DE202017007249U1 - Abtrennung von Oligosacchariden aus der Fermentationsbrühe - Google Patents

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Abstract

Ein festes sialyliertes Oligosaccharid, wobei das feste sialylierte Oligosaccharid ein sprühgetrocknetes oder kristallines saures Humanmilch-Oligosaccharid ist, das aus 6'-Sialylylactose (6'-SL) ausgewählt ist, 3-Fucosyl-3'-sialyllactose (FSL), LST a, Fucosyl-LST a (FLST a), LST b, Fucosyl-LST b (FLST b), LST c, Fucosyl-LST c (FLST c), Sialyl-LNH (SLNH), Sialyl-Lacto-N-hexaose (SLNH), Sialyllacto-N-neohexaose I (SLNH-I), Sialyllacto-N-neohexaose II (SLNH-II) und Disialyllacto-N-tetraose (DS-LNT), wobei das sialylierte Oligosaccharid von einem genetisch modifizierten Mikroorganismus produziert wird, der in der Lage ist, das sialylierte Oligosaccharid aus einem internalisierten Kohlenhydratvorläufer zu produzieren und aus einer gereinigten Fermentationsbrühe erhalten wird.

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Isolierung und Reinigung von sialylierten Oligosacchariden aus einer Fermentationsbrühe, in der sie von einem Mikroorganismus produziert werden.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Während der letzten Jahrzehnte hat das Interesse an der Herstellung und Vermarktung von Humanmilch-Oligosacchariden (HMOs) stetig zugenommen. Die Bedeutung der Humanmilch-Oligosaccharide steht in direktem Zusammenhang mit ihren einzigartigen biologischen Aktivitäten. Sialylierte Humanmilch-Oligosaccharide, wie z.B. Disialyllacto-N-tetraose, 3'-O-Sialyl-3-O-Fucosyllactose, 6'-O-Sialylactose, 3'-O-Sialylactose, 6'-O-sialylierte Lacto-N-neotetraose und 3'-O-sialylierte Lacto-N-tetraose, gehören zu den Hauptbestandteilen der menschlichen Milch. In diesen sialylierten Oligosacchariden der menschlichen Milch ist der Sialinsäurerest immer mit der 3-O- und/oder 6-O-Position einer terminalen D-Galaktose oder mit der 6-O-Position eines nichtterminalen GlcNAc-Restes über α-glykosidische Bindungen verbunden. Man geht davon aus, dass sialylierte HMOs aufgrund ihrer Rolle bei der Unterstützung der Resistenz gegen Pathogene, der Darmreifung, der Immunfunktion und der kognitiven Entwicklung einen signifikanten gesundheitlichen Nutzen für das Neugeborene haben (ten Bruggencate et al. Nutr. Rev. 72, 377 (2014)).
  • Die Bemühungen um die Entwicklung von Verfahren zur Synthese von HMOs, einschließlich sialylierter HMOs, haben in den letzten zehn Jahren aufgrund ihrer Rolle in zahlreichen humanbiologischen Prozessen erheblich zugenommen. In diesem Zusammenhang wurden Verfahren entwickelt, um sie durch mikrobielle Fermentationen, enzymatische Prozesse, chemische Synthesen oder Kombinationen dieser Technologien herzustellen. Im Hinblick auf die Produktivität haben sich Fermentationsverfahren zur Herstellung von 3'-SL und 6'-SL im Labormaßstab als vielversprechend erwiesen.
  • Die Isolierung von sialylierten Laktosen oder sialylierten Oligosacchariden aus einer komplexen Matrix, wie z.B. einer Fermentationsbrühe, ist jedoch eine schwierige Aufgabe. Antoine et al. Angew. Chem. Int. Hrsg. 44, 1350 (2005) und US 2007/0020736 zeigten die Produktion von 3'-SL und begleitenden di- und trisialylierten Laktosen durch ein genetisch modifiziertes E. coli; die Brühe, die ca. 0.8 mM 3'-SL enthält, wurde wie folgt behandelt: Adsorption der Produkte aus dem zentrifugierten Überstand auf Holzkohle/Zellit, Auswaschen der wasserlöslichen Salze mit destilliertem Wasser, Elution der Verbindungen durch einen Wasser-Ethanol- Gradienten, Abtrennung der sialylierten Produkte auf einer Biogel-Säule und Entsalzung, was zu 49 mg 3'-SL aus 1 Liter Brühe führte. WO 01/04341 undPriem et al. Glykobiologie 12, 235 (2002) zeigten die Produktion von 3'-SL durch ein genetisch modifiziertes E. coli; 3'-SL wurde durch die folgende Sequenz von Operationen isoliert: Wärmepermeabilisierung der produzierenden Zellen mit anschließender Zentrifugation, Adsorption des Produkts aus dem Überstand auf Holzkohle/Celit, Auswaschen der wasserlöslichen Salze mit destilliertem Wasser, Elution der Verbindung mit einem Gradienten aus wässrigem Ethanol, Bindung der Verbindung an einen starken Anionenaustauscher in HCO3 --Form, Elution der Verbindung mit einem linearen Gradienten einer NaHCO3-Lösung, dann Eliminierung des Natriumbicarbonats mit einem Kationenaustauscher (in H+-Form), was zu isoliertem 3'-SL mit 49% Reinigungsausbeute führte. WO 2007/101862 und Fierfort et al. J. Biotechnol. 134, 261 (2008) zeigten ein alternatives Aufarbeitungsverfahren einer 3'-SL-Fermentationsbrühe auf, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Wärmepermeabilisierung der produzierenden Zelle, Zentrifugation, Einstellung des pH-Wertes des extrazellulären Mediums auf 3,0 durch Zugabe eines starken Kationenaustauscherharzes in saurer Form, Entfernung der ausgefallenen Proteine durch Zentrifugation, Einstellung des pH-Wertes des Überstandes auf 6.0 durch Zugabe eines schwachen Anionenaustauschers in basischer Form, Bindung der Sialyllactose an einen Anionenaustauscher in HCO3 --Form, nach Waschen mit destilliertem Wasser, Elution der Verbindung mit einem kontinuierlichen Gradienten einer NaHCO3-Lösung, Entfernung des Natriumbicarbonats mit einem Kationenaustauscher (in H+-Form) bis zum Erreichen des pH-Wertes von 3,0, dann Einstellung des pH-Wertes auf 6,0 mit NaOH. Die obige Reinigung ermöglichte die Isolierung von 15 g 3'-SL aus 1 Liter Brühe, die 25,5 g 3'-SL enthielt. Drouillard et al. Kohlenhydrate. Res. 345, 1394 (2010)) wandten das obige Verfahren von Fierfort auf eine Fermentationsbrühe an, die 6'-SL (11 g/l) und etwas 6,6'-Disalylactose (DSL) enthielt, und isolierten so 3,34 g 6'-SL + DSL im Verhältnis 155/86.
  • Die WO 2006/034225 beschreibt zwei alternative Aufreinigungen von 3'-SL aus einer produzierenden Fermentationsbrühe. Nach dem ersten Verfahren wurde das Lysat aus der Kultur mit destilliertem Wasser verdünnt und mit Aktivkohle/Celit gerührt. Die Aufschlämmung wurde mit Wasser gewaschen, dann wurde das Produkt aus der Aktivkohle/Zellit mit Ethanol eluiert. Nach der zweiten Methode wurden die Kulturzellen wärmebehandelt und die ausgefällten Feststoffe durch Zentrifugation vom Überstand abgetrennt. Der resultierende Überstand wurde durch einen Mikrofilter verarbeitet, das Permeat durch eine 10 kDa-Membran geleitet und anschließend nanofiltriert. Das resultierende Retentat wurde dann diafiltriert, um die endgültige Probe zu sammeln. Beide Reinigungsmethoden lieferten 90-100 mg 3'-SL aus 1 Liter Fermentationsbrühe.
  • Der Nachteil der oben genannten Sialyllactose-Reinigungsverfahren aus einer Fermentationskultur ist die geringe bis mäßige Reinigungsausbeute. Daher wurde nach einfacheren und/oder wirksameren Wegen zur Isolierung und Reinigung dieser Produkte aus Fermentationsbrühen im industriellen Maßstab gesucht.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung eines sialylierten Oligosaccharids aus einer Fermentationsbrühe, wobei das sialylierte Oligosaccharid durch Kultivierung eines genetisch modifizierten Mikroorganismus hergestellt wird, der in der Lage ist, das sialylierte Oligosaccharid aus einem internalisierten Kohlenhydratvorläufer zu produzieren, umfassend die folgenden Schritte:
    1. i) Ultrafiltration (UF), vorzugsweise zur Abtrennung der Biomasse aus der Brühe,
    2. ii) Nanofiltration (NF), vorzugsweise um das sialylierte Oligosaccharid in der Brühe zu konzentrieren und/oder einen anorganischen Salzgehalt der Brühe zu reduzieren,
    3. iii) optionale Behandlung mit Aktivkohle, vorzugsweise zur Entfärbung der Brühe, und
    4. iv) Behandlung der Brühe mit einem starken Anionen- und/oder Kationenaustauscherharz, vorzugsweise zur Entfernung von geladenen Materialien.
