CN116694543A - 用于体内合成3’sl的新型唾液酸转移酶 - Google Patents
用于体内合成3’sl的新型唾液酸转移酶 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及唾液酸化人乳寡糖(HMO)的生产，特别是3’‑唾液酸基乳糖(3’SL)的生物合成生产，以及适用于所述生产的基因工程细胞和方法。
Description
技术领域
本发明涉及唾液酸化人乳寡糖(HMO)的生产，特别是3’-唾液酸基乳糖(3’SL)的生物合成生产，以及适用于所述生产的基因工程细胞。
背景技术
设计和建造细菌细胞工厂以生产唾液酸化人乳寡糖(HMO)，特别是更复杂的唾液酸化人乳寡糖(HMO)，对于为未来更复杂的产物提供创新和可扩展的解决方案至关重要。
为此，合理的菌株工程原理通常应用于单个细菌细胞。这些原理通常指a)向宿主引入所需的生物合成通路，b)所需反应中作为供体所需的相关活性糖的细胞池的增加，c)通过天然乳糖渗透酶LacY增强乳糖输入和d)引入合适的糖基转移酶，以促进唾液酸化寡糖的生物合成生产(参见Bych等人2019,Current Opinion in Biotechnology 56:130–137)。
WO2007/101862公开了使用例如来自脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的α-2,3-唾液酸转移酶Nst结合neuBCA基因的表达以生产CMP-neu5AC来生产唾液酸化HMO。
在WO2019/020707中提出了生产唾液酸化HMO的进一步尝试，其描述了能够在细胞中生产复杂唾液酸化HMO的许多唾液酸转移酶，其中假设3’SL可以作为次要的副产物生产。
Schelch等人2020年《生物技术进展》(Biotechnology Advances)44，107613，是一篇关于细菌唾液酸转移酶性质的综述。表2总结了大肠杆菌(E.coli)中表达的细菌唾液酸转移酶，没有指示产生了什么唾液酸寡糖(如果有的话)。
唾液酸化HMO的生产可能会受到生产菌株中唾液酸转移酶的副活性的阻碍，这种副活性可能会影响细胞甚至在没有底物的情况下健壮生长的能力，这反过来反映为唾液酸化HMO产物的产率低。
总之，需要用于HMO生产的唾液酸转移酶，其能够实现唾液酸化产物的更高产量以及生产菌株的稳定生长，以获得可扩展用于唾液酸化HMO，特别是3’SL的工业生产的稳定的唾液酸化HMO生产平台。
发明内容
本发明涉及一种基因修饰细胞，其包含编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列，能够以高产率生产唾液酸化HMO，特别是3’SL，同时保持生产菌株的大规模稳定生长。特别地，在产物形成期间，在更宽范围的生长速率上观察到稳定的生长，这反过来允许在发酵期间更快且更大的碳源供给变化。
具体地，本发明涉及一种基因修饰细胞，其过表达选自Clari1、Neigon、Poral和PmN的α-2,3-唾液酸转移酶，其包含SEQ ID NO:1、2、3或4之一的氨基酸序列或与SEQ IDNO:1、2、3或4之一具有至少80％，例如至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。优选地，当所选择的α-2,3-唾液酸转移酶在强且优选异源启动子的控制下表达时，基因修饰细胞表现出稳定的生长，以及高的产物产率，因此适合于唾液酸化HMO的大规模工业生产。由本发明的细胞产生的唾液酸化HMO通常选自3’SL、FSL、DSLNT和LST-a。优选地，所生产的唾液酸化HMO是3’SL，特别是不存在其它HMO副产物的3’SL。
根据本发明的基因修饰细胞还可以包含启动子元件，该启动子元件控制编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸的表达。唾液酸转移酶可以例如受选自PglpF、PglpA、PglpT、Plac、PmglB及其变体的启动子的控制，该启动子的核酸序列分别选自SEQ IDNO 12-22或41-54。优选地，唾液酸转移酶受重组启动子的控制，其比天然大肠杆菌Plac启动子更强。优选地，唾液酸转移酶受重组启动子的控制，该重组启动子选自SEQ ID NO 13、18、19、20、21、22、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51。
本发明还涉及一种核酸构建体，其包含编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列，其中所述酶选自Clari1、Neigon、Poral、PmN的唾液酸转移酶，该Clari1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，该Neigon包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，该Poral包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，该PmN包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且其中所述核酸序列受选自PglpF、PglpA、PglpT、Plac、PglB及其变体的启动子序列的控制，该启动子具有根据SEQ IDNO 12-22或41-54的核酸序列。所述核酸构建体通常用于宿主细胞中以生产唾液酸化HMO，例如3’SL。
根据本发明的基因修饰细胞还可以包含编码MFS转运蛋白的核酸序列，该MFS转运蛋白能够将唾液酸化HMO输出到细胞外基质中。优选地，MFS转运蛋白是分别具有根据SEQID NO:38、39或40的氨基酸序列的Nec、YberC或Fred蛋白。
根据本发明的基因修饰细胞可以包含用于制备唾液酸糖核苷酸如CMP-Neu5Ac的生物合成通路。所述唾液酸糖核苷酸通路可由编码来自空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)的NeuBCA的核酸序列(SEQ ID NO:35)编码。编码NeuBCA的核酸序列可以从携带neuBCA操纵子的高拷贝质粒编码。
根据本发明的基因修饰细胞可以是微生物，例如细菌或真菌，其中所述真菌可以选自酵母细胞，例如驹形氏酵母属(Komagataella)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶鲁维亚酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或汉逊酵母属(Hansenula)的酵母细胞，或选自曲霉属(Aspargillus)、镰刀菌属(Fusarium)或木霉菌属(Thricoderma)的丝状真菌，并且所述细菌可以选自示例性的埃希氏杆菌属(Escherichia sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、乳酸杆菌属(lactobacillus sp.)和弯曲杆菌属(Campylobacter sp.)。因此，根据本发明的基因修饰细胞可以是大肠杆菌。
本发明的基因修饰细胞可用于以高产率生产唾液酸化HMO，特别是3’SL，同时保持稳定的生长。
因此，本发明还涉及一种生产唾液酸化人乳寡糖(HMO)，特别是3’-SL的方法，所述方法包括培养包含编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列的基因修饰细胞，其中所述酶选自Clari1、Neigon、Poral和PmN，其包含SEQ ID NO:1、2、3或4之一的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1、2、3或4之一具有至少80％，例如至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方式中，所述基因修饰细胞包含根据本发明的至少一种额外的修饰。
下文将参考相关的附图和序列描述各种示例性实施方式和细节。应当注意，附图仅旨在促进实施方式的描述。它们不旨在作为对本发明的详尽描述或对本发明范围的限制。此外，所示实施方式不需要具有所示的所有方面或优点。结合特定实施方式描述的方面或优点不一定限于该实施方式，并且即使未如此示出或未如此明确描述，也可以在任何其它实施方式中实践。
附图说明
图1：在Plac启动子的控制下，表达给定α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的菌株中3’SL摩尔含量(mM)相对于表达Nst的细胞中3’SL的摩尔含量的百分比(％)(阴影条)。CstI和PM70在现有技术中已知能够产生3’SL，并用虚线指示。
图2：生长稳定性试验中使用的进料(实线)和温度(虚线)曲线。
图3A和图3B：四种不同菌株的生长稳定性试验数据，分别为Nst_Plac(粗线)、Nst_PglpF(细线)、Clari1(虚线)或Poral(虚线)。图3A显示发酵期间菌株的二氧化碳释放速率(CER)。图3B显示在发酵期间来自相同发酵的反映。
具体实施方式
本发明解决体内HMO生产的生物技术挑战，特别是含有至少一种唾液酸单糖的唾液酸化HMO，如唾液酸化的HMO 3’SL、FSL和LST-a。本发明提供了特定的菌株工程解决方案，以通过利用对乳糖上的末端半乳糖部分特异性的底物和本发明的α-2,3-唾液酸转移酶的活性来生产特定的唾液酸化HMO，特别是3’SL，这无论是在大规模发酵中的菌株稳定性还是在提高产量方面均提高了唾液酸化HMO的生产。
换句话说，本发明所涵盖的基因修饰细胞表达编码唾液酸化HMO生物合成关键酶的基因，在一些实施方式中，连同一个或多个编码用于制造唾液酸糖核苷酸的生物合成通路的基因一起使用，例如SEQ ID NO:35所示的来自空肠弯曲杆菌的neuBCA操纵子，这使得细胞能够从底物如乳糖和核苷酸活化糖，例如特别是CMP-N-乙酰神经氨酸产生唾液酸化寡糖。
具体地，所产生的唾液酸化HMO选自3’SL、FSL、DSLNT和LST-a，并且目前优选的是，产生的唾液酸化HMO是3’SL。为了生产FSL、DSLNT和LST-a，基因修饰细胞需要存在额外的糖基转移酶，如β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶和β-1,3-半乳糖基转移酶，以乳糖作为初始底物生产LST-a，或α-1,3-岩藻糖基转移酶以生产FSL。
在本上下文中使用本发明的α-2,3-唾液酸转移酶中的任何一种的优点是，当从乳糖作为初始底物开始时，它们能够识别乳糖并特异性唾液酸化乳糖以产生作为唯一HMO的3’SL，并且能够在保持生产菌株稳定生长的同时从强启动子表达。这里介绍的酶不仅提供高的3’SL滴度，而且还提供达到高生长密度的稳定生长。在实施例1中提供了通过达到高生长密度而表现出稳定生长的菌株的实例。具体地，本发明描述了α-2,3-唾液酸转移酶，其产生比现有技术中描述的α-2,3唾液酸转移酶(如CstI和PM70(参见WO2019/020707)更高的3’SL滴度，和/或在相同的生长条件下显示出比在同一宿主细胞中使用的CstII和/或Nst(参见WO2007/101862)更大或相似的生长密度。因此，本文所述的α-2,3-唾液酸转移酶的特性非常适合于大规模工业生产3’SL。
当与α-2,3-唾液酸转移酶Nst(SEQ ID NO:5)相比时，表达本发明的α-2,3-唾液酸转移酶的本发明的基因修饰细胞能够产生高滴度的3’SL，同时保持或改善所述基因修饰细胞的稳定生长。因此，本发明实现了更有效的3’SL生产，这在简单唾液酸化HMO(如3’SL)的生物技术生产中非常有益。
如实施例1所示，在相同的生长条件下，本发明的基因修饰细胞以至少等于由Nst_Plac菌株、PM70菌株或CstI菌株形成的3’SL水平或比其高至少5％，例如10％的水平形成3’SL。特别是，在相同条件下，表达Clari1、Poral、Neigon或PmN的菌株产生的3’SL是表达CstI的菌株的3倍多。
实施例1中所示的光密度(OD)表明，使用异源PglpF启动子而不是Plac启动子过表达Nst确实影响细胞的生长，这对于异源PglpF启动子下的本发明的任何唾液酸转移酶来说都不是相同程度的情况，因此使这些唾液酸转移酶能够更有效地用于唾液酸化HMO，例如3’SL的工业规模生产。
在以下各节中，描述了本发明的各个要素，特别是基因修饰细胞的各个要素。应当理解，这些要素可以跨各个部分组合。
寡糖
