからなる群から選択される炭素源の存在下で培養することを含む、条項17~19のいずれか1つに従う方法。
21.ラクトースは、シアル酸付加HMO形成のための基質として、遺伝的に操作された細胞の培養中に添加される、条項17~20のいずれか1つに従う方法。
22.シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖(HMO)は、培地及び/又は遺伝的に修飾された細胞から回収される、条項17~21のいずれか1つに従う方法。
23.α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む核酸構築体であって、前記組換え核酸配列は、
a.配列番号25の核酸配列又は配列番号25に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるPoral、
b.配列番号23の核酸配列又は配列番号23に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるClari1、
c.配列番号26の核酸配列又は配列番号26に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるPmN、及び
d.配列番号24の核酸配列又は配列番号24に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるNeigon
からなる群から選択され、酵素コーディング配列は、プロモータ配列の制御下にある、核酸構築体。
24.プロモータ配列は、配列番号12~22又は41~54に従う、好ましくは配列番号13、18、19、20、21、22、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50及び51からなる群から選択される核酸配列を有する、PglpF、PglpA_70UTR、PglpT_70UTR、Plac_70UTR、PmglB_70UTR及びそれらのバリアントからなる群から選択される、条項23に従う核酸構築体。
25.シアル酸付加HMOを産生する宿主細胞における、条項23又は24に従う核酸構築体の使用。
26.シアル酸付加HMOの生成における、条項1~16のいずれか1つに従う遺伝的に修飾された細胞の使用。
[方法]
他に明記しない限り、分子生物学の分野において知られている標準的な技術、ベクター、制御配列要素及び他の発現系要素を核酸の操作、形質転換及び発現に用いる。そのような標準的な技術、ベクター及び要素は、例えば、(非特許文献15;非特許文献16;非特許文献17;非特許文献18;非特許文献5)に見出すことができる。
18種の酵素を、クエリとして知られているα-2,3-シアリルトランスフェラーゼを用い、且つ科学論文又はデータベース、例えばKEGG及びCAZYデータベース等の情報源を利用することにより、タンパク質BLASTサーチに基づくインシリコ選択アプローチに従って集めた。
本開示において構築した株(遺伝的に操作された細胞)は、遺伝子型:F-、λ-、gyrA96、recA1、relA1、endA1、thi-1、hsdR17、supE44を有する大腸菌(Escherichia coli)K-12 DH1に基づいた。追加の修飾を大腸菌(E.coli)K-12 DH1株に行って、以下の修飾:lacZ:1.5kbpの欠失、lacA:0.5kbpの欠失、nanKETA:3.3kbpの欠失、melA:0.9kbpの欠失、wcaJ:0.5kbpの欠失、mdoH:0.5kbpの欠失及びgmd遺伝子の上流へのPlacプロモータの挿入を有するMDO株を生成した。
株を、4日間プロトコルを用いて96ディープウェルプレート内でスクリーニングした。最初の24時間中、前培養物を高密度に増殖させてから、遺伝子発現の誘導及び生成物形成を可能にする培地に移した。より詳細には、1日目中、硫酸マグネシウム、チアミン及びグルコースを補充した基礎最少培地を用いてフレッシュな前培養物を調製した。前培養物を34℃、1000rpmの振盪で24時間インキュベートし、その後、更に新しい基本最少培地(BMM、pH7,5)に移してメインの培養を開始した。新しいBMMに硫酸マグネシウム、チアミン、20%グルコース溶液のボーラス(100mLあたり50μl)及び20%ラクトース溶液のボーラス(100mlあたり5ml)を補充した。更に、グルコースがC制限増殖に適した速度で放出されるようなスクロースヒドロラーゼ(インベルターゼ)の添加を伴って、50%スクロース溶液を炭素源として提供した。IPTG(50mg/ml)を添加して、遺伝子発現及びアンピシリン抗生物質(100mg/ml)を誘導した。メインの培養物を28℃、1000rpmの振盪で72時間インキュベートした。
大腸菌(E.coli)株を、250mL発酵槽(Ambr 250 Bioreactor system、Sartorius)内において、6.9g/Lグルコースからなる100mLの無機培地並びに(NH4)2HPO4、KH2PO4、MgSO4x7H2O、KOH、NaOH、微量要素溶液、泡消し剤及びチアミンで構成される無機培地から開始して培養した。溶解酸素レベルを、最初の撹拌のカスケード及びその後の700rpm(最大4500rpmまで)、1VVM(最大3VVMまで)で開始する空気流によって20%に維持した。pHを8.5%NH4OH溶液による滴定によって6.8に維持した。培養を、類似のグルコース含有培地において増殖した前培養物由来の2%(v/v)接種材料で開始した。バッチ培地内に含有されるグルコースの枯渇後、49%(w/w)グルコース、MgSO4x7H2O、微量金属及び泡消し剤を含有する供給溶液を、0.192gグルコース/hの最初の供給速度で開始する、図2に示す供給プロファイルを用いて連続的に供給した。温度を最初に33℃にしたが、26時間の供給後に5hのランプで28℃に下げた(図x)。細胞の増殖及び代謝活性及び状態は、反射率及びCO2進化速度のオンライン測定値という結果になった。