  • Vorzugsweise wird Schritt i) vor einem der Schritte ii), iii) und iv) durchgeführt. Die Schritte ii), iii) und iv) können in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden. Das sialylierte Oligosaccharid kann nach jedem der Schritte ii), iii) und iv) gesammelt werden.
  • Ebenfalls vorzugsweise wird das Verfahren in der folgenden Reihenfolge durchgeführt: Schritt i), Schritt ii), optionaler Schritt iii) und Schritt iv).
  • Eine Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Isolierung eines sialylierten Oligosaccharids aus einer Fermentationsbrühe, wobei das sialylierte Oligosaccharid durch Kultivierung eines genetisch modifizierten Mikroorganismus hergestellt wird, der in der Lage ist, das sialylierte Oligosaccharid aus einem internalisierten Kohlenhydratvorläufer zu produzieren, umfassend die folgenden Schritte:
    1. i) Ultrafiltration (UF) der Fermentationsbrühe und Auffangen des UF-Permeats (UFP),
    2. ii) Nanofiltration (NF) der UFP und das Sammeln des NF-Retentats (NFR),
    3. iii) optional die Behandlung der UFP und/oder NFR mit Aktivkohle und das Sammeln des Kohleeluats (CE), und
    4. iv) Behandlung der UFP, NFR und/oder CE mit einem starken Anionenaustauscherharz und/oder Kationenaustauscherharz.
  • Die Schritte iii) und iv) können in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Begriffe und Definitionen
  • Der Begriff „sialyliertes Oligosaccharid“ bezeichnet nach dieser Erfindung vorzugsweise ein Zuckerpolymer, das mindestens zwei Monosaccharideinheiten enthält, von denen mindestens eine eine Sialyl-(N-Acetylneuraminyl)-Einheit ist. Das sialylierte Oligosaccharid kann eine lineare oder verzweigte Struktur haben, die Monosaccharideinheiten enthält, die durch eine interglykosidische Bindung miteinander verbunden sind. Das sialylierte Oligosaccharid ist vorteilhafterweise ein saures Oligosaccharid aus menschlicher Milch.
  • Der Begriff „saures Humanmilch-Oligosaccharid“ oder „saures HMO“ bezeichnet vorzugsweise ein komplexes Kohlenhydrat, das in der menschlichen Muttermilch gefunden wird (Urashima et al.: Milk Oligosaccharides. Nova Science Publishers, 2011) mit einer Kernstruktur, die eine Laktoseeinheit am reduzierenden Ende ist, die durch eine oder mehrere β-N-Acetyl-Laktosaminyl- und/oder eine oder mehrere β-Lakto-N-Biosyl-Einheiten verlängert werden kann, und wobei die Kernstruktur durch eine α-N-Acetyl-Neuraminyl-(Sialyl)-Einheit substituiert ist und gegebenenfalls durch eine α-L-Fucopyranosyl-Einheit substituiert werden kann. In dieser Hinsicht haben die sauren HMOs mindestens einen Sialylrest in ihrer Struktur. Beispiele für saure HMOs sind 3'-Sialyl-Lactose (3'-SL), 6'-Sialyl-Lactose (6'-SL), 3-Fucosyl-3'-Sialyl-Lactose (FSL), LST a, Fucosyl-LST a (FLST a), LST b, Fucosyl-LST b (FLST b), LST c, Fucosyl-LST c (FLST c), Sialyl-LNH (SLNH), Sialyl-Lacto-N-hexaose (SLNH), Sialyl-Lacto-N-neohexaose I (SLNH-I), Sialyl-Lacto-N-neohexaose II (SLNH-II) und Disialyl-Lacto-N-tetraose (DS-LNT).
  • Der Begriff „genetisch veränderte Zelle“ oder „genetisch veränderter Mikroorganismus“ bezeichnet vorzugsweise eine Zelle eines Mikroorganismus, wie z.B. eine Bakterienzelle, z.B. eine E. coli-Zelle, in der mindestens eine Veränderung in ihrer DNA-Sequenz vorliegt. Die Veränderung kann zu einer Veränderung der ursprünglichen Eigenschaften der Wildtyp-Zelle führen, z.B. ist die veränderte Zelle in der Lage, eine zusätzliche chemische Transformation aufgrund des eingeführten neuen genetischen Materials durchzuführen, das für die Expression eines nicht in der Wildtyp-Zelle vorhandenen Enzyms kodiert, oder sie ist nicht in der Lage, eine Transformation wie den Abbau durch Entfernung von Genen/Genen (Knockout) durchzuführen. Eine genetisch veränderte Zelle kann auf konventionelle Weise mit gentechnischen Techniken hergestellt werden, die den Fachleuten bekannt sind.
  • Der Begriff „genetisch veränderter Mikroorganismus, der in der Lage ist, ein sialyliertes Oligosaccharid aus einem internalisierten Kohlenhydratvorläufer zu produzieren“ bezeichnet vorzugsweise eine Zelle eines Mikroorganismus, der genetisch so manipuliert ist (siehe oben), dass er ein rekombinantes Gen umfasst, das für eine Sialyltransferase kodiert, die für die Synthese des sialylierten Oligosaccharids notwendig ist, einen Biosyntheseweg zur Herstellung eines Sialinsäure-Nukleotid-Donors, der geeignet ist, durch die Glycosyltransferase auf einen KohlenhydratVorläufer (Akzeptor) übertragen zu werden, und einen Mechanismus zur Internalisierung eines Kohlenhydrat-Vorläufers (Akzeptor) aus dem Kulturmedium in die Zelle, wo er sialyliert wird, um das sialylierte Oligosaccharid von Interesse zu produzieren.
  • Der Begriff „etwa“ bedeutet in einer Ausführungsform ± 10 % Abweichung vom angegebenen Wert oder in einer anderen Ausführungsform ± 5 % Abweichung.
  • Verfahren zur Trennung von sialylierten Oligosacchariden
  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Abtrennung eines sialylierten Oligosaccharids/sialylierter Laktose von anderen Verbindungen, die in einer Fermentationsbrühe vorhanden sind, die durch die Kultivierung eines genetisch modifizierten Mikroorganismus erhalten wird, der in der Lage ist, das sialylierte Oligosaccharid/die sialylierte Laktose aus einem internalisierten Kohlenhydratvorläufer zu produzieren.
  • Das Verfahren umfasst die folgenden Trennungsschritte in beliebiger Reihenfolge:
    1. i) Ultrafiltration (UF),
    2. ii) Nanofiltration (NF),
    3. iii) optional die Behandlung mit Aktivkohle, und
    4. iv) Behandlung mit starkem Anionen- und/oder Kationenaustauscherharz.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren:
    1. i) Ultrafiltration (UF) der Fermentationsbrühe und Auffangen des Ultrafiltrationspermeats (UFP),
    2. ii) Nanofiltration (NF) der UFP und das Sammeln des Nanofiltrationsretentats (NFR),
    3. iii) optional, Aktivkohlebehandlung von UFP und/oder NFR und Sammeln des Kohleeluats (CE), und
    4. iv) Behandlung von UFP, NFR und/oder CE von (a) mit einem starken Anionen- und/oder Kationenaustauscherharz.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren:
    1. i) Ultrafiltration (UF) der Fermentationsbrühe und Auffangen des Ultrafiltrationspermeats (UFP),
    2. ii) Nanofiltration (NF) der UFP und das Sammeln des Nanofiltrationsretentats (NFR),
    3. iii) die Behandlung von UFP und/oder NFR mit starkem Anionen- und/oder Kationenaustauscherharz und das Sammeln des Harz-Eluats (RE), und
    4. iv) optional, Aktivkohlebehandlung von UFP, NFR und/oder RE und Sammeln des Kohleretentats.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren liefert eine mit dem sialylierten Oligosaccharid/der sialylierten Laktose hoch angereicherte Lösung, aus der das sialylierte Oligosaccharid/die sialylierte Laktose in hoher Ausbeute und vorzugsweise mit einer zufriedenstellenden Reinheit gewonnen werden kann.