在本上下文中，术语“寡糖”是指含有至少三个单糖单元的糖聚合物，即三、四、五、六或更高级寡糖。寡糖可以具有含有单糖单元的直链或支链结构，单糖单元通过糖苷间键彼此连接。特别地，寡糖包含还原端的乳糖残基和一个或多个天然存在的5-9个碳原子的单糖，其选自醛糖(例如葡萄糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖、木糖等)、酮糖(例如果糖、山梨糖、塔格糖等)、脱氧糖(例如鼠李糖、岩藻糖等)、脱氧氨基糖(例如N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰氨基甘露糖、N-乙酰氨基半乳糖等)、糖醛酸和酮醛酸(例如N-乙酰神经氨酸)。优选地，寡糖是HMO。
人乳寡糖(HMO)
本发明的优选寡糖是人乳寡糖(HMO)。
术语“人乳寡糖”或“HMO”在本上下文中，是指母乳中发现的复杂碳水化合物。HMO具有核心结构，该核心结构在还原端包含乳糖单元，可被一个或多个β-N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个或多个β-乳-N-二糖基单元拉长，并且该核心结构可被α-L-岩藻吡喃糖基和/或α-N-乙酰基-神经氨酸基(唾液酸)部分取代。例如，HMO结构由Xi Chen在《碳水化合物化学与生物化学进展》2015年第72卷第4章中公开。
本发明集中于唾液酸化HMO，其通常是酸性的。酸性HMO的实例包括3’-唾液酸基乳糖(3’SL)、6’-唾液酸基乳糖(6’SL)、3-岩藻糖基-3’-唾液酸基乳糖(FSL)、3’-O-唾液酸基乳-N-四糖a(LST-a)、岩藻糖基-LST-a(FLST-a)、6’-O-唾液酸基乳-N-四糖b(LST-b)、岩藻糖基-LST b(FLST b)、6’-O-唾液酸基乳-N-新四糖(LST-c)、岩藻糖基-LST-c(FLST-c)、3’-O-唾液酸基乳-N-新四糖(LST-d)、岩藻糖基-LST d(FLST-d)、唾液酸基-乳-N-己糖(SLNH)、唾液酸基-乳-N-新己糖I(SLNH-I)、唾液酸基-乳-N-新六糖II(SLNH-II)和二唾液酸基-乳-N-四糖(DSLNT)。
在本发明的一个方面，细胞产生的唾液酸化人乳寡糖(HMO)是选自3’SL、FSL、DSLNT和LST-a的唾液酸化HMO。在本发明的另一方面，细胞产生的唾液酸化人乳寡糖(HMO)是三个单糖单元的HMO，例如3’SL。
这些HMO中某些的生产可能需要存在两种或多种糖基转移酶活性，特别是从乳糖作为受体寡糖开始时。然而，生产3’SL的情况并非如此，它只需要表达一种具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的糖基转移酶。
受体寡糖
根据本发明的基因修饰细胞包含重组核酸序列，其编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶，该酶能够将唾液酸从活化糖转移到受体寡糖的末端半乳糖。
在本发明的上下文中，受体寡糖是可以作为糖基转移酶底物的寡糖，该糖基转移酶能够将糖基部分从糖基供体转移到受体寡糖。糖基供体优选为核苷酸活化糖，如“糖基转移酶”一节所述。优选地，受体寡糖是制备HMO的前体，也可以称为前体分子。
在本上下文中，所述受体寡糖优选为用于生产3’SL的乳糖。比3’SL更复杂的HMO(如LST-a或FSL)的生产还可包括更复杂的受体分子，如乳-N-新四糖(LNT)，其由前体分子乳糖和/或乳-N-三糖II(LNT-II)或3FL产生。在这两种情况下，可以将前体分子引入能够从前体产生唾液酸化HMO的基因修饰细胞，或者可以对细胞进行修饰以从乳糖产生更复杂的受体分子。
受体寡糖可以是本发酵过程的中间产物、使用单独的基因修饰细胞的单独发酵过程的最终产物、或者是酶或化学产生的分子。
糖基转移酶
根据本发明的基因修饰细胞包含至少一个编码至少一种糖基转移酶的重组核酸序列，该至少一种糖基转移酶能够将唾液酸基残基从唾液酸基供体转移到受体寡糖以合成唾液酸化人乳寡糖产物，即唾液酸转移酶。
根据本发明，基因修饰细胞可包含至少一个另外的重组核酸序列，其编码至少一种能够将糖基残基从糖基供体转移到受体寡糖的糖基转移酶。另外的糖基转移酶可使基因修饰细胞从前体分子(如乳糖或LNT-II)合成LNT，或从乳糖合成3FL。另外的糖基转移酶还能够进一步修饰例如3’SL分子以产生例如FSL或LST-a或LST-b分子以产生DSLNT。
另外的糖基转移酶优选选自岩藻糖基转移酶、半乳糖基转移酶、葡糖胺基转移酶、唾液酸转移酶和N-乙酰葡糖胺基转移酶。
当需要生产更复杂的HMO时，本文所述的α-2,3-唾液酸转移酶可与一种或多种选自β-1,3-半乳糖基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶和β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶的糖基转移酶组合。在特定实施方式中，另外的糖基转移酶可以是β-1,3-半乳糖基转移酶、或β-1,4-半乳糖基转移酶、或β-1,3-半乳糖基转移酶和β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶的组合、或β-1,4-半乳糖基转移酶和β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶的组合。在另一个实施方式中，可将选自α-1,2-岩藻糖基转移酶、α-1,3-岩藻糖转移酶和α-1,3/4-岩藻糖基转移酶的岩藻糖基转移酶引入本文所述的基因工程细胞。
在一个方面，本发明的基因修饰细胞中的唾液酸转移酶是α-2,3-唾液酸转移酶。优选地，α-2,3-唾液酸转移酶能够将唾液酸单元转移到乳糖分子的末端半乳糖上。优选地，仅在半乳糖的C3位置，从而当从乳糖作为初始底物开始时，产生作为唯一HMO的3’SL。
在本发明中，能够将唾液酸部分从唾液酸基供体转移到受体寡糖的至少一种功能酶(α-2,3-唾液酸转移酶)可以选自Clari1、Neigon、Poral和PmN(表1)。这些酶一旦在基因修饰细胞中表达，例如可用于产生3’SL。
在一个实施方式中，本发明的α-2,3-唾液酸转移酶的表达进一步与β-1,3-半乳糖基转移酶结合，例如来自幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的galTK(SEQ ID NO:37，或其功能变体)。在另一个实施方式中，添加第三种酶，例如β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶，例如来自脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的LgtA(SEQ ID NO:36，或其功能变体)。
示例性糖基转移酶优选选自下述糖基转移酶。
α-2,3-唾液酸转移酶
α-2,3-唾液酸转移酶是指一种糖基转移酶，它催化唾液酸从供体底物(如CMP-N-乙酰神经氨酸)以α-2,3键转移到受体分子。优选地，本文所用的α-2,3-唾液酸转移酶不起源于基因工程细胞的物种，即，编码α-2,3-唾液酸转移酶的基因是异源的，并且选自表1中鉴定的α-2,3-唾液酸转移酶。能够将唾液酸部分转移到乳糖上的异源α-2,3-唾液酸转移酶是本领域已知的，其中三种在表1中鉴定。
表1列出了本申请中研究的α-2,3-唾液酸转移酶。唾液酸转移酶可以选自与表1中列出的任何一种α-2,3-唾液酸转移酶的氨基酸序列具有至少80％、例如80％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列。
表1.能够生产3’SL的α-2,3-唾液酸转移酶列表。
GenBank ID反映了全长酶，在本发明中可能使用了截短或突变的版本，这些由SEQID NO表示。
α-2,3-唾液酸转移酶Nst、PM70和CstI从现有技术中已知为可产生唾液酸化HMO的α-2,3-唾液酸转移酶。
本发明的实施例1鉴定了异源α-2,3-唾液酸转移酶Clari1、Neigon和Poral(分别为SEQ ID NO:1、2和3)，其在引入基因修饰细胞时能够产生比已知的α-2,3-唾液酸转移酶Nst、PM70和CstI更高或相等的3’SL滴度。
本发明的实施例1进一步鉴定了异源α-2,3-唾液酸转移酶Clari1、Neigon、Poral和PmN(分别为SEQ ID NO:1、2、3和4)，与已知的α-2,3-唾液酸转移酶Nst、PM70和CstI相比，能够产生相似或更高的3’SL滴度，而不显著影响基因修饰细胞的生长。
在本发明的一个实施方式中，具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶是来自红嘴鸥弯曲杆菌的Clari1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的另一个实施方式中，具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶是来自淋病奈瑟球菌FA 1090的Neigon，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的另一个实施方式中，具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶是来自口腔巴氏杆菌的Poral，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的另一个实施方式中，具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶是来自巴氏杆菌的PmN，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方式中，本发明的表达α-2,3-唾液酸转移酶的基因修饰细胞产生的3’SL的量与表达α-2,3-唾液酸转移酶Nst(SEQ ID NO:5)(当Nst的表达通过Plac启动子调节时)的基因修饰细胞所产生的3’SL的量至少相等，或比其高至少5％，例如至少10％、例如至少15％或例如至少20％。
在一个实施方式中，表达包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成的α-2,3-唾液酸转移酶Clari1的基因修饰细胞导致产生至少等于由表达α-2,3-唾液酸转移酶Nst(SEQ ID NO:5)(当Nst的表达通过Plac启动子调节时)的基因修饰细胞产生的3’SL的量的3’SL，或比其高至少5％，例如至少10％、例如至少15％或例如至少20％。
在一个实施方式中，表达包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成的α-2,3-唾液酸转移酶Neigon的基因修饰细胞导致产生至少等于由表达α-2,3-唾液酸转移酶Nst(SEQ ID NO:5)(当Nst的表达通过Plac启动子调节时)的基因修饰细胞产生的3’SL的量的3’SL，或比其高至少5％，例如至少7％、例如至少10％或例如至少15％。
在一个实施方式中，表达包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成的α-2,3-唾液酸转移酶Poral的基因修饰细胞导致产生至少等于由表达α-2,3-唾液酸转移酶Nst(SEQ ID NO:5)(当Nst的表达通过Plac启动子调节时)的基因修饰细胞产生的3’SL的量的3’SL，或比其高至少2％，例如至少4％或例如至少5％。
在一个实施方式中，表达包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少80％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成的α-2,3-唾液酸转移酶PmN的基因修饰细胞导致产生至少等于由表达α-2,3-唾液酸转移酶Nst(SEQ ID NO:5)(当Nst的表达通过Plac启动子调节时)的基因修饰细胞产生的3’SL的量的3’SL。
在一个实施方式中，本发明的表达α-2,3-唾液酸转移酶的基因修饰细胞产生的3’SL的量比表达α-2,3-唾液酸转移酶PM70(SEQ ID NO:6)(当PM70的表达通过Plac或PglpF启动子调节时)的基因修饰细胞所产生的3’SL的量高至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％或例如至少25％。
