CN115073539A - 一种2’-岩藻糖基乳糖分离纯化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种2’‑岩藻糖基乳糖分离纯化的方法，包括以下步骤：S1.将含2’‑岩藻糖基乳糖的发酵液纳滤，得到第一清液；S2.将第一清液经阳离子交换树脂和阴离子交换树脂吸附洗脱，得到第二清液；S3.将第二清液上样至第一维色谱柱中吸附洗脱，得到含三糖和四糖的第三清液；所得第三清液上样至第二维色谱柱中吸附洗脱，得到纯化后含有2’‑岩藻糖基乳糖的第四清液；第四清液经浓缩、结晶，即得2’‑岩藻糖基乳糖。本发明利用二维色谱法，第一维利用尺寸排阻的原理将发酵液中的单糖、二糖除去，第二维由于吸附介质对三糖和四糖的吸附作用力不同而将四糖除去，最后能得到90％以上纯度的2’‑岩藻糖基乳糖。
Description
技术领域
本发明涉及色谱分离纯化领域，具体涉及一种通过二维色谱分离纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法。
背景技术
人乳寡糖(HMOs)作为人乳中含量仅次于乳糖(55-70g/L)和脂类(15-40g/L)的第三大成分，是一类独特的、天然存在于母乳中的碳水化合物。至今已经可以通过质谱、光谱等技术，证明人乳中有200多种低聚糖。2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)作为HMOs中结构相对简单的低聚糖，在人乳中的含量最丰富，约占总HMO的30％。2’-岩藻糖基乳糖可通过α-1,2-岩藻糖基转移酶，以GDP-L-岩藻糖(GDP-L-Fuc)为供体﹑乳糖为底物催化合成。除了在婴儿护理中的营养重要性外，2’-FL的营养和药物潜力还需要通过化学或生物过程进行大规模生产。由于人乳中的HMOs的异构体很多，且常以混合物的形式存在，使得通过色谱法、纳滤等方法获得的寡糖纯度极低。更重要的是，人乳本身就很紧缺。所以，市面上大多都是依靠化学合成、酶法合成或者基于微生物发酵法的合成生物学等各类合成方法来获得高滴度的寡糖。
目前，大多采用微生物发酵法来获得2’-FL。根据公布的文献可知，迄今为止，基于微生物发酵法生产2’-FL所达到的最高报告滴度为180g/L。但是从发酵液中分离出高纯度的2’-岩藻糖基乳糖是存在很高难度的。尤其是在发酵的过程中会产生副产物二岩藻糖基-D-乳糖(DFL)，这个四糖和我们的目标产物性质很相近，导致很难被除去。另一方面，根据文献资料的查阅，我们发现α-1,2-岩藻糖转移酶wcfB在发酵中占有极其重要的位置。DFL的产生完全取决于是否在发酵过程中加入α-1,2-岩藻糖转移酶wcfB。另外研究发现，虽然在发酵过程中使用一种α-1,2-岩藻糖转移酶wcfB，最后发酵产物中不会有副产物DFL的产生，但是这也会间接导致我们的目标产物2’-FL的产量显著降低，仅有15g/L。所以目前除去发酵液中的副产物DFL依然是个首要问题。
近年来，提出了有很多方法来纯化2’-岩藻糖基乳糖。比如，中国发明申请CN112920234A提出使用活性炭对2’-FL进行纯化，但是其操作复杂，且活性炭的循环利用率低。更适合用于实验室纯化阶段，不利于工业放大生产。而且从纯化结果来看，得到的2’-FL纯度并不是很高，2’-FL的糖峰左右两边都存在一个小肩峰，说明使用这种纯化方法最后得到的产品中至少有两种副产物。不满足食品添加剂的要求。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种2’-岩藻糖基乳糖分离纯化的方法。