  • Herstellung des sialylierten Oligosaccharids durch einen genetisch veränderten Mikroorganismus
  • Die Herstellung des sialylierten Oligosaccharids/der sialylierten Laktose durch Kultivierung einer genetisch veränderten Zelle erfolgt vorzugsweise auf folgende Weise. Ein exogen zugegebener Akzeptor wird aus dem Kulturmedium in die Zelle internalisiert, wo er in einer Reaktion, die eine enzymatische Sialylierung umfasst, in das Sialyloligosaccharid von Interesse umgewandelt wird. In einer Ausführungsform kann die Internalisierung über einen passiven Transportmechanismus erfolgen, bei dem der exogene Akzeptor passiv durch die Plasmamembran der Zelle diffundiert. Der Fluss wird durch den Konzentrationsunterschied im extra- und intrazellulären Raum in Bezug auf das zu internalisierende Akzeptormolekül gelenkt, das vom Ort der höheren Konzentration in die Zone der niedrigeren Konzentration, die zum Gleichgewicht tendiert, übergehen soll. In einer anderen Ausführungsform kann der exogene Akzeptor mit Hilfe eines aktiven Transportmechanismus in der Zelle internalisiert werden, wobei der exogene Akzeptor unter dem Einfluss eines Transportproteins oder einer Permease der Zelle durch die Plasmamembran der Zelle diffundiert. Lactosepermease (LacY) hat eine Spezifität gegenüber Mono- oder Disacchariden, die aus Galactose, N-Acetyl-Glucosamin, einem galactosylierten Monosaccharid (wie Lactose), einem N-Acetyl-glucosaminylierten Monosaccharid und glycosidischen Derivaten davon ausgewählt sind. All diese Kohlenhydrat-Derivate können von einer Zelle mit einer LacY-Permease durch einen aktiven Transport leicht aufgenommen werden und sich in der Zelle anreichern, bevor sie glykosyliert werden ( WO 01/04341 , Fort et al. J. Chem. Soc., Chem. Komm. 2558 (2005), EP-A-1911850 , WO 2013/182206 , WO 2014/048439 ). Der Grund dafür ist, dass die Zelle diese Kohlenhydratakzeptoren mit Hilfe ihrer LacY-Permease in die Zelle transportieren kann und der Zelle jegliche Enzyme fehlen, die diese Akzeptoren abbauen könnten, insbesondere LacZ. Die Spezifität gegenüber dem Zuckeranteil des zu internalisierenden Substrats kann durch Mutation mit Hilfe bekannter rekombinanter DNA-Techniken verändert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der exogen hinzugefügte Akzeptor Lactose, und seine Internalisierung erfolgt über einen aktiven Transportmechanismus, der durch eine Lactosepermease der Zelle, vorzugsweise LacY, vermittelt wird. Der in der Zelle internalisierte Akzeptor wird mittels einer Sialyltransferase sialyliert, die durch ein heterologes Gen oder eine heterologe Nukleinsäuresequenz exprimiert wird, die mit bekannten Techniken in die Zelle eingeführt wird, z.B. durch Integration in das Chromosom der Zelle oder durch Verwendung eines Expressionsvektors. Die genetisch modifizierte Zelle umfasst einen Biosyntheseweg zur Herstellung eines Sialinsäuremonosaccharid-Nukleotid-Donors (typischerweise CMP-Sialinsäure), der sich für den Transfer durch die entsprechende Sialyltransferase eignet. Die genetisch modifizierte Zelle kann auf zwei Arten CMP-Sialinsäure produzieren. Zum einen wird exogen zugegebene Sialinsäure aktiv oder passiv, vorzugsweise aktiv durch eine Sialinsäurepermease, bevorzugter durch die von nanT kodierte, internalisiert und anschließend durch eine CMP-NeuAc-Synthase, z.B. durch eine heterologe neuA kodiert, in CMP-Sialinsäure umgewandelt. Auf andere Weise wird die intern verfügbare UDP-GlcNAc genutzt, indem heterologe neuC, neuB und neuA exprimiert werden, die sie über ManNAc und Sialinsäure als Zwischenprodukte in CMP-Sialinsäure umwandeln. In der Zwischenzeit wird die katabolische Aktivität der Zelle auf Sialinsäure und deren Vorläufer durch Inaktivierung/Deletion des Aldolase-Gens (nanA) und/oder des ManNAc-Kinase-Gens (nanK) unterdrückt. Der internalisierte Kohlenhydratvorläufer kann Gegenstand einer anderen Glykosylierung als der Sialylierung sein, z.B. einer N-Acetylglucosaminylierung, Galactosylierung und/oder Fucosylierung, bevor er wie oben beschrieben sialyliert wird.
  • Schritt i) der Abtrennung des sialylierten Oligosaccharids
  • Gemäß Schritt i) des Verfahrens wird die aus der Fermentation gewonnene Brühe einer Ultrafiltration unterzogen, vorzugsweise als erster Schritt. Die Fermentationsbrühe enthält neben dem produzierten sialylierten Oligosaccharid/ der sialylierten Lactose typischerweise die Biomasse der Zellen des verwendeten Mikroorganismus zusammen mit Proteinen, Proteinfragmenten, DNA, Endotoxinen, biogenen Aminen, anorganischen Salzen, nicht umgesetzten Kohlenhydratakzeptoren wie Lactose, zuckerähnlichen Nebenprodukten, Sialinsäure, Farbkörpern, etc. Der Ultrafiltrationsschritt besteht in der Abtrennung der Biomasse und vorzugsweise auch der hochmolekularen suspendierten Feststoffe von den löslichen Bestandteilen der Brühe, die die Ultrafiltrationsmembran im Permeat passieren. Dieses UF-Permeat (UFP) ist eine wässrige Lösung, die das produzierte sialylierte Oligosaccharid/die sialylierte Laktose enthält.
  • Jede herkömmliche Ultrafiltrationsmembran kann mit einem Molekulargewichtsgrenzwert (MWCO) zwischen etwa 1 und etwa 500 kDa verwendet werden, wie z.B. 10-250, 50-100, 200-500, 100-250, 1-100, 1-50, 10-25, 1-5 kDa, alle anderen geeigneten Teilbereiche. Das Membranmaterial kann eine Keramik oder ein synthetisches oder natürliches Polymer sein, z.B. Polysulfon, Polypropylen, Celluloseacetat oder Polymilchsäure. Der Ultrafiltrationsschritt kann im Dead-End- oder Cross-Flow-Modus angewendet werden. Dieser Schritt i) kann mehr als einen Ultrafiltrationsschritt unter Verwendung von Membranen mit unterschiedlichem MWCO umfassen, z.B. unter Verwendung von zwei Ultrafiltrationstrennungen, wobei die erste Membran einen höheren MWCO als die zweite Membran hat. Diese Anordnung kann eine bessere Trennwirksamkeit der Komponenten mit höherem Molekulargewicht der Brühe gewährleisten. Nach diesem Trennungsschritt enthält das Permeat Materialien, die ein geringeres Molekulargewicht als der MWCO der zweiten Membran haben, einschließlich des sialylierten Oligosaccharids/der sialylierten Laktose von Interesse.
  • In einer Ausführung wird die Fermentationsbrühe unter Verwendung einer Membran mit einem MWCO von 5-30 kDa, wie 10-25, 15 oder 20 kDa, ultrafiltriert.
  • Vorzugsweise wird der pH-Wert der in der UF-Stufe aufbereiteten Fermentationsbrühe auf etwa 4-5,5, z.B. etwa 5, eingestellt. Dieser pH-Bereich bietet eine bessere Leistung des UF-Schrittes und eine höhere Ausbeute bei der Rückgewinnung der sialylierten Oligosaccharide/sialylierten Laktose, wie bei den sialylierten Laktosen, da er die Umlagerung zu den entsprechenden Fruktose-Isomeren verhindert, insbesondere wenn die UF bei erhöhter Temperatur (s.u.) durchgeführt wird, und zusätzlich die anorganische Ausfällung während der Konzentration verhindert.
  • In einer Ausführung geht dem Ultrafiltrationsschritt eine Verdünnung der Fermentationsbrühe voraus. Der UF-Schritt wird so durchgeführt, dass der Konzentrationsgrad (Konzentrationsfaktor, CF1) mindestens 1,25, besser noch mindestens 1,5 beträgt. Andererseits ist der CF1 vorteilhaft nicht mehr als 4, vorzugsweise nicht mehr als 3. Der Konzentrationsfaktor (CF1) in diesem UF-Schritt ist das Verhältnis des Volumens (oder der Masse) des Feeds (das dem der verdünnten Brühe entspricht) und des UF-Retentats (UFR). Wenn z.B. 50 kg Brühe auf 100 kg verdünnt wird, die verdünnte Brühe ultrafiltriert wird, und 40 kg Permeat und 60 kg Retentat gesammelt werden, beträgt der CF1 1,67. Beispielhafte CF1-Bereiche der UF-Stufe sind 1,25-4, 1,25-3, 1,25-2,25, 1,5-4, 1,5-3, 1,5-2,25, 1,25-2 oder 1,5-2. Der UFR kann optional mit geringen Wassermengen gewaschen werden. Im Allgemeinen wird dieser UF-Schritt, der eine Verdünnung der Brühe vor der Ultrafiltration und gegebenenfalls das Waschen des UFP mit Wasser umfasst, mit einem Verdünnungsfaktor (DF1) von 1-3,5 charakterisiert. Der DF1 wird in diesem Schritt als das Verhältnis des Gesamtvolumens (oder der Masse) des UFP, gegebenenfalls kombiniert mit Waschfiltrat, und dem der unverdünnten Fermentationsbrühe berechnet. Wenn z.B. 50 kg Brühe auf 100 kg verdünnt wird, die verdünnte Brühe ultrafiltriert wird, und 70 kg UFP und 30 kg UFR gesammelt werden, dann beträgt der DF1 1,4. Beispielhafte DF1-Bereiche sind 1-3.1, 1.5-3.1, 1.8-3.1, 1-2.5, 1.5-2.5, 1.8-2.5, 2-3.1, 2-2.5, 2-2.3.
