CN112920234B - 一种2′-岩藻糖基乳糖的富集纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种2'‑岩藻糖基乳糖的富集纯化方法，使用浓缩的除菌体、除蛋白、除有机溶剂的发酵法生产的2’‑岩藻糖基乳的糖富集液制备2’‑岩藻糖基乳糖。本发明从发酵液中富集2’‑岩藻糖基乳糖的方法简单易行，经济高效，具有较高的回收率，从实验室到工厂只需按比例扩大体系即可，几乎不需要做其他任何改变。且在富集过程中不引入有毒有害物质，只使用了安全的去离子水和无水乙醇，可以保证富集液的安全性且利于下游纯化操作。
Description
技术领域
本发明属于分离纯化领域，具体涉及一种2’-岩藻糖基乳糖的富集纯化方法。
背景技术
临床调研表明，母乳喂养的婴幼儿在烦躁程度、哭闹时间、吐痰次数等劣性表观行为上要明显优于非母乳喂养的宝宝，甚至在上呼吸道感染、肺炎、尿道炎、过敏等幼儿常见疾病的患病频率上也显著低于非母乳喂养的。于是，母乳喂养被奉为抚养婴幼儿的圣经宝典，母乳的成分也被誉为婴幼儿食品的黄金标准。
最新研究表明，母乳喂养所带来的种种有益功能，都与母乳中的低聚糖成分息息相关。因此，作为母乳低聚糖中含量最高的2’-岩藻糖基乳糖(2’-Fucosyllactose，2’-FL)，自然成为了关注的热点。大量有关2’-岩藻糖基乳糖制备方法的文献与专利被陆续发表和刊登，有关人工合成2’-岩藻糖基乳糖安全性的研究也表明其具有较高的安全性，2’-岩藻糖基乳糖也相继在2015年和2016年获得FDA和欧盟的批准被纳入婴儿配方奶粉的合法成分。
随着化学和生物合成技术的不断进步，2’-岩藻糖基乳糖现已能够利用化学合成、酶法和生物合成法来进行工业化生产，但化学法生产存在诸多弊端，如合成步骤过多，副产物复杂，其反应体系需要大量有机溶剂，处理不当会对环境产生污染等；而酶法生产效率低，生产条件苛刻，工具酶生产本身就需要复杂的生产过程，且价格不菲；生物发酵生产的2’-岩藻糖基乳糖，相对于其他生产方法其产能高，易扩大，更安全，但由于发酵液成分复杂，分离制备难度高，目前常规采用的制备柱法纯化费用高昂，纯化成本占到了总生产成本的80％甚至更高。这导致2’-岩藻糖基乳糖发酵产业整体产能过低，且优质2’-岩藻糖基乳糖产物价格高昂，难以满足广大人民群众的需求。因此，找到一种廉价且高效的纯化方法，是降低2’-岩藻糖基乳糖生产成本以及提高2’-岩藻糖基乳糖整体产能的不二法门。
发明内容
本发明提供了一种从发酵液中富集及纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法，且该方法快速高效且廉价。
一种2'-岩藻糖基乳糖的富集纯化方法，使用浓缩的除菌体、除蛋白、除有机溶剂的发酵法生产的2’-岩藻糖基乳的糖富集液制备2’-岩藻糖基乳糖。
一种2'-岩藻糖基乳糖的富集纯化方法，具体步骤如下：
1)活性炭层析柱预处理：用不锈钢筛网筛选30目到120目粉末状椰壳活性炭，将筛选好的活性炭用去离子水清洗10遍，直到水面澄清，置于105℃烘箱中过夜彻底烘干，烘干后加入20％的乙醇水溶液搅拌洗涤后弃去洗液，再加入60％乙醇水溶液搅拌洗涤后弃去洗液，最后使用无水乙醇搅拌洗涤后湿法装柱，装柱后用洗耳球轻击玻璃层析柱表面，加快活性炭填料沉降，静置过夜后逐级使用80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％乙醇水溶液和超纯水各平衡2-6个柱体积；
2)层析纯化2’-岩藻糖基乳糖：先用去离子水平衡活性炭层析柱2-6个柱体积，然后上样2’-岩藻糖基乳糖富集液，随后按照去离子水2-4柱体积，10％乙醇2-6柱体积，15％乙醇1-2柱体积的顺序洗脱杂质，再使用15％-35％乙醇水溶液2-6柱体积洗脱2’-岩藻糖基乳糖并收集，最后用80％乙醇洗脱2-6个柱体积再生填料；再生填料可以使用活性炭填料。
活性炭层析柱预处理一般用酸水和碱水处理活性炭目的是使得活性炭内部有机物变性，从而溶出，但由于活性炭自身强大的吸附力，这样不能完全从活性炭中洗脱溶出物，使用梯度乙醇来逐级降低活性炭的吸附力，从而在活性炭不同吸附力下分别洗脱干净，这对后续的层析极其重要。
