DE202015009782U1

DE202015009782U1 - Trennung von 2'-O-Fucosyllactose aus Fermentationsbrühe

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Publication number: DE202015009782U1
Application number: DE202015009782.0U
Authority: DE
Original assignee: Glycom AS
Current assignee: Glycom AS
Priority date: 2014-06-11
Filing date: 2015-06-11
Publication date: 2020-02-10
Anticipated expiration: 2025-06-12
Also published as: DK202000086U1; DK201900111U1; EP3154995A4; EP3154995B1; DK202100114U1; WO2015188834A1; DK202100114Y4; DK3154995T3; EP3154995A1; DK202000086Y4

Abstract

Kristallisierte 2-O'-Fucusyllactose (2'-FL), hergestellt nach einem Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst:
i. Kultivieren einer genetisch modifizierten Zelle mit einem rekombinanten Gen, das für eine 1,2-Fucosyltransferase kodiert und in der Lage ist, 2'-FL durch Fucosylierung von Lactose zu erzeugen, in einem wässrigen Kulturmedium, das Lactose enthält,
ii. Abtrennen der wässrigen Lösung von Nicht-Kohlenhydratpartikeln und Verunreinigungen des wässrigen Kulturmediums, wobei die wässrige Lösung 2'-FL und ein von 2'-FL verschiedenes fucosyliertes Kohlenhydrat umfasst, wobei die wässrige Lösung 35-80 Gew.-% in Bezug auf ihren Kohlenhydratgehalt beträgt, wobei 45-95 Gew.-% der Kohlenhydrate in der wässrigen Lösung 2'-FL sind, und
iii. Kristallisieren von 2'-FL aus der wässrigen Lösung.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur selektiven Kristallisation von 2'-O-Fucosyllactose (2'-FL) aus einem wässrigen Medium, insbesondere aus der biotechnologischen Herstellung von 2'-FL.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Für die biotechnologische Herstellung von 2'-FL sind viele Verfahren bekannt, wie z.B. die Fermentation mit transformiertem E. coli. Einige von ihnen wurden nur mit qualitativen Analysemethoden untersucht, ohne die Ausbeute von 2'-FL zu erwähnen oder wie man es aus der Brühe isoliert ( WO 2010/070104 , WO 2012/007481 , Lee et al. Microb. Zellfaktor. 11:48 (2012)). Die Präparationsmethoden wurden im Labormaßstab durchgeführt und haben den Endtiter von 25 g/l hinsichtlich 2'-FL nicht überschritten (Drouillard et al. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 1778 (2006); M. Randriantsoa: Synthese microbiologique des antigenes glucidiques des groupes sanguins, These de Doctorat soutenue le 30/09/2008 à l' Universite Joseph Fourier, Grenoble, France; WO 2012/097950 , WO 2012/112777 ; Baumgärtner et al. Microb. Zellfaktor. 12:40 (2013)). Nach diesen Veröffentlichungen wurde 2'-FL dann aus dem wässrigen Kulturmedium oder Überstand, in dem E.coli fermentiert wurden, durch:

- Abtrennung des produkthaltigen Überstandes durch Zentrifugation,
- Adsorption des Produkts auf einem Bett aus Aktivkohle, das mit Wasser gewaschen wurde, um wasserlösliche Verunreinigungen wie Salze, Aminosäuren und Proteinfragmente zu entfernen, dann wurde das Produkt mit Alkohol oder wässrigem Alkohol eluiert, und dann
- Trennung von 2'-FL von anderen Kohlenhydraten wie Laktose und Fukose durch Gelpermeationschromatographie oder Flash-Chromatographie auf Kohle-Celit-Bett.

Der Hauptnachteil dieser Isolationsmethode war bisher die Notwendigkeit einer chromatographischen Trennung, um entweder die reine Substanz zu erhalten oder zumindest ein Gemisch zu erhalten, das zwar mit der Zielverbindung angereichert ist, aber noch unerwünschte Derivate enthält. Obwohl wiederholte chromatographische Trennungen zu einer Verbesserung der Reinheit führen können, können die hohen Kosten und die relativ lange technologische Zeit für die Handhabung der Feed-Lösung und der Säulenpackung, die Durchführung der Trennung und gegebenenfalls die Regeneration der Packung, insbesondere im großen oder industriellen Maßstab, nachteilig und/oder umständlich sein.
Die Kristallisation oder Umkristallisation ist eine der einfachsten und kostengünstigsten Verfahren, um ein Produkt aus einem Reaktionsgemisch zu isolieren, von Verunreinigungen zu trennen und eine Reinsubstanz zu erhalten. Die Isolierung oder Reinigung mittels Kristallisation macht den gesamten technologischen Prozess robust und kostengünstig und ist damit vorteilhaft und attraktiv gegenüber anderen Verfahren. Aus diesem Grund wurde 2'-FL, das durch chemisch-synthetische Verfahren hergestellt wurde, durch Kristallisation isoliert ( WO 2010/070616 , WO 2011/150939 , WO 2014/009921 ).
