JP2023129299A - ３’ｓｌのインビボ合成のための新規なシアリルトランスフェラーゼ - Google Patents

Abstract

【課題】シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の生成、特に３’－シアリルラクトース（３’ＳＬ）を生成する方法、及び前記生成に適した遺伝的に操作された細胞を提供する。【解決手段】α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む遺伝的に修飾された細胞であって、前記酵素は、特定のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＰｏｒａｌであり、前記細胞は、シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を産生する、遺伝的に修飾された細胞を提供する。【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明

［分野］
本開示は、シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の生成、特に３’－シアリルラクトース（３’ＳＬ）の生合成生成及び前記生成に使用するのに適した遺伝的に操作された細胞に関する。

［背景］
シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）、とりわけより複雑なシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を生成するための細菌細胞工場の設計及び構築は、将来のより複雑な生成物のための革新的且つスケーラブルな解決策を提供するうえで最も重要である。

この目的のために、合理的な株操作原理が単一の細菌細胞に一般的に適用される。そのような原理は、通常、ａ）宿主への所望の生合成経路の導入、ｂ）所望の反応においてドナーとして必要とされる関連活性化糖の細胞プールの増大、ｃ）固有のラクトースパーミアーゼＬａｃＹによるラクトース導入の増強、及びｄ）シアル酸付加オリゴ糖の生合成生成を促進するのに適した糖トランスフェラーゼの導入を指す（レビューについて、（非特許文献１）を参照されたい）。

（特許文献１）は、例えば、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼ、ＮｓｔをｎｅｕＢＣＡ遺伝子の発現と組み合わせて用いて、ＣＭＰ－ｎｅｕ５ＡＣを生成する、シアル酸付加ＨＭＯの生成を開示している。

シアル酸付加ＨＭＯを生成する更なる試みは、細胞内で複雑なシアル酸付加ＨＭＯを生成することができるいくつかのシアリルトランスフェラーゼを記載する（特許文献２）に示されており、３’ＳＬは、微量の副生成物として仮説的に生成され得る。

（非特許文献２）は、細菌シアリルトランスフェラーゼ特性に関するレビューである。表２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現される細菌シアリルトランスフェラーゼを要約しているが、存在したとしても、どのようなシアリルオリゴ糖が生成されたかの指摘はない。

シアル酸付加ＨＭＯの生成は、基質の不在下でもロバストに増殖する細胞の能力に影響を与え得る、産生株におけるシアリルトランスフェラーゼの副活性によって阻止され得、これは、したがって、シアル酸付加ＨＭＯ生成物の低い収量に反映される。

要約すると、シアル酸付加生成物のより高い収量及び産生株の安定した増殖を可能にする、ＨＭＯ生成のためのシアリルトランスフェラーゼは、特に３’ＳＬのシアル酸付加ＨＭＯの産業的生成についてスケーラブルであるロバストなシアル酸付加ＨＭＯ生成プラットフォームを得るために必要である。

［先行技術文献］
［特許文献］
［特許文献１］国際公開第２００７／１０１８６２号パンフレット
［特許文献２］国際公開第２０１９／０２０７０７号パンフレット
［特許文献３］国際公開第２０２１／１２３１１３号パンフレット
［特許文献４］国際公開第２０２１／１４８６１５号パンフレット
［特許文献５］国際公開第２０２１／１４８６２０号パンフレット
［特許文献６］国際公開第２０２１／１４８６１０号パンフレット
［特許文献７］国際公開第２０１９／１２３３２４号パンフレット
［特許文献８］国際公開第２０２０／２５５０５４号パンフレット
［特許文献９］国際公開第２０１５／１９７０８２号パンフレット
［特許文献１０］国際公開第２０１７／１８２９６５号パンフレット
［特許文献１１］国際公開第２０１７／１５２９１８号パンフレット

［非特許文献］
［非特許文献１］Ｂｙｃｈ ｅｔ ａｌ ２０１９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５６：１３０－１３７
［非特許文献２］Ｓｃｈｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ ２０２０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ ４４，１０７６１３
［非特許文献３］Ｘｉ Ｃｈｅｎ ｉｎ Ｃｈａｐｔｅｒ ４ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１５ ｖｏｌ ７２
［非特許文献４］Ｈ．Ｈ．Ｆｒｅｅｚｅ ａｎｄ Ａ．Ｄ．Ｅｌｂｅｉｎ：Ｃｈａｐｔｅｒ ４：Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，ｉｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅｄｓ．Ａ．Ｖａｒｋｉ ｅｔ ａｌ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００９）
［非特許文献５］Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ．Ｈ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９７２
［非特許文献６］Ｗａｄｄｅｌｌ Ｃ．Ｓ．ａｎｄ Ｃｒａｉｇ Ｎ．Ｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（１９８８）Ｆｅｂ；２（２）：１３７－４９．
［非特許文献７］Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８）；１８０（８）：２０６３－７
［非特許文献８］Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８）２０：１２３－１２８
［非特許文献９］Ｍｕｙｒｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．（２０００）１（３）：２３９－２４３
［非特許文献１０］Ｗｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．（２００５），１２（３）：３４９－５６．
［非特許文献１１］Ｖｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００５）；７１（４）：１８２９－３５
［非特許文献１２］Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏ／．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３
［非特許文献１３］ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７
［非特許文献１４］ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ ｎｅｅｄｌｅ／
［非特許文献１５］Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）
［非特許文献１６］Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）
［非特許文献１７］Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）
［非特許文献１８］Ｂｕｋｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ＤＮＡ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ Ｅｐｉｓｏｍｅｓ（１９７７）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）
［非特許文献１９］Ｈｅｒｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｌａｔｔｎｅｒ ２００４ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：２６７３－８１
［非特許文献２０］Ｗａｒｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ ２００５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（４）：ｅ３６

［概要］
本開示は、シアル酸付加ＨＭＯ、特に３’ＳＬを高収量で産生する一方、大規模での産生株の安定した増殖を維持することができる、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む遺伝的に修飾された細胞に関する。特に、安定した増殖は、生成物形成中、より広い範囲の増殖速度の全体にわたって観察され、これは、したがって、発酵中の炭素源の供給のより速い変動及びより大きい変動を可能にする。

特に、本開示は、配列番号１、２、３若しくは４の１つのアミノ酸配列又は配列番号１、２、３若しくは４の１つに対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、Ｃｌａｒｉ１、Ｎｅｉｇｏｎ、Ｐｏｒａｌ及びＰｍＮからなる群から選択されるα－２，３－シアリルトランスフェラーゼを過剰発現する遺伝的に修飾された細胞に関する。好ましくは、遺伝的に修飾された細胞は、選択されたα－２，３－シアリルトランスフェラーゼが強く且つ好ましくは異種のプロモータの制御下で発現される場合、安定した増殖及び高い生成物収量を示すため、シアル酸付加ＨＭＯの大規模な産業的生成に適している。本開示の細胞によって産生されるシアル酸付加ＨＭＯは、典型的には、３’ＳＬ、ＦＳＬ、ＤＳＬＮＴ及びＬＳＴ－ａからなる群から選択される。好ましくは、産生されるシアル酸付加ＨＭＯは、３’ＳＬ、特に他のＨＭＯ副生成物が存在しない３’ＳＬである。

本開示に従う遺伝的に修飾された細胞は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸の発現を制御するプロモータ要素を更に含み得る。シアリルトランスフェラーゼは、それぞれ、例えば配列番号１２～２２又は４１～５４からなる群から選択される核酸配列を有する、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＡ、ＰｇｌｐＴ、Ｐｌａｃ、ＰｍｇｌＢ及びそれらのバリアントからなる群から選択されるプロモータの制御下にあり得る。好ましくは、シアリルトランスフェラーゼは、組換えプロモータの制御下にあり、これは、固有の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐｌａｃプロモータよりも強い。好ましくは、シアリルトランスフェラーゼは、配列番号１３、１８、１９、２０、２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０及び５１からなる群から選択される組換えプロモータの制御下にある。

本開示は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む核酸構築体に更に関し、前記酵素は、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＣｌａｒｉ１、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＮｅｉｇｏｎ、配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＰｏｒａｌ及び配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＰｍＮからなるシアリルトランスフェラーゼの群から選択され、前記核酸配列は、配列番号１２～２２又は４１～５４に従う核酸配列を有する、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＡ、ＰｇｌｐＴ、Ｐｌａｃ、ＰｍｇｌＢ及びそれらのバリアントからなる群から選択されるプロモータ配列の制御下にある。前記核酸構築体は、典型的には、シアル酸付加ＨＭＯ、例えば３’ＳＬを産生する宿主細胞に用いられる。

本開示に従う遺伝的に修飾された細胞は、細胞外培地中にシアル酸付加ＨＭＯを輸送することができるＭＦＳトランスポータタンパク質をコードする核酸配列を更に含み得る。好ましくは、ＭＦＳトランスポータタンパク質は、それぞれ配列番号３８、３９又は４０に従うアミノ酸配列を有するＮｅｃ、ＹｂｅｒＣ又はＦｒｅｄタンパク質である。

本開示に従う遺伝的に修飾された細胞は、シアル酸糖ヌクレオチド、例えばＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを作成するための生合成経路を含み得る。前記シアル酸糖ヌクレオチド経路は、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のＮｅｕＢＣＡをコードする核酸配列（配列番号３５）によってコードされ得る。ＮｅｕＢＣＡをコードする核酸配列は、ｎｅｕＢＣＡオペロンを有する高コピープラスミドによってコードされ得る。

本開示に従う遺伝的に修飾された細胞は、微生物、例えば細菌又は真菌であり得、前記真菌は、例えば、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属若しくはハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属の酵母細胞から又はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属若しくはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属の糸状菌から選択され得、前記細菌は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、ラクトバチルス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種及びカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属種からなる例示的な群から選択され得る。したがって、本開示に従う遺伝的に修飾された細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり得る。

本開示の遺伝的に修飾された細胞は、シアル酸付加ＨＭＯ、特に３’ＳＬの高収量での生成に用いられる一方、安定した増殖を維持することができる。

したがって、本開示は、シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）、特に３’－ＳＬを生成する方法にも関し、前記方法は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む遺伝的に修飾された細胞を培養することを含み、前記酵素は、配列番号１、２、３若しくは４の１つのアミノ酸配列又は配列番号１、２、３若しくは４の１つに対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、Ｃｌａｒｉ１、Ｎｅｉｇｏｎ、Ｐｏｒａｌ及びＰｍＮからなる群から選択される。一部の実施形態において、前記遺伝的に修飾された細胞は、本開示に従う少なくとも１つの追加の修飾を含む。

種々の例示的な実施形態及び詳細は、関連する場合に図及び配列を参照して以降で説明される。図は、実施形態の説明を容易にすることのみを意図されることに留意するべきである。これらは、本開示の包括的な説明又は本開示の範囲に対する限定として意図されない。加えて、示される実施形態は、示される全ての態様又は利点を有する必要はない。特定の実施形態と併せて説明される態様又は利点は、その実施形態に必ずしも限定されず、そのように示されないか又はそのように明示的に説明されないとしても、他のあらゆる実施形態で実行され得る。

Ｐｌａｃプロモータの制御下でＮｓｔを発現する細胞のモル含有量（斜線バー）と比較した、所与のα－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を表す株における３’ＳＬモル含有量（ｍＭ）のパーセンテージ、％である。ＣｓｔＩ及びＰＭ７０は、３’ＳＬを生成できることが先行技術において知られており、ドットのバーによって示す。 増殖安定性試験に用いた供給プロファイル（実線）及び温度プロファイル（ドット線）である。 Ｎｓｔ＿Ｐｌａｃ（太い線）、Ｎｓｔ＿ＰｇｌｐＦ（薄い線）、ｃｌａｒｉ１（破線）又はｐｏｒａｌ（ドット線）を有する４つの異なる株の増殖安定性試験由来のデータである。Ａ）発酵中の株の二酸化炭素進化速度（Ｃｅｒ）を示す。Ｂ）発酵の時間中の同じ発酵由来の反射を示す。

［詳細な説明］
本開示は、特に少なくとも１つのシアリル単糖、例えばシアル酸付加ＨＭＯ ３’ＳＬ、ＦＳＬ及びＬＳＴ－ａを含有するシアル酸付加ＨＭＯのインビボＨＭＯ生成の生物工学的課題に取り組むものである。本開示は、ラクトース上の末端ガラクトース部分に向かう基質特異性及び本開示のα－２，３－シアリルトランスフェラーゼの活性を利用することにより、特定のシアル酸付加ＨＭＯ、特に３’ＳＬを生成するための具体的な株操作の解決策を提供し、これは、大規模な発酵における株安定性及び生成収量の増大の両方に関して、シアル酸付加ＨＭＯの生成を向上させる。

換言すると、本開示によって包含される遺伝的に修飾された細胞は、シアル酸付加ＨＭＯ生合成にとって重要な酵素をコードする遺伝子を、一部の実施形態において、シアル酸糖ヌクレオチド、例えば配列番号３５に示されるカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のｎｅｕＢＣＡオペロンを作成するための生合成経路をコードする１つ以上の遺伝子と共に発現し、これにより、細胞は、シアル酸付加オリゴ糖を基質、例えばラクトース及びヌクレオチド活性化糖、例えば特にＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸から生成することが可能となる。