在一个实施方式中，表达包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成的α-2,3-唾液酸转移酶Clari1的基因修饰细胞导致产生的3’SL的量比由表达α-2,3-唾液酸转移酶PM70(SEQ ID NO:6)(当PM70的表达通过Plac或PglpF启动子调节时)的基因修饰细胞所产生的3’SL的量高至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％或例如至少25％。
在一个实施方式中，表达包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成的α-2,3-唾液酸转移酶Neigon的基因修饰细胞导致产生的3’SL的量比由表达α-2,3-唾液酸转移酶PM70(SEQ ID NO:6)(当PM70的表达通过Plac或PglpF启动子调节时)的基因修饰细胞所产生的3’SL的量高至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％或例如至少25％。
在一个实施方式中，表达包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成的α-2,3-唾液酸转移酶Poral的基因修饰细胞导致产生的3’SL的量比由表达α-2,3-唾液酸转移酶PM70(SEQ ID NO:6)(当PM70的表达通过Plac或PglpF启动子调节时)的基因修饰细胞所产生的3’SL的量高至少3％，例如至少5％、例如至少7％、例如至少9％或例如至少10％。
在一个实施方式中，表达包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成的α-2,3-唾液酸转移酶PmN的基因修饰细胞导致产生的3’SL的量比由表达α-2,3-唾液酸转移酶PM70(SEQ ID NO:6)(当PM70的表达通过Plac或PglpF启动子调节时)的基因修饰细胞所产生的3’SL的量高至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％或例如至少25％。
在一个实施方式中，本发明的表达α-2,3-唾液酸转移酶的基因修饰细胞导致产生3’SL，同时与表达α-2,3-唾液酸转移酶Nst(SEQ ID NO:5)(当Nst的表达受PglpF启动子调节时)的基因修饰细胞相比，该基因修饰细胞在更宽的生长速率范围内表现出稳定的生长。
在一个实施方式中，表达包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成的α-2,3-唾液酸转移酶Clari1的基因修饰细胞导致产生3’SL，同时与表达α-2,3-唾液酸转移酶Nst(SEQ ID NO:5)(当Nst的表达受PglpF启动子调节时)的基因修饰细胞相比，该基因修饰细胞在更宽的生长速率范围内表现出稳定的生长。
在一个实施方式中，表达包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成的α-2,3-唾液酸转移酶Neigon的基因修饰细胞导致产生3’SL，同时与表达α-2,3-唾液酸转移酶Nst(SEQ ID NO:5)(当Nst的表达受PglpF启动子调节时)的基因修饰细胞相比，该基因修饰细胞在更宽的生长速率范围内表现出稳定的生长。
在一个实施方式中，表达包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成的α-2,3-唾液酸转移酶Poral的基因修饰细胞导致产生3’SL，同时与表达α-2,3-唾液酸转移酶Nst(SEQ ID NO:5)(当Nst的表达受PglpF启动子调节时)的基因修饰细胞相比，该基因修饰细胞在更宽的生长速率范围内表现出稳定的生长。
在一个实施方式中，表达包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成的α-2,3-唾液酸转移酶PmN的基因修饰细胞导致产生3’SL，同时与表达α-2,3-唾液酸转移酶Nst(SEQ ID NO:5)(当Nst的表达受PglpF启动子调节时)的基因修饰细胞相比，该基因修饰细胞在更宽的生长速率范围内表现出稳定的生长。
糖基-供体-核苷酸-活化的糖通路
当实施本发明的方法时，优选发生糖基转移酶介导的糖基化反应，其中活化的糖核苷酸充当糖基供体。活化的糖核苷酸通常有一个磷酸化的糖基残基附着在核苷上。特定的糖基转移酶只接受特定的糖核苷酸。因此，优选以下活化的糖核苷酸参与糖基转移：葡萄糖UDP-GlcNAc、UDP-半乳糖、UDP-葡萄糖、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖、UDP-N-乙酰氨基半乳糖(GlcNAc)和CMP-N-乙酰神经氨酸。根据本发明的基因修饰细胞可以包括一种或多种通路以产生选自葡萄糖UDP-GlcNAc、GDP-岩藻糖、UDP-半乳糖、UDP-葡萄糖、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖、UDP-N-乙酰氨基半乳糖和CMP-N-乙酰神经氨酸的核苷酸活化糖。
在该方法的一个实施方式中，基因修饰细胞能够通过从头通路产生一种或多种上述的活化的糖核苷酸。在这方面，细胞在参与相应糖核苷酸从头生物合成通路的酶的作用下，以从甘油、蔗糖、果糖或葡萄糖等简单碳源开始的逐步反应序列制备活化的糖核苷酸(单糖代谢综述参见例如H.H.Freeze和A.D.Elbein：第4章：糖基化前体，载于：糖生物学基础，第2版(Eds.A.Varki等人)，冷泉港实验室出版社(2009)。
参与活化的糖核苷酸从头生物合成通路的酶可以天然存在于细胞中或通过基因技术或重组DNA技术引入细胞中，所有这些都是本领域技术人员一般知识的一部分。
在另一个实施方式中，基因修饰细胞可以利用回收的单糖作为糖核苷酸。在挽救通路中，来自降解寡糖的单糖被激酶磷酸化，并被焦磷酸化酶转化为核苷酸糖。参与该过程的酶可以是异源酶，也可以是宿主细胞的天然酶。
唾液酸糖核苷酸合成通路
优选地，根据本发明的基因修饰细胞包括唾液酸糖核苷酸合成能力，即，基因修饰细胞包含用于制备唾液酸糖核苷酸的生物合成通路，例如作为本发明的α-2,3-唾液酸转移酶的糖基供体的CMP-N-乙酰神经氨酸。例如，基因修饰细胞通过提供外源UDP-GlcNAc 2-二聚体酶(例如空肠弯曲杆菌的NeuC(GenBank AAK91727.1)或等效物(例如(GenBankCAR04561.1))、Neu5Ac合成酶(例如空肠弯曲杆菌的NeuB(GenBank AAK91726.1)或等效物(例如，湖沼黄杆菌(Flavobacterium limnosediminis)唾液酸合成酶，GenBank WP_023580510.1)、和/或CMP-Neu5Ac合成酶(例如空肠弯曲杆菌的NeuA(GenBank AAK91728.1)或等效物(例如巴西弧菌(Vibrio brasiliensis)CMP唾液酸合酶，GenBank WP_006881452.1)包括唾液酸合成能力。
在一个或多个实例中，UDP GlcNAc 2-二聚体酶、CMP-Neu5Ac合成酶、来自空肠弯曲杆菌的Neu5Ac合成酶(也称为来自空肠弯曲菌的NeuBCA或简称NeuBCA操纵子)可以是质粒携带的或整合到基因修饰细胞的基因组中。优选地，唾液酸糖核苷酸通路由编码来自空肠弯曲杆菌的NeuBCA的核酸序列(SEQ ID NO:35)或其具有与SEQ ID NO:35具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％或例如至少99％同一性的核酸序列的功能变体编码。
此外，编码NeuBCA的核酸序列优选由携带NeuBCA操纵子的高拷贝质粒编码。在实施方式中，高拷贝质粒是BlueScribe M13质粒(pBS)。关于本发明，高拷贝质粒是当引入细胞时复制到50以上拷贝数的质粒。
缺乏的唾液酸分解代谢通路
本发明的基因修饰细胞优选具有缺乏的唾液酸分解代谢通路。“唾液酸分解代谢通路”是指一系列反应，通常由酶控制和催化，导致唾液酸降解。下文描述的示例性唾液酸分解代谢通路是大肠杆菌通路。在这一通路中，唾液酸(Neu5Ac；N-乙酰神经氨酸)被酶NanA(N-乙酰神经氨酸裂解酶)和NanK(N-乙酰甘露糖胺激酶)以及NanE(N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸异构酶)降解，这些酶均由nanATEK-yhcH操纵子编码，并被NanR抑制(http://ecocyc.org/ECOLI)。通过在内源性nanA(N-乙酰神经氨酸裂解酶)(例如，GenBank登录号D00067.1(GL216588))和/或nanK(N-乙酰甘露糖胺激酶)基因(例如，GenBank登录号(氨基酸)BAE77265.1(GL85676015))、和/或nanE(N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸异构酶，GI:947745)，并入本文以供参考)中引入突变，在大肠杆菌宿主中提供了缺乏的唾液酸分解代谢通路。可选地，nanT(N-乙酰神经氨酸转运蛋白)基因也被失活或突变。唾液酸代谢的其它中间体包括：(ManNAc-6-P)N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸；(GlcNAc-6-P)N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸；(GlcN-6-P)氨基葡萄糖-6-磷酸和(Fruc-6-P)果糖-6-磷酸。在一些优选实施方式中，nanA被突变。在其它优选实施方式中，nanA和nanK突变，而nanE保持功能。在另一优选实施方式中，nanA和nanE突变，而nanK未发生突变、失活或缺失。突变是编码nanA、nanK、nanE和/或nanT基因产物的核酸序列中的一个或多个变化。例如，突变可以是核酸序列中的1、2、至多5、至多10、至多25、至多50或至多100个变化。例如，nanA、nanK、nanE和/或nanT基因通过无效突变而突变。如本文所述的无效突变包括氨基酸替换、添加、缺失或插入，其导致酶功能丧失(即活性降低或无活性)或酶丧失(即无基因产物)。“缺失”是指完全或部分去除编码区，从而不产生(功能性)基因产物。失活是指编码序列已被改变，使得所得到的基因产物在功能上是无活性的，或者编码的基因产物的活性低于天然、天然存在的内源性基因产物的100％，例如90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％。因此，在本发明中，nanA、nanK、nanE和/或nanT基因优选被失活。
主要促进因子超家族(MFS)转运蛋白
寡糖产物，即细胞产生的HMO，可以在细胞内和细胞外基质中积累。产物可以被动的方式运输到上清液中，即它通过细胞膜向外扩散。或者，HMO转运可由促进糖衍生物从细胞向上清液流出的主要促进因子超家族转运蛋白促进。主要促进因子超家族转运蛋白可存在于外源或内源，并在发酵条件下过表达，以促进所产生的寡糖衍生物(HMO)的输出。通过已知的重组DNA技术，可以通过突变改变对待分泌产物的糖部分的特异性。
因此，根据本发明的基因修饰细胞可进一步包含编码能够输出唾液酸化人乳寡糖产物(一种或多种)的主要促进因子超家族转运蛋白的核酸序列。
近年来，已经鉴定了几种新的和有效的主要促进因子超家族转运蛋白，每种蛋白对不同的重组产生的HMO具有特异性，并且表达所述蛋白的重组细胞的开发有利于大规模工业HMO制造。WO2021/123113要求不同的大肠杆菌和异源转运蛋白用于输出3’SL、6’SL和LST-a。
因此，在一个或多个示例性实施方式中，根据本文所述方法的基因工程细胞进一步包含充当主要促进因子超家族转运蛋白的基因产物。作为主要促进因子超家族转运蛋白的基因产物可由在基因工程细胞中表达的重组核酸序列编码。编码主要促进因子超家族转运蛋白的重组核酸序列可整合到基因工程细胞的基因组中，或使用质粒表达。
在一个实施方式中，本发明的基因修饰细胞包含编码主要促进因子超家族转运蛋白的核酸序列，该蛋白能够将唾液酸化人乳寡糖产物输出到细胞外基质中，特别是优选对3’SL具有特异性的转运蛋白。
Nec
在一个实施方式中，本发明的基因修饰细胞包含编码能够输出唾液酸化人乳寡糖产物(例如3’SL)进入细胞外基质的外排转运蛋白的核酸序列。在当前的上下文，所述外排转运蛋白优选是编码源于Rosenbergiella nectarea的假定的MFS(主要促进因子超家族)转运蛋白的异源基因。更具体地，本发明涉及一种经优化以产生寡糖、特别是唾液酸化HMO的基因修饰细胞，其包含编码具有与GenBank登录ID WP_092672081.1或SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或100％序列同一性的的氨基酸序列的蛋白的重组核酸。