Aufgrund der bei der Fermentation von 2'-FL im wässrigen Kulturmedium entstehenden Nebenprodukte besteht jedoch weiterhin Bedarf an einem effizienten Verfahren zur Kristallisation von 2'-FL aus dem wässrigen Kulturmedium.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur selektiven Kristallisation von 2'-FL aus einer wässrigen Lösung, die aus einem wässrigen Kulturmedium abgeleitet ist, das 2'-FL und ein von 2'-FL verschiedenes fucosyliertes Kohlenhydrat, vorzugsweise DFL, enthält, durch Zugabe eines oder mehrerer C₁-C₄-Alkohole, vorzugsweise Methanol, zu der wässrigen Lösung. Ebenfalls bevorzugt ist eine wässrige Lösung von 35-80 Gew.-% hinsichtlich ihres Kohlenhydratgehalts, wovon 45-95 Gew.-% auf 2'-FL entfallen und das Verhältnis 2'-FL/DFL nicht weniger als etwa 1:1 beträgt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Als Ergebnis der jüngsten Entwicklungen bei der Herstellung von 2'-FL durch die Kultivierung von gentechnisch veränderten E. coli wurden wässrige Fermentationsbrühen mit einem deutlich höheren Titer von 2'-FL hergestellt, z.B. mindestens 75 Gramm, vorzugsweise mindestens 100 Gramm, insbesondere bei etwa oder mehr als 115 Gramm 2'-FL pro Liter des Kulturmediums. Es wurden jedoch auch andere fucosylierte Kohlenhydrate als 2'-FL, insbesondere 2',3-di-O-Fucosyllactose (DFL), sowie 2'-O-Fucosyl-Lactulose als Nebenprodukte in solchen hochtitrigen wässrigen Fermentationsbrühen in einem Gewichtsverhältnis von DFL/2'-FL von 2:8 bis 1:9 gefunden. Darüber hinaus konnte je nach Fermentationsprotokoll auch Laktose in solchen hochtitrigen wässrigen Brühen nachgewiesen werden.
Es wurde nun entdeckt, dass 2'-FL selektiv aus einer hochtitrigen wässrigen Lösung, die aus einer solchen hochtitrigen Fermentationsbrühe gewonnen wird, durch Behandlung der wässrigen Lösung mit einem oder mehreren C₁-C₄-Alkoholen, vorzugsweise Methanol, kristallisiert werden kann. Diese selektive Kristallisation ist besonders vorteilhaft und überraschend, wenn die wässrige Lösung auch andere fucosylierte Kohlenhydrate und/oder Lactose enthält. Diese selektive Kristallisation liefert 2'-FL von hoher Reinheit in einem Schritt, und typischerweise kann die Kristallisation von Chargen von mindestens 100 g 2'-FL, wie z.B. mindestens 1 kg oder mindestens 100 kg oder sogar mindestens 1 Tonne 2'-FL, mit einem weiten Konzentrationsbereich der kontaminierenden zuckerähnlichen Verbindungen in der wässrigen Fermentationsbrühe erreicht werden.
Dementsprechend ist ein Aspekt dieser Erfindung ein Verfahren zur selektiven Kristallisation von 2'-FL, dadurch gekennzeichnet, dass die Kristallisation aus einer wässrigen Lösung, vorzugsweise einer Fermentationsbrühe, die 2'-FL und ein von 2'-FL verschiedenes fucosyliertes Kohlenhydrat enthält, durch Zugabe eines oder mehrerer C₁-C₄-Alkohole zu der wässrigen Lösung durchgeführt wird. Das resultierende kristalline 2'-FL ist vorzugsweise ein Polymorph II, wie in WO 2011/150939 beschrieben.
Der Begriff „C₁-C₄-Alkohol“ bezieht sich vorzugsweise auf einen Mono- oder Dihydroxyalkohol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, i-Propanol, n-Butanol, i-Butanol, s-Butanol, t-Butanol, Ethylenglykol, Propylenglykol, etc. Vorzugsweise wird (werden) Monohydroxyalkohol(e) wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, i-Propanol, n-Butanol, i-Butanol, s-Butanol oder t-Butanol verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die wässrige Lösung 35-80 Gew.-%, vorzugsweise 40-68 Gew.-%, bevorzugter 45-60 Gew.-%, insbesondere 50-56 Gew.-% der Gesamtkohlenhydrate einschließlich 2'-FL und andere fucosylierte und nicht-fucosylierte Kohlenhydrate. Die oben genannten Konzentrationsbereiche können leicht durch Aufkonzentrieren des wässrigen Überstandes aus der Fermentation erreicht werden, vorzugsweise nach Entfernung von z.B. Zellen, Proteinen, Proteinfragmenten, DNA, karamelisierten Nebenprodukten, Salzen und/oder geladenen Molekülen. Diese Konzentrationsbereiche können auf konventionelle Weise erreicht werden, z.B. durch Abdestillieren von Wasser bei reduziertem Druck (20-100 mbar) und bei Umgebungstemperatur bis zu 40-60 °C oder durch Nanofiltration.
Die so entstandene wässrige Lösung wird dann bei etwa 40-60 °C gehalten, und der Lösung werden ein oder mehrere C₁-C₄-Alkohole, vorzugsweise in heißer Form, zugegeben. Die so entstandene wässrige alkoholische Lösung wird bei gleicher Temperatur typischerweise 0,5-3 Stunden gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt, wobei es zur spontanen Kristallisation kommt. Die Kristallisation kann durch Zugabe von Impfkristallen eingeleitet werden.