特に、生成されるシアル酸付加ＨＭＯは、３’ＳＬ、ＦＳＬ、ＤＳＬＮＴ及びＬＳＴ－ａからなる群から選択される。現在好ましい生成されるシアル酸付加ＨＭＯは、３’ＳＬである。ＦＳＬ、ＤＳＬＮＴ及びＬＳＴ－ａを生成するために、遺伝的に修飾された細胞は、最初の基質としてラクトースからＬＳＴ－ａを生成するための追加のグリコシルトランスフェラーゼ、例えばβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ又はＦＳＬを生成するためのα－１，３－フコシルトランスフェラーゼの存在を必要とする。

これに関連して、本開示のα－２，３－シアリルトランスフェラーゼのいずれか１つを用いる利点は、最初の基質としてラクトースから出発し、且つ強いプロモータから発現される一方、産生株の安定した増殖を維持することができる場合、ラクトースを認識し、且つシアル酸付加して、唯一のＨＭＯとして３’ＳＬを特異的に生成する能力である。ここで示される酵素は、高い３’ＳＬ力価を実現するだけでなく、高い増殖密度に達する安定した増殖も実現する。高い増殖密度に達することによって安定した増殖を示す株の例が実施例１に記載される。特に、本開示は、ＣｓｔＩ及びＰＭ７０（（特許文献２）を参照されたい）等、先行技術において記載されるα－２，３－シアリルトランスフェラーゼよりも３’ＳＬの高い力価をもたらすα－２，３－シアリルトランスフェラーゼを記載し、且つ／又は同じ増殖条件下で同じ宿主細胞に用いられたＣｓｔＩＩ及び／若しくはＮｓｔ（（特許文献１）を参照されたい）よりも高いか又はそれと類似する増殖密度を示す。したがって、本明細書中に記載されるα－２，３－シアリルトランスフェラーゼの形質は、３’ＳＬの大規模な産業生成に好適である。

本開示のα－２，３－シアリルトランスフェラーゼを発現する、本開示の遺伝的に修飾された細胞は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼＮｓｔ（配列番号５）と比較した場合、３’ＳＬの高い力価をもたらす一方、前記遺伝的に修飾された細胞の安定した増殖を維持するか又は向上させることを可能にする。これにより、本開示は、より有効な３’ＳＬ生成を可能にし、これは、単純なシアル酸付加ＨＭＯ、例えば３’ＳＬの生物工学的生成において非常に有益である。

実施例１に示されるように、本開示の遺伝的に修飾された細胞は、同じ増殖条件下でＮｓｔ＿ｐｌａｃ株、ＰＭ７０株又はＣｓｔＩ株によって形成される３’ＳＬのレベルと少なくとも等しいか又はそれを少なくとも５％、例えば１０％超えるレベルで３’ＳＬを形成する。特に、Ｃｌａｒｉ１、Ｐｏｒａｌ、Ｎｅｉｇｏｎ又はＰｍＮを発現する株は、同じ条件下でＣｓｔＩ発現株の３倍超の３’ＳＬを産生した。

実施例１に示される光学濃度（ＯＤ）は、Ｐｌａｃプロモータの代わりに異種ＰｇｌｐＦプロモータを用いるＮｓｔの過剰発現が実際に細胞の増殖に影響を与えることを示唆しているが、これは、異種ＰｇｌｐＦプロモータ下の本開示のシアリルトランスフェラーゼのいずれについても同程度に当てはまらないため、シアル酸付加ＨＭＯ、例えば３’ＳＬの産業的規模の生成においてより有効にそのシアリルトランスフェラーゼを用いることが可能となる。

以下の節では、特に遺伝的に修飾された細胞の本開示の個々の要素が説明され、その要素は、個々の節の全体にわたって組み合わされ得ることが理解される。

［オリゴ糖］
これに関連して、用語「オリゴ糖」は、少なくとも３つの単糖ユニットを含有する糖ポリマー、即ちトリ－、テトラ－、ペンタ－、ヘキサ－又はより高次のオリゴ糖を意味する。オリゴ糖は、グリコシド間結合によって互いに連結される単糖ユニットを含有する直鎖状構造又は分枝状構造を有し得る。特に、オリゴ糖は、還元末端においてラクトース残基を、且つアルドース（例えば、グルコース、ガラクトース、リボース、アラビノース、キシロースなど）、ケトース（例えば、フルクトース、ソルボース、タガトースなど）、デオキシ糖（例えば、ラムノース、フコースなど）、デオキシアミノ糖（例えば、Ｎ－アセチル－グルコサミン、Ｎ－アセチル－マンノサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミンなど）、ウロン酸及びケトアルドン酸（例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸）から選択される５～９つの炭素原子の１つ以上の天然に存在する単糖を含む。好ましくは、オリゴ糖は、ＨＭＯである。

［ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）］
本開示の好ましいオリゴ糖は、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）である。

これに関連して、用語「ヒトミルクオリゴ糖」又は「ＨＭＯ」は、ヒト母乳中に見出される複合糖質を意味する。ＨＭＯは、１つ以上のベータ－Ｎ－アセチル－ラクトサミニル及び／又は１つ以上のベータ－ラクト－Ｎ－ビオシル単位によって伸長され得る還元末端にラクトース単位を含むコア構造を有し、このコア構造は、アルファ－Ｌ－フコピラノシル及び／又はアルファ－Ｎ－アセチル－ノイラミニル（シアリル）部分によって置換され得る。ＨＭＯ構造は、例えば、（非特許文献３）によって開示されている。

本開示は、一般に酸性であるシアル酸付加ＨＭＯに重点を置く。酸性ＨＭＯの例として、３’－シアリルラクトース（３’ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’ＳＬ）、３－フコシル－３’－シアリルラクトース（ＦＳＬ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴ－ａ）、フコシル－ＬＳＴ－ａ（ＦＬＳＴ－ａ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースｂ（ＬＳＴ－ｂ）、フコシル－ＬＳＴ ｂ（ＦＬＳＴ ｂ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴ－ｃ）、フコシル－ＬＳＴ－ｃ（ＦＬＳＴ－ｃ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴ－ｄ）、フコシル－ＬＳＴ ｄ（ＦＬＳＴ－ｄ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＳＬＮＨ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ（ＳＬＮＨ－Ｉ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（ＳＬＮＨ－ＩＩ）及びジシアリル－ラクト－Ｎ－テトラオース（ＤＳＬＮＴ）が挙げられる。

本開示の一態様において、細胞によって産生されるシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）は、３’ＳＬ、ＦＳＬ、ＤＳＬＮＴ及びＬＳＴ－ａからなる群から選択されるシアル酸付加ＨＭＯである。本開示の更なる態様において、細胞によって産生されるシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）は、３つの単糖ユニットのＨＭＯ、例えば３’ＳＬである。

これらのＨＭＯの一部の産生は、特にアクセプタオリゴ糖としてラクトースから出発することにおいて、２つ以上のグリコシルトランスフェラーゼ活性の存在を必要とし得る。しかしながら、これは、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する１つのグリコシルトランスフェラーゼの発現のみを必要とする、３’ＳＬについての生成について当てはまらない。

［アクセプタオリゴ糖］
本開示に従う遺伝的に修飾された細胞は、シアル酸を活性化糖からアクセプタオリゴ糖の終端のガラクトースに転移させることができる、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む。

本開示に関連して、アクセプタオリゴ糖は、グリコシル部分をグリコシルドナーからアクセプタオリゴ糖に転移させることができるグリコシルトランスフェラーゼのための基質としての機能を果たし得るオリゴ糖である。グリコシルドナーは、好ましくは、「グリコシルトランスフェラーゼ」についての節に記載されるヌクレオチド活性化糖である。好ましくは、アクセプタオリゴ糖は、ＨＭＯを形成するための前駆体であり、前駆体分子と呼ぶこともできる。

これに関連して、前記アクセプタオリゴ糖は、好ましくは、３’ＳＬの生成のためのラクトースである。ＬＳＴ－ａ又はＦＳＬ等の３’ＳＬよりも複雑なＨＭＯの生成は、より複雑なアクセプタ分子、例えばラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮＴ）も含み得、これは、前駆体分子ラクトース及び／又はラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ）若しくは３ＦＬから生成される。両方の場合、前駆体分子は、前駆体からシアル酸付加ＨＭＯを生成することができる遺伝的に修飾された細胞に供給され得るか、又は細胞は、ラクトースからより複雑なアクセプタ分子を生成するように修飾され得る。

アクセプタオリゴ糖は、本発酵プロセスの中間生成物、別個の遺伝的に修飾された細胞を使用する別個の発酵プロセスの最終生成物又は酵素によって若しくは化学的に生成される分子であり得る。

［グリコシルトランスフェラーゼ］
本開示に従う遺伝的に修飾された細胞は、シアリル残基をシアリルドナーからアクセプタオリゴ糖に転移させて、シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖生成物、即ちシアリルトランスフェラーゼを合成することができる少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの組換え核酸配列を含む。

本開示に従う遺伝的に修飾された細胞は、グリコシル残基をグリコシルドナーからアクセプタオリゴ糖に転移させることができる少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの更なる組換え核酸配列を含み得る。追加のグリコシルトランスフェラーゼにより、遺伝的に修飾された細胞は、ラクトース又はＬＮＴ－ＩＩ等の前駆体分子からＬＮＴを合成するか、又はラクトースから３ＦＬを合成することができる。追加のグリコシルトランスフェラーゼは、例えば、３’ＳＬ分子を更にデコレートして、例えばＦＳＬ又はＬＳＴ－ａ分子若しくはＬＳＴ－ｂ分子を生成してＤＳＬＮＴを生成することもできる。

追加のグリコシルトランスフェラーゼは、好ましくは、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコサミニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ及びＮ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼからなる群から選択される。

より複雑なＨＭＯを生成することが所望される場合、本明細書中に記載されるα－２，３－シアリルトランスフェラーゼは、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ及びβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニル－トランスフェラーゼからなる群から選択される１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼと組み合わされ得る。特定の実施形態において、追加のグリコシルトランスフェラーゼは、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ若しくはβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ又はβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ及びβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニル－トランスフェラーゼの組合せ又はβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ及びβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニル－トランスフェラーゼの組合せであり得る。更なる実施形態において、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，３／４－フコシルトランスフェラーゼからなる群から選択されるフコシルトランスフェラーゼは、本明細書中に記載される遺伝的に操作された細胞上に導入され得る。

一態様において、本開示の遺伝的に修飾された細胞内のシアリルトランスフェラーゼは、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼである。好ましくは、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸ユニットをラクトース分子の末端ガラクトース上に転移させることができる。好ましくは、単独でガラクトースのＣ３位置にあり、それにより最初の基質としてラクトースから出発する場合に３’ＳＬを唯一のＨＭＯとして生成する。

本開示において、シアリル部分をシアリルドナーからアクセプタオリゴ糖に転移させることができる少なくとも１つの機能的酵素（α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ）は、Ｃｌａｒｉ１、Ｎｅｉｇｏｎ、Ｐｏｒａｌ及びＰｍＮからなるリストから選択することができる（表１）。これらの酵素は、遺伝的に修飾された細胞内で発現されると、例えば３’ＳＬを生成するのに用いられ得る。

一実施形態において、本開示のα－２，３－シアリルトランスフェラーゼの発現は、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、例えばピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）由来のｇａｌＴＫ（配列番号３７又はその機能的バリアント）と更に組み合わされる。更なる実施形態において、第３の酵素、例えばβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニル－トランスフェラーゼ、例えば髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＬｇｔＡ（配列番号３６又はその機能的バリアント）が加えられる。

例示されるグリコシルトランスフェラーゼは、好ましくは、以下に記載されるグリコシルトランスフェラーゼから選択される。

［α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ］
アルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼは、ドナー基質、例えばＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸からアルファ－２，３－結合内のアクセプタ分子へのシアリルの転移を触媒するグリコシルトランスフェラーゼを指す。好ましくは、本明細書中で用いられるアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼは、遺伝的に操作された細胞の種に由来しない。即ち、アルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、異種起源のものであり、表１において特定されるアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼから選択される。ラクトース上にシアリル部分を転移させることができる異種アルファ２，３－シアリルトランスフェラーゼは、当技術分野において知られており、その３つが表１に特定されている。

本出願において調査されるα－２，３－シアリルトランスフェラーゼは、表１に記載されている。シアリルトランスフェラーゼは、表１に記載されるアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼのいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％又は例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列から選択することができる。

ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤは、全長酵素を反映し、本開示においてトランケートされたか又は変異したバージョンが用いられ得、これらは、配列番号によって表される。

アルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼＮｓｔ、ＰＭ７０及びＣｓｔＩは、シアル酸付加ＨＭＯを生成することができるアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼとして先行技術から知られている。