  • In anderen Ausführungsformen wird die erhaltene (d.h. unverdünnte) Fermentationsbrühe ultrafiltriert, der UF-Schritt wird so durchgeführt, dass der Konzentrationsgrad (Konzentrationsfaktor, CF2) mindestens 1,25, besser noch mindestens 1,5 beträgt. Andererseits ist der CF2 vorteilhaft nicht mehr als 4, vorzugsweise nicht mehr als 3. Der Konzentrationsfaktor in diesem UF-Schritt ist das Verhältnis des Volumens (oder der Masse) der Brühe (das dem des UF-Zulaufs entspricht) und des UF-Retentats (UFR). Wenn z.B. 100 kg Brühe direkt ultrafiltriert und 40 kg Permeat und 60 kg Retentat gesammelt werden, beträgt der CF2 1,67. Beispielhafte CF2-Bereiche des UF-Schrittes sind 1,25-4, 1,25-3, 1,25-2,25, 1,5-4, 1,5-3, 1,5-2,25, 1,25-2 oder 1,5-2. Vorzugsweise umfasst dieser Schritt einen Waschschritt des im obigen UF-Schritt erhaltenen UFR, um die Rückgewinnungsausbeute des sialylierten Oligosaccharids/sialylierten-Laktose-Produktes zu verbessern. Dieser Schritt wird durch Zugabe von Wasser, vorzugsweise gereinigtem Wasser, zum UFR durchgeführt, um eine Suspension zu erhalten, und die wässrige Phase der Suspension wird durch dieselbe UF-Membran geleitet, die im obigen UF-Schritt verwendet wurde, um ein Waschfiltrat von vorzugsweise demselben Volumen (oder derselben Masse) wie das verwendete Waschwasser zu sammeln. Als allgemeine Regel gilt: je höher der CF des vorhergehenden UF-Schrittes, desto mehr Wasser wird zugegeben. Darüber hinaus gilt: je mehr Waschwasser, desto mehr zusätzlich gewonnenes Produkt. Ab einer bestimmten Menge Waschwasser kann jedoch kein signifikant mehr Produkt aus der UFR ausgewaschen werden. Das Waschwasser kann in einer Portion oder mehreren nachfolgenden Portionen zugegeben werden, es ist jedoch günstig, wenn das Waschwasser kontinuierlich mit der gleichen Durchflussrate wie die Durchflussrate der Filtratsammlung in den UFR gegeben wird, um ein konstantes UFR-Konzentratvolumen zu erhalten. Nach dem Waschschritt werden das UFP und das Waschfiltrat für die nächste(n) Reinigungs-/Isolationsstufe(n) zusammengeführt. Die kombinierten UFP + Waschfiltratfraktionen enthalten 85-96 % des sialylierten Oligosaccharid/ sialylierten-Laktose-Produkts der Fermentationsbrühe (nach Masse), wenn ihr Verdünnungsfaktor (DF2) 1 bis 3,5 beträgt. DF2 wird in diesem Schritt als das Verhältnis des Gesamtvolumens (oder der Masse) des UFP kombiniert mit Waschfiltrat und dem der unverdünnten Fermentationsbrühe (das dem des UF-Futtermittels entspricht) berechnet. Wenn z.B. 100 kg Brühe direkt ultrafiltriert werden, 40 kg UFP gesammelt werden und die UFR mit 200 kg Wasser gewaschen wird, dann beträgt der DF2 2,4. Beispielhafte DF2-Bereiche sind 1-3.1, 1.5-3.1, 1.8-3.1, 1-2.5, 1.5-2.5, 1.8-2.5, 2-3.1, 2-2.5, 2-2.3. Vorzugsweise trägt die Anwendung von mehr als dem 3-fachen Waschwasservolumen oder der Waschwassermasse (im Vergleich zum Brühe-Volumen oder der Masse vor UF) nicht wesentlich zur Verbesserung der Rückgewinnung bei. Andererseits erhöht das Sammeln eines größeren Waschfiltratvolumens die technologische Zeit der nachfolgenden Schritte ii), iii) und iv). Aus technologischer Sicht ist es vorteilhaft, wenn das Volumen (oder die Masse) des verwendeten Waschwassers etwa das 1,5-2,5-fache, z.B. das 1,6-1,9-fache, des Volumens der in der UF-Stufe verwendeten Brühe beträgt.
  • Der UF-Schritt wird bzw. die UF- und Waschschritte werden bei konstanter Temperatur, vorzugsweise zwischen 15 und 65 °C, durchgeführt, wie z.B. bei 15-20 oder bei 55-65 °C. In diesem gesamten Bereich ist eine zufriedenstellende Rückgewinnungsausbeute verfügbar, jedoch ist die Rückgewinnungsausbeute umso höher, je höher die Temperatur ist. Folglich ist bei höherer Temperatur eine geringere DF ausreichend, um die gleiche Rückgewinnungsausbeute zu erreichen. Bei 55-65 °C gewährleistet eine DF von etwa 2,0-2,3 vorzugsweise etwa 90 % der Rückgewinnungsausbeute oder sogar mehr.
  • Es sollte betont werden, dass keine Hitzeinaktivierung und keine Störung der produzierenden Zelle oder die Behandlung der Zelle mit einem Mittel (wie Triton X), das die Zellwand durchlässiger macht, notwendig ist, um das intrazellulär angesammelte Produkt aufzufangen.
  • Schritt ii) der Abtrennung des sialylierten Oligosaccharids
  • Schritt ii) des Verfahrens umfasst einen Nanofiltrationsschritt (NF). Schritt ii) kann auf Schritt i), optional Schritt iii) oder Schritt iv) folgen. Dieser Nanofiltrationsschritt kann vorteilhaft verwendet werden, um die zuvor behandelte Fermentationsbrühe, die das sialylierte Oligosaccharid/die sialylierte Laktose enthält, zu konzentrieren und/oder um Ionen, hauptsächlich einwertige Ionen, und organische Materialien mit einem geringeren Molekulargewicht als das des sialylierten Oligosaccharids/der sialylierten Laktose, wie z.B. Monosaccharide, zu entfernen. Die Nanofiltrationsmembran hat einen MWCO, der die Retention der interessierenden sialylierten Oligosaccharid-sialylierten Laktose gewährleistet, d.h. ihr MWCO ist niedriger als das der in Schritt a) verwendeten Ultrafiltrationsmembran(en) und etwa 25-50 % des Molekulargewichts des sialylierten Oligosaccharids/der sialylierten Laktose. Als Beispiel ist eine Nanofiltrationsmembran mit einem MWCO von etwa 150-300 Da für die Rückhaltung von sialylierter Laktose geeignet. Dabei wird das sialylierte Oligosaccharid/die sialylierte Laktose im NF-Retentat (NFR) angereichert. Die Nanofiltration kann mit der Diafiltration mit Wasser kombiniert werden, um durchlässige Moleküle besser zu entfernen, z.B. bis die Leitfähigkeit des Permeats keine oder nur noch sehr geringe Salze aufweist.
  • Der erfindungsgemäße NF-Schritt wird, mit oder ohne den optionalen Diafiltrationsschritt, bei konstanter Temperatur, vorzugsweise zwischen 15-45 °C, wie z.B. bei 15-20 °C oder bei 35-45 °C, durchgeführt. Dieser NF-Schritt, mit oder ohne Diafiltration, wird so lange fortgesetzt, bis die gewünschte Konzentration der sialylierten Oligosaccharide und der sialylierten Laktose im NFR erreicht ist. Andere technische Parameter wie die Einstellung des Flusses und des Drucks sind eine Frage von Routinefähigkeiten.
  • Mit dem oben angegebenen NF-Schritt können mindestens 95 % des sialylierten Oligosaccharids/der sialylierten Laktose, die im vorherigen Schritt erhalten wurden, beibehalten werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform folgt Schritt ii) auf Schritt i), d.h. das in Schritt i) erhaltene UF-Permeat wird nanofiltriert und das NF-Retentat, das das hergestellte sialylierte Oligosaccharid/die sialylierte Laktose enthält, wird gesammelt und entweder weiteren Trennungsschritten des Verfahrens unterzogen oder als Ausgangslösung zur Gewinnung des sialylierten Oligosaccharids/der sialylierten Laktose verwendet.