此外，在WO2021/148615中进一步描述了具有GenBank登录ID WP_092672081.1的MFS转运蛋白蛋白，并在本文中可互换地指示为“Nec蛋白”或“Nec转运蛋白”或“Nec”；编码Nec蛋白的核酸序列在本文中被指示为“nec编码核酸/DNA”或“nec基因”或“nec”。
预计Nec有助于增加所产生的唾液酸化HMO，例如本发明的基因工程细胞中的3’SL的流出。
因此，在一个实施方式中，本发明的基因修饰细胞包含编码Nec转运蛋白的核酸序列。
Fred/YberC
在实施方式中，本发明的基因修饰细胞包含编码外排转运蛋白的核酸序列，该外排转运蛋白能够将简单唾液酸化人乳寡糖产物如3’SL和6’SL输出到细胞外基质中。在当前上下文，所述外排转运蛋白优选是编码假定的MFS(主要促进因子超家族)转运蛋白的异源基因，所述MFS(主要促进因子超家族)转运蛋白源自弗氏耶尔森菌(Yersiniafrederiksenii)和/或伯氏耶尔森菌(Yersinia bercovieri)。更具体地，本发明涉及一种经优化以产生寡糖、特别是唾液酸化HMO的基因修饰细胞，其包含编码具有与GenBank登录ID WP_087817556.1(SEQ ID NO:40)或GenBank登录号EEQ08298(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或100％序列同一性的的氨基酸序列的蛋白的重组核酸。
具有GenBank登录ID WP_087817556.1的MFS转运蛋白蛋白在WO2021/148620中进一步描述，并在本文中可互换地指示为“Fred蛋白”或“Fred转运蛋白”或“Fred”；编码Fred蛋白的核酸序列在本文中被指示为“fred编码核酸/DNA”或“fred基因”或“fred”。
因此，在一个实施方式中，本发明的基因修饰细胞包含编码Nec或Fred转运蛋白的核酸序列。
此外，在WO2021/148610中进一步描述了具有GenBank登录ID EEQ08298的MFS转运蛋白蛋白，并在本文中可互换地指示为“YberC蛋白”或“YberC转运蛋白”或“YberC”；编码YberC蛋白的核酸序列在本文中被指示为“yberC编码核酸/DNA”或“yberC基因”或“yberC”。
Fred和YberC促进了在本发明的基因工程细胞中产生的唾液酸化HMO(例如3’SL)的流出增加。
因此，在一个实施方式中，本发明的基因修饰细胞包含编码Fred转运蛋白的核酸序列。在一个实施方式中，本发明的基因修饰细胞包含编码YberC转运蛋白的核酸序列。
基因修饰细胞
在本上下文中，术语“基因修饰细胞”和“基因工程细胞”可互换使用。如本文所用，“基因修饰细胞”是一种宿主细胞，其遗传物质已通过使用基因工程技术的人类干预而改变，这种技术例如但不限于转化或转染，例如用异源多核苷酸序列、Crisper/Cas编辑和/或随机诱变。在一个实施方式中，用重组核酸序列转化或转染基因工程细胞。
基因修饰可以例如选自糖基转移酶的包含和/或代谢通路工程化和MFS转运蛋白的包含，如以上章节中所述，本领域技术人员将知道如何将其结合成能够产生一种或多种唾液酸化HMO的基因修饰细胞。
在本发明的一个方面，基因修饰细胞包含编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列，与表达α-2,3-唾液酸转移酶Nst(其中Nst的表达由Plac启动子调节)的细胞相比，该基因修饰细胞能够产生高至少5％的3’SL摩尔HMO含量。
基因工程细胞优选是微生物细胞，例如原核细胞或真核细胞。可用作宿主细胞的合适的微生物细胞包括细菌细胞、古细菌细胞、藻类细胞和真菌细胞。
基因工程细胞可以是例如细菌或酵母细胞。在一个优选实施方式中，基因工程细胞是细菌细胞。
宿主细胞
关于细菌宿主细胞，原则上没有限制；它们可能是真细菌(革兰氏阳性或革兰氏阴性)或古细菌，只要它们允许基因操作以插入目的基因，并且可以在生产规模上培养。优选地，宿主细胞具有允许培养到高细胞密度的性质。适合于根据本发明的HMO的重组工业生产的细菌宿主细胞的非限制性实例可以是草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)(成团泛菌(Pantoea aggredens))、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、弯曲杆菌属(Campylobacter sp)、柠檬泛菌(Pantoea citrea)、果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)或野油菜黄单孢菌(Xanthomonas campestris)。也可以使用芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌，包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、嗜热芽孢杆菌(Bacillusthermophilus)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、分枝杆菌(Bacillus mycoides)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、缓慢芽孢杆菌(Bacillus lentus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)。类似地，可以使用本发明的方法对乳杆菌属和乳球菌属的细菌进行工程化，包括但不限于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)和弗氏丙酸杆菌(Proprionibacterium freudenreichii)也是适用于本文所述公开的细菌种类。作为本发明的一部分，还包括如本文所述工程化的来自肠球菌(Enterococcus)属(例如，粪肠球菌(Enterococcus faecium)和嗜热肠球菌(Enterococcus thermophiles))、双歧杆菌属(Bifidobacterium)(例如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)和两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum))、孢子乳杆菌属(Sporolactobacillus spp.)、微单孢菌属(Micromomospora spp.)、微球菌属(Micrococcus spp.)、红球菌属(Rhodococcus spp.)和假单胞菌(Pseudomonas)(例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))。
适合于异源产物的重组工业生产的真菌宿主细胞的非限制性实例是例如酵母细胞，例如法夫驹形氏酵母(Komagataella phaffii)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、毕赤酵母和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或丝状真菌，例如曲霉属(Aspargillus sp)、镰刀菌属(Fusarium sp)或木霉属(Thricoderma sp)，示例性物种为黑曲霉(A.niger)、构巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉(A.oryzae)、茄病镰刀菌(F.solani)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)和瑞氏木霉(T.reesei)。
在一个或多个示例性实施方式中，基因工程细胞选自大肠杆菌属、芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、棒状杆菌属和弯曲杆菌属。
在一个或多个示例性实施方式中，基因工程细胞选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸乳杆菌、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、解脂耶氏酵母、毕赤酵母和酿酒酵母。
在一个或多个示例性实施方式中，基因工程细胞是枯草芽孢杆菌。
在一个或多个示例性实施方式中，基因工程细胞是酿酒酵母或毕赤酵母。
在一个或多个示例性实施方式中，基因工程细胞是大肠杆菌。
在一个或多个示例性实施方式中，本发明涉及基因工程细胞，其中细胞源自大肠杆菌K-12菌株或DE3。
重组核酸序列
本发明涉及一种基因修饰细胞，其包含编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶(例如选自Clari1、Neigon、Poral和PmN的酶)的重组核酸序列，其中所述细胞产生人乳寡糖(HMO)，特别是唾液酸化HMO，优选3’SL。
在本上下文中，术语“重组核酸序列”、“重组基因/核酸/核苷酸序列/DNA编码”或“编码核酸序列”可互换使用，旨在表示人工核酸序列(即，在适当的控制序列(即启动子序列)的控制下转录成mRNA并翻译成蛋白质的非重叠三联体(密码子)。
编码序列的边界通常由位于mRNA5’端开放阅读框上游的核糖体结合位点、转录起始密码子(AUG、GUG或UUG)和翻译终止密码子(UAA、UGA或UAG)决定。编码序列可以包括但不限于基因组DNA、cDNA、合成和重组核酸序列。
术语“核酸”包括RNA、DNA和cDNA分子。应当理解，作为遗传密码退化的结果，可以产生编码给定蛋白质的大量核酸序列。
重组核酸序列可以是编码DNA序列，例如基因，或非编码DNA序列例如调控DNA，例如启动子序列或其它非编码调控序列。
重组核酸序列还可以是异源的。如本文所用，“异源”是指细胞或生物体外来的多肽、氨基酸序列、核酸序列或核苷酸序列，即，非天然存在于所述细胞或生物体中的多肽、核酸序列、核酸分子或核苷酸序列。
本发明还涉及一种核酸构建体，其包含编码核酸序列，即目的基因(例如唾液酸转移酶基因)的重组DNA序列和非编码调控DNA序列，例如启动子DNA序列，如源自lac操纵子或glp操纵子的启动子序列的重组启动子序列，或源自另一基因组启动子DNA序列的启动子序列或合成启动子序列，其中编码序列和启动子序列可操作地连接。
术语“可操作连接”是指两个或多个核酸(例如DNA)片段之间的功能关系。它是指转录调控序列与转录序列的功能关系。例如，如果启动子序列在适当的宿主细胞或其它表达体系中刺激或调节编码序列的转录，则启动子序列与编码序列可操作地连接。
通常，与转录序列可操作连接的启动子序列在物理上与转录序列相邻，即它们是顺式作用的。
在一个示例性实施方式中，本发明的核酸构建体可以是载体DNA的一部分，在另一个实施方式中，该构建体是整合在宿主细胞基因组中的表达盒/盒。
因此，术语“核酸构建体”是指人工构建的核酸片段，特别是DNA片段，其旨在被插入到目标细胞，例如细菌细胞中，以修饰基因组基因的表达或构建体中可能包含的基因/编码DNA序列的表达。因此，在实施方式中，本发明涉及包含编码唾液酸转移酶的重组核酸序列的核酸构建体，其中所述重组核酸序列选自编码Clari1、Neigon、Poral和PmN的核酸序列，如SEQ ID NO:23、24、25或27，或其功能变体。
本发明的一个实施方式是包含编码唾液酸转移酶的重组核酸序列的核酸构建体，其中所述重组核酸序列选自a)Clari1，其包含SEQ ID NO:23的核酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的核酸序列或由其组成；b)Neigon，其包含SEQ ID NO:24的核酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的核酸序列或由其组成；c)Poral，其包含SEQ ID NO:25的核酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的核酸序列或由其组成；和d)PmN，其包含SEQ ID NO:27的核酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的核酸序列或由其组成。优选地，编码唾液酸转移酶的序列受启动子序列的控制，该启动子序列选自具有表2中鉴定的核酸序列的启动子序列。
表2-选择的启动子序列