本開示の実施例１は、異種アルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼＣｌａｒｉ１、Ｎｅｉｇｏｎ及びＰｏｒａｌ（それぞれ配列番号１、２及び３）を特定し、これらは、遺伝的に修飾された細胞中に導入された場合、知られているアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼＮｓｔ、ＰＭ７０及びＣｓｔＩよりも高いか又はそれと等しい３’ＳＬ力価をもたらすことができる。

本開示の実施例１は、異種アルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼＣｌａｒｉ１、Ｎｅｉｇｏｎ、Ｐｏｒａｌ及びＰｍＮ（それぞれ配列番号１、２、３及び４）が、遺伝的に修飾された細胞中に導入された場合、知られているアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼＮｓｔ、ＰＭ７０及びＣｓｔＩと類似するか又はそれらよりも高い３’ＳＬ力価をもたらすことができる一方、遺伝的に修飾された細胞の増殖に大きく影響を与えないことを更に確認した。

本開示の一実施形態において、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるカンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）由来のＣｌａｒｉ１である。

本開示の別の実施形態において、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２と少なくとも８０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ＦＡ １０９０由来のＮｅｉｇｏｎである。

本開示の別の実施形態において、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるパスツレラ・オラリス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｏｒａｌｉｓ）由来のＰｏｒａｌである。

本開示の別の実施形態において、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属由来のＰｍＮである。

一実施形態において、本開示のα－２，３－シアリルトランスフェラーゼを発現する遺伝的に修飾された細胞は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼＮｓｔ（配列番号５）の発現がＰｌａｃプロモータを介して調節される場合、Ｎｓｔを発現する遺伝的に修飾された細胞によって産生される３’ＳＬの量と少なくとも等しいか又はそれよりも少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％若しくは例えば少なくとも２０％高い３’ＳＬの産生をもたらす。

一実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるα－２，３－シアリルトランスフェラーゼＣｌａｒｉ１を発現する遺伝的に修飾された細胞は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼＮｓｔ（配列番号５）の発現がＰｌａｃプロモータを介して調節される場合、Ｎｓｔを発現する遺伝的に修飾された細胞によって産生される３’ＳＬの量と少なくとも等しいか又はそれよりも少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％若しくは例えば少なくとも２０％高い３’ＳＬの産生をもたらす。

一実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるα－２，３－シアリルトランスフェラーゼＮｅｉｇｏｎを発現する遺伝的に修飾された細胞は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼＮｓｔ（配列番号５）の発現がＰｌａｃプロモータを介して調節される場合、Ｎｓｔを発現する遺伝的に修飾された細胞によって産生される３’ＳＬの量と少なくとも等しいか又はそれよりも少なくとも５％、例えば少なくとも７％、例えば少なくとも１０％若しくは例えば少なくとも１５％高い３’ＳＬの産生をもたらす。

一実施形態において、配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるα－２，３－シアリルトランスフェラーゼＰｏｒａｌを発現する遺伝的に修飾された細胞は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼＮｓｔ（配列番号５）の発現がＰｌａｃプロモータを介して調節される場合、Ｎｓｔを発現する遺伝的に修飾された細胞によって産生される３’ＳＬの量と少なくとも等しいか又はそれよりも少なくとも２％、例えば少なくとも４％若しくは例えば少なくとも５％高い３’ＳＬの産生をもたらす。

一実施形態において、配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるα－２，３－シアリルトランスフェラーゼＰｍＮを発現する遺伝的に修飾された細胞は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼＮｓｔ（配列番号５）の発現がＰｌａｃプロモータを介して調節される場合、Ｎｓｔを発現する遺伝的に修飾された細胞によって産生される３’ＳＬの量とほぼ等しい３’ＳＬの産生をもたらす。

一実施形態において、本開示のα－２，３－シアリルトランスフェラーゼを発現する遺伝的に修飾された細胞は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼＰＭ７０（配列番号６）の発現がＰｌａｃ又はＰｇｌｐＦプロモータを介して調節される場合、ＰＭ７０を発現する遺伝的に修飾された細胞によって産生される３’ＳＬの量よりも少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、例えば少なくとも２０％又は例えば少なくとも２５％高い３’ＳＬの産生をもたらす。

一実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるα－２，３－シアリルトランスフェラーゼＣｌａｒｉ１を発現する遺伝的に修飾された細胞は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼＰＭ７０（配列番号６）の発現がＰｌａｃ又はＰｇｌｐＦプロモータを介して調節される場合、ＰＭ７０を発現する遺伝的に修飾された細胞によって産生される３’ＳＬの量よりも少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、例えば少なくとも２０％又は例えば少なくとも２５％高い３’ＳＬの産生をもたらす。

一実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるα－２，３－シアリルトランスフェラーゼＮｅｉｇｏｎを発現する遺伝的に修飾された細胞は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼＰＭ７０（配列番号６）の発現がＰｌａｃ又はＰｇｌｐＦプロモータを介して調節される場合、ＰＭ７０を発現する遺伝的に修飾された細胞によって産生される３’ＳＬの量よりも少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、例えば少なくとも２０％又は例えば少なくとも２５％高い３’ＳＬの産生をもたらす。

一実施形態において、配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるα－２，３－シアリルトランスフェラーゼＰｏｒａｌを発現する遺伝的に修飾された細胞は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼＰＭ７０（配列番号６）の発現がＰｌａｃ又はＰｇｌｐＦプロモータを介して調節される場合、ＰＭ７０を発現する遺伝的に修飾された細胞によって産生される３’ＳＬの量よりも少なくとも３％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも７％、例えば少なくとも９％又は例えば少なくとも１０％高い３’ＳＬの産生をもたらす。

一実施形態において、配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるα－２，３－シアリルトランスフェラーゼＰｍＮを発現する遺伝的に修飾された細胞は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼＰＭ７０（配列番号６）の発現がＰｌａｃ又はＰｇｌｐＦプロモータを介して調節される場合、ＰＭ７０を発現する遺伝的に修飾された細胞によって産生される３’ＳＬの量よりも少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、例えば少なくとも２０％又は例えば少なくとも２５％高い３’ＳＬの産生をもたらす。

一実施形態において、本開示のα－２，３－シアリルトランスフェラーゼを発現する遺伝的に修飾された細胞は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼＮｓｔ（配列番号５）の発現がＰｇｌｐＦプロモータによって調節される場合、３’ＳＬの産生をもたらす一方、遺伝的に修飾された細胞は、Ｎｓｔを発現する遺伝的に修飾された細胞と比較して、より広い範囲の増殖率にわたって安定した増殖を示す。

一実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるα－２，３－シアリルトランスフェラーゼＣｌａｒｉ１を発現する遺伝的に修飾された細胞は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼＮｓｔ（配列番号５）の発現がＰｇｌｐＦプロモータを介して調節される場合、３’ＳＬの産生をもたらす一方、遺伝的に修飾された細胞は、Ｎｓｔを発現する遺伝的に修飾された細胞と比較して、より広い範囲の増殖率にわたって安定した増殖を示す。

一実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるα－２，３－シアリルトランスフェラーゼＰｏｒａｌを発現する遺伝的に修飾された細胞は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼＮｓｔ（配列番号５）の発現がＰｇｌｐＦプロモータを介して調節される場合、３’ＳＬの産生をもたらす一方、遺伝的に修飾された細胞は、Ｎｓｔを発現する遺伝的に修飾された細胞と比較して、より広い範囲の増殖率にわたって安定した増殖を示す。

一実施形態において、配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるα－２，３－シアリルトランスフェラーゼＮｅｉｇｏｎを発現する遺伝的に修飾された細胞は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼＮｓｔ（配列番号５）の発現がＰｇｌｐＦプロモータを介して調節される場合、３’ＳＬの産生をもたらす一方、遺伝的に修飾された細胞は、Ｎｓｔを発現する遺伝的に修飾された細胞と比較して、より広い範囲の増殖率にわたって安定した増殖を示す。

一実施形態において、配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるα－２，３－シアリルトランスフェラーゼＰｍＮを発現する遺伝的に修飾された細胞は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼＮｓｔ（配列番号５）の発現がＰｇｌｐＦプロモータを介して調節される場合、３’ＳＬの産生をもたらす一方、遺伝的に修飾された細胞は、Ｎｓｔを発現する遺伝的に修飾された細胞と比較して、より広い範囲の増殖率にわたって安定した増殖を示す。

［グリコシルドナー－ヌクレオチド活性化糖経路］
本開示の方法を実行する場合、好ましくは、活性化糖ヌクレオチドがグリコシルドナーとして機能するグリコシルトランスフェラーゼ媒介グリコシル化反応が起こる。活性化糖ヌクレオチドは、一般に、リン酸化されたグリコシル残基がヌクレオシドに取り付けられている。特定のグリコシルトランスフェラーゼ酵素が特定の糖ヌクレオチドのみを受け取る。したがって、好ましくは、以下の活性化糖ヌクレオチドがグリコシル転移に関与する：グルコース－ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ－ガラクトース、ＵＤＰ－グルコース、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸。本開示に従う遺伝的に修飾された細胞は、グルコース－ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、ＧＤＰ－フコース、ＵＤＰ－ガラクトース、ＵＤＰ－グルコース、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルガラクトサミン及びＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸からなる群から選択されるヌクレオチド活性化糖を産生する１つ以上の経路を含み得る。

方法の一実施形態において、遺伝的に修飾された細胞は、デノボ経路により、上記の１つ以上の活性化糖ヌクレオチドを産生することができる。この点に関して、活性化糖ヌクレオチドは、単純炭素源様グリセロール、スクロース、フルクトース又はグルコースから出発する多段階反応シーケンスにおいて、各糖ヌクレオチドのデノボ生合成経路に関与する酵素の作用下で細胞によって形成される（単糖代謝についてのレビューについて、例えば（非特許文献４）を参照されたい）。

活性化された糖ヌクレオチドのデノボ生合成経路に関与する酵素は、細胞内に天然に存在し得るか、又は遺伝子技術若しくは組換えＤＮＡ技術（それらは、全て当業者の一般知識の一部である）によって細胞中に導入され得る。

別の実施形態において、遺伝的に修飾された細胞は、得られた単糖を糖ヌクレオチドに利用することができる。サルベージ経路において、分解したオリゴ糖に由来する単糖がキナーゼによってリン酸化されて、ピロホスホリラーゼによってヌクレオチド糖に変換される。手順に関与する酵素は、宿主細胞とは異種のもの又は宿主細胞に固有のものであり得る。

［シアル酸糖ヌクレオチド合成経路］
好ましくは、本開示に従う遺伝的に修飾された細胞は、シアル酸糖ヌクレオチド合成能力を含む。即ち、遺伝的に修飾された細胞は、シアラート糖ヌクレオチド、例えば本開示のアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼのためのグリコシルドナーとしてのＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸を作成するための生合成経路を含む。例えば、遺伝的に修飾された細胞は、外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ２－エピメラーゼ（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）のＮｅｕＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２７．１）若しくは均等物（例えば、（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＲ０４５６１．１）、Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ（例えば、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のＮｅｕＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２６．１）若しくは均等物（例えば、フラボバクテリウム・リムノセディミニス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｎｏｓｅｄｉｍｉｎｉｓ）シアル酸シンターゼ、ＧｅｎＢａｎｋ ＷＰ＿０２３５８０５１０．１）及び／又はＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼ（例えば、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のＮｅｕＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２８．１）若しくは均等物（例えば、ビブリオ・ブラシリエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）ＣＭＰ－シアル酸シンターゼ、ＧｅｎＢａｎｋ ＷＰ＿００６８８１４５２．１）の提供によるシアル酸合成能力を含む。

１つ以上の例において、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ ２－エピメラーゼ、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のＮｅｕ５Ａｃシンターゼ（カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のＮｅｕＢＣＡとも称される）又は単純にｎｅｕＢＣＡオペロンは、プラスミドに担持され得るか、又は遺伝的に修飾された細胞のゲノム中に組み込まれ得る。好ましくは、シアル酸糖ヌクレオチド経路は、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のＮｅｕＢＣＡをコードする核酸配列（配列番号３５）又は配列番号３５と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％若しくは例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的バリアントによってコードされている。

加えて、ＮｅｕＢＣＡをコードする核酸配列は、好ましくは、ｎｅｕＢＣＡオペロンを有する高コピープラスミドによってコードされる。実施形態において、高コピープラスミドは、ＢｌｕｅＳｃｒｉｂｅ Ｍ１３プラスミド（ｐＢＳ）である。本開示に関して、高コピープラスミドは、細胞中に導入される場合、５０を超えるコピー数に複製するプラスミドである。

