KR20230098181A - 발효액으로부터 산성 모유 올리고당의 정제 방법 - Google Patents

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알프레드 윌리 본테
프란치스코 요하네스 후베르투스 쥬리센
마르티나 헨리카 마리아 반 게누크텐
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프리슬랜드캄피나 네덜란드 비.브이.
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Abstract

본 발명은 이온 교환 방법을 사용하여 발효액으로부터 산성 모유 올리고당(HMO)을 정제하는 방법에 관한 것이다. 이 방법을 통해 전기투석과 같은 탈염 작업의 횟수 및/또는 범위를 줄일 수 있다. 그러한 작업을 아예 실시하지 않는 것도 가능하다.

Description

발효액으로부터 산성 모유 올리고당의 정제 방법
본 발명은 산성 모유 올리고당(HMO)의 정제 방법에 관한 것이다.
모유에는 유아의 건강한 발달에 중요한 다양한 올리고당(HMO)이 함유되어 있다. 많은 HMO가 건강한 장내 마이크로바이옴의 발달에 중요한 역할을 한다.
수많은 HMO가 존재하며, 모유에 가장 많이 존재하는 것은 푸코실화 락토스 예컨대 2'-푸코실락토스(2'-FL) 및 3'-푸코실락토스(3'-FL), 시알릴화 락토스 예컨대 3'-시알릴락토스(3'-SL) 및 6'-시알릴락토스(6'-SL), 및 락토-N-테트라오스(LNT) 및 락토-N-네오테트라오스(LNnT)와 같은 사당류이다.
2'-FL, 3- FL, LNT, 및 LNnT는 대전되지 않는다는 점에서 중성이다.
중성 HMO는 생산되는 발효액에서 비교적 용이하게 정제될 수 있다. 음이온- 및 양이온-교환 크로마토그래피는 하전된 종을 제거하기 위해 이 정제에 사용된다.
예를 들어, WO 2019/063757에는 발효액의 한외여과, 강한 양이온 교환 수지를 사용한 양이온 교환, OH- 형태의 약한 음이온 교환 수지를 사용한 음이온 교환, 및 높은 다공성의 약한 양이온 교환 흡착제 수지를 사용하는 푸코실화된 HMO와 다른 중성 성분을 최종적으로 흡착하는 것을 포함하는 푸코실화된 HMO의 정제 방법이 개시되어 있다.
시알릴화된 HMO, 예컨대 3'-시알릴락토스(3'-SL) 및 6'-시알릴락토스(6'-SL)는 산성/음으로 하전되며, 일반적으로 그들의 나트륨 형태로 제조된다. 이 음전하는 중성 HMO에 대한 위에서 설명한 정제 기술의 적용을 방해하는데, 음으로 하전된 HMO가 음이온 교환 수지에 결합하는 다른 음이온과 경쟁하여 불량한 분리를 야기하기 때문이다.
WO 2009/113861에는 선택적인 연화 및 나노여과 절차 후, 탈지된, 바람직하게는 단백질이 없는 우유 스트림을 (i) 양이온 교환 단계, (ii) 유리 염기 형태의 음이온 교환 수지를 사용하고 수분 함량이 30~48%인 음이온 교환 단계, (iii) 수분 함량이 >45%이고 바람직하게는 또한 유리 염기 형태인 미세다공성 또는 겔형 음이온 교환 수지에 올리고당류를 결합시키는 단계, 및 (iv) 산성 염 용액을 사용하여 상기 수지로부터 올리고당류를 용출시키는 단계에 적용함으로써, 상기 우유 스트림으로부터, 시알릴화된 올리고당류를 분리하는 것이 개시되어 있다.
WO 2010/106320에는 일련의 2개의 음이온 교환 수지 및 2개의 양이온 교환 수지를 사용하여 유장을 탈염시킨 후 탈염된 유장을 강산성 양이온 교환 수지 및 약염기성 음이온 수지와 접촉시킴으로써 유장으로부터 3'-SL을 단리 및 정제하는 방법이 개시되어 있다. 3'-SL은 약한 음이온 교환 수지에 결합하고, 이후에 이로부터 용출된다.
WO 2017/152918에는 (i) 한외여과, (ii) 나노여과, (iii) 선택적 활성탄 처리 및 (iv) 강한 음이온 또는 강한 양이온 교환 수지로의 처리에 의해 발효액으로부터 시알릴화된 올리고당을 단리하는 방법이 개시되어 있다. 시알릴화된 올리고당류를 포함하는 음전하 물질은 강한 음이온 교환 수지에 결합한다. 한 구현예에서, 시알릴화된 올리고당은 수성 산 또는 염 용액을 사용한 용출에 의해 음이온 교환 수지로부터 회수된다. 또다른 구현예에서, 생성물은 H+ 형태의 강한 양이온 교환 수지로부터 용출되고, 이어서 NaOH로 중화되어, 올리고당의 나트륨 염이 생성된다.