发明思路：本发明利用二维色谱法对2’-FL进行纯化；其中，第一维色谱柱先根据尺寸排阻的原理，由于单糖、双糖和三、四糖在溶液中的分子尺寸差异大，从而将单双糖从发酵液中除去；然后第二维色谱柱根据三糖和四糖的羟基数目不同，从而亲水性树脂对其吸附作用力也不同，从而除去四糖。本发明简单易操作，便能收集到90％以上纯度的2’-FL；并且，本发明在降低成本的同时，还能减少操作过程中的糖的损失。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种2’-岩藻糖基乳糖分离纯化的方法，包括以下步骤：
S1.纳滤除蛋白质和菌体：将含2’-岩藻糖基乳糖的发酵液纳滤，得到第一清液；
S2.离子交换树脂脱色、除盐：将步骤S1所得第一清液经阳离子交换树脂和阴离子交换树脂吸附洗脱，得到第二清液；
S3.二维色谱分离纯化2’-岩藻糖基乳糖：将步骤S2所得第二清液上样至第一维色谱柱中，根据尺寸排阻的原理进行吸附洗脱，将单糖和双糖从第二清液中去除，得到含三糖和四糖的第三清液；所得第三清液上样至第二维色谱柱中，根据吸附作用力不同的原理进行吸附洗脱，将四糖从第三清液中出去，得到纯化后含有2’-岩藻糖基乳糖的第四清液；所得第四清液经浓缩、结晶，过滤、洗涤、干燥，即得2’-岩藻糖基乳糖。
步骤S1中，所述含2’-岩藻糖基乳糖的发酵液是以蔗糖或甘油为底物发酵生产的含2’-岩藻糖基乳糖的发酵液，其主要包括蛋白质、菌体、盐、单糖、双糖、三糖(2’-岩藻糖基乳糖)和四糖。
步骤S1中，将含2’-岩藻糖基乳糖的发酵液于80～120℃下加热0.3～0.7h后，再经孔径为100～400nm的陶瓷膜纳滤，得到第一清液；优选地，所述加热的温度为90～110℃，优选为100℃；优选地，所述加热的时间为0.4～0.6h，优选为0.5h；优选地，所述陶瓷膜的孔径为200～300nm，优选为300nm。
在本发明技术方案中，步骤S2中通过将阴、阳离子树脂串联使用，可以达到一次性除盐、脱色的效果。只需要使用纯水就能将盐和色素给洗脱干净，不会对树脂造成污染。且仅需要在常温下进行，高效节能。
步骤S2中，所述阳离子交换树脂的骨架为聚苯乙烯共聚物，官能团为-COOH，氢型率≥98％；所述阳离子交换树脂的粒度为0.315～1mm，含水量为45％～52％，比表面积为200～2000m2/g，孔径为100～500nm，粒径为0.4～0.7mm。
所述阳离子交换树脂包括但不限于
D001阳离子树脂、
D301阴离子树脂、Amberlite IRC76弱酸性阳离子树脂(蓝膜水处理公司)。
步骤S2中，所述阴离子交换树脂的骨架为聚苯乙烯共聚物，官能团为季胺I型，离子形态为氯型；所述阴离子交换树脂的粒度为0.1～1.25mm，含水量50％～60％，比表面积为200～2000m2/g，孔径为100～500nm，粒径为0.4～0.7mm。
所述阴离子交换树脂包括但不限于
D201阴离子树脂、
D113阴离子树脂、SBA强碱阴离子树脂(蓝膜水处理公司)。
步骤S2中，如图1所示，将阳离子交换树脂和阴离子交换树脂串联，将步骤S1所得第一清液上样至串联后的装填柱中，上样结束后用水洗脱，待洗脱结束后收集流出液，即为第二清液。
其中，所述第一清液的上样量为0.5～0.8BV，所述第一清液的上样速率为0.8～1.5BV/h；所示水的用量为1～1.5BV，所述洗脱的速率为1～1.5BV/h。
步骤S2中，所述第二清液的电导率为230～350us/cm。
在本发明的技术方案中，步骤S3中，如图2所示，(1)首先，根据该类填料排阻分子量的大小接近葡萄糖、蔗糖等杂质的分子量，而远小于2’-岩藻糖基乳糖和二岩藻糖基-D-乳糖(四糖，DFL)的分子量，2’-岩藻糖基乳糖和DFL因为分子量太大不能进入树脂孔道而被排阻，葡萄糖、蔗糖等较小并进入孔道与树脂基团之间相互作用而获得一定的保留，根据上述原理使得2’-岩藻糖基乳糖和DFL先流出来(流入到第二维色谱柱中)，单糖和二糖后流出。(2)然后第二维根据2’-岩藻糖基乳糖和DFL之间的羟基数目不同，亲水性不同，DFL由于羟基数目比2’-岩藻糖基乳糖的多，所以被亲水性树脂吸附的能力更强，从而使得2’-岩藻糖基乳糖先流出而DFL后流出，极大的提高了2’-岩藻糖基乳糖的纯度。