［欠損性シアル酸代謝経路］
本開示の遺伝的に修飾された細胞は、好ましくは、欠損性シアル酸代謝経路を有する。「シアル酸代謝経路」は、シアル酸の分解を生じさせる、通常、酵素によって制御及び触媒される一連の反応を意味する。以降に記載される例示的なシアル酸代謝経路は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）経路である。この経路において、シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ；Ｎ－アセチルノイラミン酸）は、全てｎａｎＡＴＥＫ－ｙｈｃＨオペロンによってコードされ、且つＮａｎＲによって抑制される酵素ＮａｎＡ（Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ）及びＮａｎＫ（Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ）及びＮａｎＥ（Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸エピメラーゼ）によって分解される（ｈｔｔｐ：／／ｅｃｏｃｙｃ．ｏｒｇ／ＥＣＯＬＩ）。欠損性シアル酸代謝経路は、内因性ｎａｎＡ（Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ０００６７．１（ＧＬ２１６５８８））及び／又はｎａｎＫ（Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ）遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号（アミノ酸）ＢＡＥ７７２６５．１（ＧＬ８５６７６０１５））及び／又はｎａｎＥ（Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸エピメラーゼ、ＧＩ：９４７７４５）内に変異を導入することにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主内に与えられる。任意選択的に、ｎａｎＴ（Ｎ－アセチルノイラミナートトランスポータ）遺伝子も不活化されるか又は変異する。シアル酸代謝の他の中間体として、（ＭａｎＮＡｃ－６－Ｐ）Ｎ－アセチルマンノサミン－６－ホスファート；（ＧｌｃＮＡｃ－６－Ｐ）Ｎ－アセチルグルコサミン－６－ホスファート；（ＧｌｃＮ－６－Ｐ）グルコサミン－６－ホスファート及び（Ｆｒｕｃ－６－Ｐ）フルクトース－６－ホスファートが挙げられる。一部の好ましい実施形態において、ｎａｎＡは、変異している。他の好ましい実施形態において、ｎａｎＡ及びｎａｎＫは、変異している一方、ｎａｎＥは、機能的なままである。別の好ましい実施形態において、ｎａｎＡ及びｎａｎＥは、変異している一方、ｎａｎＫは、変異、不活化又は欠失されていない。変異は、ｎａｎＡ、ｎａｎＫ、ｎａｎＥ及び／又はｎａｎＴの遺伝子産物をコードする核酸配列内の１つ以上の変化である。例えば、変異は、核酸配列内の１つ、２つ、最大５つ、最大１０個、最大２５個、最大５０個又は最大１００個の変化であり得る。例えば、ｎａｎＡ、ｎａｎＫ、ｎａｎＥ及び／又はｎａｎＴ遺伝子は、ヌル変異によって変異している。本明細書中に記載されるヌル変異は、酵素の機能の消失（即ち活性の引下げ又は活性なし）又は酵素の消失（即ち遺伝子産物なし）の何れかを誘発するアミノ酸の置換、付加、欠失又は挿入を含む。「欠失した」は、（機能的）遺伝子産物が産生されないように、コーディング領域が完全に又は部分的に除去されていることを意味する。「不活化された」は、結果として生じる遺伝子産物が機能的に不活性であるか、又は固有の天然に存在する内因性遺伝子産物の活性の１００％未満、例えば９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％若しくは２０％の遺伝子産物をコードするようにコーディング配列が変更されていることを意味する。したがって、本開示において、ｎａｎＡ、ｎａｎＫ、ｎａｎＥ及び／又はｎａｎＴ遺伝子は、好ましくは、不活化されている。

［メジャーファシリテータスーパーファミリー（ＭＦＳ）トランスポータタンパク質］
細胞によって産生されるオリゴ糖生成物、ＨＭＯは、細胞内マトリックス及び細胞外マトリックスの両方において蓄積され得る。生成物は、受動的に上清にトランスポートされ得、即ち細胞膜を横断して外側に拡散する。代わりに、ＨＭＯトランスポートは、細胞から上清への糖誘導体の放出を促進するメジャーファシリテータスーパーファミリートランスポータタンパク質によって促進され得る。メジャーファシリテータスーパーファミリートランスポータは、外生的又は内生的に存在し得、発酵の条件下で過剰発現されて、産生されるオリゴ糖誘導体（ＨＭＯ）の輸送を増強する。分泌される生成物の糖部分に対する特異性は、既知の組換えＤＮＡ技術による変異によって変更させることができる。

したがって、本開示に従う遺伝的に修飾された細胞は、１つ又は複数のシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖生成物を輸送することができるメジャーファシリテータスーパーファミリートランスポータタンパク質をコードする核酸配列を更に含み得る。

近年、いくつかの新しい効果的なメジャーファシリテータスーパーファミリートランスポータタンパク質が同定されており、それぞれ組換えにより生成された様々なＨＭＯに対する特異性を有し、前記タンパク質を発現する組換え細胞の開発は、高い規模の産業的ＨＭＯ製造に有利である。（特許文献３）は、３’ＳＬ、６’ＳＬ及びＬＳＴ－ａの輸送のための様々な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び異種トランスポータを特許請求している。

したがって、１つ以上の例示的な実施形態において、本明細書中に記載される方法に従う遺伝的に操作された細胞は、メジャーファシリテータスーパーファミリートランスポータとしての機能を果たす遺伝子産物を更に含む。メジャーファシリテータスーパーファミリートランスポータとしての機能を果たす遺伝子産物は、遺伝的に操作された細胞内で発現される組換え核酸配列によってコードされ得る。メジャーファシリテータスーパーファミリートランスポータをコードする組換え核酸配列は、遺伝的に操作された細胞のゲノム中に組み込まれ得るか、又はプラスミドを用いて発現され得る。

一実施形態において、本開示の遺伝的に修飾された細胞は、細胞外培地中にシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖生成物を輸送することができるメジャーファシリテータスーパーファミリートランスポータタンパク質をコードする核酸配列を含み、特に３’ＳＬに対する特異性を有するトランスポータが好ましい。

［Ｎｅｃ］
一実施形態において、本開示の遺伝的に修飾された細胞は、シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖生成物、例えば３’ＳＬを細胞外培地中に輸送することができる排出トランスポータタンパク質をコードする核酸配列を含む。これに関連して、前記排出トランスポータタンパク質は、好ましくは、細菌ローゼンベルギエラ・ネクタレア（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｅｌｌａ ｎｅｃｔａｒｅａ）に由来する、推定のＭＦＳ（メジャーファシリテータスーパーファミリー）トランスポータタンパク質をコードする異種遺伝子である。より具体的には、本開示は、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＩＤ ＷＰ＿０９２６７２０８１．１又は配列番号３８のアミノ酸配列のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％又は１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする組換え核酸を含む、オリゴ糖、特にシアル酸付加ＨＭＯを産生するように最適化された遺伝的に修飾された細胞に関する。

加えて、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＩＤ ＷＰ＿０９２６７２０８１．１のＭＦＳトランスポータタンパク質は、（特許文献４）に更に記載されており、本明細書中で互換的に「Ｎｅｃタンパク質」、又は「Ｎｅｃトランスポータ」、又は「Ｎｅｃ」として識別され；Ｎｅｃタンパク質をコードする核酸配列は、「ｎｅｃコーディング核酸／ＤＮＡ」、又は「ｎｅｃ遺伝子」、又は「ｎｅｃ」として本明細書中で識別される。

Ｎｅｃは、本開示の遺伝的に操作された細胞において、産生されたシアル酸付加ＨＭＯ、例えば３’ＳＬの排出の増大を促進することが予想される。

したがって、一実施形態において、本開示の遺伝的に修飾された細胞は、Ｎｅｃトランスポータタンパク質をコードする核酸配列を含む。

［Ｆｒｅｄ／ＹｂｅｒＣ］
実施形態において、本開示の遺伝的に修飾された細胞は、単純なシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖生成物、例えば３’ＳＬ及び６’ＳＬを細胞外培地中に輸送することができる排出トランスポータタンパク質をコードする核酸配列を含む。これに関連して、前記排出トランスポータタンパク質は、好ましくは、細菌エルシニア・フレデリクセニ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎｉｉ）及び／又は細菌エルシニア・ベルコヴィエリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）に由来する、推定のＭＦＳ（メジャーファシリテータスーパーファミリー）トランスポータタンパク質をコードする異種遺伝子である。より具体的には、本開示は、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＩＤ ＷＰ＿０８７８１７５５６．１（配列番号４０）又はＧｅｎＢａｎｋ受託ＥＥＱ０８２９８（配列番号３９）のアミノ酸配列のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％又は１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする組換え核酸を含む、オリゴ糖、特にシアル酸付加ＨＭＯを産生するように最適化された遺伝的に修飾された細胞に関する。

ＧｅｎＢａｎｋ受託ＩＤ ＷＰ＿０８７８１７５５６．１のＭＦＳトランスポータタンパク質は、（特許文献５）に更に記載されており、本明細書中で互換的に「Ｆｒｅｄタンパク質」、又は「Ｆｒｅｄトランスポータ」、又は「Ｆｒｅｄ」として識別され；Ｆｒｅｄタンパク質をコードする核酸配列は、「ｆｒｅｄコーディング核酸／ＤＮＡ」、又は「ｆｒｅｄ遺伝子」、又は「ｆｒｅｄ」として本明細書中で識別される。

したがって、一実施形態において、本開示の遺伝的に修飾された細胞は、Ｎｅｃ又はＦｒｅｄトランスポータタンパク質をコードする核酸配列を含む。

加えて、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＩＤ ＥＥＱ０８２９８のＭＦＳトランスポータタンパク質は、（特許文献６）に更に記載されており、本明細書中で互換的に「ＹｂｅｒＣタンパク質」、又は「ＹｂｅｒＣトランスポータ」、又は「ＹｂｅｒＣ」として識別され；ＹｂｅｒＣタンパク質をコードする核酸配列は、「ＹｂｅｒＣコーディング核酸／ＤＮＡ」、又は「ｙｂｅｒＣ遺伝子」、又は「ｙｂｅｒＣ」として本明細書中で識別される。

Ｆｒｅｄ及びＹｂｅｒＣは、本開示の遺伝的に操作された細胞において、産生されるシアル酸付加ＨＭＯ、例えば３’ＳＬの排出の増大を促進する。

したがって、一実施形態において、本開示の遺伝的に修飾された細胞は、Ｆｒｅｄトランスポータタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、本開示の遺伝的に修飾された細胞は、ＹｂｅｒＣトランスポータタンパク質をコードする核酸配列を含む。

［遺伝的に修飾された細胞］
これに関連して、用語「遺伝的に修飾された細胞」及び「遺伝的に操作された細胞」は、互換的に用いられる。本明細書中で用いられる「遺伝的に修飾された細胞」は、遺伝物質が遺伝的工学技術を用いてヒト干渉によって変更されている宿主細胞であり、そのような技術は、例えば、以下に限定されないが、例えば異種ポリヌクレオチド配列、Ｃｒｉｓｐｅｒ／Ｃａｓ編集及び／又はランダム変異誘発による形質転換又は形質移入である。一実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、組換え核酸配列により形質転換又は形質移入されている。

遺伝的修飾は、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ及び／又は代謝経路工学の包含並びに先の節に記載されるＭＦＳトランスポータの包含から選択され得、当業者であれば、１つ以上のシアル酸付加ＨＭＯを産生することができる遺伝的に修飾された細胞中に組み込む方法を知っているであろう。

本開示の一態様において、遺伝的に修飾された細胞は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含み、これは、Ｎｓｔの発現がＰｌａｃプロモータによって調節されるα－２，３－シアリルトランスフェラーゼＮｓｔを発現する細胞と比較して、３’ＳＬモルＨＭＯ含有量を少なくとも５％多く産生することができる。

遺伝的に操作された細胞は、好ましくは、微生物細胞、例えば原核細胞又は真核細胞である。宿主細胞として機能し得る適切な微生物細胞として、細菌細胞、古細菌細胞、藻類細胞及び真菌細胞が挙げられる。

遺伝的に操作された細胞は、例えば、細菌細胞又は酵母細胞であり得る。好ましい一実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、細菌細胞である。

［宿主細胞］
細菌宿主細胞に関して、原則として、限定されないが、それらは、対象の遺伝子を挿入するための遺伝的操作を可能にする限り、真正細菌（グラム陽性又はグラム陰性）又は古細菌であり得、製造規模で培養することができる。好ましくは、宿主細胞は、高細胞密度への培養を可能にする特性を有する。本開示に従うＨＭＯの産業的組換え生成に適した細菌宿主細胞の非限定的な例として、エルウィニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）（パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ））、シトロバクター・フロインジイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属種、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）、ペクトバクテリウム・カロトボルム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）又はキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）があり得る。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ラテロスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）及びバチルス・サーキュサンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）が挙げられるバチルス属（ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の細菌も用いられ得る。同様に、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ヘルベチクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）及びラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されないラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌が本開示の方法を用いて操作され得るストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）及びプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）も、本明細書中に記載される本開示に適した細菌種である。本発明の一部として挙げられるのは、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）及びエンテロコッカス・サーモフィルス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ））、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えば、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）及びビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ））、スポロラクトバチルス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、ミクロモモスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｍｏｓｐｏｒａ）属種、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属種、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属種及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（例えば、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）及び緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））由来の、本明細書中に記載されるように操作された菌株でもある。