Vorzugsweise sollten 45-95 % des Gesamtkohlenhydratgehalts, einschließlich 2'-FL und anderer fucosylierter und nicht-fucosylierter Kohlenhydrate, in der wässrigen Lösung vor der Kristallisation 2'-FL sein. Die oben definierten Kristallisationsbedingungen erlauben einen weiten Bereich von 2'-FL-Gehalten im Verhältnis zum Gesamtkohlenhydratgehalt, unter dem eine selektive Kristallisation von 2'-FL in hoher Ausbeute und guter Reinheit durchgeführt werden kann. Dementsprechend kann die selektive Kristallisation aus einer wässrigen Lösung durchgeführt werden, die 35-80 Gew.-% bezogen auf ihren Gesamtkohlenhydratgehalt, bestehend aus 2'-FL und anderen fucosylierten und nicht fucosylierten Kohlenhydraten, aufweist und zu etwa 50 % oder etwa 60 % oder etwa 70 % oder etwa 80 % oder etwa 90 % aus 2'-FL besteht.
Vorzugsweise ist das Volumen des einen oder mehrerer C₁-C₄-Alkohole, die der oben beschriebenen wässrigen Lösung zuzusetzen sind, etwa 3-9-fach, bezogen auf das Gewicht von 2'-FL in dieser wässrigen Lösung, noch bevorzugter können etwa 4-8 Volumina und noch bevorzugter etwa 5-7 Volumina, bezogen auf das Gewicht von 2'-FL, in einer, zwei oder sogar mehreren Portionen zugegeben werden.
Ebenfalls vorzugsweise ist das fucosylierte Kohlenhydrat in der wässrigen Lösung, das sich von 2'-FL unterscheidet eine fucosylierte Lactose anders als 2'-FL und/oder eine fucosylierte Lactulose, vorzugsweise eine andere fucosylierte Lactose als 2'-FL. Eine fucosylierte Lactose außer 2'-FL kann jede monofucosylierte Lactose außer 2'-FL sein, die während der Fermentation als Folge einer mangelhaften, defekten oder beeinträchtigten Fucosylierung außer einer α-1,2-Fucosylierung an der Galactose-Einheit der Lactose (z.B. einer, die zu 3-O-Fucosyllactose (3-FL) führt), oder der Fucose-Migration von 2'-FL unter der Kultivierungsbedingung oder bei postfermentiven Operationen oder der Fucose-Hydrolyse von multifucosylierter, vorzugsweise difucosylierter Lactose, gebildet wird. Eine andere fucosylierte Lactose als 2'-FL kann auch eine multifucosylierte, vorzugsweise difucosylierte Lactose sein, die durch Überfucosylierung von Lactose unter den Kultivierungsbedingungen gebildet werden kann. Bei der difukosylierten Lactose handelt es sich vorzugsweise um 2,2'-Di-O-Fucosyllactose oder 2',3-di-O-Fucosyllactose (DFL), insbesondere DFL als charakteristisches Nebenprodukt, das bei der fermentativen Herstellung von 2'-FL entsteht.
In einer bevorzugteren Ausführungsform eines Verfahrens zur selektiven Kristallisation von 2'-FL aus einer wässrigen Lösung, die 2'-FL und DFL enthält, kann das Gewichtsverhältnis 2'-FL/DFL in weiten Bereichen variieren, ohne dass die Gefahr besteht, dass DFL neben 2'-FL signifikant mitkristallisiert, beträgt aber nicht weniger als 1:1. So arbeitet die selektive Kristallisation effektiv bei einem 2'-FL/DFL-Verhältnis von mehr als 1:1, vorzugsweise mehr als 2:1, bevorzugter mehr als 4:1, noch bevorzugter mehr als 6:1, insbesondere zwischen 8:1 und 12:1.
Die wässrige Lösung, die 2'-FL und DFL enthält, aus der 2'-FL selektiv kristallisiert werden kann, kann weitere kohlenhydratähnliche Verunreinigungen wie 2-O-Fucosyllactulose, Lactose, Lactulose, Fucose, Glucose, Galactose u.ä. enthalten. Diese Verunreinigungen können während der Fermentation oder in den nach der Fermentation durchgeführten Aufreinigungs-/Isolationsschritten z.B. durch Umlagerung (z.B. 2-O-Fucosyllactulose, Lactulose) oder durch Hydrolyse (z.B. Fucose, Glucose, Galactose, Lactose) entstanden sein, oder es kann sich um ein nicht verbrauchtes Edukt oder einen während der Fermentation zugesetzten Inhaltsstoff handeln (z.B. Lactose als Akzeptor, Glucose als Kohlenstoffquelle). Diese zuckerähnlichen Verunreinigungen werden in der für die Kristallisation zu verwendenden wässrigen Lösung in einer Konzentration von maximal 1-2 Gew.-% (einzeln) bzw. 5-7 Gew.-% (insgesamt) nachgewiesen. Typischerweise kann die wässrige Lösung, die 2'-FL und DFL enthält und für Kristallisationszwecke verwendet werden soll, weiterhin Lactose als unbenutzten Akzeptor enthalten, der während der Fermentation zur Herstellung von 2'-FL aus Lactose durch Fucosylierung in weniger als 1 Gew.-% zugesetzt wird.