步骤S3中，所述第一维色谱柱中树脂的骨架为二乙烯基苯交联的凝胶聚苯乙烯，官能团为磺酸；所述第一维色谱柱中树脂为H+型树脂、Na+型树脂、K+型树脂和Ca2+型树脂中的任意一种，优选为Na+型树脂、K+型树脂和Ca2+型树脂中的任意一种，最优选为Ca2+型树脂；所述第一维色谱柱中树脂的粒度为0.315～1mm，含水量为35％～70％，比表面积为100～1000m2/g，孔径为1～200nm，粒径为0.2～1.5mm，容量为1～3eq/L，交联度为2％～8％；优选地，所述交联度为6％～8％，优选为6％或8％，进一步优选为6％。
所述第一维色谱柱树脂包括但不限于
LSI-010(H+型树脂)、DIAIONTMUBK530(K+型树脂)、MCI GEL CK08P(H+型树脂)、MCI GEL CK04S(Na+型树脂)、DIAIONTM UBK510L(Ca2+型树脂)。
步骤S3中，所述第二维色谱柱中树脂的骨架为聚丙烯酰胺，官能团为硼酸型、HLB亲水亲油型和酰胺型中的任意一种，优选为HLB亲水亲油型或酰胺型，进一步优选为酰胺型；即，根据亲水能力的不同，优选硼酸型树脂，更优选HLB亲水亲油平衡树脂，最优选的为丙烯酰胺型树脂；所述第二维色谱柱中树脂的粒度为0.315～1mm，含水量为35％～70％，比表面积为100～1000m2/g，孔径为1～200nm，粒径为0.1～1.5mm，交联度为2％～8％；优选地，所述交联度为6％～8％，优选为6％或8％，进一步优选为6％。
所述第二维色谱柱树脂包括但不限于Super Amphi HLB(HLB亲水亲油型树脂)、HW40C(丙烯酸型树脂)、PierceTM Boronic Acid Resin(硼酸型树脂)。
步骤S3中，将步骤S2所得第二清液上样至第一维色谱柱中，上样结束后用水洗脱，所得流出液(含有三糖和四糖的第三清液)流入到第二维色谱柱中，待单糖和/或双糖即将从第一维色谱柱流出时，停止流入；待第三清液在第二维色谱柱流尽之后，用水洗脱，收集第二维色谱柱流出液，当四糖即将从第二维色谱柱中流出时，停止收集，所得流出液即为纯化后含有2’-岩藻糖基乳糖的第四清液。
其中，所述第二清液的上样量为0.5～0.9BV，所述第二清液的上样速率为0.6～1BV/h；在第一维色谱柱中，所述水的用量为1～2BV，所述洗脱的速率为0.5～1BV/h；在第二维色谱柱中，所述水的用量为1～2BV，所述洗脱的速率为0.5～1.5BV/h。
步骤S3中，所述第四清液于40～90℃下浓缩0.5～7.5h，趁热于乙醇溶液中结晶，即得纯度为90％以上的2’-岩藻糖基乳糖；优选地，所述浓缩的时间为1～6h，优选为2～5h，进一步优选为4h；优选地，所述浓缩为旋蒸；优选地，通过上述方法可获得纯度为90％以上的2’-岩藻糖基乳糖。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：
1、本发明提出利用尺寸排阻和吸附差异的不同，从而将四种糖完全分开。最终经高效液相法检测，证明可得到90％以上纯度的2’-岩藻糖基乳糖。整个操作过程简单、重复利用率高、后期维护便利。在实际纯化中，只需要按比例放大实验。整个过程中使用的是纯水和乙醇，没有使用其它任何的有机试剂，对环境友好。也更适合用于放大实验。
2、本发明提出使用离子交换法，从而除去发酵液中的色素。避免使用大量的活性炭，因为活性炭通常再生不太彻底，微孔易堵塞，多次再生后吸附性能明显降低。且一般活性炭的再生都需要高温加热，也会造成大量能源的浪费，十分的不环保。
3、本发明提出了使用阴、阳离子交换法对发酵液进行除盐，提高了2’-岩藻糖基乳糖避免了使用电渗析而造成安装过程复杂、维护费用高、糖收率低等问题。
4、本发明提出二维色谱法得到高纯度的2’-FL操作可靠、时间短。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1是阴阳离子除盐。