異種生成物の産業的組換え生成に適した真菌宿主細胞の非限定的な例として、例えば、酵母細胞、例えばコマガタエラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及び出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は糸状菌、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属種、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属種若しくはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属種があり、例示的な種として、クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ｆ．ソラニイ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）、赤かび病（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）及びＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）である。

１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、ラクトバチルス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種及びカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属種からなる群から選択される。

１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及び出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択される。

１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。

１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。

１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。

１つ以上の例示的な実施形態において、本開示は、遺伝的に操作された細胞に関し、その細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２株又はＤＥ３に由来する。

［組換え核酸配列］
本開示は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、例えばＣｌａｒｉ１、Ｎｅｉｇｏｎ、Ｐｏｒａｌ及びＰｍＮからなる群から選択される酵素をコードする組換え核酸配列を含む遺伝的に修飾された細胞に関し、前記細胞は、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）、特にシアル酸付加ＨＭＯ、好ましくは３’ＳＬを産生する。

これに関連して、用語「組換え核酸配列」、「～をコードする組換え遺伝子／核酸／ヌクレオチド配列／ＤＮＡ」又は「コーディング核酸配列」は、互換的に用いられ、適切な制御配列、即ちプロモータ配列の制御下にある場合、ｍＲＮＡに転写されてポリペプチドに翻訳される連続的非重複三重項（コドン）のセットを含む、人工的（即ち核酸配列を形成する標準的なラボ方法を用いてインビトロで生成される）核酸配列を意味することが意図される。

コーディング配列の境界は、一般に、ｍＲＮＡの５’末端、翻訳開始コドン（ＡＵＧ、ＧＵＧ又はＵＵＧ）及び翻訳終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）でのオープンリーディングフレームの僅かに上流に位置決めされるリボソーム結合部位によって決定される。コーディング配列として、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成及び組換え核酸配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。

用語「核酸」には、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びｃＤＮＡ分子が含まれる。遺伝コードの縮重の結果として、所与のタンパク質をコードする多数の核酸配列が生成され得ることが理解される。

組換え核酸配列は、コーディングＤＮＡ配列、例えば遺伝子又は非コーディングＤＮＡ配列、例えば調節ＤＮＡ、例えばプロモータ配列若しくは他の非コーディング調節配列であり得る。

組換え核酸配列は、加えて、異種起源であり得る。本明細書中で用いられる「異種」は、細胞又は生物と無関係のポリペプチド、アミノ酸配列、核酸配列又はヌクレオチド配列、即ち前記細胞又は生物内に天然に存在しないポリペプチド、アミノ酸配列、核酸分子又はヌクレオチド配列を指す。

本開示は、コーディング核酸配列、即ち対象の遺伝子の組換えＤＮＡ配列、例えばシアリルトランスフェラーゼ遺伝子及び非コーディング調節ＤＮＡ配列、例えばプロモータＤＮＡ配列、例えばｌａｃオペロン若しくはｇｌｐオペロンのプロモータ配列に由来する組換えプロモータ配列又は別のゲノムプロモータＤＮＡ配列に由来するプロモータ配列或いは合成プロモータ配列を含む核酸構築体にも関し、コーディング配列及びプロモータ配列は、作動可能に連結している。

用語「作動可能に連結した」は、２つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）断片間の機能的関係を指す。これは、転写調節配列の転写配列との機能的関係を指す。例えば、プロモータ配列は、これが適切な宿主細胞又は他の発現系におけるコーディング配列の転写を刺激又は調節する場合、コーディング配列と作動可能に連結している。

一般に、転写配列に作動可能に連結しているプロモータ配列は、転写配列に物理的に隣接しており、即ち、それらは、シス作用性である。

例示的な一実施形態において、本開示の核酸構築体は、ベクターＤＮＡの一部であり得、別の実施形態において、構築体は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれている発現カセット／カートリッジである。

したがって、用語「核酸構築体」は、ゲノムの遺伝子の発現を修飾するか、又は構築体中に含まれ得る遺伝子／コーディングＤＮＡ配列を発現させるために標的細胞、例えば細菌細胞中に挿入されることが意図される、核酸の人工的に構築された断片、特にＤＮＡ断片を意味する。したがって、実施形態において、本開示は、シアリルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸配列を含む核酸構築体に関し、前記組換え核酸配列は、Ｃｌａｒｉ１、Ｎｅｉｇｏｎ、Ｐｏｒａｌ及びＰｍＮをコードする核酸配列、例えば配列番号２３、２４、２５若しくは２７又はその機能的バリアントからなる群から選択される。

本開示の一実施形態は、シアリルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸配列を含む核酸構築体であり、前記組換え核酸配列は、ａ）配列番号２３の核酸配列又は配列番号２３に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなるＣｌａｒｉ１；ｂ）配列番号２４の核酸配列又は配列番号２４に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなるＮｅｉｇｏｎ；ｃ）配列番号２５の核酸配列又は配列番号２５に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなるＰｏｒａｌ、及びｄ）配列番号２７の核酸配列又は配列番号２７に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなるＰｍＮからなる群から選択される。好ましくは、シアリルトランスフェラーゼコーディング配列は、表２に特定される核酸配列を有するプロモータ配列から選択されるプロモータ配列の制御下にある。

プロモータは、異種起源のものであるか、遺伝的に修飾される細胞に固有のものであり得るか、又はそれは、異種の要素及び／又は固有の要素を組み合わせた組換えプロモータであり得る。

生成物の生成を増大させる１つの方法は、グリコシルトランスフェラーゼ又はグリコシルドナーの生合成経路に関与する酵素等、生成物を生成するのに用いられる所望の酵素活性の生成を調節することであり得る。

所望の酵素の発現を駆動するプロモータ強度を増大させることは、こうする１つの方法であり得る。プロモータの強度は、β－ガラクトシダーゼ活性が、以前に説明されるようにアッセイされるｌａｃＺ酵素アッセイを用いて評価することができる（例えば、（非特許文献５）を参照されたい）。簡潔には、細胞は、Ｚ－バッファ中に希釈されて、ドデシル硫酸ナトリウム（０．１％）及びクロロホルムにより浸透性にされる。ＬａｃＺアッセイは、３０℃で実行される。試料が予熱されて、アッセイは、２００μｌオルト－ニトロ－フェニル－β－ガラクトシダーゼ（４ｍｇ／ｍｌ）の添加によって開始されて、試料が僅かに黄色に変わった場合に５００μｌの１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３の添加によって止められる。オルトニトロフェノールの放出は、その後、４２０ｎｍでの光学濃度の変化として判定される。特定の活性は、ミラーユニット（ＭＵ）［Ａ４２０／（ｍｉｎ＊ｍｌ＊Ａ６００）］で報告される。活性が１０，０００ＭＵを超える調節要素は、強いとみなされ、活性が３，０００ＭＵ未満の調節要素は、弱いとみなされ、その間にあるものは、中間の強度を有する。強い調節要素の例は、およそ１４．０００ＭＵの活性を有するＰｇｌｐＦプロモータであり、弱いプロモータの例は、ＩＰＴＧにより誘導された場合におよそ２３００ＭＵの活性を有するＰｌａｃである。

実施例１及び２に示されるアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼ、Ｎｓｔと同様に高い量を発現する場合、全ての酵素が宿主細胞によって等しく十分に許容されるわけではない。したがって、Ｎｓｔが３’ＳＬの生成に用いられる場合、それは、弱いプロモータＰｌａｃの制御下にある。なぜなら、ＰｇｌｐＦの制御下にある場合、宿主細胞の増殖が影響を受けるからである。

本開示の一態様において、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列の発現は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼによる前記酵素の発現の増強を付与するプロモータによって調節され、Ｐｌａｃ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＡ、ＰｇｌｐＴ又はＰｍｇｌＢ及びそれらのバリアントからなるプロモータの群から選択される。好ましくは、シアリルトランスフェラーゼは、配列番号１３、１８、１９、２０、２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０及び５１からなる群から選択される強い組換えプロモータの制御下にある。

本開示の別の態様において、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列の発現は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する前記酵素の発現の増強を付与する組換えプロモータによって調節される。

更に、本開示の構築体は、加えて、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（例えば、ＬｇｔＡをコードする配列番号３６の核酸配列）、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧａｌＴＫをコードする配列番号３７の核酸配列）、１つ以上のＭＦＳトランスポータ（例えば、Ｎｅｃ、ＹｂｅｒＣ又はＦｒｅｄをコードする配列番号３８、３９又は４０の核酸配列）をコードする１つ以上の核酸配列及び１つ以上のシアル酸糖ヌクレオチド合成経路酵素をコードする１つ以上の核酸配列、例えばシアル酸糖ヌクレオチド合成経路酵素をコードする配列番号３５の核酸配列を含み得る。実施形態において、本開示の前記核酸配列の発現は、ＰｇｌｐＦ（配列番号１３）若しくはＰｌａｃ＿７０ＵＴＲ（配列番号１８）プロモータ若しくはＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ（配列番号２０）又はそれらのバリアント、例えば表２に特定されるプロモータ、特に配列番号１３、１８、１９、２０、２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０及び５１からなる群から選択されるプロモータの制御下にある。ＰｇｌｐＦ及びＰｍｇｌＢプロモータ配列の適切な更なるバリアントが、それぞれ（特許文献７）及び（特許文献８）に記載されている（参照によって本明細書に組み込まれる）。

構築体（発現カセット）内に含まれる対象の核酸構築体の細菌ゲノム中への組込みは、従来の方法により、例えばａｔｔＴｎ７部位について記載されている、染色体上の特異的部位に相同であるフランキング配列を含有する直線状カートリッジを用いることにより（非特許文献６）；組換えがファージλのＲｅｄリコンビナーゼ機能又はＲａｃプロファージのＲｅｃＥ／ＲｅｃＴリコンビナーゼ機能によって媒介される核酸配列のゲノム組込み方法により（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）；Ｒｅｄ／ＥＴ組み換えに基づく方法により（非特許文献１０；非特許文献１１）；又は陽性クローン、即ち例えばマーカー遺伝子若しくは遺伝子機能の損失若しくは獲得によって選択され得る発現カセットを有するクローンにより達成され得る。

１つ以上の例示的な実施形態において、本開示は、配列番号２３、２４、２５又は２７に示される１つ以上の組換え核酸配列に関する。

特に、本開示は、配列番号２３、２４、２５又は２７と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一又は１００％同一の配列を有する組換え核酸配列及び／又はその機能的相同体の１つ以上に関する。

［配列同一性］
本明細書中で用いられる用語「配列同一性」は、ペアワイズアラインメントに基づく、２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間、即ち候補配列（例えば、本開示の配列）と基準配列（例えば、先行技術配列）との間の相関性を説明する。本開示のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（非特許文献１２）を用いて判定される（ＥＭＢＯＳＳパッケージ（非特許文献１３）、好ましくはバージョン５．０．０以後のＮｅｅｄｌｅプログラムにより実行される（（非特許文献１４）で入手可能））。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（３０ ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性」（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性パーセントとして用いられ、以下のように算出される：（同一の残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント内のギャップの総数）。

本開示のために、２つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（非特許文献１２）を用いて判定される（ＥＭＢＯＳＳパッケージ（非特許文献１３）１０、好ましくはバージョン５．０．０以後のＮｅｅｄｌｅプログラムにより実行される）。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ及びＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性」（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性パーセントとして用いられ、以下のように算出される：（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント内のギャップの総数）。

［機能的相同体］
本明細書中に記載されるタンパク質／核酸配列の機能的相同体又は機能的バリアントは、その元々の機能性を保持する、変更を遺伝コード内に有するタンパク質／核酸配列である。機能的相同体は、変異誘発によって得ることができるか、又は同じ若しくは他の種由来の天然に存在するバリアントであり得る。機能的相同体は、タンパク質／核酸配列の機能性と比較して、少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の存続する機能性を有するべきである。

開示されるアミノ酸又は核酸配列のいずれか１つの機能的相同体は、より高い機能性も有し得る。表１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つの機能的相同体又は表４の配列のいずれか１つをコードする組換え核酸は、理想的には、ＨＭＯ収量の増大、細胞からのＨＭＯ生成物の輸送若しくはラクトース等のＨＭＯ産生のための基質の導入、純度／副生成物形成の向上、バイオマス形成の引下げ、遺伝的に操作された細胞の生存能力、本開示に従う遺伝的に操作された細胞のロバスト性又は産生に必要とされる消耗品の引下げに関してシアル酸付加ＨＭＯの産生に関与することができるべきである。

［遺伝的に修飾された細胞の使用］
本開示は、例えば、以下に限定されないが、シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を生成する方法における、本明細書中で開示される遺伝的に修飾された細胞又は核酸構築体のあらゆる商用利用にも関する。

例示される実施形態において、本開示に従う遺伝的に修飾された細胞及び／又は核酸構築体は、ＨＭＯの製造に用いられる。

例示された実施形態において、本開示に従う遺伝的に修飾された細胞及び／又は核酸構築体は、１つ以上のシアル酸付加ＨＭＯの製造に用いられ、シアル酸付加ＨＭＯは、３’ＳＬ、ＦＳＬ、ＤＳＬＮＴ及びＬＳＴ－ａである。