  • Schritt iii) der Abtrennung des sialylierten Oligosaccharids
  • Das Verfahren kann, wie oben erwähnt, einen oder mehrere optionale Trennungsschritte umfassen, wie z.B. den unten beschriebenen Schritt iii).
  • Nach einer Ausführungsform umfasst das Verfahren den optionalen Schritt iii): Es wird eine Aktivkohlebehandlung durchgeführt. Der optionale Schritt iii) kann auf Schritt i), Schritt ii) oder Schritt iv) folgen. Die Behandlung mit Aktivkohle (AC) hilft bei Bedarf, Farbstoffe und/oder wasserlösliche Verunreinigungen, wie z.B. Salze, zu entfernen.
  • Eine kohlenhydrathaltige Substanz wie ein sialyliertes Oligosaccharid/sialylierte Laktose von Interesse neigt dazu, aus ihrer wässrigen Lösung an die Oberfläche von Kohlepartikeln gebunden zu werden, z.B. eine wässrige Lösung, die nach Schritt i), Schritt ii) oder Schritt iv) erhalten wurde. In ähnlicher Weise adsorbieren auch die Farbstoffe an die Kohle. Während die Kohlenhydrate und farbgebenden Stoffe adsorbiert werden, können wasserlösliche Stoffe, die nicht oder nur schwächer an die Kohle gebunden sind, mit Wasser eluiert werden. Durch den Wechsel des Elutionsmittels von Wasser zu wässrigem Ethanol kann das adsorbierte sialylierte Oligosaccharid/die sialylierte Laktose leicht eluiert und in einer separaten Fraktion gesammelt werden. Die adsorbierten farbgebenden Substanzen würden weiterhin an der Kohle adsorbiert bleiben, so dass in Schritt iii) gleichzeitig eine Entfärbung und Entsalzung erreicht werden kann. Die Behandlung der Holzkohle kann durch Zugabe von Holzkohle (z.B. Pulver, Pellet oder Granulat) zur wässrigen Lösung des sialylierten Oligosaccharids/sialylierter Laktose unter Rühren, Abfiltrieren der Holzkohle, erneutes Suspendieren in wässrigem Ethanol unter Rühren und Abtrennen der Holzkohle durch Filtration erfolgen. Bei der Reinigung in höherem Maßstab wird die wässrige Lösung des sialylierten Oligosaccharids/der sialylierten Laktose nach Schritt i), Schritt ii) oder Schritt iv) in eine mit Holzkohle gepackte Kolonne geladen, die gegebenenfalls mit Celit gemischt werden kann, und die Kolonne dann mit dem erforderlichen Elutionsmittel gewaschen. Die Fraktionen, die das sialylierte Oligosaccharid/die sialylierte Laktose enthalten, werden gesammelt. Von diesen Fraktionen kann das Ethanol, falls erforderlich, z.B. durch Verdampfen entfernt werden, um eine wässrige Lösung des sialylierten Oligosaccharids/der sialylierten Laktose zu erhalten.
  • Alternativ dazu wird unter bestimmten Bedingungen das sialylierte Oligosaccharid nicht oder zumindest nicht wesentlich an die Kohlepartikel adsorbiert, und die Elution mit Wasser führt zu einer wässrigen Lösung des sialylierten Oligosaccharids/der sialylierten Laktose ohne deren signifikanten Verlust, während die farbgebenden Substanzen adsorbiert bleiben. Um dies zu erreichen, sollte die zur Entfärbung eingesetzte Menge an Aktivkohle etwa 12-25 Masse-%, bezogen auf den Gehalt an sialyliertem Oligosaccharid der in einem vorhergehenden Schritt erhaltenen Einsatzlösung, vorzugsweise etwa 15-20 %, bezogen auf den Sialyllaktosegehalt der Einsatzlösung, betragen. Mit dieser speziellen Anordnung können bis zu mindestens 90 % des sialylierten Oligosaccharids/der sialylierten Laktose (bezogen auf die Masse), die in einem vorhergehenden Schritt erhalten wurden, in Form einer entfärbten Lösung zurückgewonnen werden.
  • Optional kann das Holzkohlebett mit reinem Wasser gewaschen werden, um weitere Mengen an sialyliertem Oligosaccharid/sialylierter Laktose zu sammeln, die optional an Holzkohle gebunden werden. Je mehr Waschwasser eingesetzt wird, desto mehr wird zusätzlich gewonnen. Ab einer bestimmten Waschwassermenge kann jedoch nicht signifikant mehr Produkt aus der Kohle ausgewaschen werden, und die Chance, bereits gebundene Farbkörper abzuwaschen, steigt. Um einen Kompromiss zwischen einer maximalen Rückgewinnungsausbeute und der Verdünnung des Eluats zu erhalten, werden daher in diesem Waschschritt 16-25 1 gereinigtes Wasser/kg Holzkohle verwendet, vorzugsweise in mindestens zwei Portionen. Dies führt zu einer weiteren Rückgewinnung von ca. 5 % sialyliertem Oligosaccharid/sialylierter Laktose aus Holzkohle (um so mindestens 95 % der kumulierten Rückgewinnungsausbeute in diesem AC-Behandlungsschritt zu erreichen), während die erhaltene Lösung farblos ist und der AC-Verdünnungsfaktor nur ca. 1,4-1,9 beträgt (der AC-Verdünnungsfaktor wird als das Verhältnis des Volumens (oder der Masse) der mit Holzkohle behandelten kombinierten Elutionsmittel und der Futtermittellösung berechnet). In einer bevorzugten Ausführungsform folgt die Aktivkohlebehandlung dem Nanofiltrationsschritt ii) und wird auf das NF-Retentat angewendet.
  • Schritt iv) der Abtrennung des sialylierten Oligosaccharids
  • In Schritt iv) wird die vorbehandelte wässrige Lösung des sialylierten Oligosaccharids/der sialylierten Laktose aus Schritt i), ii) oder iii) mit Hilfe eines Ionenaustauscherharzes weiter gereinigt.
  • Nach einer Ausführungsform von Schritt iv) ist das Ionenaustauscherharz ein Anionenaustauscherharz, vorzugsweise ein starkes Anionenaustauscherharz. Die wässrige Lösung des sialylierten Oligosaccharids/der sialylierten Lactose wird mit einem Anionenaustauscherharz in jeder geeigneten Weise in Kontakt gebracht, die es ermöglicht, die negativ geladenen Materialien auf das Anionenaustauscherharz zu absorbieren, einschließlich des sialylierten Oligosaccharids/der sialylierten Lactose. Die resultierende Flüssigkeit enthält nach dem Kontakt mit dem Anionenaustauscherharz als Eluat hauptsächlich Wasser, Kationen und neutrale Kohlenhydrate wie den Kohlenhydratakzeptor, der zuvor der zu sialylierenden Fermentationskultur zugesetzt wurde, z.B. Laktose (falls nach einem oder mehreren vorherigen Reinigungsschritten noch vorhanden). Das sialylierte Oligosaccharid/die sialylierte Lactose kann aus dem Anionenaustauscherharz gewonnen werden, indem es mit einer wässrigen Lösung eines geeigneten Salzes wie dem eines Alkalimetalls (Li, Na, K), eines Erdalkalimetalls (wie Ca, Mg) oder eines Ammoniumions in Form von z.B. Acetat, Halogenid (wie Chlorid oder Bromid), Carbonat, Bicarbonat, Sulfat usw. als Elutionsmittel eluiert wird. Alternativ kann die zurückgehaltene sialylierte Oligosaccharid/sialylierte Lactose auch mit einer wässrigen Alkalilösung aus dem Anionenaustauscherharz entfernt werden, um das entsprechende Salz zu erhalten. Um das sialylierte Oligosaccharid/die sialylierte Lactose in saurer Form zu erhalten, kann eine saure Lösung als Elutionsmittel verwendet werden, z.B. HCl, Schwefelsäure, Salpetersäure, usw. Die Konzentration der wässrigen alkalischen oder sauren Lösung muss so verdünnt werden, dass die Struktur des sialylierten Oligosaccharids/der sialylierten Laktose nicht zerstört wird. Geeignete Desorptionsbedingungen können durch Routineversuche ermittelt werden. Falls erforderlich, kann das sialylierte Oligosaccharid/die sialylierte Laktose in saurer Form in sein organisches oder anorganisches Salz umgewandelt werden, wie z.B. in der WO 2011/100979 beschrieben. Entweder das saure sialylierte Oligosaccharid/die sialylierte Lactose oder ihr geeignetes Salz können aus ihrer wässrigen Lösung durch Fällung mit einem Alkohol oder einer wässrigen Alkohollösung isoliert werden.