Doch vorzugsweise wird das Verfahren zur Kristallisation von 2'-FL aus einer wässrigen Lösung, die 2'-FL und ein von 2'-FL verschiedenes fucosyliertes Kohlenhydrat, vorzugsweise DFL, enthält, durch Zugabe von nur einem C₁-C₄-Alkohol, bevorzugter einem C₁-C₂-Alkohol (d.h. Methanol oder Ethanol), unter denen Methanol die bevorzugte Wahl für einen Alkohol ist, durchgeführt.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur selektiven Kristallisation von 2'-FL umfasst die zur Kristallisation verwendete wässrige Lösung 2'-FL, DFL und gegebenenfalls Lactose in einer Konzentration von 40-68 Gew.-%, bevorzugter 45-60 Gew.-%, insbesondere 50-56 Gew.-%. Der Anteil von 2'-FL an der oben definierten Kohlenhydratmasse der oben definierten wässrigen Lösung beträgt mehr als etwa 80 %, vorzugsweise mehr als etwa 85 % und insbesondere etwa 90 %. Das Verhältnis 2'-FL/DFL in der oben definierten Kohlenhydratmasse liegt bei 8:1 bis 12:1 nach Gewicht. Zu dieser wässrigen Lösung wird, vorzugsweise nach Erwärmung auf etwa 45-55 °C und unter Rühren, Methanol, vorzugsweise in 2-3 etwa gleichen Portionen, zugegeben, wobei die Temperatur im vorgegebenen Bereich gehalten wird. Nach der Zugabe der gesamten Methanolmenge, die typischerweise 4-8 Volumina beträgt, vorzugsweise 5-7 Volumina, bezogen auf das Gewicht von 2'-FL in der wässrigen Lösung, wird die Temperatur des gerührten Gemisches 0,5-2 Stunden lang auf dem gleichen Niveau wie bei der Methanolzugabe gehalten, dann lässt man das Gemisch auf Raumtemperatur abkühlen, bei der das Rühren 12-24 Stunden lang fortgesetzt wird. Die Kristallisation erfolgt spontan bei der Zugabe von Methanol oder in der Kühlphase, kann aber durch die Zugabe von 2'-FL-Impfkristallen erleichtert werden.
Nach einer weiteren bevorzugten Realisierung des Verfahrens zur selektiven Kristallisation von 2'-FL enthält die wässrige Ausgangsmischung 2'-FL, DFL und gegebenenfalls Lactose in einer Konzentration von 50-80 Gew.-%, bevorzugter 55-70 Gew.-%, insbesondere etwa 60-68 Gew.-%. Der Anteil von 2'-FL in der oben definierten Kohlenhydratmasse der oben definierten wässrigen Lösung beträgt etwa 48-65 %, und das Verhältnis 2'-FL/DFL in der oben definierten Kohlenhydratmasse beträgt etwa 1:1 bis 2:1 nach Gewicht. Zu dieser wässrigen Lösung wird, vorzugsweise nach Erwärmung auf etwa 55-60 °C und unter Rühren, Methanol, vorzugsweise in 2-3 etwa gleichen Portionen, zugegeben, wobei die Temperatur im vorgegebenen Bereich gehalten wird. Nach der Zugabe der gesamten Menge Methanol, die typischerweise etwa 5-8,5 Volumina beträgt, vorzugsweise etwa 6,5-7,5 Volumina bezogen auf das Gewicht von 2'-FL in der wässrigen Lösung, wird die Temperatur des gerührten Gemisches 0,5-2 Stunden lang auf der gleichen Temperatur wie bei der Methanolzugabe gehalten, dann lässt man das Gemisch auf Raumtemperatur abkühlen, bei der das Rühren 12 Stunden bis 3 Tage fortgesetzt wird. Die Kristallisation erfolgt spontan bei der Zugabe von Methanol oder in der Kühlphase, kann aber durch die Zugabe von 2'-FL-Impfkristallen erleichtert werden.
Die wäßrige Lösung zur selektiven Kristallisation von 2'-FL nach der oben im einzelnen beschriebenen vorliegenden Erfindung, die 2'-FL und ein von 2'-FL verschiedenes fucosyliertes Kohlenhydrat, vorzugsweise DFL, enthält, wird durch ein Verfahren hergestellt, das die Schritte umfaßt:

i. Kultivierung einer genetisch modifizierten Zelle, vorzugsweise einer E. coli-Zelle, die ein rekombinantes Gen aufweist, das für eine α-1,2-Fucosyltransferase kodiert und in der Lage ist, 2'-FL durch Fucosylierung von Lactose zu produzieren, in einem wässrigen Kulturmedium, das Lactose enthält, und
ii. Abtrennung der wässrigen Kohlenhydratfraktion, die 2'-FL und eine andere fucosylierte Lactose als 2'-FL, vorzugsweise DFL, umfasst, von Nicht-Kohlenhydratpartikeln und Verunreinigungen der Fermentationsbrühe.