图2是二维色谱原理图。
图3实施例1最终获得的2’-岩藻糖基乳糖的质谱图。
图4实施例1最终获得的2’-岩藻糖基乳糖的离子流图。
图5实施例1为除盐后的膜清液的质谱图。
图6实施例1为除盐后的膜清液的离子流图。
以上图3-6为LC-Q-TOF的检测结果。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均可以通过市售购买获得的常规产品。
以下实施例中所述含2’-岩藻糖基乳糖的发酵液主要包括蛋白质、菌体、盐、单糖、双糖、三糖(2’-岩藻糖基乳糖)和四糖，盐总共10g/L、单糖和双糖均为10g/L、三糖约40g/L、四糖约10g/L。
实施例1
S1.除蛋白质和菌体：使用300nm的陶瓷膜将含2’-岩藻糖基乳糖的发酵液中大量存在的菌体、蛋白质等杂质一次性除去，获得含有2’-岩藻糖基乳糖的膜清液。
S2.脱色、脱盐：通过一台蠕动泵将分别装填有
D001阳离子树脂和
D201阴离子树脂的柱子串联起来。
首先，先将0.8BV步骤S1所得膜清液以1BV/h的流速进入装填柱，然后待膜清液流尽之后，再用1.5BV纯水以1BV/h的流速将盐给洗脱下来，最后收集流出液，即为脱色除盐后的膜清液。
所得膜清液的质谱图和离子流图分别如图5和图6所示，实验发现，除盐前膜清液的电导率为12ms/cm，经过离子交换树脂脱色除盐后，收集到的膜清液的电导率为300us/cm，说明膜清液中基本没有盐的存在了，该步糖的收率为98％(单糖、二糖、三糖和四糖的总收率)。
S3.将步骤S2中获得的膜清液以0.6BV/h的流速和0.5BV的上样量，上样至第一维色谱中，当膜清液上样完毕，用1.5BV的纯水洗脱，流速为1BV/h。
在第一维色谱的出口配有三通阀，实验刚开始关掉收集单糖、二糖管道的阀门，让第一维的流出液(含三糖和四糖的流出液)流入第二维色谱柱中，待单糖、二糖即将从第一维色谱柱中流出时将三通阀流向第二维的管道阀门关掉，收集含单糖、双糖的流出液。
在含三糖和四糖的流出液在第二维色谱柱流尽之后，将1.5BV的纯水以1BV/h的流速对第二维色谱进行洗脱，在第二维色谱柱出口收集流出液，即为含有三糖的流出液(含有2’-岩藻糖基乳糖的第四清液)，当四糖即将从第二维色谱柱中流出时，停止收集。然后用HPLC检测糖的浓度。2’-岩藻糖基乳糖的收率为97％。
其中，第一维色谱柱填料为
LSI-010，第二维色谱柱填料为001×7强酸性阳离子树脂。
S4.浓缩、结晶：将步骤S3制备的滤液先用旋转蒸发仪浓缩，旋蒸温度为60℃，真空度为0.09MPa，直接趁热在80％纯度的乙醇溶液中结晶，过滤、洗涤和烘干，得到2’-岩藻糖基乳糖。
在本实施例中，通过高效液相检测可得到纯度为95％的2’-岩藻糖基乳糖，收率为90％，所得2’-岩藻糖基乳糖的质谱图和离子流图分别如图3和图4所示。
实施例2
S1.除蛋白质和菌体：使用400nm的陶瓷膜将含2’-岩藻糖基乳糖的发酵液中大量存在的菌体、蛋白质等杂质一次性除去，获得含有2’-岩藻糖基乳糖的膜清液。
S2.脱色、脱盐：通过一台蠕动泵将分别装填有
D301阴离子树脂和
D113阴离子树脂的柱子串联起来。
首先，先将0.5BV步骤S1所得膜清液以1BV/h的流速进入装填柱，然后待膜清液流尽之后，再用1.5BV纯水以1.5BV/h的流速将盐给洗脱下来，最后收集流出液，即为脱色除盐后的膜清液。
实验发现，除盐前膜清液的电导率为12ms/cm，经过离子交换树脂脱色除盐后，收集到的发酵液的电导率为350us/cm，说明膜清液中基本没有盐的存在了，该步糖的收率为96％。
S3.将步骤S2中获得的膜清液以0.6BV/h的流速和0.5BV的上样量，上样至第一维色谱中，当膜清液上样完毕，用1.5BV的纯水洗脱，流速为1BV/h。
在第一维色谱的出口配有三通阀，实验刚开始关掉收集单糖、二糖管道的阀门，让第一维的流出液(含三糖和四糖的流出液)流入第二维色谱柱中，待单糖、二糖即将从第一维色谱柱中流出时将三通阀流向第二维的管道阀门关掉，收集含单糖、双糖的流出液。