WO 2019/229118에는 적어도 하나, 그러나 바람직하게는 2개의 한외여과 단계를 사용하여 세포 덩어리를 제거하고, 생성된 용액을 H+ 형태의 양이온 교환 수지 및 Cl- 형태의 강한 음이온 교환 수지로 처리하고, 생성된 용액으로부터의 탄수화물을 2개의 멤브레인, 즉 분자량 컷-오프가 300~500 Da인 멤브레인과 분자량 컷-오프가 600~800 Da인 멤브레인을 통해 여과하여 제거함으로써, 발효액에서 다른 탄수화물로부터 시알릴락토스를 정제하는 방법이 개시되어 있다.
양이온 교환 수지로 처리한 후, 용액은 NaOH로 pH 7로 중화되었다. 음이온 교환 수지로 처리한 후, 용액은 다시 pH 7로 중화되었다. 따라서, 다량의 염이 유입되어 이를 전기투석에 의해 제거해야만 했다.
WO 2019/043029에는 원심분리, 정밀여과 또는 한외여과에 의해 발효액으로부터 바이오매스를 분리하고, H+ 형태의 강한 양이온 교환 수지를 사용하여 양이온을 제거하고, 생성된 시알릴락토스-함유 용출액의 pH를 7로 높이고, Cl- 형태의 강한 음이온 교환 수지를 사용하여 음이온성 불순물을 제거하고, 나노여과 또는 정용여과를 통해 슬라릴락토스보다 분자량이 낮은 화합물을 제거하여, 발효액에서 다른 탄수화물로부터 시알릴락토스를 정제하는 방법이 개시되어 있다.
또한, 이 방법은 두 이온 교환 처리 사이에 NaOH로 시알릴락토스를 pH 7로 중화하는 단계를 포함하여, 제거되어야 하는 많은 염이 생성된다.
EP 3 456 836 A1에는 발효액으로부터 시알릴락토스를 분리하는 두 가지 방법들이 개시되어 있다. 두 방법 모두 이온 교환 단계와 이후 한외여과, 나노여과 및/또는 활성탄 처리를 포함한다. 첫 번째 방법에 따르면, 이온 교환 단계는 Cl- 형태의 강한 음이온 교환 수지를 사용하는 음이온 교환으로 시작하여 H+ 또는 Na+ 형태의 양이온 교환 수지를 사용하는 양이온 교환 단계로 이어진다. 이 구현예의 개시된 이점은 이들 2개의 이온 교환 단계들 사이에 중화가 필요하지 않다는 점이다.
그러나, 이 구현예의 단점은 음이온 교환 단계가 용액의 pH를 상승시킬 수 있고, 이는 (Ca-염과 같은) 임의의 염을 침전시킬 수 있다는 점이다. 따라서, 금속 이온의 침전이 일어나기 전에 이를 제거하기 위해 음이온 교환 대신 양이온으로 시작하는 것이 더 바람직하다.
두 번째 방법은 H+ 또는 Na+ 형태의 수지를 사용하는 양이온 교환으로 시작하여, Cl- 형태의 강한 음이온 교환 수지를 사용하는 음이온 교환으로 이어진다. H+ 형태의 양이온 교환 수지가 사용되는 경우, 강한 음이온 교환 수지를 사용하기 전에 NaOH로 중화하여 시알릴락토스의 나트륨 염을 형성해야 한다. 그렇지 않으면, 시알릴락토스가 강한 음이온 교환 수지에 결합할 것이다. 이 중화에는 염의 도입이 필요하다.
이제 이온 교환 단계들 사이에 염을 적게 도입하고/하거나 중화 단계 없이 이온 교환 방법을 사용하여 발효액에서 산성 HMO를 충분히 단리 및 정제할 수 있음이 밝혀졌다. 그 결과, 전기투석과 같은 탈염 작업의 횟수 및/또는 정도가 감소될 수 있다. 그러한 작업을 아예 실시하지 않는 것도 가능하다.