Schritt ii) in dem oben genannten Verfahren kann einen konventionellen Demineralisierungsschritt umfassen, bei dem Mineralien, Salze und andere geladene Moleküle vor der Kristallisation aus der wässrigen Lösung extrahiert werden. Die Demineralisierung kann mit herkömmlichen Ionenaustauscherharzen durchgeführt werden, indem die wässrige Lösung durch ein Kationenaustauscherharz in H⁺-Form und ein Anionenaustauscherharz in Form einer freien Base geleitet wird. Das Kationenaustauscherharz ist vorzugsweise ein starker, das Anionenaustauscherharz ein schwacher Austauscher. Die lonenaustauscherharze können neben der Entfernung von Salzen und geladenen Molekülen aus der Lösung auch Proteine, DNA und Farbstoff-/Karamellkörper, die nach vorherigen Reinigungsschritten gegebenenfalls in der Lösung verblieben sind, physikalisch adsorbieren. Alternativ kann die Demineralisierung auch mittels einer konventionellen Elektrodialyse durchgeführt werden. Die so gewonnene Lösung kann dann entweder durch einen konventionellen Verdampfungsschritt oder durch eine konventionelle Nanofiltration aufkonzentriert werden.
Darüber hinaus kann Schritt ii) im obigen Verfahren weiterhin eine konventionelle Holzkohlebehandlung, vorzugsweise vor dem Demineralisierungsschritt, umfassen, um Farbkörper und gegebenenfalls wasserlöslichen Biojunk zu entfernen, der gegebenenfalls aus früheren Reinigungsschritten übriggeblieben ist. Die Kohlenhydratverbindungen haben eine starke Affinität zur Adsorption an Holzkohle in wässrigem Medium, so dass wasserlösliche Verunreinigungen leicht mit (destilliertem) Wasser weggespült werden können. Die Kohlenhydrate können dann mit Alkohol oder wässrigem Alkohol aus dem Kohlebett eluiert werden.
Darüber hinaus kann Schritt ii) im oben genannten Verfahren einen konventionellen Klärschritt zur Entfernung von Zellen, Zellfragmenten und Proteinen nach der Fermentation, vorzugsweise vor der oben beschriebenen Holzkohlebehandlung, umfassen. Die Klärung kann auf konventionelle Weise erfolgen, z.B. durch Sedimentation in einer Zentrifuge, wobei eine geklärte oder teilweise geklärte Überstandslösung entsteht. Alternativ kann die Fermentationsbrühe auf herkömmliche Weise einer Ultrafiltration unterzogen werden, um hochmolekulare Bestandteile zu entfernen. Die semipermeable Membran, die für die Ultrafiltration einer 2'-FL-Fermentationsbrühe verwendet wird, kann in geeigneter Weise einen Cut-off von 5-50 kDa, vorzugsweise 10-25 kDa, bevorzugterweise etwa 15 kDa, aufweisen. Abhängig von den Eigenschaften der zu klärenden Fermentationsbrühe können Kombinationen aus höher und niedriger abgeschnittenen Membranen (in dieser Reihenfolge) innerhalb des oben angegebenen Bereichs eingesetzt werden. Optional kann auf die Zentrifugation oder Ultrafiltration eine Nanofiltration folgen, bei der die wässrige Lösung, die 2'-FL und begleitende Kohlenhydrate enthält, auf herkömmliche Weise konzentriert wird, bevor sie mit Holzkohle behandelt wird. In diesem Nanofiltrationsschritt kann seine Membran eine Porengröße haben, die eine Rückhaltung von 2'-FL mit einem Molekulargewicht von 488 gewährleistet; daher kann typischerweise eine 200-300 Da Cut-off-Membran verwendet werden.
Schritt i) in dem oben genannten Verfahren umfasst vorzugsweise die Herstellung von 2'-FL in hohem Titer. Es wird ein E. coli-Stamm, insbesondere ein E. coli LacZ^-Y⁺-Stamm, verwendet, der nur eine rekombinante Glykosyltransferase aufweist, die eine α-1,2-Fucosyltransferase ist, vorzugsweise eine α-1,2-Fucosyltransferase, die durch das futC-Gen aus Helicobacter pylori kodiert wird. Zur Herstellung einer Mischung von 2'-FL in hoher Ausbeute umfasst das Verfahren vorzugsweise: a) Für das Kulturmedium Bereitstellen einer Kohlenstoff- und Energiequelle und mindestens 50, vorzugsweise mindestens 75, noch bevorzugter mindestens 100, noch bevorzugter mindestens 125 Gramm Laktose, bezogen auf 1 Liter des ursprünglichen Kulturvolumens. Das Verfahren umfasst außerdem vorzugsweise: b) die Zufuhr von Laktose zum Kulturmedium für mehr als 4 Tage, vorzugsweise bis zu 7 Tagen, vorzugsweise in kontinuierlicher Weise. Es wird besonders bevorzugt, dass das Verfahren die beiden Schritte a) und b) umfasst. Es wird auch besonders bevorzugt, dass das Endvolumen des Nährbodens nicht mehr als das Dreifache, vorzugsweise nicht mehr als das Zweifache, insbesondere weniger als das Zweifache des Volumens des Nährbodens beträgt, bevor die Laktose und die Kohlenstoff- und Energiequelle, vorzugsweise Glyzerin, dem Nährboden zugeführt werden. Die Kultivierung erfolgt vorzugsweise in folgender Weise:

- eine erste Phase exponentiellen Zellwachstums, das durch ein Substrat auf Kohlenstoffbasis gewährleistet wird, und
- eine zweite Phase des Zellwachstums, die durch eine kontinuierlich zugeführte Kohlenstoff- und Energiequelle zusammen mit der kontinuierlich zugeführten Laktose begrenzt wird.