これらのＨＭＯの生成は、２つ以上のグリコシルトランスフェラーゼ活性の存在を必要とする場合がある。

１つ以上の実施形態において、遺伝的に操作された細胞及び／又は核酸構築体は、３’ＳＬの製造に用いられる。好ましくは、３’ＳＬは、製造される唯一のＨＭＯである。

［シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を生成する方法］
本開示は、シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を生成する方法にも関し、前記方法は、本開示に従う遺伝的に修飾された細胞を培養することを含む。本開示の実施例１は、産生株において発現された場合に３’ＳＬを生成して、Ｎｓｔアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼと比較した場合に安定した増殖を示す異種アルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼＣｌａｒｉ１、Ｎｅｉｇｏｎ、Ｐｏｒａｌ及びＰｍＮ（それぞれ配列番号１、２、３及び４）を特定した。

本開示は、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を生成する方法に関し、特に３’ＳＬが生成される。特に、他のＨＭＯが存在しない３’ＳＬ。

本開示は、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を生成する方法にも関し、生成される３’ＳＬの量は、Ｎｓｔの発現がＰｌａｃプロモータを介して調節される場合、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼＮｓｔ（配列番号５）を発現する遺伝的に修飾された細胞の使用を含む方法によって生成される３’ＳＬの量よりも少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％又は例えば少なくとも２０％高い。

本開示は、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を生成する方法にも関し、３’ＳＬの量は、ＰＭ７０の発現がＰｌａｃ又はＰｇｌｐＦプロモータを介して調節される場合、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼＰＭ７０を発現する遺伝的に修飾された細胞の使用を含む方法によって生成される３’ＳＬの量よりも少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、例えば少なくとも２０％又は例えば少なくとも２５％高い。

したがって、本開示は、シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を生成する方法に関し、前記方法は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む遺伝的に修飾された細胞を培養することを含み、前記酵素は、
ａ．配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＣｌａｒｉ１、
ｂ．配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＮｅｉｇｏｎ、
ｃ．配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＰｏｒａｌ、及び
ｄ．配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＰｍＮ
からなる群から選択される。

更なる実施形態において、遺伝的に修飾された細胞は、本開示に従う少なくとも１つの追加の修飾を含む。

１つ以上の例示的な実施形態において、本開示のα－２，３－シアリルトランスフェラーゼは、表２に開示されるＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ、Ｐｌａｃ＿７０ＵＴＲ若しくはＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲプロモータ又はそれらのバリアントの制御下にある。好ましくは、シアリルトランスフェラーゼは、配列番号１３、１８、１９、２０、２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０及び５１からなる群から選択される組換えプロモータの制御下にある。したがって、例示的な実施形態において、本開示のα－２，３－シアリルトランスフェラーゼは、表２に開示されるＰｇｌｐＦプロモータ又はそのバリアントの制御下にある。別の例示的な実施形態において、本開示のα－２，３－シアリルトランスフェラーゼは、表２に開示されるＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲプロモータ又はそのバリアントの制御下にある。

更なる遺伝的修飾は、例えば、追加のグリコシルトランスフェラーゼ及び／又は代謝経路工学の包含並びに先の節に記載されるＭＦＳトランスポータの包含から選択され得、当業者であれば、１つ以上のシアル酸付加ＨＭＯを産生することができる遺伝的に修飾された細胞中に組み込む方法を知っているであろう。

方法は、特に、シアル酸付加ＨＭＯ、特にシアル酸付加ＨＭＯ ３’ＳＬを産生する遺伝的に修飾された細胞を培養することを含む。

方法は、シアル酸付加ＨＭＯを産生する遺伝的に修飾された細胞を培養することを含み、且つ前記遺伝的に操作された細胞を、グルコース、スクロース、フルクトース、キシロース及びグリセロールからなる群から選択されるエネルギー源（炭素源）の存在下で培養することを更に含む。

一態様において、本開示に従う方法は、シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）、例えば３’ＳＬ、ＦＳＬ、ＤＳＬＮＴ及び／又はＬＳＴ－ａを生成する。

一態様において、本開示に従う方法は、３’ＳＬを唯一のＨＭＯとして生成する。

本開示に従う方法においてシアル酸付加ＨＭＯの生成を可能にするために、遺伝的に修飾された細胞は、シアル酸糖ヌクレオチドを作成するための生合成経路を含み得、代わりにシアル酸が細胞の培養中に加えられ得る。

本開示の方法の好ましい実施形態において、遺伝的に修飾された細胞は、シアル酸糖ヌクレオチドを作成するための生合成経路を含む。好ましくは、本開示の方法において、シアル酸糖ヌクレオチドは、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃである。したがって、本開示の方法において、糖ヌクレオチド経路は、遺伝的に修飾された細胞によって発現され、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ経路は、配列番号３５のカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のｎｅｕＢＣＡオペロンによってコードされる。本開示の方法において、シアル酸糖ヌクレオチド経路は、ｎｅｕＢＣＡオペロンを有する高コピープラスミドによってコードされる。

本開示の方法は、グリコシルドナーを提供することを含み、これは、１つ以上の遺伝的に操作された細胞によって別途合成され、且つ／又は代替源から培地に外生的に加えられる。

一態様において、本開示の方法は、ＨＭＯ形成のための基質としてアクセプタ単糖を提供することを更に含み、アクセプタ単糖は、少なくとも２つの単糖ユニットを含み、これは、培地に外因的に加えられ、且つ／又は別個の微生物発酵によって生成される。

一態様において、本開示の方法は、少なくとも２つの単糖ユニットを含むアクセプタ単糖を提供することを含み、これは、培地に外因的に加えられ、且つ／又は別個の微生物発酵によって生成され、及びラクトース、ＬＮＴ－ＩＩ及びＬＮＴ、好ましくはラクトースから選択される。好ましい実施形態において、ＨＭＯ形成のための基質は、遺伝的に操作された細胞の発酵中に培養物に供給されるラクトースである。

シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）は、培養物から、培地及び／又は遺伝的に修飾された細胞から回収される。

特に、本開示は、シアル酸付加ＨＭＯを生成する方法に関し、前記方法は、
ａ）ｉ．好ましくはＰｇｌｐＦプロモータ制御下の、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列であって、前記酵素は、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＣｌａｒｉ１、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＮｅｉｇｏｎ、配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＰｏｒａｌ及び配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＰｍＮ
からなる群から選択される、組換え核酸配列；
ｉｉ．任意選択的に、好ましくはＰｇｌｐＦプロモータの制御下の、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）由来のＧａｌＴＫ等の異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列、
ｉｉｉ．任意選択的に、好ましくはＰｇｌｐＦプロモータの制御下の、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＬｇｔＡ等のβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニル－トランスフェラーゼをコードする核酸配列、
ｉｖ．任意選択的に、好ましくはＰｇｌｐＦ又はＰｌａｃプロモータの制御下の、限定されないが、Ｆｒｅｄ、Ｎｅｃ及び／又はＹｂｅｒＣ等のＭＦＳトランスポータをコードする核酸配列
を含む遺伝的に修飾された細胞を得ることと、
ｂ）前記遺伝的に修飾された細胞を炭素源含有培地中及びラクトースの存在下で培養することと、
ｃ）前記遺伝的に修飾された細胞により、前記シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）、特に３’ＳＬ及び／又はＬＳＴ－ａを生成することと、
ｄ）培地及び／又は遺伝的に修飾された細胞からシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）、特に３’ＳＬ及び／又はＬＳＴ－ａを回収することと
を含む。

特に、本開示は、３’ＳＬを生成する方法に関し、前記方法は、
ａ）ｉ．α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列であって、前記酵素は、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＣｌａｒｉ１である、組換え核酸配列、及び
ｉｉ．好ましくはＰｇｌｐＦ又はＰｌａｃプロモータの制御下の、限定されないが、Ｆｒｅｄ、Ｎｅｃ及び／又はＹｂｅｒＣ等のＭＦＳトランスポータをコードする核酸配列
を含む遺伝的に修飾された細胞を得ることと、
ｂ）前記遺伝的に修飾された細胞を炭素源含有培地中及びラクトースの存在下で培養することと、
ｃ）前記遺伝的に修飾された細胞により、前記シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）、特に３’ＳＬを生成することと、
ｄ）培地及び／又は遺伝的に修飾された細胞からシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）、特に３’ＳＬを回収することと
を含む。

特に、本開示は、３’ＳＬを生成する方法に関し、前記方法は、
ａ）ｉ．α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列であって、前記酵素は、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＰｏｒａｌである、組換え核酸配列、及び
ｉｉ．好ましくはＰｇｌｐＦ又はＰｌａｃプロモータの制御下の、限定されないが、Ｆｒｅｄ、Ｎｅｃ及び／又はＹｂｅｒＣ等のＭＦＳトランスポータをコードする核酸配列
を含む遺伝的に修飾された細胞を得ることと、
ｂ）前記遺伝的に修飾された細胞を炭素源含有培地中及びラクトースの存在下で培養することと、
ｃ）前記遺伝的に修飾された細胞により、３’ＳＬを生成することと、
ｄ）培地及び／又は遺伝的に修飾された細胞から３’ＳＬを回収することと
を含む。

特に、本開示は、３’ＳＬを生成する方法に関し、前記方法は、
ａ）ｉ．α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列であって、前記酵素は、配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＰｏｒａｌである、組換え核酸配列、及び
ｉｉ．好ましくはＰｇｌｐＦ又はＰｌａｃプロモータの制御下の、限定されないが、Ｆｒｅｄ、Ｎｅｃ及び／又はＹｂｅｒＣ等のＭＦＳトランスポータをコードする核酸配列
を含む遺伝的に修飾された細胞を得ることと、
ｂ）前記遺伝的に修飾された細胞を炭素源含有培地中及びラクトースの存在下で培養することと、
ｃ）前記遺伝的に修飾された細胞により、３’ＳＬを生成することと、
ｄ）培地及び／又は遺伝的に修飾された細胞から３’ＳＬを回収することと
を含む。

特に、本開示は、３’ＳＬを生成する方法に関し、前記方法は、
ａ）ｉ．α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列であって、前記酵素は、配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＰｍＮである、組換え核酸配列、及び
ｉｉ．好ましくはＰｇｌｐＦ又はＰｌａｃプロモータの制御下の、限定されないが、Ｆｒｅｄ、Ｎｅｃ及び／又はＹｂｅｒＣ等のＭＦＳトランスポータをコードする核酸配列
を含む遺伝的に修飾された細胞を得ることと、
ｂ）前記遺伝的に修飾された細胞を炭素源含有培地中及びラクトースの存在下で培養することと、
ｃ）前記遺伝的に修飾された細胞により、３’ＳＬを生成することと、
ｄ）培地及び／又は遺伝的に修飾された細胞から３’ＳＬを回収することと
を含む。

制御バイオリアクタ内での培養又は発酵（本明細書中で互換的に用いられる）は、典型的には、（ａ）炭素源によって確実にされる培地中での第１相の指数関数的細胞増殖、及び（ｂ）炭素制限下でランする培地内での第２相の細胞増殖（炭素源は、アクセプタオリゴ糖、例えばラクトースと共に連続的に添加されて、この相でのＨＭＯ生成物の形成が可能となる）を含む。炭素（糖）制限とは、増殖速度が培養ブロス内の炭素源（糖）の濃度によって動力学的に制御される発酵の段階を意味し、これは、したがって、発酵槽への炭素添加の速度（糖供給速度）によって判定される。

大規模生成がとられる場合の微生物株の安定性は、収量及び生成物形成が高い好結果の発酵を得るうえで重要である。大規模発酵中の多くの因子により、細胞は、ストレスを受けるようになり、潜在的に代謝活性を引き下げるか又は代謝の変化を誘導して、毒性の副生成物、例えば酢酸及びギ酸を形成して早期の発酵停止に至る場合がある。大規模発酵中の不完全な混合は、細胞が耐えることができなければならない、例えば気体及び炭素源の勾配をもたらす。所望の生成物を生成するために細胞中に導入される異種遺伝子のアンバランスな発現は、細胞の最大増殖速度を引き下げ得る毒性を誘導し得、これは、したがって、とりわけ炭素源勾配に曝された場合に副生成物形成を引き起こし得る。遺伝的に修飾された細胞（Ｎｓｔ株）内で３’ＳＬを生成する配列番号５のＮｓｔα－２，３－シアリルトランスフェラーゼの過剰発現に関して、本発明者らは、炭素制限段階中の増殖速度が高くなり過ぎる場合、株があまり安定しないことを観察した。より広い範囲の増殖速度にわたり且つまた勾配に曝された場合、安定した増殖を示す株を有することが所望される。Ｎｓｔ株と比較して、本開示のα－２，３－シアリルトランスフェラーゼを発現する株は、よりフレキシブルであり、炭素源のより高い特定の供給速度がより高い容量生成能を与えるのに用いられる、よりアグレッシブな供給プロファイルに対処することができる。更に、細胞は、大規模な発酵の糖勾配を模倣する糖供給プロファイルのパルス化バージョンにより良好に耐えることができる。本開示の遺伝的に修飾された細胞の安定性は、方法の節に記載される「増殖安定性試験」及び「ストレス試験」を用いて、Ｎｓｔ株の安定性と比較することができる。