따라서, 본 발명은 발효액으로부터 산성 모유 올리고당(HMO)을 정제하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
(i) 발효액으로부터 바이오매스를 분리하여 미정제 용액을 제공하는 단계;
(ii) 미정제 용액에 H+ 형태의 양이온 교환 물질을 사용한 양이온 교환을 수행하여, pH 범위가 1~3인 용액을 얻는 단계;
(iii) 1~3 범위의 pH를 갖는 용액에 Cl- 형태의 약염기성 음이온 교환 물질을 사용한 음이온 교환을 수행하여, 1.5~5.5, 바람직하게는 1.5~4 범위의 pH를 갖는 용액을 얻는 단계;
(iv) 1.5~5.5, 바람직하게는 1.5~4 범위의 pH를 갖는 용액에 흡착제 물질을 사용한 흡착을 수행하여, 중성 유기 화합물을 제거하는 단계;
(v) 선택적으로, 흡착이 이루어진 용액의 pH를 5~6 범위의 값으로 조정하는 단계;
(vi) 선택적으로, 음이온 교환 수지를 사용하여 용액에 음이온 교환을 수행하여 산성 모유 올리고당을 수지에 결합시킨 다음, 염 용액을 사용하여 수지로부터 산성 모유 올리고당을 용출시키는 단계로서, 단계 (iii) 및 (iv) 또는 단계 (iv) 및 (v) 사이에 수행되는, 단계;
이로써 상기 산성 모유 올리고당을 포함하는 정제된 용액을 얻는 단계.
이 방법으로 정제될 수 있는 산성 모유 올리고당의 예는, 바람직하게는 6'-시알릴락토스(6'-SL), 3'-시알릴락토스(3'-SL), 디시알릴락토-N-테트라오스, 3'-시알릴-3-푸코실락토스, 시알릴락토-N-테트라오스, 푸코실 시알릴 락토-N-네오헥사오스, 디-푸코실 시알릴락토-N-헥사오스, 시알릴락토-N-테트라오스 a, 시알릴락토-N-테트라오스 b, 푸코실 시알릴락토-N-헥사오스, 및 3'-푸코실 시알릴락토-N-테트라오스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 시알릴화된 올리고당을 포함한다. 이 방법에 의해 정제되는 보다 바람직한 HMO는 6'-시알릴락토스(6'-SL), 3'-시알릴락토스(3'-SL), 디시알릴락토-N-테트라오스, 3'-시알릴-3-푸코실락토스, 및 시알릴락토-N-테트라오스이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 방법은 6'-시알릴락토스(6'-SL) 또는 3'-시알릴락토스(3'-SL)를 정제하는 데 사용된다.
단계 (ii) 및 (iii)에서 이온 교환 물질로 처리하는 동안, 산성 HMO는 용액에 남아 있는 반면 다른 하전 성분은 효과적으로 제거된다. 산성 HMO는 단계 (iii)에서 사용된 약염기성 음이온 교환 물질에 결합하지 않거나 매우 소량만 결합한다.
단계 (iii)에서 약염기성 음이온 교환 수지에 노출될 때 용액의 낮은 pH 조건으로 인해, HMO가 양성자화되어 중성 HMO로 거동한다는 이론이 있다. 반면에, 용액의 다른 음전하 성분은 약염기성 음이온 교환 물질에 결합하여 용액에서 제거된다.
발효액은 전형적으로 HMO의 생산에 사용되는 미생물 또는 이의 잔해, 및 미생물을 위한 영양분을 포함한다. HMO가 생산되는 잔류 탄소원도 존재할 수 있다. 또한, 미생물에 의해 생성된 하나 이상의 부산물이 존재할 수 있다.
HMO의 발효 생산은 예를 들어 상기 언급된 선행 기술 또는 그 안에 인용된 선행 기술에 기재된 바와 같이 올리고당의 미생물학적 생산을 위한 공지된 방법론에 기반하여 수행될 수 있다. 락토스는 바람직하게는 발효액에서 미생물에 의해 HMO로 전환되는 탄소원으로 사용된다.
액상으로부터 바이오매스의 분리(단계 (i))는 HMO를 생산하기 위해 사용된 발효액의 유형에 대해 그 자체로 알려진 방식으로 달성될 수 있다. 정화 및/또는 여과를 사용할 수 있다. 단계 (i) 이전 또는 도중에, 상기 발효액이 탈기 단계에 적용될 수 있다. 적합한 탈기 단계는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 탈기는 후속 단계에서 기포 형성 위험을 감소시킨다는 점에서 유리하다. 이러한 기포는 충전 컬럼을 통과하는 용액의 흐름에 악영향을 미칠 수 있으며, 느슨한 비드가 사용되는 경우 가스 형성으로 인해 흡착제 또는 이온 교환 물질이 부유할 수 있다.
단계 (i)에 의해 얻어진 미정제 용액은 정밀여과(MF) 및/또는 한외여과(UF)에 적용될 수 있다. MF는 일반적으로 1 μm 미만, 바람직하게는 약 0.1~0.2 μm의 공극 크기를 갖는 막으로 수행된다. MF는 특히 세포 물질(완전한 세포, 그의 단편) 및 기타 초분자 잔해를 제거하는 데 적합하다. MF는 대략 주변 온도에서 수행될 수 있다. 일반적으로 온도는 20~75℃ 범위이다. 바람직하게는, MF는 적어도 30℃의 온도, 보다 바람직하게는 35~70℃ 범위의 온도에서 수행된다. 비교적 높은 온도는 HMO의 수율 증가에 유리한 것으로 밝혀졌다. 약 40~50℃ 범위의 온도, 예컨대 약 45℃의 온도, 또는 약 60~70℃ 범위의 온도, 예컨대 약 65℃가 특히 유리하다. 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 바이오매스로부터 액상으로의 배설이 승온에서 개선된다고 생각한다. 또한, 고온, 특히 약 60℃ 내지 70℃의 온도는 정밀여과 동안 세포 물질의 더 높은 농축 인자를 달성하는 데 유리하며, 이는 HMO의 수율에 긍정적인 영향을 미친다.