BEISPIELE
Beispiel 1
Die Produktion von 2'-FL in hoher Ausbeute
Bakterienstämme und Inokulumvorbereitung:
Gentechnisch verändertes E. coli wurde aus E. coli K-Stamm gemäß WO 01/04341 und Drouillard et al. Angew konstruiert. Chem. Int. Ed. Eng. 45, 1778 (2006), durch die Deletion von Genen, die Laktose, die Oligosaccharidprodukte und ihre Stoffwechselzwischenprodukte abbauen können, u. a. die Gene lacZ, lacA und wcaJ, die Beibehaltung der an der GDP-Fucosebiosynthese beteiligten manB-, manC-, gmd- und wcaG-Gene und die Einfügung des H. pylori futC-Gens für α-1,2-Fucosyltransferase als einzige Glycosyltransferase.
Fermentationsbedingungen:
Glucose, Glycerin, Isopropylthio-β-D-Galactopyranosid (IPTG) und Lactose wurden jeweils bei 120 °C sterilisiert.
Die Kultur wurde in einem 3 I Fermenter mit 1,5 I mineralischem Kulturmedium durchgeführt (Samain et al. J. Biotechnol. 72, 33 (1999)). Die Temperatur wurde auf 33 °C gehalten und der pH-Wert mit 28% NH₄OH auf 6,8 reguliert. Das Inokulum (1 % des Volumens des Basalmediums) bestand aus einem LB-Medium und der Kultur des produzierenden Stammes. Die exponentielle Wachstumsphase begann mit der Inokulation und endete bis zur Erschöpfung der Kohlenstoffquelle (Glukose 17,5 g/l), die dem Medium anfänglich zugegeben wurde. Der Induktor (Isopropyl Thio-β-D-Galactopyranosid, IPTG, 1-2 ml einer 50 mg/ml Lösung) wurde am Ende der Exponentialphase zugegeben. Dann wurde ein Fed-Batch realisiert, bei dem 1 I einer Dosierungslösung mit 500 g Glycerin und 160-200 g in Wasser gelöster Laktose verwendet wurde, die der Kultur während 4-7 Tagen zugesetzt wurde. Am Ende der Fermentation schwankte die 2'-FL-Konzentration zwischen 68-114 g/l, und das Verhältnis 2'-FL:DFL schwankte in der entstandenen Mischung zwischen etwa 80:20 bis 88:12. Fucosylierte Lactulose (2'-O-Fucosyl-Lactulose) war in dieser Mischung nicht mehr als 1 % enthalten.
Beispiel 2
Reinigung der Brühe
Zellen und Proteine wurden durch Ultrafiltration entfernt und die erhaltene Lösung wurde durch Nanofiltration auf ca. 400 ml konzentriert (die Lösung enthielt ≈93 g 2'-FL, ≈10.5 g DFL und ≈0.5 g Laktose). Die Lösung wurde dann mit Holzkohle (8 g) zur Entfärbung behandelt. Die entfärbte Lösung wurde durch ein starkes Kationenaustauscherharz (H⁺-Form) und ein schwaches Anionenaustauscherharz (freie Basenform) eluiert, um sie zu entmineralisieren und die Restfarbe aufzufangen (Elutionsmittel: entmineralisiertes Wasser). Eine Trennung der Kohlenhydrate wurde nicht beobachtet. Die kohlenhydratpositiven Fraktionen wurden gepoolt und bei 40 °C bei reduziertem Druck (20-30 mbar) auf 216 g konzentriert. Die Analyse der resultierenden fast farblosen Lösung zeigte keinen Verlust von 2'-FL, DFL und Laktose durch Adsorption an die Kohle und die Harze sowie das Vorhandensein von ≈10-15 g nicht analysierter anderer Verunreinigungen.
Beispiel 3
Selektive Kristallisation von 2'-FL aus einem 2'-FL/DFL-Gemisch ≈8.9:1
Das Konzentrat aus Beispiel 2 wurde dann auf 50 °C erhitzt und 280 ml Methanol unter Rühren langsam und unter Beibehaltung der Temperatur zugegeben. Nach Zugabe von Impfkristallen (50 mg) wurde eine weitere Portion Methanol (280 ml) bei 50 °C langsam zugegeben und das Rühren bei dieser Temperatur 1 Stunde lang fortgesetzt. Die Kristallisationslösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und 18 Stunden gerührt. Der Feststoff wurde gefiltert, mit kaltem Methanol gewaschen und unter Vakuum (15 mbar) bei 50 °C 16 Stunden lang getrocknet, um 82 g weißer Kristalle zu erhalten. 2'-FL- Assay mittels HPLC: 97,8 %, mittels IC: 97,1 %; Wassergehalt: 0,64 % (KF); relative Reinheit von 2'-FL bei HPLC: 99,1 %, bei IC: 99,4 %; Ausbeute der selektiven Kristallisation: 86 %.