制备2’-岩藻糖基乳糖：取层析纯化得到的2’-岩藻糖基乳糖洗脱液，置于旋蒸仪低温减压浓缩，再用冷冻干燥法得到2’-岩藻糖基乳糖产品。
优选的，所述2’-岩藻糖基乳的糖富集液是用微生物在培养基中发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的发酵液。
优选的，所述2’-岩藻糖基乳的糖富集液是用大肠杆菌在培养基中发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的发酵液。
优选的，所述2’-岩藻糖基乳的糖富集液是用大肠杆菌E.coli-XYY1在M9培养基中发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的发酵液。
优选的，2’-岩藻糖基乳的糖富集液具体制备方法如下：
1)过滤发酵液：将发酵终止的发酵液从发酵罐中转移至容器中，置于低温冰箱静置过夜，随后加入发酵液中菌体等质量的硅藻土抽滤发酵液，得到澄清发酵液；
2)浓缩发酵液：将澄清发酵液用旋蒸仪低温减压浓缩发酵液，得到浓缩发酵液。
3)除蛋白：在浓缩发酵液中加入2-4倍体积的预冷无水乙醇，充分混合均匀后置于低温冰箱过夜析出蛋白，用高速离心机离心除去蛋白沉淀得到无蛋白浓缩发酵液。
4)富集2’-岩藻糖基乳糖：将无蛋白浓缩发酵液置于旋蒸仪低温减压浓缩后，低温静置过夜后高速离心去除沉淀，得到2’-岩藻糖基乳糖富集液。
用该方法制备的富集液菌体残留低，蛋白残留低，且无有机溶剂残留，和后续的活性炭层析实验完美对接。糖的浓度约为原发酵液的30-100倍。
活性炭层析整个过程从上样到再生完成需要15个体积，流速约2.5个体积每小时，总时长6h；使用凝胶柱和阴阳离子层析柱的组合方法，同样体积的凝胶柱约8h，阴阳离子柱各6h，再生加平衡约6h，加起来在30h以上，比活性炭柱耗时高数倍。
本发明相对于现有技术积极效果在于：
1)本发明从发酵液中富集2’-岩藻糖基乳糖的方法简单易行，经济高效，具有较高的回收率，从实验室到工厂只需按比例扩大体系即可，几乎不需要做其他任何改变。且在富集过程中不引入有毒有害物质，只使用了安全的去离子水和无水乙醇，可以保证富集液的安全性且利于下游纯化操作。
2)本发明的纯化制备方法成本极低。相对于传统制备功能性糖类物质所采用凝胶层析或阴阳离子层析来说，活性炭填料每千克售价不足十元，加上前处理费用也不足十五元，而凝胶层析或阴阳离子层析填料则动辄数百数千元每升，购买此方法所涉及的填料的成本仅有传统方法的几十分之一。另外昂贵的填料则需要更加繁琐的发酵液前处理手续，无形中又增加了生产成本。
3)本发明在常规生产中，生产效率远大于传统工艺。活性炭由于其内表面积巨大，具有超高的流量，在同样规格的层析柱中流量要比凝胶柱或阴阳离子柱高十余倍，这大大缩短了纯化制备所需的时间。
附图说明：
图1是原发酵液示差检测器下的液相色谱图
图2是经过富集的2’-岩藻糖基乳糖富集液示差检测器下的液相色谱图
图3是2’-岩藻糖基乳糖富集液在活性炭层析柱中梯度洗脱的2’-岩藻糖基乳糖浓度曲线
图4是冻干后2’-岩藻糖基乳糖产品复溶后示差检测器下的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。一切熟悉本领域的技术人员均可在此发明的基础上加以改编和应用，以适应自身工艺的需求。
在实例中2’-岩藻糖基乳糖的定量方式采用液相色谱外标定量法，仪器型号为Waters Binary HPLC Pump 1525-Detector 2414/2489，色谱柱采用Phenomenex RezexROA-Organic Acid H+(8％)，2’-岩藻糖基乳糖标准品采用日本Glycarbo的98％标准品。
M9培养基配制
一、先配制1M的MgSO4:MgSO4·7H2O 2.46g加双蒸水10ML溶解，高压灭菌备用；
二、配制1M的Cacl2:CaCl2·6H2O 2.191g加双蒸水10ML溶解，高压灭菌备用；