한외여과 단계는 투과물에서 단백질, DNA 및/또는 내독소를 제거하는 데 특히 적합하다. 열처리는 단백질을 변형시키는, 예를 들어 그것을 변성시키는 역할을 하여, UF 막을 통한 투과성이 낮아진다. UF 막은 바람직하게는 5 kDa 이하, 특히 약 3 kDa 이하의 컷-오프를 갖는다. 컷-오프는 일반적으로 적어도 약 1 kDa이다.
바람직한 구현예에서, MF 투과물은 한외여과 전에, 20℃ 미만, 보다 바람직하게는 15℃ 미만, 가장 바람직하게는 8~12℃ 범위의 온도로 냉각된다.
발효액으로부터의 HMO 회수율을 증가시키기 위해, MF 및/또는 UF가 정용여과로 적용될 수 있다.
위에서 논의된 선택적인 여과 단계 후 미정제 용액은 양이온 교환 물질(단계 (ii)); 약염기성 음이온 교환 물질(단계 (iii)); 및 흡착제 물질(단계 (iv))로 처리된다.
용어들 ‘약한' 이온 교환 및 ‘강한' 이온 교환'은 일반적으로 당업계에 알려져 있다. 강한 이온 교환기는 일단 이온 교환기가 평형을 이루면 그의 매트릭스의 전하를 크게 잃지 않으므로, 일반적으로 강산성 pH에서 강알칼리성 pH까지의 광범위한 pH 범위가 사용될 수 있다. 강한 음이온 교환 수지는 일반적으로 4차 암모늄 그룹의 존재를 특징으로 한다.
약한 이온 교환기는 그들의 전하를 일반적으로 약한 음이온 교환 물질의 경우 산성에서 대략 중성 pH까지, 약한 양이온 교환 물질의 경우 알칼리성에서 대략 중성 pH까지 유지하는 더 구체적인 범위의 pH 값을 갖는다. 약한 음이온 교환 기는 일반적으로 4차 암모늄 그룹의 부재를 특징으로 한다. 일반적인 약한 음이온 교환 기는 3차 아민 기이다.
이온 교환 물질은 충진 컬럼, 멤브레인, 전하-변형 심층 필터 카트리지로 제공되거나 현탁된 또는 유동화된 물질로 사용될 수 있다. 이온 교환 물질은 전형적으로 고정된 작용기(음이온 교환 물질의 경우 양이온성, 양이온 교환 물질의 경우 음이온성)가 제공된 매트릭스를 포함한다. 적합한 매트릭스의 예는 섬유질 겔, 미세결정질 겔 또는 비드 겔이다. 이들은 예를 들어 다당류 기반 물질(예를 들어, 아가로스, 세파로스, 셀룰로스), 실리카-기반 물질 또는 유기 (공)중합체(예를 들어, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌)로 제조될 수 있다. 작용기는 유도체화에 의해 도입될 수 있다.
이온 교환 물질은 예를 들어, 관심 있는 특정 물질에 대해 공급자가 지정한 대로, 그 자체로 공지된 방식으로 사용될 수 있다. 강한 이온 교환기의 장점은 넓은 pH 범위에서 이온을 포획할 수 있다는 점이다. 약한 이온 교환기의 장점은 재생이 용이하고, 재생에 필요한 화학물질이 적다는 점이다.
본 발명의 방법에 사용되는 이온 교환 물질은 식품 등급 기준을 충족해야 하며, 즉 식품 성분을 생산하는 데 사용할 수 있어야 하며, 바람직하게는 다양한 종교적 식품 기준(예를 들어, 할랄 및 코셔)도 충족해야 한다.
단계 (ii)의 양이온-교환 물질은 양이온 교환기로서, 즉 양전하 성분의 제거를 위해 사용된다. 양이온-교환 단계 (ii)는 바람직하게는 강한 양이온-교환 물질로 처리하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 양이온-교환 물질은 스티렌-디비닐벤젠 양이온 교환 수지, 보다 바람직하게는 겔형 스티렌-디비닐벤젠 양이온 교환 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는 강산 양이온 교환 물질이다. 양이온-교환 (단계 (ii))은 H+ 형태의 양이온-교환 물질을 사용하여 수행된다. 바람직한 구현예에서, 양이온-교환 물질은 술폰산 작용기를 포함한다. 가장 바람직하게는, 양이온-교환 물질은 스티렌/디비닐벤젠 겔형 매트릭스 및 술폰산 작용기를 갖는 강산 양이온 교환 수지이다.