用語「製造」、又は「製造規模」、又は「大規模生成」、又は「大規模発酵」は、互換的に用いられ、本開示の意味において、最小容量が１００Ｌ、例えば１，０００Ｌ、例えば１０，０００Ｌ、例えば１００，０００Ｌ、例えば２００，０００Ｌの培養ブロスである発酵を規定する。通常、「製造規模」プロセスは、例えば、治療用化合物又は組成物の場合、毒性試験、治験及び市場供給の需要を満たす対象のＨＭＯ生成物の量を生じる大容量を加工処理できることによって規定される。大容量に加えて、製造規模の方法は、振盪フラスコ培養のような単純なラボスケールの方法とは対照的に、撹拌、通気、栄養素供給、プロセスパラメータ（ｐＨ、温度、溶存酸素圧、背圧等）のモニタリング及び制御のための装置を装備しているバイオリアクタ（発酵槽）の技術システムの使用を特徴とする。大体において、本開示の実施例に記載される振盪フラスコ、卓上バイオリアクタ又はディープウエルフォーマット等のラボスケールの方法における発現系の挙動は、バイオリアクタの複雑な環境におけるそのシステムの挙動を予測することを可能にする。

発酵プロセスに用いられる適切な培地に関して制限はない。培地は、半規定、即ち複雑な培地化合物（例えば、酵母抽出物、大豆ペプトン、カザミノ酸等）であり得るか、又はそれは、いかなる複雑な化合物も含めずに化学的に規定され得る。炭素源は、グルコース、スクロース、フルクトース、キシロース及びグリセロールからなる群から選択され得る。１つ以上の例示的な実施形態において、培地は、グリセロール、スクロース及びグルコースを含有する群から選択される１つ以上のエネルギー炭素源が補充される。

１つ以上の例示的な実施形態において、培地は、唯一の炭素エネルギー源としてスクロースを含有する。１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、１つ以上の異種ポリペプチドをコードする１つ以上の異種核酸配列を含み、これは、前記遺伝的に操作された細胞の唯一の炭素エネルギー源としてのスクロースの利用を可能にする。

１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、（特許文献９）（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるｓｃｒＹＡオペロン及びｓｃｒＢＲオペロンを更に含むＰＴＳ依存性スクロース利用システムを含む。

本開示の方法を実行した後、産生されたシアル酸付加ＨＭＯは、従来の様式で細胞培養物又は発酵ブロスから集めることができる。

［回収／収集］
シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）は、培地及び／又は遺伝的に修飾された細胞から回収される。これに関連して、用語「回収」は、用語「収集」と互換的に用いられる。これに関連して、「回収」及び「収集」の両方は、発酵の終了後、培養物／ブロスから、産生されたＨＭＯを集めることに関する。１つ以上の例示的な実施形態において、これは、バイオマス（即ち宿主細胞）及び培地の両方に含まれる、即ちバイオマスからの発酵ブロスの分離前に／分離をせずにＨＭＯを集めることを含み得る。他の実施形態において、産生されたＨＭＯは、バイオマス及び発酵ブロスから別個に、即ち培地（即ち発酵ブロス）からのバイオマスの分離後に集められ得る。

培地からの細胞の分離は、当業者に周知のあらゆる方法、例えば適切なあらゆるタイプの遠心又は濾過により実行することができる。培地からの細胞の分離は、発酵ブロスの収集直後に続けるか、又は適切な条件で発酵ブロスを貯蔵した後の段階で実行することができる。残留バイオマス（又は全発酵ブロス）からの産生されたＨＭＯの回収として、バイオマス（即ち産生細胞）からの抽出が挙げられる。

発酵からの回収後、ＨＭＯは、更なる加工処理及び精製に利用可能である。

ＨＭＯは、当技術分野で知られている、例えば（特許文献１０）又は（特許文献１１）に記載される手順に従って精製することができ、後者は、シアル酸付加ＨＭＯの精製を記載している。精製されたＨＭＯは、栄養補助食品、医薬として又は他のあらゆる目的、例えば研究のために用いることができる。

培養の終了時、生成物としてのオリゴ糖は、細胞内マトリックス及び細胞外マトリックスの両方において蓄積され得る。

本開示に従う方法は、微生物の増殖を支援するように設計され、且つ例えばグルコース、スクロース、フルクトース、キシロース及びグリセロールからなる群から選択される１つ以上の糖質源又は炭素源のみを含有する培地内において、遺伝的に操作された微生物細胞を培養することを含む。１つ以上の例示的な実施形態において、培地は、グリセロール、スクロース及びグルコースを含有する群から選択される１つ以上のエネルギー炭素源が補充される。

［製造された生成物］
遺伝的に操作された細胞又は核酸構築体の使用に従う用語「製造された生成物」は、１つ以上の生成物ＨＭＯとして意図される１つ以上のＨＭＯを指す。種々の生成物は、先に記載されている。

有利には、本明細書中に開示される方法は、副生成物対生成物の比率の低下及び生成物の全収量（及び／又は総計でのＨＭＯ）の増大の両方を実現する。この生成物形成に関して、副生成物形成が少ないほど、生成物生成の上昇を促進し、且つ生成及び生成物回収プロセスの両方の効率を増大させて、ＨＭＯの優れた製造手順を実現する。

製造される生成物は、１つ以上のＨＭＯを含む粉末、組成、懸濁液又はゲルであり得る。

［配列］
本出願は、参照によって本明細書に組み込まれるテキストフォーマット及び電子フォーマットの配列表を含有する。

本出願に用いられる配列番号の概要は、表１（アルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼタンパク質配列）、表２（プロモータ配列）及び表４（アルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼＤＮＡ配列）に見出され得、本出願に記載される追加の配列は、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のｎｅｕＢＣＡオペロン（配列番号３５）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＬｇｔＡ（配列番号３６）、ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）由来のβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼｇａｌＴＫ（配列番号３７）及びＭＦＳトランスポータ配列Ｎｅｃ（配列番号３８）、ＹｂｅｒＣ（配列番号３９）及びＦｒｅｄ（配列番号４０）をコードするＤＮＡ配列である。

［実施形態］
本開示の種々の実施形態が以下の条項に記載される：
１．α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む遺伝的に修飾された細胞であって、前記酵素は、
ａ．配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＰｏｒａｌ、
ｂ．配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＣｌａｒｉ１、
ｃ．配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＰｍＮ、及び
ｄ．配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＮｅｉｇｏｎ
からなるシアリルトランスフェラーゼの群から選択され、前記細胞は、シアル酸付加ＨＭＯを産生する、遺伝的に修飾された細胞。
２．シアル酸付加ＨＭＯは、３’ＳＬ、ＦＳＬ、ＤＳＬＮＴ及びＬＳＴ－ａからなる群から選択される、条項１に従う遺伝的に修飾された細胞。
３．シアル酸付加ＨＭＯは、３’ＳＬである、条項１又は２のいずれかに従う遺伝的に修飾された細胞。
４．３’ＳＬは、遺伝的に修飾された細胞によって産生される唯一のＨＭＯである、先の条項のいずれか１つに従う遺伝的に修飾された細胞。
５．α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸配列は、配列番号１２～２２又は４１～５４に従う、好ましくは配列番号１３、１８、１９、２０、２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０及び５１からなる群から選択される核酸配列を有する、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ、Ｐｌａｃ＿７０ＵＴＲ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ及びそれらのバリアントからなる群から選択されるプロモータの制御下にある、先の条項のいずれか１つに従う遺伝的に修飾された細胞。
６．β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ及びβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニル－トランスフェラーゼからなる群から選択される１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする１つ以上の核酸配列を更に含む、先の条項のいずれか１つに従う遺伝的に修飾された細胞。
７．細胞外培地中にシアル酸付加ＨＭＯを輸送することができるＭＦＳトランスポータタンパク質をコードする核酸配列を更に含む、先の条項のいずれか１つに従う遺伝的に修飾された細胞。
８．ＭＦＳトランスポータタンパク質は、Ｆｒｅｄ、ＹｂｅｒＣ又はＮｅｃタンパク質である、条項７に従う遺伝的に修飾された細胞。
９．シアル酸糖ヌクレオチドを作成するための生合成経路を含む、先の条項のいずれか１つに従う遺伝的に修飾された細胞。
１０．シアル酸糖ヌクレオチドは、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃであり、前記シアル酸糖ヌクレオチド経路は、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のＮｅｕＢＣＡをコードする核酸配列（配列番号３５）によってコードされる、条項９に従う遺伝的に修飾された細胞。
１１．シアル酸糖ヌクレオチド経路は、ｎｅｕＢＣＡオペロンを有する高コピープラスミドによってコードされる、条項９又は１０に従う遺伝的に修飾された細胞。
１２．微生物である、先の条項のいずれかに従う遺伝的に修飾された細胞。
１３．細菌又は真菌である、先の条項のいずれかに従う遺伝的に修飾された細胞。
１４．前記真菌は、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属若しくはハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属の酵母細胞から又はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属若しくはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属の糸状菌から選択される、条項１３に従う遺伝的に修飾された細胞。
１５．前記細菌は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、ラクトバチルス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種及びカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属種からなる群から選択される、条項１３に従う遺伝的に修飾された細胞。
１６．前記細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、条項１５に従う遺伝的に修飾された細胞。
１７．シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を生成する方法であって、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む遺伝的に修飾された細胞を培養することを含み、前記酵素は、
ａ．配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＰｏｒａｌ、
ｂ．配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＣｌａｒｉ１、
ｃ．配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＰｍＮ、及び
ｄ．配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＮｅｉｇｏｎ
からなる群から選択され、前記遺伝的に修飾された細胞は、任意選択的に、条項４～１１に従う少なくとも１つの追加の修飾を含む、方法。
１８．生成されるシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）は、３’ＳＬである、条項１７に従う方法。
１９．３’ＳＬは、生成される唯一のヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）である、条項１７又は１８に従う方法。
２０．遺伝的に操作された細胞を、グルコース、スクロース、フルクトース、キシロース及びグリセロールからなる群から選択される炭素源の存在下で培養することを含む、条項１７～１９のいずれか１つに従う方法。
２１．ラクトースは、シアル酸付加ＨＭＯ形成のための基質として、遺伝的に操作された細胞の培養中に添加される、条項１７～２０のいずれか１つに従う方法。
２２．シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）は、培地及び／又は遺伝的に修飾された細胞から回収される、条項１７～２１のいずれか１つに従う方法。
２３．α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む核酸構築体であって、前記組換え核酸配列は、
ａ．配列番号２５の核酸配列又は配列番号２５に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＰｏｒａｌ、
ｂ．配列番号２３の核酸配列又は配列番号２３に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＣｌａｒｉ１、
ｃ．配列番号２６の核酸配列又は配列番号２６に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＰｍＮ、及び
ｄ．配列番号２４の核酸配列又は配列番号２４に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＮｅｉｇｏｎ
からなる群から選択され、酵素コーディング配列は、プロモータ配列の制御下にある、核酸構築体。
２４．プロモータ配列は、配列番号１２～２２又は４１～５４に従う、好ましくは配列番号１３、１８、１９、２０、２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０及び５１からなる群から選択される核酸配列を有する、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ、Ｐｌａｃ＿７０ＵＴＲ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ及びそれらのバリアントからなる群から選択される、条項２３に従う核酸構築体。
２５．シアル酸付加ＨＭＯを産生する宿主細胞における、条項２３又は２４に従う核酸構築体の使用。
２６．シアル酸付加ＨＭＯの生成における、条項１～１６のいずれか１つに従う遺伝的に修飾された細胞の使用。

［実施例］
［方法］
他に明記しない限り、分子生物学の分野において知られている標準的な技術、ベクター、制御配列要素及び他の発現系要素を核酸の操作、形質転換及び発現に用いる。そのような標準的な技術、ベクター及び要素は、例えば、（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献５）に見出すことができる。

以下に記載する実施形態は、本開示を例示するために選択されたものであり、決して本開示を限定するものではない。

［酵素］
１８種の酵素を、クエリとして知られているα－２，３－シアリルトランスフェラーゼを用い、且つ科学論文又はデータベース、例えばＫＥＧＧ及びＣＡＺＹデータベース等の情報源を利用することにより、タンパク質ＢＬＡＳＴサーチに基づくインシリコ選択アプローチに従って集めた。

［株］
本開示において構築した株（遺伝的に操作された細胞）は、遺伝子型：Ｆ^－、λ^－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１に基づいた。追加の修飾を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１株に行って、以下の修飾：ｌａｃＺ：１．５ｋｂｐの欠失、ｌａｃＡ：０．５ｋｂｐの欠失、ｎａｎＫＥＴＡ：３．３ｋｂｐの欠失、ｍｅｌＡ：０．９ｋｂｐの欠失、ｗｃａＪ：０．５ｋｂｐの欠失、ｍｄｏＨ：０．５ｋｂｐの欠失及びｇｍｄ遺伝子の上流へのＰｌａｃプロモータの挿入を有するＭＤＯ株を生成した。