  • Nach einer anderen Ausführungsform von Schritt iv) ist das Ionenaustauscherharz ein Kationenaustauscherharz, vorzugsweise ein starkes Kationenaustauscherharz. Die Lösung des sialylierten Oligosaccharids/der sialylierten Laktose wird mit dem Kationenaustauscherharz in einer geeigneten Weise in Kontakt gebracht, die es ermöglicht, positiv geladene Materialien auf das Kationenaustauscherharz zu absorbieren. Die resultierende Flüssigkeit (Eluat) enthält nach dem Kontakt mit dem Kationenaustauscherharz die sialylierte Oligosaccharide/sialylierte Lactose in saurer Form (wenn das Kationenaustauscherharz in H-Form vorliegt) oder in Salzform (wenn das Kationenaustauscherharz in der entsprechenden Salzform vorliegt). Falls erforderlich, kann das sialylierte Oligosaccharid/die sialylierte Lactose in saurer Form in ihr organisches oder anorganisches Salz umgewandelt werden, wie z.B. in der WO 2011/100979 beschrieben. Vorzugsweise wird eine wässrige Alkalilösung verwendet, bis der pH-Wert etwa 7 erreicht, um das entsprechende Alkalisalz des sialylierten Oligosaccharids/der sialylierten Laktose zu erhalten. Entweder das saure sialylierte Oligosaccharid/die sialylierte Lactose oder ihr geeignetes Salz können aus ihrer wässrigen Lösung durch Ausfällung mit einem Alkohol oder einer wässrigen Alkohollösung isoliert werden.
  • In Schritt iv) muss die Konzentration der wässrigen Lauge oder der gegebenenfalls als Elutionsmittel verwendeten Säurelösung so weit verdünnt werden, dass das sialylierte Oligosaccharid/die sialylierte Laktose nicht abgebaut wird.
  • Eine der oben in Schritt iv) angegebenen Ionenaustauscherharzbehandlungen kann ausreichen, um das sialylierte Oligosaccharid/die sialylierte Laktose in der erforderlichen Reinheit zu erhalten. Falls erforderlich, können sowohl Kationen- als auch Anionenaustauscherharz-Chromatographie in beliebiger Reihenfolge angewendet werden.
  • Ebenfalls in Schritt iv) kann der Vernetzungsgrad im Ionenaustauscherharz in Abhängigkeit von den Betriebsbedingungen der Ionenaustauschersäule gewählt werden. Ein hochvernetztes Harz bietet den Vorteil der Haltbarkeit und eines hohen Grades an mechanischer Integrität, leidet jedoch unter einer verringerten Porosität und einem Abfall des Massentransfers. Ein niedrig vernetztes Harz ist zerbrechlicher und neigt dazu, durch Absorption der mobilen Phase zu quellen. Die Partikelgröße des Ionenaustauscherharzes wird so gewählt, dass ein effizienter Fluss des Eluenten möglich ist, während die geladenen Materialien noch effektiv entfernt werden. Eine geeignete Flussrate kann auch durch Anlegen eines Unterdrucks am Elutionsende der Säule oder eines Überdrucks am Beladungsende der Säule und Sammeln des Eluenten erreicht werden. Es kann auch eine Kombination aus Über- und Unterdruck verwendet werden.
  • Nicht einschränkende Beispiele für ein geeignetes saures Kationenaustauscherharz können z.B. Amberlite IR100, Amberlite IR120, Amberlite FPC22, Dowex 50WX, Finex CS16GC, Finex CS13GC, Finex CS12GC, Finex CS11GC, Lewatit S, Diaion SK, Diaion UBK, Amberjet 1000, Amberjet 1200 sein.
  • Nicht einschränkende Beispiele für ein geeignetes basisches Anionenaustauscherharz können z.B. Amberjet 4200, Amberjet 4600, Amberlite IR400, Amberlite IR410, Amberlite IR458, Diaion SA, Diaion UBA120, Lewatit MonoPlus M, Lewatit S7468 sein.
  • In einer Ausführung wird in Schritt iv) ein starkes Kationenaustauscherharz in H+-Form verwendet, gefolgt von der Zugabe einer alkalischen Lösung zum Eluenten, um ein Alkalisalz des sialylierten Oligosaccharids zu erhalten.
  • In anderer Ausführungsform umfasst Schritt iv) der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines starken Kationenaustauscherharzes in Salzform, wobei die Salzform vorzugsweise aus einem einwertigen alkalischen Kation wie Na+ oder K+ besteht. Bei dieser Art von Ionenaustauscherharz werden die Kationen der Beladungslösung, die das sialylierte Oligosaccharid/die sialylierte Lactose enthält, direkt durch das alkalische Kation (z.B. Na+ oder K+) des Harzes ausgetauscht, um das entsprechende Alkalisalz des sialylierten Oligosaccharids/der sialylierten Lactose zu liefern, ohne dass eine pH-Einstellung nach dem Stand der Technik erforderlich ist.
  • Die Rückgewinnungsausbeute dieses Schrittes beträgt mehr als 95 %, sogar nahezu quantitativ. Ein Überschuss der einwertigen alkalischen Kationen kann in einem Diafiltrationsschritt entfernt werden, vorzugsweise unter Verwendung einer Nanofiltrationsmembran wie in Schritt ii), der oben offengelegt wurde, um die Reinheit des isolierten sialylierten Oligosaccharids/sialylierten Laktosesalzes zu verbessern. Darüber hinaus ist die nach dem Stand der Technik vorgeschlagene Anwendung von Anionenaustauscherharz in HCO3--Form vermeidbar, was im industriellen Betrieb hinsichtlich der Durchführbarkeit von Vorteil ist, da bei der Entfernung von Bikarbonat durch Versäuerung eine beträchtliche Menge Kohlendioxidgas freigesetzt würde, was möglicherweise zusätzliche Sicherheit und technische Maßnahmen erfordert.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Reinigung, vorzugsweise zur Isolierung, eines sialylierten Oligosaccharids/einer sialylierten Laktose wird die Ultrafiltration gemäß Schritt i) vorzugsweise vor einem der Schritte ii), iii) und iv) durchgeführt, und jeder der Schritte ii), iii) und iv) kann in beliebiger Reihenfolge angewendet werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform folgt Schritt ii) auf Schritt i).
  • Nach den Isolierungs-/Reinigungsschritten i), ii), optionalem Schritt iii) und iv) kann die so erhaltene sialylierte Oligosaccharide/sialylierte Laktose in ihrer Säure- oder Salzform bereitgestellt werden. Wenn eine feste Form des sialylierten Oligosaccharids/der sialylierten Laktose erforderlich ist, kann sie sprühgetrocknet, gefriergetrocknet oder kristallisiert werden. Dementsprechend kann das Verfahren der Erfindung einen oder mehrere weitere Schritte umfassen, wie z.B. die Sprühtrocknung einer wässrigen Lösung des sialylierten Oligosaccharids/der sialylierten Laktose, die nach Schritt i), Schritt ii), optional Schritt iii) oder Schritt iv) erhalten wurde; oder Gefriertrocknen einer wässrigen Lösung des sialylierten Oligosaccharids/der sialylierten Laktose, die nach Schritt i), Schritt ii), optionalem Schritt iii) oder Schritt iv) erhalten wurde; oder Kristallisieren eines sialylierten Oligosaccharids/einer sialylierten Laktose aus einer wässrigen Lösung, die nach Schritt i), Schritt ii), optionalem Schritt iii) oder Schritt iv) erhalten wurde. Alternativ kann das sialylierte Oligosaccharid/sialylierte Lactose, das/die nach dem oben genannten Verfahren isoliert und gereinigt wurde, in Form einer konzentrierten wässrigen Lösung oder eines Sirups durch Entfernung von Wasser, z.B. durch Destillation, vorzugsweise Vakuumdestillation, oder Nanofiltration, bereitgestellt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Produktion eines sialylierten Oligosaccharids/sialylierter Laktose durch einen genetisch modifizierten Mikroorganismus ist der Mikroorganismus, der in der Lage ist, ein sialyliertes Oligosaccharid zu produzieren, ein E. coli, vorzugsweise vom LacY+LacZ- Genotyp, der neuBCA trägt. Das heterologe Sialyltransferase-Gen im Mikroorganismus ist vorzugsweise eine α-2,3- oder eine α-2,6-Sialyltransferase, mit deren Hilfe aus der exogen zugegebenen Lactose als Kohlenhydratakzeptor 3'-SL bzw. 6'-SL hergestellt wird. Ein solcher Mikroorganismus wird z.B. in WO 2007/101862 , Fierfort et al. J Biotechnol. 134, 261 (2008) und Drouillard et al. Kohlenhydr. Res. 345, 1394 (2010).