*启动子活性在下文所述的LacZ试验中评估，PglpF启动子在同一试验中作为阳性参考。为了在多个测定中进行比较，相对于PglpF启动子计算活性，一个范围表示多个测定的结果。
启动子对于基因修饰细胞可以是异源的、天然的，或者它可以是结合异源和/或天然元件的重组启动子。
增加产物产量的一种方法可以是调节用于生产产物的所需酶活性的生产，例如糖基转移酶或参与糖基供体生物合成通路的酶。
增加驱动所需酶表达的启动子强度可能是实现这一点的一种方式。启动子的强度可以使用lacZ酶测定法来评估，其中β-半乳糖苷酶活性如前所述(参见例如，Miller J.H.分子遗传学实验，冷泉港实验室出版社，纽约，1972)。简而言之，细胞在Z缓冲液中稀释，并用十二烷基硫酸钠(0.1％)和氯仿渗透。LacZ测定在30℃下进行。预热样品，加入200μl邻硝基苯基-β-半乳糖苷酶(4mg/ml)开始测定，当样品变为微黄色时，加入500μl 1M Na2CO3停止测定。邻硝基苯酚的释放随后被确定为420nm处的光密度变化。具体活性以米勒单位(MU)[A420/(min*ml*A600)]报告。活性高于10,000MU的调节元件被认为是强的，活性低于3,000MU的调节元件被认为是弱的，介于两者之间的调节元件具有中等强度。强调节元件的一个实例是具有约14,000MU活性的PglpF启动子，弱启动子的一个实例是当用IPTG诱导时具有约2,300MU活性的Plac。
如实施例1和2中所示，并非所有酶在高表达量时都能被宿主细胞同样良好地耐受，如α-2,3-唾液酸转移酶Nst的情况。因此，当Nst用于产生3’SL时，它受到弱启动子Plac的控制，因为当它受到PglpF的控制时，宿主细胞的生长受到影响。
在本发明的一个方面，编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列的表达由启动子调节，该启动子赋予所述具有α-2,3-唾液酸转移酶的酶的增强表达，该启动子选自Plac、PglpF、PglpA、PglpT或PmglB及其变体。优选地，唾液酸转移酶在选自SEQ IDNO 13、18、19、20、21、22、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51的强重组启动子的控制下。
在本发明的另一方面，编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列的表达由重组启动子调节，该重组启动子赋予所述具有α-2,3-唾液酸转移酶的酶的增强表达。
此外，本发明的构建体还可包含一个或多个核酸序列，该核酸序列编码β-1,3-N-乙酰基-葡糖胺基转移酶，如编码LgtA的SEQ ID NO:36的核酸序列，该核酸序列编码β-1,3-半乳糖基转移酶，如编码GalTK的SEQ ID NO:37的核酸序列，该核酸序列编码一个或多个MFS转运蛋白，例如编码Nec、YberC或Fred的SEQ ID NO:38、39或40的核酸序列，还可包含一个或多个编码一种或多种唾液酸糖核苷酸合成通路酶(例如编码唾液酸糖核苷酸合成通路酶的SEQ ID NO:35的核酸序列)的核酸序列。在实施方式中，本发明的所述核酸序列的表达受PglpF(SEQ ID NO:13)或Plac_70UTR(SEQ ID NO:18)启动子或PmglB_70UTR(SEQ ID NO:20)或其变体(如表2中鉴定的启动子)的控制，特别是受选自SEQ ID NO 13、18、19、20、21、22、41、42、43、44、45、46、47、48、49、，50和51的启动子的控制。PglpF和PmglB启动子序列的其它合适变体分别描述在WO2019/123324和WO2020/255054中(并入本文以供参考)。
包含在构建体(表达盒)中的目的核酸构建体整合到细菌基因组中可以通过常规方法实现，例如通过使用含有与染色体上特定位点同源的侧翼序列的线性盒，如针对attTn7位点所述(Waddell C.S.和Craig N.L.,Genes Dev.(1988)2月；2(2):137-49.)；核酸序列的基因组整合方法，其中重组由噬菌体λ的Red重组酶功能或Rac原噬菌体的RecE/RecT重组酶功能介导(Murphy，J Bacteriol.(1998)；180(8):2063-7；Zhang等人，NatureGenetics(1998)20:123-128；Muyrers等人，EMBO Rep.(2000)1(3):239-243)；基于Red/ET重组的方法(Wenzel等人，Chem Biol.(2005)，12(3):349-56；Vetcher等人，《应用环境微生物学》，(2005)；71(4):1829-35)；或阳性克隆，即携带表达盒的克隆，可以例如通过标记基因或基因功能的丧失或获得来选择。
在一个或多个示例性实施方式中，本发明涉及如SEQ ID NO:23、24、25或27所示的一个或更多个重组核酸序列。
特别地，本发明涉及一个或多个重组核酸序列和/或其功能同源物，其具有与SEQID NO:23、24、25或27具有至少70％同一性的序列，例如至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性或100％同一性。
序列同一性
本文使用的术语“序列同一性”描述了两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性，即候选序列(例如，本发明的序列)和参考序列(例如现有技术序列)基于它们的成对比对。为了本发明的目的，使用在EMBOSS包的Needle程序(EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite,Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277)，优选是5.0.0或更高版本(可在https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss needle/获得)中实现的Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mo/.Biol.48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是10的间隔开放惩罚、0.5的间隔扩展惩罚和EBLOSUM62(30BLOSUM62的EMBOSS版本)替代矩阵。标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作同一性百分比，其计算方法如下：(相同残基数x 100)/(对齐长度-对齐间隔总数)。
为了本发明的目的，使用在EMBOSS包的Needle程序(EMBOSS:the EuropeanMolecular Biology Open Software Suite，Rice等人，2000，Trends Genet.16:276-277)，优选是5.0.0或更高版本中实现的Needleman Wunsch算法(Needlemman and Wunsch，1970，同上)来确定两个核苷酸序列之间的序列同一性。使用的参数是10的间隔开放惩罚、0.5的间隔扩展惩罚和DNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替代矩阵。标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作同一性百分比，计算如下：(相同的脱氧核糖核苷酸x100)/(对齐长度-对齐间隔总数)。
功能同系物
如本文所述的蛋白质/核酸序列的功能同系物或功能变体是具有遗传密码改变的蛋白质/氨基酸序列，其保留其原始功能。功能同系物可以通过诱变获得，也可以是来自相同或其它物种的天然变体。与蛋白质/核酸序列的功能性相比，功能同系物应具有至少50％的剩余功能性，例如至少60％、70％、80％、90％或100％。
所公开的氨基酸或核酸序列中的任何一个的功能同系物也可以具有更高的功能性。就增加的HMO产量、将HMO产物输出细胞或输入用于HMO生产的例如乳糖的底物、提高的纯度/副产物形成、生物质形成的减少、基因工程细胞的活力、根据本发明的基因工程细胞健壮性(robustness)或生产所需的消耗品的减少而言，表1中所示的氨基酸序列中的任何一个的功能同系物或编码表4中任何一个序列的重组核酸理想地应该能够参与唾液酸化HMO的生产。
基因修饰细胞的用途
本发明还涉及本文公开的基因修饰细胞或核酸构建体的任何商业用途，例如但不限于，用于生产唾液酸化人乳寡糖(HMO)的方法中。
在示例性实施方式中，根据本发明的基因修饰细胞和/或核酸构建体用于HMO的制造。
在一个示例性实施方式中，根据本发明的基因修饰细胞和/或核酸构建体用于制造一种或多种唾液酸化HMO，其中唾液酸化HMO是3’SL、FSL、DSLNT和LST-a。
这些HMO的产生可能需要存在两种或多种糖基转移酶活性。
在一个或多个实施方式中，基因工程细胞和/或核酸构建体用于制造3’SL。优选地，3’SL是唯一制造的HMO。
一种生产唾液酸化人乳寡糖(HMO)的方法
本发明还涉及生产唾液酸化人乳寡糖(HMO)的方法，所述方法包括培养根据本发明的基因修饰细胞。本发明的实施例1鉴定了异源α-2,3-唾液酸转移酶Clari1、Neigon、Poral和PmN(分别为SEQ ID NO:1、2、3和4)，当在生产菌株中表达产生3’SL时，与Nstα-2,3-唾液酸转移酶相比，其表现出稳定的生长。
本发明涉及一种生产人乳寡糖(HMO)的方法，特别是生产3’SL。特别是在没有其它HMO存在的情况下的3’SL。
本发明还涉及生产人乳寡糖(HMO)的方法，其中所产生的3’SL的量比通过包括使用表达α-2,3-唾液酸转移酶Nst(SEQ ID NO:5)(当Nst的表达通过Plac启动子调节时)的基因修饰细胞的方法产生的3’SL的量高至少5％，例如至少10％、例如至少15％或例如至少20％。
本发明还涉及一种生产人乳寡糖(HMO)的方法，其中所产生的3’SL的量比通过包括使用表达α-2,3-唾液酸转移酶PM70(当PM70的表达通过Plac或PglpF启动子调节时)的基因修饰细胞的方法产生的3’SL的量高至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％或例如至少25％。
因此，本发明涉及一种生产唾液酸化人乳寡糖(HMO)的方法，所述方法包括培养包含编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列的基因修饰细胞，其中所述酶选自：
a.Clari1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成，
b.Neigon，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成，
c.Poral，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成，以及
d.PmN，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在进一步的实施方式中，基因修饰细胞包括至少一种根据本发明的额外修饰。
在一个或多个示例性实施方式中，本发明的α-2,3-唾液酸转移酶受表2中公开的PglpF、PglpA_70UTR、PglpT_70UTR、Plac_70UTR或PmglB_70UTR启动子或其变体的控制。优选地，唾液酸转移酶受重组启动子的控制，重组启动子选自SEQ ID NO 13、18、19、20、21、22、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51。因此，在一个示例性实施方式中，本发明的α-2,3-唾液酸转移酶在表2中公开的PglpF启动子或其变体的控制下。在另一个示例性实施方式中，本发明的α-2,3-唾液酸转移酶在表2中公开的PmglB_70UTR启动子或其变体的控制下。
进一步的基因修饰可以例如选自包含额外的糖基转移酶和/或代谢通路工程，以及包含MFS转运蛋白，如以上章节所述，本领域技术人员将知道如何将其结合成能够产生一种或多种唾液酸化HMO的基因修饰细胞。
该方法特别包括培养产生唾液酸化HMO，特别是唾液酸化HMO3’SL的基因修饰细胞。
该方法包括培养产生唾液酸化HMO的基因修饰细胞，并且进一步包括在选自葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖和甘油的能量源(碳源)存在下培养所述基因修饰细胞。
在一个方面，根据本发明的方法产生唾液酸化人乳寡糖(HMO)，如3’SL、FSL、DSLNT和/或LST-a。