在含三糖和四糖的流出液在第二维色谱柱流尽之后，将1.5BV的纯水以1BV/h的流速对第二维色谱进行洗脱，在第二维色谱柱出口收集流出液，即为含有三糖的流出液(含有2’-岩藻糖基乳糖的第四清液)，当四糖即将从第二维色谱柱中流出时，停止收集。然后用HPLC检测糖的浓度。2’-岩藻糖基乳糖的收率为96％。
其中，第一维色谱柱填料为DIAIONTM UBK530，第二维色谱柱填料为HW40C。
S4.浓缩、结晶：将步骤S3制备的滤液先用旋转蒸发仪浓缩，旋蒸温度为56℃，真空度为0.09MPa，直接趁热在60％纯度的乙醇溶液中结晶，过滤、洗涤和烘干，得到2’-岩藻糖基乳糖。
在本实施例中，通过高效液相检测可得到纯度为90％的2’-岩藻糖基乳糖，收率为87％。
实施例3
S1.除蛋白质和菌体：使用100nm的陶瓷膜将含2’-岩藻糖基乳糖的发酵液中大量存在的菌体、蛋白质等杂质一次性除去，获得含有2’-岩藻糖基乳糖的膜清液。
S2.脱色、脱盐：通过一台蠕动泵将分别装填有SBA强碱阴离子树脂(蓝膜水处理公司)和Amberlite IRC76弱酸性阳离子树脂(蓝膜水处理公司)的柱子串联起来。
首先，先将0.8BV步骤S1所得膜清液以1.5BV/h的流速进入装填柱，然后待膜清液流尽之后，再用1BV纯水以1BV/h将盐给洗脱下来，最后收集流出液，即为脱色除盐后的膜清液。
实验发现，除盐前膜清液的电导率为12ms/cm，经过离子交换树脂脱色除盐后，收集到的发酵液的电导率为330us/cm，说明膜清液中基本没有盐的存在了，该步糖的收率为95％。
S3.将步骤S2中获得的膜清液以0.9BV/h的流速和0.9BV的上样量，上样至第一维色谱中，当膜清液上样完毕，用1.5BV的纯水洗脱，流速为1BV/h。
在第一维色谱的出口配有三通阀，实验刚开始关掉收集单糖、二糖管道的阀门，让第一维的流出液(含三糖和四糖的流出液)流入第二维色谱柱中，待单糖、二糖即将从第一维色谱柱中流出时将三通阀流向第二维的管道阀门关掉，收集含单糖、双糖的流出液。
在含三糖和四糖的流出液在第二维色谱柱流尽之后，将1.5BV的纯水以1.5BV/h的流速对第二维色谱进行洗脱，在第二维色谱柱出口收集流出液，即为含有三糖的流出液(含有2’-岩藻糖基乳糖的第四清液)，当四糖即将从第二维色谱柱中流出时，停止收集。然后用HPLC检测糖的浓度。2’-岩藻糖基乳糖的收率为94％。
其中，第一维色谱柱填料为MCI GEL CK08P，第二维色谱柱填料为HW40C。
S4.浓缩、结晶：将步骤S3制备的滤液先用旋转蒸发仪浓缩，旋蒸温度为56℃，真空度为0.09MPa，直接趁热在60％纯度的乙醇溶液中结晶，过滤、洗涤和烘干，得到2’-岩藻糖基乳糖。
在本实施例中，通过高效液相检测可得到纯度为93％的2’-岩藻糖基乳糖，收率为88％。
实施例4
S1.除蛋白质和菌体：使用300nm的纳滤膜将含2’-岩藻糖基乳糖的发酵液中大量存在的菌体、蛋白质等杂质一次性除去，获得含有2’-岩藻糖基乳糖的膜清液。
S2.脱色、脱盐：通过一台蠕动泵将分别装填有SBA强碱阴离子树脂(蓝膜水处理公司)和Amberlite IRC76弱酸性阳离子树脂(蓝膜水处理公司)的柱子串联起来。
首先，先将0.8BV步骤S1所得膜清液以0.8BV/h的流速进入装填柱，然后待膜清液流尽之后，再用1BV纯水以1BV/h将盐给洗脱下来，最后收集流出液，即为脱色除盐后的膜清液。
实验发现，除盐前膜清液的电导率为12ms/cm，经过离子交换树脂脱色除盐后，收集到的发酵液的电导率为230us/cm，说明膜清液中基本没有盐的存在了。该步糖的收率为96％。
S3.将步骤S2中获得的膜清液以0.6BV/h的流速和0.6BV的上样量，上样至第一维色谱中，当膜清液上样完毕，用1.5BV的纯水洗脱，流速为0.5BV/h。