Beispiel 4
Selektive Kristallisation von 2'-FL aus einem 2'-FL/DFL-Gemisch ≈1:1
Die Mutterlauge aus Beispiel 3 wurde gefriergetrocknet. Eine Probe des gefriergetrockneten Pulvers (20 g, mit ≈8.4 g 2'-FL, ≈8.4 g DFL und ≈0.3 g Laktose) wurde in Wasser (5 ml) und Methanol (60 ml) bei 60 °C aufgenommen, die Mischung wurde angeimpft und 1 Stunde lang gerührt, dann auf Raumtemperatur abgekühlt und 3 Tage gerührt. Die weißen Kristalle wurden abfiltriert und getrocknet und ergaben 6,9 g. 2'-FL-Assay mittels HPLC: 93,3 %.
Beispiel 5
Selektive Kristallisation von 2'-FL aus einem 2'-FL/DFL-Gemisch ≈1.7:1
Die Kristallisation wurde gemäß Beispiel 3 aus einer Lösung durchgeführt, die ≈23 g 2'-FL, ≈2.5 g DFL und ≈0.15 g Laktose (100 ml) enthält, die aus einer Fermentationsbrühe nach Ultra- und Nanofiltration gewonnen wurde, um 18.7 g 2'-FL zu erhalten. Das Methanol wurde aus der Mutterlauge abdestilliert und auf 11 g Gewicht konzentriert (mit ≈4.2 g 2'-FL und ≈2.5 g DFL). Der entstandene Sirup wurde auf 60 °C erwärmt und portionsweise Methanol (30 ml) zugegeben, zwischen zwei Portionen Methanol wurde die Lösung angeimpft. Nach 1 Stunde Rühren unter Rückfluss wurde die Suspension auf Raumtemperatur abgekühlt, die Kristalle wurden abgefiltert, gewaschen und getrocknet, um 3,2 g 2'-FL zu erhalten.
Beispiel 6
Selektive Kristallisation von 2'-FL aus einer 2'-FL/DFL-Mischung ≈10.2:1
Eine wässrige Lösung, die 173 g 2'-FL, 17 g DFL und 4 g Laktose (600 ml) enthält und aus einer Fermentationsbrühe nach Ultrafiltration, Nanofiltration und Behandlung mit Holzkohle und Ionenaustauscherharzen, wie in Beispiel 2 angegeben, gewonnen wurde, wurde durch Vakuumdestillation (70-100 mbar, 50-60 °C) auf etwa 270 ml konzentriert. Die resultierende Mischung wurde mit Methanol (1040 ml) versetzt, wobei die Lösung bei etwa 50 °C gehalten wurde. Anschließend wurden die Impfkristalle zugegeben und das Rühren wurde bei 50 °C für 1 Stunde und bei Raumtemperatur für 15 Stunden fortgesetzt. Die Kristalle wurden abgefiltert, mit kaltem Methanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet, so dass 158 g weißer Feststoff (91 %) entstanden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2010/070104 [0002]
WO 2012/007481 [0002]
WO 2012/097950 [0002]
WO 2012/112777 [0002]
WO 2010/070616 [0004]
WO 2011/150939 [0004, 0009]
WO 2014/009921 [0004]
WO 0104341 [0026]

Claims

Kristallisierte 2-O'-Fucusyllactose (2'-FL), hergestellt nach einem Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst: i. Kultivieren einer genetisch modifizierten Zelle mit einem rekombinanten Gen, das für eine 1,2-Fucosyltransferase kodiert und in der Lage ist, 2'-FL durch Fucosylierung von Lactose zu erzeugen, in einem wässrigen Kulturmedium, das Lactose enthält, ii. Abtrennen der wässrigen Lösung von Nicht-Kohlenhydratpartikeln und Verunreinigungen des wässrigen Kulturmediums, wobei die wässrige Lösung 2'-FL und ein von 2'-FL verschiedenes fucosyliertes Kohlenhydrat umfasst, wobei die wässrige Lösung 35-80 Gew.-% in Bezug auf ihren Kohlenhydratgehalt beträgt, wobei 45-95 Gew.-% der Kohlenhydrate in der wässrigen Lösung 2'-FL sind, und iii. Kristallisieren von 2'-FL aus der wässrigen Lösung.
Das kristallisierte 2'-FL nach Anspruch 1, wobei das von 2'-FL verschiedene fucosylierte Kohlenhydrat eine von 2'-FL verschiedene monofucosylierte Lactose, eine multifucosylierte Lactose, vorzugsweise eine difucosylierte Lactose, bevorzugter 2,2'-di-O-Fucosyllactose oder 2',3-di-O-Fucosyllactose (DFL), besonders bevorzugt DFL, ist.
Das kristallisierte 2'-FL nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die wässrige Lösung weiterhin als Nebenprodukte DFL und/oder 2'-O-Fucusyllactulose enthält.
Das kristallisierte 2'-FL nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die fucosylierte Lactose, die nicht 2'-FL ist, DFL ist.
Das kristallisierte 2'-FL nach Anspruch 4, wobei das 2'-FL/DFL-Verhältnis nicht weniger als etwa 1:1, bezogen auf das Gewicht, beträgt.
Das kristallisierte 2'-FL nach Anspruch 5, wobei das Verhältnis 2'-FL/DFL in der wässrigen Lösung mehr als 1:1, vorzugsweise mehr als 2:1, bevorzugter mehr als 4:1, noch bevorzugter mehr als 6:1, insbesondere zwischen 8:1 und 12:1, wie etwa 8:2 oder 9:1, beträgt.