在一个方面，根据本发明的方法产生3’SL作为唯一HMO。
为了能够在根据本发明的方法中生产唾液酸化HMO，基因修饰细胞可以包含用于制备唾液酸糖核苷酸的生物合成通路，或者可以在细胞培养期间添加唾液酸。
在本发明方法的优选实施方式中，基因修饰细胞包含用于制备唾液酸糖核苷酸的生物合成通路。优选地，在本发明的方法中，唾液酸糖核苷酸是CMP-Neu5Ac。因此，在本发明的方法中，糖核苷酸通路由基因修饰细胞表达，其中CMP-Neu5Ac通路由来自空肠弯曲杆菌的SEQ ID NO:35的neuBCA操纵子编码。在本发明的方法中，唾液酸糖核苷酸通路由携带neuBCA操纵子的高拷贝质粒编码。
本发明的方法包括提供糖基供体，其由一个或多个基因工程细胞单独合成和/或从替代来源外源添加到培养基中。
在一个方面，本发明的方法还包括提供受体糖作为HMO形成的底物，受体糖包含至少两个单糖单元，其外源添加到培养基中和/或通过单独的微生物发酵产生。
在一个方面，本发明的方法包括提供包含至少两个单糖单元的受体糖，受体糖是外源添加到培养基中和/或通过单独的微生物发酵产生的，并且选自乳糖、LNT-II和LNT，优选乳糖。在优选的实施方式中，用于HMO形成的底物是乳糖。
唾液酸化人乳寡糖(HMO)从培养基和/或基因修饰细胞中回收。
特别地，本发明涉及一种生产唾液酸化HMO的方法，所述方法包括：
a)获得基因修饰细胞，其包含
i.优选在PglpF启动子控制下的重组核酸序列，其编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶，其中所述酶选自：Clari1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成；Neigon，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成；Poral，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成；和PmN，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成；
ii.任选地编码异源β-1,3-半乳糖基转移酶，例如来自幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)的GalTK的核酸序列，优选在PglpF启动子的控制下，
iii.任选地，编码β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶，例如来自脑膜炎奈瑟菌的LgtA的核酸序列，优选在PglpF启动子的控制下，和
iv.任选编码MFS转运蛋白，例如但不限于Fred、Nec和/或YberC的核酸序列，优选在PglpF或Plac启动子的控制下，和
b)在含碳源的培养基中并在乳糖存在下培养所述基因修饰细胞，以及
c)通过所述基因修饰细胞生产所述唾液酸化人乳寡糖(HMO)，特别是3’SL和/或LST-a，以及
d)从培养基和/或基因修饰细胞中回收唾液酸化人乳寡糖(HMO)，特别是3’SL和/或LST-a。
特别地，本发明涉及一种生产3’SL的方法，所述方法包括：
a)获得基因修饰细胞，其包含
i.编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列，其中所述酶是Clari1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成，以及
ii.编码MFS转运蛋白，例如但不限于Fred、Nec和/或YberC的核酸序列，优选在PglpF或Plac启动子的控制下，和
b)在含碳源的培养基中并在乳糖存在下培养所述基因修饰细胞，以及
c)通过所述基因修饰细胞生产所述唾液酸化人乳寡糖(HMO)，特别是3’SL，以及
d)从培养基和/或基因修饰细胞中回收唾液酸化人乳寡糖(HMO)，特别是3’SL。
特别地，本发明涉及一种生产3’SL的方法，所述方法包括：
a)获得基因修饰细胞，其包含
i.编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列，其中所述酶是Neigon，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成，以及
ii.编码MFS转运蛋白，例如但不限于Fred、Nec和/或YberC的核酸序列，优选在PglpF或Plac启动子的控制下，和
b)在含碳源的培养基中并在乳糖存在下培养所述基因修饰细胞，以及
c)通过所述基因修饰细胞产生3’SL，以及
d)从培养基和/或所述基因修饰细胞中回收3’SL。
特别地，本发明涉及一种生产3’SL的方法，所述方法包括：
a)获得基因修饰细胞，其包含
i.编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列，其中所述酶是Poral，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成，以及
ii.编码MFS转运蛋白，例如但不限于Fred、Nec和/或YberC的核酸序列，优选在PglpF或Plac启动子的控制下，和
b)在含碳源的培养基中并在乳糖存在下培养所述基因修饰细胞，以及
c)通过所述基因修饰细胞产生3’SL，以及
d)从培养基和/或基因修饰细胞中回收3’SL。
特别地，本发明涉及一种生产3’SL的方法，所述方法包括：
a)获得基因修饰细胞，其包含
i.编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列，其中所述酶是PmN，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％或例如至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成，以及
ii.编码MFS转运蛋白，例如但不限于Fred、Nec和/或YberC的核酸序列，优选在PglpF或Plac启动子的控制下，和
b)在含碳源的培养基中并在乳糖存在下培养所述基因修饰细胞，以及
c)通过所述基因修饰细胞产生3’SL，以及
d)从培养基和/或所述基因修饰细胞中回收3’SL。
在受控生物反应器中培养或发酵(本文中可互换使用)通常包括(a)在由碳源确保的培养基中的指数细胞生长的第一阶段，和(b)在碳源限制下运行的培养基中的细胞生长的第二阶段，其中碳源与受体寡糖(例如乳糖)一起连续添加，允许在该阶段形成HMO产物。碳(糖)限制是指发酵过程中的一个阶段，其中生长速率由培养液中碳源(糖)的浓度动态控制，而培养液中的碳源浓度又由向发酵罐添加碳的速率(糖进料速率)决定。
微生物菌株在大规模生产时的稳定性对于获得高产率和产物形成的成功发酵至关重要。大规模发酵过程中的许多因素会导致细胞受到压力，并可能降低代谢活性或诱导代谢变化，形成有毒副产物，如乙酸和甲酸，从而导致过早停止发酵。大规模发酵过程中的不完美混合会产生气体和碳源等梯度，细胞必须能够承受这些梯度。引入到细胞中以产生所需产物的异源基因的不平衡表达可诱导毒性，该毒性可降低细胞的最大生长速率，进而可触发副产物的形成，特别是当暴露于碳源梯度时。关于SEQ ID NO:5的Nstα-2,3-唾液酸转移酶在基因修饰细胞(Nst菌株)中的过表达以产生3’SL，本发明人观察到，如果碳源限制阶段的生长速率变得过高，则该菌株不太稳定。期望具有在更宽的生长速率范围内以及在暴露于梯度时表现出稳定生长的菌株。与Nst菌株相比，表达本发明的α-2,3-唾液酸转移酶的菌株更灵活，并且能够应对更具挑战性的进料情况，其中使用碳源的更高的比进料速率来产生更高的体积生产率。此外，细胞还能够更好地承受模拟大规模发酵的糖梯度的糖供给曲线的脉冲版本。本发明的基因修饰细胞的稳定性可以使用方法部分中描述的“生长稳定性测试”和“应力测试”与Nst菌株的稳定性进行比较。
术语“制造”或“制造规模”或“大规模生产”或“大规模发酵”可互换使用，并且在本发明的含义中定义了最小体积为100L的发酵，例如1000L，例如10,000L，例如100,000L，例如200,000L培养液。通常，“制造规模”工艺的定义是能够处理大量产生的目的HMO产物，例如，在治疗化合物或组合物的情况下，满足毒性试验、临床试验以及市场供应的需求。除了体积大之外，与摇瓶培养等简单的实验室规模方法相比，制造规模方法的特点是使用生物反应器(发酵罐)的技术体系，该生物反应器配备有用于搅拌、曝气、营养物进料、监测和控制过程参数(pH、温度、溶解氧张力、背压等)的装置，在很大程度上，实验室规模方法中的表达体系的行为，例如本发明的实例中描述的摇瓶、台式生物反应器或深井格式，允许预测该体系在生物反应器的复杂环境中的行为。
关于发酵过程中使用的合适的细胞培养基，没有限制。培养基可以是半限定的，即含有复合培养基化合物(例如酵母回收物、大豆蛋白胨、酪蛋白氨基酸等)，或者可以是化学限定的，不含任何复合化合物。碳源可以选自葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖和甘油。在一个或多个示例性实施方式中，培养基补充有一种或多种选自甘油、蔗糖和葡萄糖的能量和碳源。
在一个或多个示例性实施方式中，培养基包含蔗糖作为唯一的碳和能量源。在一个或多个示例性实施方式中，基因工程细胞包含编码一种或多种异源多肽的一种或多种异源核酸序列，该异源多肽能够利用蔗糖作为所述基因工程细胞的唯一碳源和能量源。
在一个或多个示例性实施方式中，基因工程细胞包括PTS依赖性蔗糖利用体系，进一步包括如WO2015/197082(并入本文以供参考)中所述的scrYA和scrBR操纵子。
在实施本发明的方法之后，可以以常规方式从细胞培养物或发酵液中收集所产生的唾液酸化HMO。
回收/收获
唾液酸化人乳寡糖(HMO)从培养基和/或基因修饰细胞中回收。在本上下文中，术语“回收”与术语“收获”可互换使用。本文中的“回收”和“收获”都涉及在发酵结束后从培养物/培养液中收集产生的HMO。在一个或多个示例性实施方式中，其可包括收集包括在生物质(即宿主细胞)和培养基两者中的HMO，即在发酵液与生物质分离之前/不分离之前。在其它实施方式中，所产生的HMO可与生物质和发酵液分开收集，即，在生物质与培养基(即发酵液)分离之后/以后。
从培养基中分离细胞可以用本领域技术人员公知的任何方法进行，例如任何合适类型的离心或过滤。从培养基中分离细胞可在收获发酵液后立即进行，或在适当条件下储存发酵液后的稍后阶段进行。从剩余生物质(或总发酵液)中回收产生的HMO包括从生物质(即生产细胞)中回收HMO。
发酵回收后，HMO可用于进一步加工和纯化。
HMO可以根据本领域已知的方法纯化，例如，如WO2017/182965或WO2017/152918中所述，其中后者描述了唾液酸化HMO的纯化。纯化的HMO可以用作营养品、药物或任何其它用途，例如用于研究。
在培养结束时，寡糖作为产物可以在细胞内和细胞外基质中积累。
根据本发明的方法包括在培养基中培养基因工程微生物细胞，该培养基被设计为支持微生物的生长，并且含有一种或多种碳水化合物源或仅仅碳源，例如选自葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖和甘油。在一个或多个示例性实施方式中，培养基补充有一种或多种选自甘油、蔗糖和葡萄糖的能量源和碳源。
制造的产物
根据基因工程细胞或核酸构建体的用途，术语“制造的产物”是指一种或多种HMO，用作一种或多种产物HMO。各种产物如上所述。
有利地，本文公开的方法提供了降低的副产物与产物比率和提高的产物(和/或所有HMO)的总产量。这减少了与产物形成相关的副产物形成，有利于提高产物产量，提高了生产和产物回收过程的效率，提供了HMO的优良制造工艺。
制造的产物可以是包含一种或多种HMO的粉末、组合物、悬浮液或凝胶。
序列
当前申请包含文本格式和电子格式的序列表，其并入本文以供参考。
本申请中使用的SEQ ID NO的概述可在表1(α-2,3-唾液酸转移酶蛋白序列)、表2(启动子序列)和表4(α-2,3-唾液酸转移酶DNA序列)中找到，本申请中描述的其它序列是编码来自空肠弯曲杆菌neuBCA操纵子(SEQ ID NO:35)、来自脑膜炎奈瑟菌的β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶LgtA(SEQ ID NO:36)、来自幽门螺杆菌的β-1,3-半乳糖基转移酶galTK(SEQID NO:37)和MFS转运蛋白序列Nec(SEQ ID NO:38)、YberC(SEQ ID NO:39)和Fred(SEQ IDNO:40)的DNA序列。
实施方式