在第一维色谱的出口配有三通阀，实验刚开始关掉收集单糖、二糖管道的阀门，让第一维的流出液(含三糖和四糖的流出液)流入第二维色谱柱中，待单糖、二糖即将从第一维色谱柱中流出时将三通阀流向第二维的管道阀门关掉，收集含单糖、双糖的流出液。
在含三糖和四糖的流出液在第二维色谱柱流尽之后，将1.5BV的纯水以0.5BV/h的流速对第二维色谱进行洗脱，在第二维色谱柱出口收集流出液，即为含有三糖的流出液(含有2’-岩藻糖基乳糖的第四清液)，当四糖即将从第二维色谱柱中流出时，停止收集。然后用HPLC检测糖的浓度。2’-岩藻糖基乳糖的收率为96％。
其中，第一维色谱柱填料为MCI GEL CK04S，第二维色谱柱填料为PierceTMBoronicAcid Resin。
S4.浓缩、结晶：将步骤S3制备的滤液先用旋转蒸发仪浓缩，旋蒸温度为50℃，真空度为0.09MPa，直接趁热在50％纯度的乙醇溶液中结晶，过滤、洗涤和烘干，得到2’-岩藻糖基乳糖。
在本实施例中，通过高效液相检测可得到纯度为91％的2’-岩藻糖基乳糖，收率为86％。
实施例5
S1.除蛋白质和菌体：使用300nm的陶瓷膜将含2’-岩藻糖基乳糖的发酵液中大量存在的菌体、蛋白质等杂质一次性除去，获得含有2’-岩藻糖基乳糖的膜清液。
S2.脱色、脱盐：通过一台蠕动泵将分别装填有SBA强碱阴离子树脂(蓝膜水处理公司)和Amberlite IRC76弱酸性阳离子树脂(蓝膜水处理公司)的柱子串联起来。
首先，先将0.7BV步骤S1所得膜清液以1.5BV/h的流速进入装填柱，然后待膜清液流尽之后，再用1.3BV纯水以1BV/h将盐给洗脱下来，最后收集流出液，即为脱色除盐后的膜清液。
实验发现，除盐前膜清液的电导率为12ms/cm，经过离子交换树脂脱色除盐后，收集到的发酵液的电导率为330us/cm，说明膜清液中基本没有盐的存在了。该步糖的收率为97％。
S3.将步骤S2中获得的膜清液以1BV/h的流速和0.6BV的上样量，上样至第一维色谱中，当膜清液上样完毕，用1.3BV的纯水洗脱，流速为0.9BV/h。
在第一维色谱的出口配有三通阀，实验刚开始关掉收集单糖、二糖管道的阀门，让第一维的流出液(含三糖和四糖的流出液)流入第二维色谱柱中，待单糖、二糖即将从第一维色谱柱中流出时将三通阀流向第二维的管道阀门关掉，收集含单糖、双糖的流出液。
在含三糖和四糖的流出液在第二维色谱柱流尽之后，将1.3BV的纯水以0.8BV/h的流速对第二维色谱进行洗脱，在第二维色谱柱出口收集流出液，即为含有三糖的流出液(含有2’-岩藻糖基乳糖的第四清液)，当四糖即将从第二维色谱柱中流出时，停止收集。然后用HPLC检测糖的浓度。2’-岩藻糖基乳糖的收率为98％。
其中，第一维色谱柱填料为DIAIONTM UBK510L，第二维色谱柱填料为PierceTMBoronic Acid Resin。
S4.浓缩、结晶：将步骤S3制备的滤液先用旋转蒸发仪浓缩，旋蒸温度为60℃，真空度为0.09MPa，直接趁热在60％纯度的乙醇溶液中结晶，过滤、洗涤和烘干，得到2’-岩藻糖基乳糖。
在本实施例中，通过高效液相检测可得到纯度为92％的2’-岩藻糖基乳糖，收率为88％。
本发明提供了一种通过二维色谱分离纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种2’-岩藻糖基乳糖分离纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.纳滤除蛋白质和菌体：将含2’-岩藻糖基乳糖的发酵液纳滤，得到第一清液；
S2.离子交换树脂脱色、除盐：将步骤S1所得第一清液经阳离子交换树脂和阴离子交换树脂吸附洗脱，得到第二清液；
S3.二维色谱分离纯化2’-岩藻糖基乳糖：将步骤S2所得第二清液上样至第一维色谱柱中吸附洗脱，得到含三糖和四糖的第三清液；所得第三清液上样至第二维色谱柱中吸附洗脱，得到纯化后含有2’-岩藻糖基乳糖的第四清液；所得第四清液经浓缩、结晶，即得2’-岩藻糖基乳糖；