三、再配制5×M9盐溶液：
Na2PO4·7H2O 12.8g
KH2PO43.0g
NaCl 0.5g
NH4Cl 1.0g
加双蒸水200ml溶解，121度灭菌15分钟，
备注：以上三样分别配制，分别装瓶，可以一起送去高压。
四、配制20％的葡萄糖溶液：4g葡萄糖加双蒸水20ml溶解，0.22微米滤器过滤除菌；
五、无菌操作配制M9培养基
5×M9盐溶液200ml
1M的MgSO42ml
20％的葡萄糖溶液20ml
1M的Cacl20.1ml
加灭菌双蒸水至1000ml。
实施例1：
从发酵液中富集2’-岩藻糖基乳糖：
1)过滤发酵液：将发酵终止的20.8L发酵液从发酵罐中转移至容器中，置于4℃冰箱静置12h后加入917g硅藻土混匀，用孔径10微米的水相滤膜抽滤发酵液，得到19.2L澄清发酵液。发酵液是大肠杆菌E.coli-XYY1在M9培养基中发酵得到的。(取10mL发酵液，8000rpm离心10min，弃去上清，称重湿菌体质量为0.44g，20.8L发酵液总计约917g菌体。)
2)浓缩发酵液：取4L澄清发酵液用旋蒸仪于65度21.8kPa下浓缩至92mL，得到浓缩发酵液。
3)除蛋白：在92mL浓缩发酵液中加入230mL 4度预冷的无水乙醇，充分混合均匀后置于4℃冰箱6h析出蛋白，用高速离心机12000g离心除去蛋白沉淀得到241mL无蛋白浓缩发酵液。
4)富集2’-岩藻糖基乳糖：将241mL无蛋白浓缩发酵液置于旋蒸仪60度20.3kPa下浓缩至34mL，4℃低温静置8h后12000g离心去除沉淀，得到28mL 2’-岩藻糖基乳糖富集液，浓度是原发酵液的30倍。
实施例2：
用实施例1制备的2’-岩藻糖基乳糖富集液纯化制备2’-岩藻糖基乳糖：
1)活性炭层析柱预处理：将购买的粉末状椰壳活性炭用不锈钢筛网过筛，先用80目筛网过滤，取截留下来的较大颗粒活性炭，再过40目筛网，去除截留的大颗粒活性炭。将筛选好的活性炭用去离子水清洗10遍，直到水面澄清，置于105℃烘箱中干燥12h。烘干后加入20％的乙醇水溶液搅拌洗涤30min后弃去洗液，再加入60％乙醇水溶液搅拌洗涤30min后弃去洗液，最后使用无水乙醇搅拌洗涤30min后湿法装柱。装柱采用湿法装柱，将活性炭填料与无水乙醇1:1混匀后快速平稳导入玻璃层析柱中(欣维尔，C368060)，随后用洗耳球轻击玻璃层析柱表面，加快活性炭填料沉降，静置12h后分别使用80％、60％、40％、20％、0％乙醇水溶液冲洗填料。冲洗完成后再静置12h，待填料不再沉降后，用刻度尺测量柱床高度，结合层析柱内径，计算柱体积。
2)层析纯化2’-岩藻糖基乳糖：先用去离子水平衡活性炭层析柱2个柱体积，然后上样2’-岩藻糖基乳糖富集液28mL，随后按照去离子水2柱体积，10％乙醇4柱体积，15％乙醇1柱体积的顺序洗脱杂质，再使用15％乙醇3柱体积洗脱2’-岩藻糖基乳糖并收集，最后用80％乙醇洗脱3个柱体积再生填料。
3)制备2’-岩藻糖基乳糖：取层析纯化得到的2’-岩藻糖基乳糖洗脱液4.5L，置于旋蒸仪60度21.1kPa浓缩至220mL，再用冻干机冻干得到2’-岩藻糖基乳糖产品，产品色谱纯度达85.04％。
实施例3：
从发酵液中富集2’-岩藻糖基乳糖：
1)过滤发酵液：将发酵终止的20.8L发酵液从发酵罐中转移至容器中，置于4℃冰箱静置12h后加入917g硅藻土混匀，用孔径10微米的水相滤膜抽滤发酵液，得到19.2L澄清发酵液。发酵液是大肠杆菌E.coli-XYY1在M9培养基中发酵得到的。(取10mL发酵液，8000rpm离心10min，弃去上清，称重湿菌体质量为0.44g，20.8L发酵液总计约917g菌体。)
2)浓缩发酵液：取4L澄清发酵液用旋蒸仪于65度21.8kPa下浓缩至92mL，得到浓缩发酵液。
5)除蛋白：在92mL浓缩发酵液中加入230mL 4度预冷的无水乙醇，充分混合均匀后置于4℃冰箱6h析出蛋白，用高速离心机12000g离心除去蛋白沉淀得到300mL无蛋白浓缩发酵液。