在以下条目中描述了本发明的各种实施方式：
1.一种基因修饰细胞，其包含编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列，其中所述酶选自包括以下的唾液酸转移酶：
a.Poral，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，
b.Clari1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，
c.PmN，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，以及
d.Neigon，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，
其中所述细胞产生唾液酸化HMO。
2.根据条目1的基因修饰细胞，其中唾液酸化HMO选自3’SL、FSL、DSLNT和LST-a。
3.根据条目1或2中任一项的基因修饰细胞，其中唾液酸化HMO为3’SL。
4.根据前述条目中任一项的基因修饰细胞，其中3’SL是由基因修饰细胞产生的唯一HMO。
5.根据前述条目中任一项的基因修饰细胞，其中编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的核酸序列受选自PglpF、PglpA_70UTR、PglpT_70UTR、Plac_70UTR、PmglB_70UTR及其变体的启动子的控制，该启动子具有根据SEQ ID NO 12-22或41-54的核酸序列，优选选自SEQ ID NO 13、18、19、20、21、22、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51。
6.根据前述条目中任一项的基因修饰细胞，其中细胞还包含一种或多种核酸序列，其编码一种或多种糖基转移酶，该糖基转移酶选自β-1,3-半乳糖基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶和β-1,3-N-乙酰基葡糖胺基转移酶。
7.根据前述条目中任一项的基因修饰细胞，其中细胞进一步包含编码MFS转运蛋白的核酸序列，该MFS转运蛋白能够将唾液酸化HMO输出到细胞外基质中。
8.根据条目7的基因修饰细胞，其中MFS转运蛋白是Fred、YberC或Nec蛋白。
9.根据前述条目中任一项的基因修饰细胞，其中细胞包含用于制备唾液酸糖核苷酸的生物合成通路。
10.根据条目9的基因修饰细胞，其中唾液酸糖核苷酸是CMP-Neu5Ac，并且所述唾液酸糖核苷酸通路由编码来自空肠弯曲杆菌的NeuBCA的核酸序列(SEQ ID NO:35)编码。
11.根据条目9或10的基因修饰细胞，其中唾液酸糖核苷酸通路由携带neuBCA操纵子的高拷贝质粒编码。
12.根据前述条目中任一项的基因修饰细胞，其中所述修饰细胞是微生物。
13.根据前述条目中任一项的基因修饰细胞，其中所述修饰细胞是细菌或真菌。
14.根据条目13的基因修饰细胞，其中所述真菌选自驹形氏酵母属(Komagataella)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶鲁维亚酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或汉逊酵母属(Hansenula)的酵母细胞，或选自曲霉属(Aspargillus)、镰刀菌属(Fusarium)或木霉菌属(Thricoderma)的丝状真菌。
15.根据条目13的基因修饰细胞，其中所述细菌选自埃希氏杆菌属(Escherichiasp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、乳酸杆菌属(lactobacillus sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)和弯曲杆菌属(Campylobacter sp.)。
16.根据条目15的基因修饰细胞，其中所述细菌是大肠杆菌。
17.一种生产唾液酸化人乳寡糖(HMO)的方法，所述方法包括培养包含编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列的基因修饰细胞，其中所述酶选自：
a.Poral，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，
b.Clari1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，
c.PmN，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，以及
d.Neigon，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，
其中所述基因修饰细胞任选地包含至少一种根据条目4至9的额外修饰。
18.根据条目17的方法，其中所生产的唾液酸化人乳寡糖(HMO)是3’SL。
19.根据条目17或18的方法，其中3’SL是所生产的唯一人乳寡糖(HMO)。
20.根据条目17至19中任一项的方法，其中方法包括在选自葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖和甘油的碳源存在下培养基因工程细胞。
21.根据条目17至20中任一项的方法，其中在基因工程细胞的培养期间添加乳糖作为唾液酸化HMO形成的底物。
22.根据条目17至21中任一项的方法，其中唾液酸化人乳寡糖(HMO)从培养基和/或基因修饰细胞中回收。
23.一种核酸构建体，其包含编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列，其中所述重组核酸序列选自：
a.Poral，其包含SEQ ID NO:25的核酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的核酸序列或由其组成，
b.Clari1，其包含SEQ ID NO:23的核酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的核酸序列或由其组成，
c.PmN，其包含SEQ ID NO:26的核酸序列或与SEQ ID NO:26具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的核酸序列或由其组成，
d.Neigon，其包含SEQ ID NO:24的核酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的核酸序列或由其组成，
其中编码酶的序列受启动子序列的控制。
24.根据条目23的核酸构建体，其中启动子序列选自PglpF、PglpA_70UTR、PglpT_70UTR、Plac_70UTR和PmglB_70UTR及其变体，其具有根据SEQ ID NO 12-22或41-54的核酸序列，优选选自SEQ ID NO 13、18、19、20、21、22、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51。
25.根据条目23或24的核酸构建体在宿主细胞中用于产生唾液酸化HMO的用途。
26.根据条目1至16中任一项的基因修饰细胞在唾液酸化HMO生产中的用途。
实施例
方法
除非另有说明，否则分子生物学领域中已知的标准技术、载体、控制序列元件和其它表达体系元件用于核酸操作、转化和表达。这样的标准技术、载体和元件可以例如在以下文献中找到：Ausubel等人(著)，Current Protocols in Molecular Biology(1995)(JohnWiley&Sons)；Sambrook、Fritsch和Maniatis(著)，Molecular Cloning(1989)(冷泉港实验室出版社，纽约)；Berger&Kimmel，Methods in Enzymology 152:Guide to MolecularCloning Techniques(1987)(学术出版社)；Bukhari等人(著)，DNA Insertion Elements,Plasmids and Episomes(1977)(冷泉港实验室出版社，纽约)；Miller,J.H.Experimentsin molecular genetics(1972)(冷泉港实验室出版社，纽约)。
选择下面描述的实施方式来说明本发明，并且不以任何方式限制本发明。
酶：
使用已知的α-2,3-唾液酸转移酶作为查询，并利用比如科学文章或数据库(例如KEGG和CAZY数据库)的信息源，采用基于蛋白质BLAST搜索的电子选择方法收集18种酶。
表3.在本发明的框架内测试的酶的列表
菌株
本申请中构建的菌株(基因工程细胞)基于大肠杆菌K-12DH1，基因型为：F-、gyrA96、recA1、relA1、endA1、thi-1、hsdR17、supE44。对大肠杆菌K-12DH1菌株进行了额外的修饰，以生成具有以下修饰的MDO菌株：lacZ：缺失1.5kbp，lacA：缺失0.5kbp，nanKETA：缺失3.3kbp，melA：缺失0.9kbp，wcaJ：缺失0.5kbp，mdoH：缺失0.5kbp，以及在gmd基因上游插入Plac启动子。
将目的基因插入大肠杆菌基因组的方法是本领域技术人员熟知的。将基因盒插入大肠杆菌染色体可以使用具有特定选择标记基因和筛选方法的Gene gorging法(参见例如Herring和Blattner 2004 J.Bacteriol.186:2673-81和Warming等人2005Nucleic AcidsRes.33(4):e36)来完成。
编码单独的α-2,3-唾液酸转移酶的密码子优化的DNA序列被遗传整合到MDO菌株中。此外，在Plac启动子的控制下，用携带来自空肠弯曲杆菌的neuBCA操纵子(SEQ ID NO:35)的高拷贝质粒转化每种菌株。neuBCA操纵子编码形成活化的唾液酸糖核苷酸(CMP-Neu5Ac)所需的所有酶。CMP-Neu5Ac作为研究中的α-2,3-唾液酸转移酶促进的预期糖基转移酶反应的供体，即唾液酸从活化的糖CMP-Neu5Ac转移到乳糖(受体)的末端半乳糖，形成3’SL。
表4中提供了背景菌株(MDO)的基因型，以及能够产生3’SL作为唯一HMO的α-2,3-唾液酸转移酶表达菌株。
表4.本实施例中使用的能够产生3’SL的菌株的基因型。
*2,3-ST是α-2,3-唾液酸转移酶的缩写，该序列被插入宿主菌株的基因组中。
深孔试验
使用4天方案在96个深孔板中筛选菌株。在最初的24小时内，将预培养物生长到高密度，然后转移到能够诱导基因表达和产物形成的培养基中。更具体地，在第1天期间，使用补充有硫酸镁、硫胺素和葡萄糖的基础最低培养基制备新鲜预培养物。将预培养物在34℃和1000rpm摇动下孵育24小时，然后进一步转移到新的基础最低培养基(BMM，pH 7.5)中，开始主培养。新的BMM补充了硫酸镁、硫胺素、一团(bolus)20％葡萄糖溶液(50μl/100mL)和一团20％乳糖溶液(5ml/100mL)。此外，提供50％的蔗糖溶液作为碳源，同时添加蔗糖水解酶(转化酶)，从而以适合C-限制生长的速率释放葡萄糖。加入IPTG(50mg/ml)以诱导基因表达和氨苄青霉素抗生素(100mg/ml)。将主培养物在28℃和1000rpm摇动下孵育72小时。
生长稳定性试验
将大肠杆菌菌株在250mL发酵罐(Ambr 250Bioreactor system，Sartorius)中培养，从100mL矿物培养基开始，该矿物培养基由6.9g/L葡萄糖和由(NH4)2HPO4、KH2PO4、MgSO4x 7H2O、KOH、NaOH、微量元素溶液、消泡剂和硫胺素组成的矿物培养基组成。通过第一次搅拌和随后以700rpm(最高4500rpm)和1VVM(最高3VVM)开始的气流的级联，使溶解氧水平保持在20％。通过用8.5％的NH4OH溶液滴定将pH保持在6.8。从在类似的含葡萄糖培养基中生长的预培养物的2％(v/v)接种物开始培养。在耗尽分批培养基中所含的葡萄糖后，使用图2中所示的进料曲线，以0.192g葡萄糖/h的初始进料速率开始，连续进料含有49％(w/w)葡萄糖、MgSO4 x 7H2O、微量金属和消泡剂的进料溶液。温度最初为33℃，但在进料26小时后，温度在5小时内梯度下降至28℃(图x)。细胞的生长、代谢活性和状态随后是反射率和CO2释放速率的在线测量。
实施例1–体内3’SL合成
在使用乳糖作为初始底物时，筛选表达单独的α-2,3-唾液酸转移酶的基因修饰细胞，以确定其产生唾液酸化HMO(3’SL)的能力，作为唯一的HMO。