步骤S2中，所述阳离子交换树脂的骨架为聚苯乙烯共聚物，官能团为-COOH，氢型率≥98％；所述阴离子交换树脂的骨架为聚苯乙烯共聚物，官能团为季胺I型，离子形态为氯型；
步骤S3中，所述第一维色谱柱中树脂的骨架为二乙烯基苯交联的凝胶聚苯乙烯，官能团为磺酸；所述第二维色谱柱中树脂的骨架为聚丙烯酰胺，官能团为酰胺。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中，将含2’-岩藻糖基乳糖的发酵液于80～120℃下加热0.3～0.7h后，再经孔径为100～400nm的陶瓷膜纳滤，得到第一清液。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中，所述阳离子交换树脂的粒度为0.315～1mm，含水量为45％～52％，比表面积为200～2000m2/g，孔径为100～500nm，粒径为0.4～0.7mm；所述阴离子交换树脂的粒度为0.1～1.25mm，含水量50％～60％，比表面积为200～2000m2/g，孔径为100～500nm，粒径为0.4～0.7mm。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中，将阳离子交换树脂和阴离子交换树脂串联，将步骤S1所得第一清液上样至串联后的装填柱中，上样结束后用水洗脱，待洗脱结束后收集流出液，即为第二清液。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述第一清液的上样量为0.5～0.8BV，所述第一清液的上样速率为0.8～1.5BV/h；所示水的用量为1～1.5BV，所述洗脱的速率为1～1.5BV/h。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中，所述第二清液的电导率为500us/cm以下。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3中，所述第一维色谱柱中树脂的粒度为0.315～1mm，含水量为35％～70％，比表面积为100～1000m2/g，孔径为1～200nm，粒径为0.2～1.5mm，容量为1～3eq/L，交联度为2％～8％；所述第二维色谱柱中树脂的粒度为0.315～1mm，含水量为35％～70％，比表面积为100～1000m2/g，孔径为1～200nm，粒径为0.1～1.5mm，交联度为2％～8％。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3中，将步骤S2所得第二清液上样至第一维色谱柱中，上样结束后用水洗脱，收集第一维色谱柱流出液，待单糖和/或双糖即将从第一维色谱柱流出时，停止收集，所得流出液即为含有三糖和四糖的第三清液；并将第三清液流入第二维色谱柱中，用水洗脱，收集第二维色谱柱流出液，当四糖即将从第二维色谱柱中流出时，停止收集，所得流出液即为纯化后含有2’-岩藻糖基乳糖的第四清液。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述第二清液的上样量为0.5～0.9BV，所述第二清液的上样速率为0.6～1BV/h；在第一维色谱柱中，所述水的用量为1～2BV，所述洗脱的速率为0.5～1BV/h；在第二维色谱柱中，所述水的用量为1～2BV，所述洗脱的速率为0.5～1.5BV/h。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3中，所述第四清液于40～90℃下浓缩0.5～7.5h，趁热于乙醇溶液中结晶，即得纯度为90％以上的2’-岩藻糖基乳糖。
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