個々のアルファ-2,3-シアリルトランスフェラーゼ酵素を発現する遺伝的に修飾された細胞を、最初の基質としてラクトースを用いた場合にシアル酸付加HMO、3’SLを唯一のHMOとして生成する能力の有無に関してスクリーニングした。
α-2,3-シアリルトランスフェラーゼを発現する株のロバスト性は、3’SLの製造をアップスケールする場合に重要である。本実施例において、実施例1由来の優良株、Clari1又はPoralを発現する株の増殖を、PglpF又はPlacプロモータの制御下でNstを発現する株と比較した。
Claims (16)
- α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む遺伝的に修飾された細胞であって、前記酵素は、配列番号3のアミノ酸配列又は配列番号3に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるPoralであり、前記細胞は、シアル酸付加HMOを産生する、遺伝的に修飾された細胞。
- 前記シアル酸付加HMOは、3’SL、FSL、DSLNT及びLST-aからなる群から選択される、請求項1に記載の遺伝的に修飾された細胞。
- 3’SLは、前記遺伝的に修飾された細胞によって産生される唯一のHMOである、請求項1又は2に記載の遺伝的に修飾された細胞。
- α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする前記核酸配列は、配列番号12~22又は41~54に記載の核酸配列を有する、PglpF、PglpA_70UTR、PglpT_70UTR、Plac_70UTR、PmglB_70UTR及びそれらのバリアントからなる群から選択されるプロモータの制御下にある、請求項1又は2に記載の遺伝的に修飾された細胞。
- α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする前記核酸配列は、配列番号13、18、19、20、21、22、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50及び51からなる群から選択される核酸配列を有する、PglpF、PglpA_70UTR、PglpT_70UTR、Plac_70UTR、PmglB_70UTR及びそれらのバリアントからなる群から選択されるプロモータの制御下にある、請求項1又は2に記載の遺伝的に修飾された細胞。
- 細胞外培地中に前記シアル酸付加HMOを輸送することができるMFSトランスポータタンパク質をコードする核酸配列を更に含む、請求項1又は2に記載の遺伝的に修飾された細胞。
- シアル酸糖ヌクレオチドを作成するための生合成経路を含む、請求項1又は2に記載の遺伝的に修飾された細胞。
- ヤロウイア(Yarrowia)属、ピキア(Pichia)属、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、エシェリキア(Escherichia)属種、バチルス(Bacillus)属種、ラクトバチルス(lactobacillus)属種、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属種及びカンピロバクター(Campylobacter)属種からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の遺伝的に修飾された細胞。
- 大腸菌(E.coli)細胞である、請求項1又は2に記載の遺伝的に修飾された細胞。
- シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖(HMO)を生成する方法であって、α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む遺伝的に修飾された細胞を培養することを含み、前記酵素は、配列番号3のアミノ酸配列又は配列番号3に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるPoralである、方法。
- 生成される前記シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖(HMO)は、3’SLである、請求項10に記載の方法。
- ラクトースは、シアル酸付加HMO形成のための基質として、前記遺伝的に操作された細胞の前記培養中に添加される、請求項10に記載の方法。
- 前記シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖(HMO)は、前記遺伝的に修飾された細胞から回収される、請求項10に記載の方法。
- α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む核酸構築体であって、前記組換え核酸配列は、配列番号25の核酸配列又は配列番号25に対して少なくとも90%の同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなるPoralであり、前記酵素をコードする組換え核酸配列は、配列番号12~22又は41~54に記載の核酸配列を有する、PglpF、PglpA_70UTR、PglpT_70UTR、Plac_70UTR、PmglB_70UTR及びそれらのバリアントからなる群から選択されるプロモータ配列の制御下にある、核酸構築体。
- シアル酸付加HMOを生成するために宿主細胞において使用するためのものである、請求項14に記載のα-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む核酸構築体。
- シアル酸付加HMOの生成に使用するためのものである、請求項1又は2に記載の遺伝的に修飾された細胞。
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