対象の遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のゲノム中に挿入する方法は、当業者に周知である。遺伝子ゴージング（例えば、（非特許文献１９）及び（非特許文献２０）を参照されたい）を特定の選択マーカー遺伝子及びスクリーニング方法に用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体中への遺伝的カセットの挿入を行うことができる。

個々のα－２，３－シアリルトランスフェラーゼをコードするコドン最適化されたＤＮＡ配列をＭＤＯ株中にゲノム的に組み込んだ。加えて、各株を、Ｐｌａｃプロモータの制御下にあるカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のｎｅｕＢＣＡオペロン（配列番号３５）を有する高コピープラスミドにより形質転換した。ｎｅｕＢＣＡオペロンは、活性化シアル酸糖ヌクレオチド（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）の形成に必要とされる全ての酵素をコードする。ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃは、３’ＳＬを形成するような、調査下のα－２，３－シアリルトランスフェラーゼによって促進される、意図されるグリコシルトランスフェラーゼ反応、即ち活性化糖ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃからラクトースの末端ガラクトース（アクセプタ）へのシアル酸の移入のためのドナーとしての機能を果たす。

バックグラウンド株（ＭＤＯ）及び唯一のＨＭＯとして３’ＳＬを生成することができるα－２，３－シアリルトランスフェラーゼ発現株の遺伝子型を表４に記載する。

［ディープウェルアッセイ］
株を、４日間プロトコルを用いて９６ディープウェルプレート内でスクリーニングした。最初の２４時間中、前培養物を高密度に増殖させてから、遺伝子発現の誘導及び生成物形成を可能にする培地に移した。より詳細には、１日目中、硫酸マグネシウム、チアミン及びグルコースを補充した基礎最少培地を用いてフレッシュな前培養物を調製した。前培養物を３４℃、１０００ｒｐｍの振盪で２４時間インキュベートし、その後、更に新しい基本最少培地（ＢＭＭ、ｐＨ７，５）に移してメインの培養を開始した。新しいＢＭＭに硫酸マグネシウム、チアミン、２０％グルコース溶液のボーラス（１００ｍＬあたり５０μｌ）及び２０％ラクトース溶液のボーラス（１００ｍｌあたり５ｍｌ）を補充した。更に、グルコースがＣ制限増殖に適した速度で放出されるようなスクロースヒドロラーゼ（インベルターゼ）の添加を伴って、５０％スクロース溶液を炭素源として提供した。ＩＰＴＧ（５０ｍｇ／ｍｌ）を添加して、遺伝子発現及びアンピシリン抗生物質（１００ｍｇ／ｍｌ）を誘導した。メインの培養物を２８℃、１０００ｒｐｍの振盪で７２時間インキュベートした。

［増殖安定性試験］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、２５０ｍＬ発酵槽（Ａｍｂｒ ２５０ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）内において、６．９ｇ／Ｌグルコースからなる１００ｍＬの無機培地並びに（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ４、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＭｇＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、微量要素溶液、泡消し剤及びチアミンで構成される無機培地から開始して培養した。溶解酸素レベルを、最初の撹拌のカスケード及びその後の７００ｒｐｍ（最大４５００ｒｐｍまで）、１ＶＶＭ（最大３ＶＶＭまで）で開始する空気流によって２０％に維持した。ｐＨを８．５％ＮＨ_４ＯＨ溶液による滴定によって６．８に維持した。培養を、類似のグルコース含有培地において増殖した前培養物由来の２％（ｖ／ｖ）接種材料で開始した。バッチ培地内に含有されるグルコースの枯渇後、４９％（ｗ／ｗ）グルコース、ＭｇＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ、微量金属及び泡消し剤を含有する供給溶液を、０．１９２ｇグルコース／ｈの最初の供給速度で開始する、図２に示す供給プロファイルを用いて連続的に供給した。温度を最初に３３℃にしたが、２６時間の供給後に５ｈのランプで２８℃に下げた（図ｘ）。細胞の増殖及び代謝活性及び状態は、反射率及びＣＯ_２進化速度のオンライン測定値という結果になった。

［実施例１ － インビボ３’ＳＬ合成］
個々のアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼ酵素を発現する遺伝的に修飾された細胞を、最初の基質としてラクトースを用いた場合にシアル酸付加ＨＭＯ、３’ＳＬを唯一のＨＭＯとして生成する能力の有無に関してスクリーニングした。

活性化シアル酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を産生する遺伝的に修飾された細胞中に導入した場合に３’ＳＬを合成する能力を試験するために、１８種の酵素（表３）の一群を編集した。ここで、細胞には、ＨＭＯ産生のための基質としてラクトースを供給した。

１８種の個々のα－２，３－シアリルトランスフェラーゼ（表３）を発現する遺伝的に修飾された株を、「方法」の節に記載するように生成した。細胞を、「方法」の節に記載するようにセットアップしたフェッドバッチディープウェルアッセイによりスクリーニングした。株によって産生される個々のＨＭＯのモル含有量をＨＰＬＣによって測定した。

表４は、唯一のＨＭＯとして３’ＳＬを産生した１３種の株の遺伝子型を記載する。

Ｎｓｔは、３’ＳＬの生成のための周知の酵素であり、本実施例において陽性対照として用いた。ＮｓｔがＰｇｌｐＦ又はＰｌａｃプロモータの制御下で発現される２つの株を生成した。ここで、Ｐｌａｃプロモータの制御下でＮｓｔを発現する株は、インキュベーションの終了時の細胞の光学濃度によって示されるように、ＰｇｌｐＦプロモータ（Ｐｌａｃよりも１０倍強い）の制御下でＮｓｔを発現する株と比較して増殖がより良好である（表５）。この理由から、Ｎｓｔ＿Ｐｌａｃを基準として用いた。

３’ＳＬ産生細胞の結果をＮｓｔ＿Ｐｌａｃ株と比較した３’ＳＬの量（モル含有量、ｍＭ）として表５に示す（パーセンテージ、％）。３’ＳＬは、株によって産生される唯一のＨＭＯであった。

表５に示すデータから、Ｎｓｔ＿Ｐｌａｃ株によって形成される３’ＳＬのレベルを少なくとも５％超えるレベルで３’ＳＬを形成することができる３種の酵素（Ｃｌａｒｉ１、Ｎｅｉｇｏｎ及びＰｏｒａｌ）が存在する一方、酵素ＰｍＮは、Ｎｓｔ＿Ｐｌａｃ株と類似の３’ＳＬレベルを生成したことが分かる。これらのレベルは、先行技術において３’ＳＬを形成することが知られているＣｓｔＩ及びＰＭ７０によって生成される３’ＳＬの量も超える。これらの株によって産生される３’ＳＬの相対量を図１に示す。

セットアップしたディープウェルアッセイにおいて、細菌細胞は、とりわけ、培養物がより高い光学濃度に達する実験の終了時に向けて、最適以下の酸素処理に起因して酸を生成し得る。これらの酸が形成される程度は、最終光学濃度に影響を与え得るが、インキュベーションの終了時の光学濃度を、いかによく細胞が異種α－２，３－シアリルトランスフェラーゼの発現に対処するかの尺度として用いることができ、密度が高いほど増殖が良好であった。これに基づいて、ＰｍＮは、増殖がＮｓｔ＿Ｐｌａｃ株よりも最適であることが分かり、これは、株がＮｓｔα－２，３－シアリルトランスフェラーゼよりも良好にＰｍＮα－２，３－シアリルトランスフェラーゼを許容することを示している。これは、Ｎｓｔがより強いプロモータの制御下にあることから、より高いレベルで発現されるＮｓｔ＿ＰｇｌｐＦ株の増殖のかなりの引下げによって更に支持される。

α－２，３－シアリルトランスフェラーゼＣｌａｒｉ１、Ｎｅｉｇｏｎ、Ｐｏｒａｌ及びＰｍＮの発現は、強いプロモータＰｇｌｐＦによって制御される場合、株によって十分に許容され、増殖特性が類似するＮｓｔ＿Ｐｌａｃ株と比較した場合、より多くの量又は等しい量の３’ＳＬを生成する。

［実施例２ － α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ発現株の増殖安定性］
α－２，３－シアリルトランスフェラーゼを発現する株のロバスト性は、３’ＳＬの製造をアップスケールする場合に重要である。本実施例において、実施例１由来の優良株、Ｃｌａｒｉ１又はＰｏｒａｌを発現する株の増殖を、ＰｇｌｐＦ又はＰｌａｃプロモータの制御下でＮｓｔを発現する株と比較した。

株を、「材料」の節に記載する増殖安定性試験に従って発酵した。

発酵中に記録した二酸化炭素進化速度（ＣＥＲ）は、発酵中に細胞がＣＯ_２を産生する速度を反映し、本質的に株の代謝の尺度である。ＣＥＲが低下する場合、細胞の代謝が変化していることを示す。増殖安定性試験において、供給を高いグルコース供給速度で開始し、これを、その後、およそ２５時間でかなり引き下げる（図２）。図３Ａは、発酵中に測定したＣＥＲを示し、全ての株に、図２に示す供給プロファイルの変化後にＣＥＲの低下があることを示す。本開示のα－２，３－シアリルトランスフェラーゼを有する株、Ｃｌａｒｉ１（破線）及びＰｏｒａｌ（ドット線）は、両方とも３５時間目のＣＥＲの最初の低下後に回復するが、Ｐｌａｃプロモータ（太い線）及びＰｇｌｐＦプロモータ（薄い実線）を有するＮｓｔ株は、両方とも決して回復しない。

Ａｍｂｒ ２５０バイオリアクタシステムにおける発酵中に測定した反射率は、リアクタ内でのバイオマスの間接的尺度であり、これは、通常、発酵の全体を通して増大し続ける。図３Ｂは、図３Ａに示すのと同じ発酵の反射率を示し、また、ここで、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼＰｏｒａｌ及びＣｌａｒｉ１を発現する株は、供給プロファイルのシフト後に増殖する能力を維持するが、２つのＮｓｔ株は、増殖を止めることが明らかである。

Claims (15)

1. α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む遺伝的に修飾された細胞であって、前記酵素は、配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＰｏｒａｌであり、前記細胞は、シアル酸付加ＨＭＯを産生する、遺伝的に修飾された細胞。
2. 前記シアル酸付加ＨＭＯは、３’ＳＬ、ＦＳＬ、ＤＳＬＮＴ及びＬＳＴ－ａからなる群から選択される、請求項１に記載の遺伝的に修飾された細胞。
3. ３’ＳＬは、前記遺伝的に修飾された細胞によって産生される唯一のＨＭＯである、請求項１又は２に記載の遺伝的に修飾された細胞。
4. α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする前記核酸配列は、配列番号１２～２２又は４１～５４に従う、好ましくは配列番号１３、１８、１９、２０、２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０及び５１からなる群から選択される核酸配列を有する、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ、Ｐｌａｃ＿７０ＵＴＲ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ及びそれらのバリアントからなる群から選択されるプロモータの制御下にある、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝的に修飾された細胞。
5. 細胞外培地中に前記シアル酸付加ＨＭＯを輸送することができるＭＦＳトランスポータタンパク質をコードする核酸配列を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝的に修飾された細胞。
6. シアル酸糖ヌクレオチドを作成するための生合成経路を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の遺伝的に修飾された細胞。
7. ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、ラクトバチルス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種及びカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属種からなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の遺伝的に修飾された細胞。
8. 前記細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項７に記載の遺伝的に修飾された細胞。
9. シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を生成する方法であって、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む遺伝的に修飾された細胞を培養することを含み、前記酵素は、配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＰｏｒａｌであり、前記遺伝的に修飾された細胞は、任意選択的に、請求項４～６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの追加の修飾を含む、方法。
10. 生成される前記シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）は、３’ＳＬである、請求項９に記載の方法。
11. ラクトースは、シアル酸付加ＨＭＯ形成のための基質として、前記遺伝的に操作された細胞の前記培養中に添加される、請求項９又は１０に記載の方法。
12. 前記シアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）は、前記培地及び／又は前記遺伝的に修飾された細胞から回収される、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む核酸構築体であって、前記組換え核酸配列は、配列番号２５の核酸配列又は配列番号２５に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなるＰｏｒａｌであり、前記酵素コーディング配列は、配列番号１２～２２又は４１～５４に従う、好ましくは配列番号１３、１８、１９、２０、２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０及び５１からなる群から選択される核酸配列を有する、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ、Ｐｌａｃ＿７０ＵＴＲ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ及びそれらのバリアントからなる群から選択されるプロモータ配列の制御下にある、核酸構築体。
14. シアル酸付加ＨＭＯを生成するために宿主細胞において使用するためのものである、請求項１３に記載のα－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする組換え核酸配列を含む核酸構築体。
15. シアル酸付加ＨＭＯの生成に使用するためのものである、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝的に修飾された細胞。

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