양이온 교환 물질로 처리한 후, HMO-함유 용액은 1~3 범위의 pH를 갖게 된다. 이 용액은 이후에 pH를 높이고 용액에 추가 이온을 도입할 필요 없이 음이온 교환 물질에 적용된다(단계 (iii)). 위에서 언급한 바와 같이, HMO가 양성자화되어 중성 HMO로 거동하는 것은 음이온 교환 동안 낮은 pH 조건으로 인한 것이다.
단계 (iii)의 약염기성 음이온-교환 물질은 음으로 하전된 성분, 특히 인산염 및 황산염과 같은 다가 이온을 제거하기 위한 음이온 교환기로 사용된다. 음이온-교환 물질은 Cl- 형태이며, 이는 음이온 교환 물질이 선택적으로 다른 이온, 예를 들어 OH-, 음이온과 조합된 Cl- 반대 이온을 함유함을 의미한다. 바람직하게는, 음이온의 적어도 90%는 Cl- 음이온이다. 또한 2개의 음이온 교환 물질을 사용하는 것도 가능하며, 하나는 Cl- 형태이고, 다른 하나는 또 다른 형태, 예를 들어 OH- 형태이다. 여과된 용액을 이 물질로 처리하는 동안, 용액의 강한 음이온은 물질에 결합하는 반면, 대부분의 산성 HMO는 용액에 남아 있다.
음이온-교환 물질은 바람직하게는 스티렌-디비닐벤젠 음이온 교환 수지 및 가교 아크릴 음이온 교환 수지, 보다 바람직하게는 겔형 스티렌-디비닐벤젠 음이온 교환 수지 및 겔형 가교 아크릴 음이온 교환 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는 약염기성 음이온 교환 물질이다. 수지는 바람직하게는 3차 아민 작용기, 보다 바람직하게는 디메틸아민 작용기를 갖는다. 음이온 교환 물질은 Cl- 형태이다.
강한 음이온 교환 수지는 유기산 불순물에 유리하게 양성자화된 HMO를 포획하는 반면, 약한 음이온 교환 수지는 양성자화된 HMO가 컬럼을 통해 흐르는 동안 음이온성 불순물을 우선적으로 포획한다.
음이온 교환 수지의 재생은 HCl에 의해 수행될 수 있으며, 이는 이후에 양이온 교환 수지의 재생제로 사용될 수 있다.
음이온 교환 처리 후, HMO-함유 용액은 1.5~5.5, 바람직하게는 1.5~4 범위의 pH를 갖는다. 용액을 단계 (iv)의 흡착제 물질에 적용하기 전에 pH를 높이거나 낮출 필요가 없다. 또한, 이 단계에서 pH가 상승하면 용액에 여전히 존재할 수 있는 유기산 불순물이 음전하를 띠고, 선택적 단계 (vi)의 음이온 교환 물질에서 음으로 하전된 HMO와 경쟁하게 된다.
단계 (iv)의 흡착제 물질은 비이온성 유기 성분과 해리되지 않은 분자를 제거하는 역할을 하며, 활성탄과 같은 통상적인 흡착제 물질일 수 있지만, 바람직하게는 양이온-교환형 물질이다. 이러한 양이온 교환 물질은 바람직하게는 단계 (ii)에서 사용되는 양이온 교환 물질보다 더 높은 다공성 및 더 낮은 밀도의 이온 그룹을 갖는다.
단계 (iv)에서 사용될 수 있는 양이온 교환 물질의 공극률은 바람직하게는 0.8 내지 1.2 ml/g, 보다 바람직하게는 0.9 내지 1.1 ml/g, 및 가장 바람직하게는 0.95 내지 1.05 ml/g 범위이다. BET 표면적은 바람직하게는 600 m2/g 이상, 보다 바람직하게는 650 m2/g 이상, 보다 더 바람직하게는 670 m2/g 이상, 그리고 가장 바람직하게는 700 m2/g 이상이다.