编制一组18种酶(表3)，用于测试当它们被引入产生活化的唾液酸(CMP-Neu5Ac)的基因修饰细胞中时合成3’SL的能力，其中细胞以乳糖作为HMO生产的底物。
如“方法”部分所述，产生了表达18种单独的α-2,3-唾液酸转移酶的基因修饰菌株(表3)。如“方法”部分所述，在补料分批深孔试验装置中筛选细胞。通过HPLC测量菌株产生的各个HMO的摩尔含量。
表4列出了产生3’SL作为唯一HMO的13种菌株的基因型。
Nst是用于产生3’SL的已知酶，在本实施例中用作阳性对照。产生了两种在PglpF或Plac启动子控制下表达Nst的菌株，其中与在PglpF启动子控制之下表达Nst(比Plac强10倍)的菌株相比，在Plac启动子控制之下表达Nst的菌株具有更好的生长，如培养结束时细胞的光密度所示(表5)。因此，Nst_Plac被用作参考。
产生3’SL的细胞的结果在表5中显示为与Nst_Plac菌株相比的3’SL量(摩尔含量，mM)(百分比，％)。3’SL是该菌株产生的唯一HMO。
表5：相对于Nst_Plac菌株产生的3’SL摩尔含量(mM)，每种菌株产生的3’SL摩尔含量(mM)，以及培养结束时观察到的光密度。
| 菌株号 | 3’SL相对％ | 光密度 |
| MDO | 0.0 | 5.1 |
| Clari1 | 115.5 | 4.1 |
| Neigon | 113.3 | 4.3 |
| Poral | 105.0 | 4.4 |
| Nst_Plac | 100.0 | 4.3 |
| PmN | 98.9 | 4.6 |
| PM70 | 95.6 | 4.2 |
| Pmult | 94.2 | 4.8 |
| Avi | 93.1 | 4.5 |
| MhnN | 68.8 | 4.7 |
| Csub1 | 53.5 | 3.7 |
| Ccol | 36.6 | 5.0 |
| CstI | 31.2 | 3.9 |
| Nst_PglpF | 105.8 | 3.7 |
从表5中给出的数据可以看出，有3种酶(Clari1、Neigon和Poral)可以在比Nst_Plac菌株形成的3’SL水平高至少5％的水平上形成3’SL，而酶PmN产生与Nst_Plac菌株类似的3’SL水平。这些水平也高于CstI和PM70(在现有技术中已知形成3’SL)产生的3’SL的量。这些菌株产生的3’SL的相对量如图1所示。
在深孔试验装置中，细菌细胞由于欠理想的氧合作用而产生酸，特别是在实验结束时，培养物达到了更高的光密度。尽管这些酸的形成程度会影响最终的光密度，但孵育结束时的光密度可以作为细胞如何处理异源α-2,3-唾液酸转移酶的指标，密度越高，生长越好。基于此，可以看出PmN比Nst_Plac菌株具有更优化的生长，表明该菌株耐受PmNα-2,3唾液酸转移酶比Nstα-2,3-唾液酸转移酶更好，这进一步得到了Nst_PglpF菌株显著减少的生长的支持，其中Nst在更强的启动子的控制下，因此在更高的水平上表达。
当受强启动子PglpF控制时，菌株对α-2,3-唾液酸转移酶Clari1、Neigon、Poral和PmN的表达具有良好的耐受性，并且与具有类似生长曲线的Nst_Plac菌株相比，产生更多或同等数量的3’SL。
实施例2–表达α-2,3-唾液酸转移酶的菌株的生长稳定性
当扩大3’SL的生产规模时，表达α-2,3-唾液酸转移酶的菌株的健壮性是重要的。在本实施例中，将实施例1中表现最好的菌株(表达Clari1或Poral的菌株)的生长与在PglpF或Plac启动子控制下表达Nst的菌株进行比较。
根据“材料”一节中描述的生长稳定性试验对菌株进行发酵。
在发酵期间记录的二氧化碳释放速率(CER)反映了细胞在发酵期间产生CO2的速率，并且基本上是菌株代谢的量度。如果CER下降，则表明细胞代谢发生变化。在生长稳定性测试中，进料开始于高葡萄糖进料速率，然后在25小时左右显著降低(图2)。图3A显示发酵过程中测得的CER，并显示所有菌株在图2所示的进料曲线变化后CER都有所下降。本发明的具有α-2,3-唾液酸转移酶Clari1(虚线)和Poral(虚线)的菌株均在35小时CER初始下降后恢复，而具有Plac启动子(粗线)和PglpF启动子(细实线)的Nst菌株并未恢复。
在Ambr 250生物反应器体系中发酵期间测量的反射率是反应器中生物量的间接测量，通常在整个发酵过程中持续增加。图3B显示了与图3A所示相同发酵的反射率，这里也很清楚，表达α-2,3-唾液酸转移酶Poral和Clari1的菌株在进料曲线变化后保持生长能力，而两个Nst菌株停止生长。
Claims (26)
1.一种基因修饰细胞，其包含编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列，其中所述酶选自以下的唾液酸转移酶：
a.Poral，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，
b.Clari1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，
c.PmN，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，和
d.Neigon，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，
其中所述细胞产生唾液酸化HMO。
2.根据权利要求1所述的基因修饰细胞，其中所述唾液酸化HMO选自3’SL、FSL、DSLNT和LST-a。
3.根据权利要求1或2所述的基因修饰细胞，其中所述唾液酸化HMO为3’SL。
4.根据前述权利要求中任一项所述的基因修饰细胞，其中3’SL是由所述基因修饰细胞产生的唯一HMO。
5.根据前述权利要求中任一项所述的基因修饰细胞，其中所述编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的核酸序列受选自PglpF、PglpA_70UTR、PglpT_70UTR、Plac_70UTR、PmglB_70UTR及其变体的启动子的控制，所述启动子具有根据SEQ ID NO 12-22或41-54的核酸序列，优选选自SEQ ID NO 13、18、19、20、21、22、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51。
6.根据前述权利要求中任一项所述的基因修饰细胞，其中所述细胞还包含一种或多种核酸序列，其编码一种或多种糖基转移酶，所述糖基转移酶选自β-1,3-半乳糖基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶和β-1,3-N-乙酰基-葡糖胺基-转移酶。
7.根据前述权利要求中任一项所述的基因修饰细胞，其中所述细胞还包含编码MFS转运蛋白的核酸序列，所述MFS转运蛋白能够将唾液酸化HMO输出到细胞外基质中。
8.根据权利要求6所述的基因修饰细胞，其中所述MFS转运蛋白是Fred、YberC或Nec蛋白。
9.根据前述权利要求中任一项所述的基因修饰细胞，其中所述细胞包含用于制备唾液酸糖核苷酸的生物合成通路。
10.根据权利要求9所述的基因修饰细胞，其中所述唾液酸糖核苷酸是CMP-Neu5Ac，并且所述唾液酸糖核苷酸通路由编码来自空肠弯曲杆菌Campylobacter jejuni的NeuBCA的核酸序列(SEQ ID NO:35)编码。
11.根据权利要求9或10所述的基因修饰细胞，其中所述唾液酸糖核苷酸通路由携带neuBCA操纵子的高拷贝质粒编码。
12.根据前述权利要求中任一项所述的基因修饰细胞，其中所述修饰细胞是微生物。
13.根据前述权利要求中任一项所述的基因修饰细胞，其中所述修饰细胞是细菌或真菌。
14.根据权利要求13所述的基因修饰细胞，其中所述真菌选自驹形氏酵母属Komagataella、克鲁维酵母属Kluyveromyces、耶鲁维亚酵母属Yarrowia、毕赤酵母属Pichia、酵母菌属Saccharomyces、裂殖酵母属Schizosaccharomyces或汉逊酵母属Hansenula的酵母细胞，或选自曲霉属Aspargillus、镰刀菌属Fusarium或木霉菌属Thricoderma的丝状真菌。
15.根据权利要求13所述的基因修饰细胞，其中所述细菌选自埃希氏杆菌属Escherichia sp.、芽孢杆菌属Bacillus sp.、乳酸杆菌属lactobacillus sp.、棒状杆菌属Corynebacterium sp.和弯曲杆菌属Campylobacter sp.。
16.根据权利要求15所述的基因修饰细胞，其中所述细菌是大肠杆菌E.coli。
17.一种生产唾液酸化人乳寡糖HMO的方法，所述方法包括培养包含编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列的基因修饰细胞，其中所述酶选自：
a.Poral，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，
b.Clari1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，
c.PmN，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，和
d.Neigon，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，
其中所述基因修饰细胞任选地包含至少一种根据权利要求4-9所述基因修饰细胞的额外修饰。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所生产的所述唾液酸化人乳寡糖HMO是3’SL。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中3’SL是所生产的唯一人乳寡糖HMO。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述方法包括在选自葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖和甘油的碳源存在下培养所述基因修饰细胞。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的方法，其中在所述基因修饰细胞的培养期间添加乳糖作为唾液酸化HMO形成的底物。
22.根据权利要求17-21中任一项所述的方法，其中所述唾液酸化人乳寡糖HMO从培养基和/或所述基因修饰细胞中回收。
23.一种核酸构建体，其包含编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列，其中所述重组核酸序列选自：
a.Poral，其包含SEQ ID NO:25的核酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的核酸序列或由其组成，
b.Clari1，其包含SEQ ID NO:23的核酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的核酸序列或由其组成，
c.PmN，其包含SEQ ID NO:26的核酸序列或与SEQ ID NO:26具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的核酸序列或由其组成，
d.Neigon，其包含SEQ ID NO:24的核酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的核酸序列或由其组成，
其中所述编码酶的序列受启动子序列的控制。
24.根据权利要求23所述的核酸构建体，其中所述启动子序列选自PglpF、PglpA_70UTR、PglpT_70UTR、Plac_70UTR、PmglB_70UTR及其变体，其具有根据SEQ ID NO 12-22或41-54的核酸序列，优选选自SEQ ID NO 13、18、19、20、21、22、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51。
25.根据权利要求23或24所述的核酸构建体在宿主细胞中用于产生唾液酸化HMO的用途。
26.根据权利要求1-16中任一项所述的基因修饰细胞在唾液酸化HMO生产中的用途。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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