6)富集2’-岩藻糖基乳糖：将300mL无蛋白浓缩发酵液置于旋蒸仪60度20.3kPa下浓缩至50mL，4℃低温静置8h后12000g离心去除沉淀，得到48mL 2’-岩藻糖基乳糖富集液，浓度是原发酵液的80倍。
实施例4：
用实施例3制备的2’-岩藻糖基乳糖富集液纯化制备2’-岩藻糖基乳糖：
1)活性炭层析柱预处理：将购买的粉末状椰壳活性炭用不锈钢筛网过筛，先用80目筛网过滤，取截留下来的较大颗粒活性炭，再过40目筛网，去除截留的大颗粒活性炭。将筛选好的活性炭用去离子水清洗10遍，直到水面澄清，置于105℃烘箱中干燥12h。烘干后加入20％的乙醇水溶液搅拌洗涤30min后弃去洗液，再加入60％乙醇水溶液搅拌洗涤30min后弃去洗液，最后使用无水乙醇搅拌洗涤30min后湿法装柱。装柱采用湿法装柱，将活性炭填料与无水乙醇1:1混匀后快速平稳导入玻璃层析柱中(欣维尔，C368060)，随后用洗耳球轻击玻璃层析柱表面，加快活性炭填料沉降，静置12h后分别使用80％、60％、40％、20％、0％乙醇水溶液冲洗填料。冲洗完成后再静置12h，待填料不再沉降后，用刻度尺测量柱床高度，结合层析柱内径，计算柱体积约为1.5L。
2)层析纯化2’-岩藻糖基乳糖：先用去离子水平衡活性炭层析柱5个柱体积，然后上样2’-岩藻糖基乳糖富集液28mL，随后按照去离子水4柱体积，10％乙醇4柱体积，15％乙醇1柱体积的顺序洗脱杂质，再使用15％乙醇3柱体积洗脱2’-岩藻糖基乳糖并收集，最后用80％乙醇洗脱1.5个柱体积再生填料。
3)制备2’-岩藻糖基乳糖：取层析纯化得到的2’-岩藻糖基乳糖洗脱液4.5L，置于旋蒸仪60度21.1kPa浓缩至220mL，再用冻干机冻干得到2’-岩藻糖基乳糖产品，产品色谱纯度达85.04％。
Claims (1)
1.一种2'-岩藻糖基乳糖的富集纯化方法，使用浓缩的除菌体、除蛋白、除有机溶剂的发酵法生产的2’-岩藻糖基乳糖的富集液制备2’-岩藻糖基乳糖，所述糖富集液是用大肠杆菌E.coli-XYY1在M9培养基中发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的发酵液，其特征在于，具体步骤如下：
1）活性炭层析柱预处理：用不锈钢筛网筛选30目到120目粉末状椰壳活性炭，将筛选好的活性炭用去离子水清洗10遍，直到水面澄清，置于105℃烘箱中过夜彻底烘干，烘干后加入20%的乙醇水溶液搅拌洗涤后弃去洗液，再加入60%乙醇水溶液搅拌洗涤后弃去洗液，最后使用无水乙醇搅拌洗涤后湿法装柱，装柱后用洗耳球轻击玻璃层析柱表面，加快活性炭填料沉降，静置过夜后逐级使用80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%乙醇水溶液和超纯水各平衡2-6个柱体积；
2）层析纯化2’-岩藻糖基乳糖：先用去离子水平衡活性炭层析柱2-6个柱体积，然后上样2’-岩藻糖基乳糖富集液，随后按照去离子水2-4柱体积，10%乙醇2-6柱体积，15%乙醇1-2柱体积的顺序洗脱杂质，再使用15%-35%乙醇水溶液2-6柱体积洗脱2’-岩藻糖基乳糖并收集，最后用80%乙醇洗脱2-6个柱体积再生填料；
3）制备2’-岩藻糖基乳糖：取层析纯化得到的2’-岩藻糖基乳糖洗脱液，置于旋蒸仪低温减压浓缩，再用冷冻干燥法得到2’-岩藻糖基乳糖产品；
所述2’-岩藻糖基乳糖富集液具体制备方法如下：
1）过滤发酵液：将发酵终止的发酵液从发酵罐中转移至容器中，置于低温冰箱静置过夜，随后加入发酵液中菌体等质量的硅藻土抽滤发酵液，得到澄清发酵液；
2）浓缩发酵液：将澄清发酵液用旋蒸仪低温减压浓缩发酵液，得到浓缩发酵液；
3）除蛋白：在浓缩发酵液中加入2-4倍体积的预冷无水乙醇，充分混合均匀后置于低温冰箱过夜析出蛋白，用高速离心机离心除去蛋白沉淀得到无蛋白浓缩发酵液；
4）富集2’-岩藻糖基乳糖：将无蛋白浓缩发酵液置于旋蒸仪低温减压浓缩后，低温静置过夜后高速离心去除沉淀，得到2’-岩藻糖基乳糖富集液，该溶液中2’-岩藻糖基乳糖的浓度为原发酵液的30-100倍。
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