흡착제 물질은 바람직하게는 술폰산 기의 존재에 의해 친수성이 증가되는 스티렌/디비닐 벤젠 공중합체 매트릭스이다. 본 발명의 방법에서, 성분, 전형적으로 유기 성분, 특히 비양이온성 성분, 특히 용액의 pH에서 중성인 성분을 흡착하는 데 사용된다. 활성탄과 같은 흡착제 물질에 비해 이러한 물질의 이점은 산성 올리고당의 흡착에 대해 불활성이라는 점이다. 놀랍게도, 흡착제 물질은 HMO를 함유하는 용액에서 색을 제거하는 데에도 적합하다는 것이 밝혀졌다. 특히, 메일라드(Maillard) 반응 생성물과 알돌 반응 생성물을 제거하는 데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 바람직하게는 양이온-교환 (단계 (ii)) 및 음이온-교환 (단계 (iii)) 단계들 이후에 사용되는 단계 (iv)의 흡착제 물질은 또한 (잔류) 양이온을 제거할 수 있다. 따라서, 단계 (iv)의 흡착제 물질은 (흡착을 통한) 성분, 특히 중성 성분의 제거에 사용된다.
단계 (iii)과 (iv) 사이 또는 단계 (iv)와 (v) 후에, 산성 용액에 선택적으로 음이온 교환 수지를 사용한 추가 음이온 교환을 수행하여 산성 모유 올리고당을 수지에 결합시킨다.
HMO와 결합할 수 있으려면, 상기 음이온 교환 수지의 음이온이 올바른 pKa를 가져야 한다. 즉, 상기 음이온에 상응하는 산의 pKa는 정제될 HMO의 산 형태의 pKa보다 높아야 한다. 예를 들어, 대부분의 시알릴락토스의 pH 범위는 약 2.9이다. 따라서, 음이온 교환 수지는 바람직하게는 상응하는 산의 pKa가 이 값 초과, 더욱 바람직하게는 4 초과, 가장 바람직하게는 4.5 초과인 음이온을 포함한다.
적합한 음이온의 예는 히드록실(OH-), 중탄산염(HCO3 -) 및 1가 유기산 음이온, 예컨대 아세테이트이다. 가장 바람직한 구현예에서, 음이온은 OH-이다.
약한 음이온 교환 수지는 일반적으로 강한 음이온 교환 수지보다 더 많은 수의 작용기를 갖고 따라서 더 많은 HMO에 결합할 수 있으므로, 음이온-교환 수지는 바람직하게는 약염기성 음이온 교환 물질이다. 약한 음이온 교환 수지는 바람직하게는 스티렌-디비닐벤젠 음이온 교환 수지 및 가교 아크릴 음이온 교환 수지, 보다 바람직하게는 겔형 스티렌-디비닐벤젠 음이온 교환 수지 및 미세다공성 또는 겔형 가교 아크릴 음이온 교환 수지로 이루어진 군으로부터 선택된다. 수지는 바람직하게는 3차 아민 작용기, 보다 바람직하게는 디메틸아민 작용기를 갖는다.
이어서 염 용액, 바람직하게는 NaCl 용액을 사용하여 상기 수지로부터 산성 모유 올리고당을 용출시킨다.
단계 (iii)과 (iv) 사이 또는 단계 (iv) 이후에 단계 (vi)를 선택적으로 포함하는 상기 단계 (i)~(iv) 이후, 생성된 용액의 pH는 5 초과, 바람직하게는 5~6 범위의 값으로 조정될 수 있다. 이는 HMO의 가수분해를 감소하고/하거나 방지하는 역할을 한다. 바람직하게는, KOH 또는 NaOH, 가장 바람직하게는 NaOH가 pH를 높이는 데 사용된다.
이러한 pH 조정은 단계 (vi)가 수행되지 않은 경우에 특히 바람직하다.
일반적으로 강한 양이온-교환, 약한 음이온-교환, 흡착, 및 선택적으로 음이온 교환 및 용출의 단일 처리 순서에 미정제 용액을 적용하는 것으로 충분하다. 그러나, 원하는 경우, 정제된 용액이 추가로 처리, 예를 들어 추가로 정제 및/또는 농축될 수 있다. 이러한 추가 처리는 바람직하게는 나노여과(NF) 및/또는 역삼투(RO)를 포함하며, 선택적으로 정용여과와 조합된다. NF 또는 RO 처리는 전형적으로 물을 제거하여 HMO를 농축하는 데 사용된다. (막 면적이 적게 필요한) 높은 플럭스가 필요한 경우, NF가 특히 적합한 것으로 간주된다. 비교적 높은 압력에서 작동되는 RO는 HMO 함량이 35~50 중량%의 HMO 함량과 같이 고농축 시럽을 얻는 데 특히 적합한 것으로 밝혀졌다.
대안적으로 또는 추가로, 정제된 용액은 용액을 농축하기 위해 증발 단계에 적용되어, 농축 용액(시럽)을 생성할 수 있다.
특정 구현예에서, (예를 들어, NF, RO 또는 증발에 의한) 농축 단계는 세균이나 포자가 용액에 존재하지 않도록 보장하기 위해 멸균 등급 정밀여과 단계가 뒤따른다.
시럽은 바람직하게는 적어도 25 중량%, 바람직하게는 25~50 중량%, 특히 25~35 중량%의 HMO 함량을 갖는다.