  • Dementsprechend ist eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Isolierung einer sialylierten Laktose aus einer Fermentationsbrühe, die durch Kultivierung eines genetisch modifizierten Mikroorganismus erhalten wird, der in der Lage ist, die sialylierte Laktose aus einer internalisierten Laktose zu produzieren, umfassend die folgenden Schritte:
    1. i) Ultrafiltration der Brühe, um ein Ultrafiltrationspermeat zu erhalten,
    2. ii) Nanofiltration des Ultrafiltrationspermeats, um ein Nanofiltrationsretentat zu erhalten,
    3. iii) Aktivkohlebehandlung des Nanofiltrationsretentats, um eine entfärbte wässrige Lösung zu erhalten, und
    4. iv) Behandlung der wässrigen Lösung von Schritt iii) mit einem starken Anionen- und/oder Kationenaustauscherharz.
  • Als ein nicht limitierendes Beispiel wurde die Isolationsausbeute von 3'-SL aus seiner Fermentationsbrühe, hergestellt nach WO 2007/101862 oder Fierfort et al. J. Biotechnol. 134, 261 (2008), durch die folgende Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens verbessert:
    1. i) Ultrafiltration der Brühe, vorzugsweise durch eine 15 kDa-Membran, um ein UF-Permeat zu erhalten, gefolgt von einer Wasserwäsche des UF-Retentats, wobei der DF 1,8-3,1 beträgt und vorzugsweise der CF der Ultrafiltration 1,25-2,25 beträgt,
    2. ii) Nanofilterung, vorzugsweise mit einer 150-300 kDa-Membran, das kombinierte UF-Permeat und Wasserwaschfiltrat, um ein NF-Retentat zu erhalten,
    3. iii) Zugabe von Aktivkohle zum NF-Retentat, vorzugsweise von pulverförmiger Aktivkohle, vorzugsweise in einer Menge von 12-25 Massenprozent, bezogen auf den 3'-SL-Gehalt des NF-Retentats, um eine entfärbte wässrige Lösung zu erhalten, und
    4. iv) die Behandlung der entfärbten Lösung mit einem Ionenaustauscherharz, die aus der Anwendung eines stark sauren Ionenaustauscherharzes besteht
      • - entweder in der H+-Form, gefolgt von der Neutralisierung des Eluats mit NaOH-Lösung,
      • - oder in der Na+-Form,
    um das Natriumsalz von 3'-SL entstehen zu lassen.
  • Mit dem obigen Verfahren können mindestens 70 % des durch die Fermentation vor Schritt i) erzeugten 3'-SL in der gereinigten Natriumsalzform isoliert werden. Das obige Verfahren kann auf 6'-SL-haltige Fermentationsbrühe mit der gleichen Leistung angewendet werden.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Ultrafiltration
  • Eine Fermentationsbrühe mit 3'-SL (340-450 1) wurde bei 60-65 °C ultrafiltriert (15 kDa), um das UFP mit einem CF von 1,6-1,7 zu sammeln. Das UF-Retentat wurde dann mit gereinigtem Wasser gewaschen (1,5-2,5-fache Volumina bezogen auf das ultrafiltrierte Volumen der Brühe) und die Suspension wurde durch dieselbe Membran filtriert, um ein Waschfiltrat zu sammeln, so dass das kombinierte Volumen von UFP und Waschfiltrat 1050 1 betrug. Die Analyse zeigte, dass 87-96 % des in der Brühe enthaltenen 3'-SL im kombinierten UFP- und Waschfiltrat zurückgewonnen wurden.
  • Beispiel 2: Nanofiltration
  • Das kombinierte UFP und Waschfiltrat aus dem vorherigen Schritt (14,6 kg) wurde mit einer 150-300 Da-Membran bei 20-22 bar und 45 °C nanofiltriert, bis das Retentat einen Brix-Wert von etwa 20-25 zeigte. Die Analyse zeigte, dass 96 % der im kombinierten UFP und Waschfiltrat enthaltenen 3'-SL im NF-Retentat zurückgewonnen wurden.
  • Beispiel 3: Behandlung mit Aktivkohle
  • Einem NF-Retentat, das gemäß Beispiel 1 und anschließendem Beispiel 2 hergestellt wurde (Volumenbereich: 200-470 1, Konzentrationsbereich bezüglich 3'-SL: 170-210 g/l), wurde pulverförmige Aktivkohle zugegeben (16-20 Gew.-% vs. 3'-SL im NF-Retentat), und die Suspension wurde 1 Stunde lang gerührt. Die Aktivkohle wurde durch Rezirkulation der Lösung gefiltert, bis sie klar wurde. Die Holzkohle wurde zweimal mit Wasser gewaschen (10 1/kg Holzkohle pro Waschgang), und die Filtrate wurden zusammengeführt. Die Analyse zeigte, dass 91-98 % des im NF-Retentat enthaltenen 3'-SL im AC-Filtrat zurückgewonnen wurden.
  • Beispiel 4: Behandlung mit Aktivkohle und Ionenaustausch
  • Einem NF-Retentat, das gemäß Beispiel 1 und anschließendem Beispiel 2 hergestellt wurde, mit dem Unterschied, dass es 6'-SL statt 3'-SL (201 g Lösung mit 16,8 g 6'-SL) enthielt, wurde pulverisierte Aktivkohle (5 g) zugegeben und die Suspension 1 Stunde lang gerührt. Die Aktivkohle wurde dann abfiltriert und mit destilliertem Wasser (40 ml) gewaschen. Das kombinierte Filtrat (231 g) wurde in zwei gleiche Teile geteilt. Die erste Lösung wurde an den Kopf einer Amberlite FPC 22 (H+) Ionenaustauschersäule (50 ml) gebracht und eluiert, gefolgt von einem Waschen der Säule mit destilliertem Wasser (50 ml). Zum Eluat wurde NaOH-Lösung (5M, 3,1 ml) hinzugefügt, um einen pH-Wert von 6,7 zu erreichen. Die Lösung wurde gefriergetrocknet, um 9,24 g weißes Pulver zu erhalten. Die zweite Lösung wurde an den Kopf einer Amberlite FPC 22 (Na+) Ionenaustauschersäule (50 ml) gebracht und eluiert, gefolgt von einem Waschen der Säule mit destilliertem Wasser (50 ml). Das Eluat wurde gefriergetrocknet, um 9,27 g weißes Pulver zu erhalten.
  • Gehalt (nach IC): 82,9 % (freie Säure), 90,8 % (freie Säure als wasserfrei), 85,7 % (Na-Salz), 94,0 % (Na-Salz als wasserfrei). Gehalt (durch NMR): 88,9 % (freie Säure), 92,0 % (Na-Salz). Wassergehalt (nach KF): 8,8 %.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Claims (41)

  1. Ein festes sialyliertes Oligosaccharid, wobei das feste sialylierte Oligosaccharid ein sprühgetrocknetes oder kristallines saures Humanmilch-Oligosaccharid ist, das aus 6'-Sialylylactose (6'-SL) ausgewählt ist, 3-Fucosyl-3'-sialyllactose (FSL), LST a, Fucosyl-LST a (FLST a), LST b, Fucosyl-LST b (FLST b), LST c, Fucosyl-LST c (FLST c), Sialyl-LNH (SLNH), Sialyl-Lacto-N-hexaose (SLNH), Sialyllacto-N-neohexaose I (SLNH-I), Sialyllacto-N-neohexaose II (SLNH-II) und Disialyllacto-N-tetraose (DS-LNT), wobei das sialylierte Oligosaccharid von einem genetisch modifizierten Mikroorganismus produziert wird, der in der Lage ist, das sialylierte Oligosaccharid aus einem internalisierten Kohlenhydratvorläufer zu produzieren und aus einer gereinigten Fermentationsbrühe erhalten wird.
  2. Das feste sialylierte Oligosaccharid nach Anspruch 1, erhältlich durch das Verfahren zur Abtrennung eines sialylierten Oligosaccharids aus der Fermentationsbrühe, die durch Kultivierung eines genetisch modifizierten Mikroorganismus, der in der Lage ist, das sialylierte Oligosaccharid aus einem internalisierten Kohlenhydratvorläufer zu produzieren, erhalten wurde, wobei die Abtrennung die folgenden Schritte umfasst: i) Ultrafiltration, ii) Nanofiltration, iii) gegebenenfalls Aktivkohlebehandlung, iv) Behandlung mit Ionenaustauscherharz und v) Sprühtrocknung oder Gefriertrocknung oder Kristallisation.
  3. Das feste sialylierte Oligosaccharid nach Anspruch 2, wobei der Schritt iv) die Behandlung mit einem starken Anionen- und/oder Kationenaustauscherharz umfasst.
  4. Das feste sialylierte Oligosaccharid nach Anspruch 3, wobei Schritt v) nach einem der Schritte i), ii), iii) oder iv) durchgeführt wird.
  5. Das feste sialylierte Oligosaccharid nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei Schritt i) zwei aufeinanderfolgende Ultrafiltrationen umfasst und die Molekulargewichtsgrenze der ersten Ultrafiltrationsmembran höher als die der zweiten Membran ist.
  6. Das feste sialylierte Oligosaccharid nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei Schritt i) weiterhin einen Waschschritt des Ultrafiltrationsretentats umfasst, um ein Waschfiltrat zu erhalten.