Das kristallisierte 2'-FL nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die wäßrige Lösung 2'-FL, DFL und gegebenenfalls Lactose in einer Konzentration von 40-68 Gew.-%, bevorzugter 45-60 Gew.-%, besonders bevorzugt 50-56 Gew.-% der Gesamtkohlenhydrate enthält, wobei der Anteil von 2'-FL in der Kohlenhydratmasse mehr als etwa 80%, bevorzugter etwa 85% und besonders etwa 90% beträgt und das Gewichtsverhältnis 2'-FL/DFL etwa 8:1 bis 12:1 beträgt.
Das kristallisierte 2'-FL nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die wäßrige Lösung 2'-FL, DFL und gegebenenfalls Lactose in einer Konzentration von 50-80 Gew.-%, bevorzugter 55-70 Gew.-%, insbesondere etwa 60-68 Gew.-%, enthält, wobei der Anteil von 2'-FL in der Kohlenhydratmasse etwa 40-65 % und das 2'-FL/DFL-Verhältnis etwa 1:1 bis 2:1, bezogen auf das Gewicht, beträgt.
Das kristallisierte 2'-FL nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die wässrige Lösung einen Titer von 2'-FL von mindestens 75 Gramm, bevorzugter von mindestens 100 Gramm, insbesondere etwa 115 Gramm 2'-FL pro Liter des Kulturmediums, aufweist.
Das kristallisierte 2'-FL nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die wässrige Lösung eine kohlenhydratähnliche Verunreinigung enthält, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 2-O-Fucosyllactulose, Lactose, Lactulose, Fucose, Glucose und Galactose besteht.
Das kristallisierte 2'-FL nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die wässrige Lösung weiterhin Laktose als Verunreinigung enthält.
Das kristallisierte 2'-FL nach einem der Ansprüche 10 oder 11, wobei die Verunreinigung in einer Konzentration von nicht mehr als 1-2 Gew.-% (einzeln) oder 5-7 Gew.-% (insgesamt) in der wässrigen Lösung vorliegt.
Das kristallisierte 2'-FL nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das kristalline 2'-FL ein wasserfreies 2'-FL ist, insbesondere ein 2'-FL-Polymorph II.
Das kristallisierte 2'-FL nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das kristallisierte 2'-FL eine Reinheit von 93,3 % bis 99,4 % aufweist.
Das kristallisierte 2'-FL nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei Schritt ii. weiterhin einen Klärungsschritt zur Entfernung von Zellen, Zellfragmenten und Proteinen umfasst.
Das kristallisierte 2'-FL nach Anspruch 15, wobei der Klärschritt durch Sedimentation mit einer Zentrifuge oder alternativ durch Ultrafiltration erfolgt.
Das kristallisierte 2'-FL nach Anspruch 16, wobei auf die Zentrifugation oder Ultrafiltration eine Nanofiltration folgt, vorzugsweise unter Verwendung einer Membran, die die Rückhaltung von 2'-FL gewährleistet, noch bevorzugter eine Trennmembran zwischen 200-300 Da.
Das kristallisierte 2'-FL nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei Schritt ii. weiterhin einen Holzkohlebehandlungsschritt umfasst.
Das kristallisierte 2'-FL nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei Schritt ii. weiterhin einen Schritt zur Demineralisierung und/oder Entfärbung der in Schritt i. erhaltenen Fermentationsbrühe umfasst.
Das kristallisierte 2'-FL nach Anspruch 19, wobei der Schritt zur Demineralisierung und/oder Entfärbung der in Schritt i erhaltenen Fermentationsbrühe eine lonenaustauscherharzbehandlung ist.
Das kristallisierte 2'-FL nach Anspruch 20, wobei die Behandlung des Ionenaustauscherharzes das Durchleiten der wässrigen Lösung durch ein Kationenaustauscherharz in H⁺-Form und ein Anionenaustauscherharz in freier Basenform umfasst.
Das kristallisierte 2'-FL nach Anspruch 20 oder 21, wobei der Behandlung mit dem lonenaustauscherharz eine Ultrafiltration der in Schritt i erhaltenen Fermentationsbrühe vorausgeht.
Das kristallisierte 2'-FL nach Anspruch 19, wobei der Schritt zur Demineralisierung der in Schritt i erhaltenen Fermentationsbrühe durch Elektrodialyse durchgeführt wird.
Das kristallisierte 2'-FL nach einem der Ansprüche 19 bis 23, wobei auf die Demineralisierung ein Verdampfungsschritt oder ein Nanofiltrationsschritt folgt.
Das kristallisierte 2'-FL nach einem der Ansprüche 19 bis 24, wobei dem Demineralisierungsschritt eine Holzkohlebehandlung vorausgeht.
Das kristallisierte 2'-FL nach einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei die Kristallisation durch Zugabe eines oder mehrerer C₁-C₄-Alkohole zu der wässrigen Lösung durchgeführt wird.
Das kristallisierte 2'-FL nach Anspruch 26, wobei 3-9 Volumina Alkohol, bezogen auf das Gewicht von 2'-FL, zugegeben werden
Der kristallisierte 2'-FL nach einem der Ansprüche 26 oder 27, wobei der C₁-C₄-Alkohol Methanol oder Ethanol, vorzugsweise Methanol, ist.