원하는 경우, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 HMO는 활성탄 또는 전하-변형 심층 필터와 같은 흡착제 물질을 사용하여 연마 단계에 적용될 수 있다. 정제된 용액이 농축 단계에 적용되어야 하는 경우, 연마 단계는 일반적으로 농축 단계 전에 수행된다. 연마 단계는 잔류 DNA 단편 및/또는 잔류 색상과 같은 유기 화합물의 추가 감소 또는 제거에 특히 유용하다.
본 발명의 방법으로부터 생성된 용액 또는 시럽은 결정질 HMO를 얻기 위해 결정화 단계에 적용될 수 있다. 적합한 결정화 조건은 일반적으로 올리고당 또는 특히 관심 있는 HMO에 대해 당업계에 공지된 조건을 기반으로 할 수 있다.
대안적으로, 분말 형태의 HMO를 얻기 위해 용액 또는 시럽이 건조 단계에 적용될 수 있다. 적합한 건조 조건은 일반적으로 올리고당 또는 특히 관심 있는 HMO에 대해 당업계에 공지된 조건을 기반으로 할 수 있다. 바람직한 건조 단계에는 분무-냉각, 분무 건조 및 동결건조(동결-건조)가 포함된다. 분무-건조에 의해 특히 우수한 결과가 달성되었다. HMO 분말의 수분 함량은 바람직하게는 10 중량% 미만, 보다 바람직하게는 8 중량% 미만, 보다 더 바람직하게는 5 중량% 미만이다. 가장 바람직하게는, 이러한 분말의 수분 함량은 건조 물질(DM)을 기준으로 2 내지 4% 범위이다.
본 발명의 방법은 70% 이상의 HMO 수율(발효액 내의 HMO 함량 기준) 및 90 중량% 이상의 HMO 순도(건조 물질 기준)를 달성할 수 있게 한다. 바람직한 구현예에서, 수율은 75~99 중량% 범위, 특정 구현예에서 80~97 중량% 범위(발효액 내의 HMO 함량 기준)이다.
바람직하게는, 6'-SL은 발효액 내의 6'-SL 함량을 기준으로 70% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 더 바람직하게는 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 85% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상의 수율로 발효액으로부터 얻어진다.
실시예
액체에서 박테리아 바이오매스를 제거하기 위해, 15 g/l 3'-SL 초과를 함유하는 발효액(20 kg)을 정밀여과하였다. MF 투과물은 단백질과 남아있는 DNA를 제거하기 위해 5 kDa 컷-오프 세라믹 UF 막(Tami Industries)으로 직교류 한외여과하였다.
그런 다음, UF 투과물을 이온 교환 크로마토그래피로 추가 정제하였다. 제1 컬럼에서, H+ 형태의 강한 양이온 교환 수지(설포네이트 작용기가 있는 스티렌-디비닐 벤젠 겔 매트릭스)에서 양이온이 제거되었다. 컬럼에서 나온 용액의 pH는 1.7~1.9였다. 제2 크로마토그래피 컬럼에서, 용액을 Cl- 형태의 약염기성 음이온 교환 수지(3차 아민 작용기와 가교결합된 아크릴 겔 매트릭스)로 처리하여, pH를 1.7 내지 1.9로 유지하면서 음이온을 Cl-로 교환하였다. 3'-SL은 이러한 조건에서 수지에 결합되지 않았다. 착색제 및 기타 흡착 불순물을 제거하여 용액의 pH를 변화시키지 않기 위해, 흡착제 수지로 제3 크로마토그래피 정제 단계를 수행하였다. 흡착제 수지는 약 1.0 ml/g의 공극률, 600~900Å의 평균 공극 크기, 및 700 m2/g 이상의 표면적을 갖는, H+ 형태의 설폰 작용기를 갖는 스티렌 디비닐벤젠 공중합체 매트릭스였다.
이온 교환 처리의 정제 효과는 다음 분석 결과로 나타낸다(모든 양은 건조 물질 기준 %; "n.d."는 "미검출"을 의미하며, 농도가 각 분석 방법의 검출 한계 미만임을 의미함).
Figure pct00001
크로마토그래피 단계후, 용액의 pH는 예를 들어, 수산화나트륨을 첨가함으로써 원하는 수준으로 증가될 수 있다. 염화물, 유기산 및 소량의 당과 같은 여전히 남아 있는 물질은 직교류 나노여과, 예를 들어, 분자량 컷-오프가 150~500 Da인 중합체 폴리피페라진 또는 폴리아미드 막을 사용하여 추가로 제거될 수 있다. 그렇게 함으로써, 건조 물질에서 88% 이상의 3'-SL 순도에 도달할 수 있다.