  7. Das feste sialylierte Oligosaccharid nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei Schritt i) weiterhin die Verdünnung der Fermentationsbrühe vor der UF umfasst.
  8. Das feste sialylierte Oligosaccharid nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei der Verdünnungsfaktor von Schritt i) 1 bis 3,5 beträgt.
  9. Das feste sialylierte Oligosaccharid nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei der Ultrafiltrationsschritt durch einen Konzentrationsfaktor von mindestens 1,25 gekennzeichnet ist.
  10. Das feste sialylierte Oligosaccharid nach einem der Ansprüche 2 bis 9, wobei das Ultrafiltrationspermeat oder das kombinierte Ultrafiltrationspermeat und Waschfiltrat in Schritt ii) nanofiltriert wird.
  11. Das feste sialylierte Oligosaccharid nach einem der Ansprüche 2 bis 10, wobei die Molekulargewichtsgrenze der Nanofiltrationsmembran in Schritt ii) niedriger ist als die der Ultrafiltrationsmembran in Schritt i).
  12. Das feste sialylierte Oligosaccharid nach einem der Ansprüche 2 bis 11, wobei die Molekulargewichtsgrenze der Nanofiltrationsmembran in Schritt ii) etwa 25-50 % des Molekulargewichts des sialylierten Oligosaccharids beträgt.
  13. Das feste sialylierte Oligosaccharid nach einem der Ansprüche 2 bis 12, wobei das Ultrafiltrationspermeat oder das kombinierte Ultrafiltrationspermeat und Waschfiltrat oder das Nanofiltrationsretentat mit Aktivkohle behandelt wird, und wobei die Menge der aufgebrachten Aktivkohle etwa 12 bis 25 Masse-% relativ zum Gehalt an sialyliertem Oligosaccharid des Ultrafiltrationspermeats, des kombinierten Ultrafiltrationspermeats und Waschfiltrats oder des Nanofiltrationsretentats beträgt.
  14. Das feste sialylierte Oligosaccharid nach einem der Ansprüche 2 bis 13, wobei in Schritt iv) ein starkes Kationenaustauscherharz in H+-Form verwendet wird, gefolgt von der Zugabe einer alkalischen Lösung zu dem Eluenten, um das alkalische Salz des sialylierten Oligosaccharids zu erhalten.
  15. Das feste sialylierte Oligosaccharid nach einem der Ansprüche 2 bis 14, wobei ein starkes Kationenaustauscherharz in einwertiger alkalischer Kationenform in Schritt iv) verwendet wird, um das Alkalisalz des sialylierten Oligosaccharids zu erhalten.
  16. Das feste sialylierte Oligosaccharid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das feste sialylierte Oligosaccharid sprühgetrocknetes 6-'SL ist.
  17. Das feste sialylierte Oligosaccharid nach Anspruch 16 mit einem Wassergehalt von weniger als 10 %(w/w).
  18. Das feste sialylierte Oligosaccharid nach einem der Ansprüche 1-15, wobei das feste sialylierte Oligosaccharid gefriergetrocknet ist.
  19. Das feste sialylierte Oligosaccharid nach einem der Ansprüche 1-15, wobei das feste sialylierte Oligosaccharid kristallin ist.
  20. Das feste sialylierte Oligosaccharid nach einem der Ansprüche 1-15, wobei das sialylierte Oligosaccharid sialylierte Laktose ist.
  21. Festes sialyliertes Oligosaccharid, wobei das feste sialylierte Oligosaccharid eine sprühgetrocknete oder kristalline 3'-Sialialylactose (3'-SL) ist, wobei das sialylierte Oligosaccharid durch einen genetisch modifizierten Mikroorganismus hergestellt wird, Kohlenhydratvorläufer zu produzieren und von einer Fermentationsbrühe durch ein Verfahren abgetrennt wird, das einen Schritt der Behandlung der Fermentationsbrühe mit einem Anionenaustauscherharz umfasst.
  22. Das feste 3'-SL nach Anspruch 21, erhältlich durch das Verfahren zur Abtrennung eines Oligosaccharids aus der Fermentationsbrühe, die durch Kultivieren eines genetisch modifizierten Mikroorganismus, der in der Lage ist, das Oligosaccharid aus einem internalisierten Kohlenhydratvorläufer zu produzieren, erhalten wurde, wobei die Abtrennung die folgenden Schritte umfasst: i) Ultrafiltration, ii) Nanofiltration, iii) gegebenenfalls Aktivkohlebehandlung, iv) Behandlung mit Anionenaustauscherharz und gegebenenfalls Kationenaustauscherharzbehandlung und v) Sprühtrocknung oder Gefriertrocknung oder Kristallisation.
  23. Das feste 3'-SL nach Anspruch 22, wobei der Schritt iv) die Behandlung mit einem starken Anionenaustauscherharz umfasst.
  24. Das feste 3'-SL nach Anspruch 23, wobei Schritt v) nach einem der Schritte i), ii), iii) oder iv) durchgeführt wird.
  25. Das feste 3'-SL nach einem der Ansprüche 22 bis 24, wobei Schritt i) zwei aufeinanderfolgende Ultrafiltrationen umfasst und die Molekulargewichtsgrenze der ersten Ultrafiltrationsmembran höher als die der zweiten Membran ist.
  26. Das feste 3'-SL nach einem der Ansprüche 22 bis 25, wobei Schritt i) weiterhin einen Waschschritt des Ultrafiltrationsretentats umfasst, um ein Waschfiltrat zu erhalten.
  27. Das feste 3'-SL nach einem der Ansprüche 22 bis 26, wobei Schritt i) weiterhin die Verdünnung der Fermentationsbrühe vor UF umfasst.
  28. Das feste 3'-SL nach einem der Ansprüche 22 bis 27, wobei der Verdünnungsfaktor von Schritt i) 1 bis 3,5.
  29. Das feste 3'-SL nach einem der Ansprüche 22 bis 28, wobei der Ultrafiltrationsschritt durch einen Konzentrationsfaktor von mindestens 1,25 gekennzeichnet ist.
  30. Das feste 3'-SL nach einem der Ansprüche 22 bis 29, wobei das Ultrafiltrationspermeat oder das kombinierte Ultrafiltrationspermeat und Waschfiltrat in Schritt ii) nanofiltriert wird.
  31. Das feste 3'-SL nach einem der Ansprüche 22 bis 30, wobei die Molekulargewichtsgrenze der Nanofiltrationsmembran in Schritt ii) niedriger ist als die der Ultrafiltrationsmembran in Schritt i).
  32. Das feste 3'-SL nach einem der Ansprüche 22 bis 31, wobei die Molekulargewichtsgrenze der Nanofiltrationsmembran in Schritt ii) etwa 25-50 % des Molekulargewichts des sialylierten Oligosaccharids beträgt.
  33. Das feste 3'-SL nach einem der Ansprüche 22 bis 32, wobei das Ultrafiltrationspermeat oder das kombinierte Ultrafiltrationspermeat und Waschfiltrat oder das Nanofiltrationsretentat mit Aktivkohle behandelt wird, und wobei die Menge der aufgebrachten Aktivkohle etwa 12-25 Massen-% relativ zum Gehalt an sialylierten Oligosacchariden des Ultrafiltrationspermeats, des kombinierten Ultrafiltrationspermeats und Waschfiltrats oder des Nanofiltrationsretentats beträgt.
  34. Das feste 3'-SL nach einem der Ansprüche 22 bis 33, wobei ein starkes Kationenaustauscherharz in H+-Form in Schritt iv) verwendet wird, gefolgt von der Zugabe einer alkalischen Lösung zum Eluenten, um das alkalische Salz des sialylierten Oligosaccharids zu erhalten.
  35. Das feste 3'-SL nach einem der Ansprüche 22 bis 34, wobei ein starkes Kationenaustauscherharz in einwertiger alkalischer Kationenform in Schritt iv) verwendet wird, um das Alkalisalz des sialylierten Oligosaccharids zu erhalten.
  36. Das feste 3'-SL nach einem der Ansprüche 21-35, wobei das feste sialylierte Oligosaccharid sprühgetrocknetes 3'-SL ist.
  37. Das feste 3'-SL nach Anspruch 36, mit einem Wassergehalt von weniger als 10 %(w/w).
  38. Das feste 3'-SL nach einem der Ansprüche 21-35, wobei das feste sialylierte Oligosaccharid gefriergetrocknet ist.
  39. Das feste 3'-SL nach einem der Ansprüche 21-35, wobei das feste sialylierte Oligosaccharid kristallin ist.
  40. Das feste 3'-SL nach Anspruch 38, mit einem Wassergehalt von weniger als 10 %(w/w).
  41. Das feste sialylierte Oligosaccharid nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 40, wobei das sialylierte Oligosaccharid in saurer Form oder in einer Salzform vorliegt.
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