Claims (15)

  1. 발효액으로부터 산성 모유 올리고당(HMO)을 정제하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    (i) 발효액으로부터 바이오매스를 분리하여 미정제 용액을 제공하는 단계;
    (ii) 미정제 용액에 H+ 형태의 양이온 교환 물질을 사용한 양이온 교환을 수행하여, pH 범위가 1~3인 용액을 얻는 단계;
    (iii) 1~3 범위의 pH를 갖는 용액에 Cl- 형태의 약염기성 음이온 교환 물질을 사용한 음이온 교환을 수행하여, 1.5~5.5, 바람직하게는 1.5~4 범위의 pH를 갖는 용액을 얻는 단계;
    (iv) 1.5~5.5, 바람직하게는 1.5~4 범위의 pH를 갖는 용액에 흡착제 물질을 사용한 흡착을 수행하여, 중성 유기 화합물을 제거하는 단계;
    (v) 선택적으로, 흡착이 이루어진 용액의 pH를 5~6 범위의 값으로 조정하는 단계; 및
    (vi) 선택적으로, 음이온 교환 수지를 사용하여 용액에 음이온 교환을 수행하여 산성 모유 올리고당을 수지에 결합시킨 다음, 염 용액을 사용하여 수지로부터 산성 모유 올리고당을 용출시키는 단계로서, 상기 단계는, 단계 (iii) 및 (iv)의 사이 또는 단계 (iv) 및 (v)의 사이에 수행되는, 단계;를 포함하며,
    이로써 상기 산성 모유 올리고당을 포함하는 정제된 용액을 얻는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 산성 모유 올리고당은 6'-시알릴락토스(6'-SL), 3'-시알릴락토스(3'-SL), 디시알릴락토-N-테트라오스, 3'-시알릴-3-푸코실락토스, 및 시알릴락토-N-테트라오스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 6'-시알릴락토스(6'-SL) 및 3'-시알릴락토스(3'-SL)로부터 선택되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    단계 (ii)의 양이온 교환 물질이 강산 양이온 교환 물질, 바람직하게는 겔형 스티렌/디비닐벤젠 양이온 교환 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는 강산 양이온 교환 물질, 보다 바람직하게는 스티렌/디비닐벤젠 겔형 매트릭스 및 술폰산 작용기를 갖는 강산 양이온 교환 수지인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (iii)의 약염기성 음이온 교환 물질은 3차 아민, 바람직하게는 디메틸아민 작용기를 갖는, 아크릴 겔형 매트릭스 및 스티렌/디비닐벤젠 겔형 매트릭스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (iv)에서의 흡착제 물질은 약한 양이온 교환 물질로, 바람직하게는 스티렌/디비닐벤젠 공중합체 매트릭스 및 술폰산 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되고 0.8 내지 1.2 ml/g, 보다 바람직하게는 0.9 내지 1.1 ml/g, 및 가장 바람직하게는 0.95 내지 1.05 ml/g의 공극률, 및/또는 600 m2/g 이상, 보다 바람직하게는 650 m2/g 이상, 보다 더 바람직하게는 670 m2/g 이상 및 가장 바람직하게는 700 m2/g 이상의 BET 표면적을 갖는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (vi)의 음이온 교환 수지는 약염기성 음이온 교환 수지이며, 바람직하게는, 3차 아민, 바람직하게는 디메틸아민 작용기를 갖는, 아크릴 겔형 매트릭스 및 스티렌/디비닐벤젠 겔형 매트릭스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (i)은 5 kDa 이하, 바람직하게는 3 kDa 이하, 가장 바람직하게는 3 kDa의 분자량 컷-오프를 갖는 막의 사용을 수반하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (i)은 20~75℃ 범위, 바람직하게는 30~70℃ 범위, 특히 40~50℃ 범위 또는 60~70℃ 범위의 온도에서 수행되는 정밀여과 단계를 수반하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    MF 투과물이 단계 (ii) 전에 냉각 단계를 거치는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (vi)의 음이온 교환 수지는 OH- 형태인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    정제된 용액을 나노여과 및/또는 역삼투에 적용하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    정제된 용액이 선택적으로 하나 이상의 추가 처리 단계 후에 건조 또는 결정화 단계, 바람직하게는 분무-건조 단계에 적용되는, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    모유 올리고당이 10 중량% 미만, 바람직하게는 8 중량% 미만, 보다 바람직하게는 5 중량% 미만의 수분 함량을 갖는 분말 형태로 얻어지는, 방법.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    산성 모유 올리고당이 시럽 형태로 얻어지는, 방법.
  15. 산성 모유 올리고당의 제조 방법으로서,
    발효액에서 미생물 발효에 의해 산성 모유 올리고당을 생성하는 단계; 및
    생성된 산성 모유 올리고당을 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 정제하는 단계
    를 포함하는, 방법.
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