CN116322922A - 用于从发酵液中纯化酸性母乳寡糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于使用离子交换法从发酵液中纯化酸性母乳寡糖(HMO)的方法。该方法允许减少脱盐操作如电渗析的次数和/或程度。甚至可以避免此类操作。

Description

用于从发酵液中纯化酸性母乳寡糖的方法

本发明涉及一种用于纯化酸性母乳寡糖(HMO)的方法。

母乳含有各种寡糖(HMO)，其对婴儿的健康发育是重要的。许多HMO在健康肠道微生物组的发展中起重要作用。

存在很多HMO；母乳中最丰富地存在的HMO是岩藻糖基化乳糖如2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)和3’-岩藻糖基乳糖(3’-FL)、唾液酸化乳糖如3’-唾液乳糖(3’-SL)和6’-唾液乳糖(6’-SL)、以及四糖像乳糖-N-四糖(LNT)和乳糖-N-新四糖(LNnT)。

2’-FL、3-FL、LNT和LNnT是中性的，从某种意义上说它们是不带电的。

中性HMO可以相对容易地从产生它们的发酵液中纯化。在该纯化中使用阴离子交换色谱法和阳离子交换色谱法以去除带电物质。

例如，WO 2019/063757披露了用于纯化岩藻糖基化HMO的方法，该方法包括发酵液的超滤、使用强阳离子交换树脂的阳离子交换、使用呈OH^-形式的弱阴离子交换树脂的阴离子交换、以及最后使用高度多孔的弱阳离子交换吸附性树脂吸附除岩藻糖基化HMO之外的中性组分。

唾液酸化HMO如3’-唾液乳糖(3’-SL)和6’-唾液乳糖(6’-SL)是酸性的/带负电的并且通常以其钠形式制备。这种负电荷阻碍了上述中性HMO的纯化技术的应用，因为带负电的HMO将在与阴离子交换树脂结合时与其他阴离子竞争，从而导致不良分离。

WO 2009/113861披露了通过以下方式从脱脂乳流、优选无蛋白质的乳流中分离唾液酸化寡糖：使所述乳流-在任选的软化和纳滤程序之后-经受(i)阳离子交换步骤，(ii)使用呈游离碱形式且具有30％-48％水分含量的阴离子交换树脂的阴离子交换步骤，(iii)将寡糖与水分含量>45％且优选地也呈游离碱形式的微孔或凝胶型阴离子交换树脂结合，以及(iv)使用酸式盐溶液从所述树脂中洗脱寡糖。

WO 2010/106320披露了用于通过以下方式从乳清中分离和纯化3’-SL的方法：使用一系列的两种阴离子交换树脂和两种阳离子交换树脂使乳清脱矿化，随后使脱矿化的乳清与强酸性阳离子交换树脂和弱碱性阴离子树脂接触。3’-SL与弱阴离子交换树脂结合并随后从其中洗脱。

WO 2017/152918披露了用于通过以下方式从发酵液中分离唾液酸化寡糖的方法：(i)超滤、(ii)纳滤、(iii)任选的活性炭处理和(iv)用强阴离子或强阳离子交换树脂处理。带负电的材料(包括唾液酸化寡糖)与强阴离子交换树脂结合。在一个实施例中，唾液酸化寡糖通过用酸或盐的水溶液洗脱从阴离子交换树脂中回收。在另一个实施例中，从呈H⁺形式的强阳离子交换树脂中洗脱产物并且随后用NaOH中和，从而产生寡糖的钠盐。

WO 2019/229118披露了通过以下方式从发酵液中的其他碳水化合物中纯化唾液乳糖：使用至少一个但优选两个超滤步骤去除细胞团块，用呈H⁺形式的阳离子交换树脂和呈Cl^-形式的强阴离子交换树脂处理所得溶液，以及通过在以下两个膜上过滤从所得溶液中去除碳水化合物：截留分子量为300-500Da的一个膜和截留分子量为600-800Da的一个膜。用阳离子交换树脂处理后，用NaOH将溶液中和至pH 7。用阴离子交换树脂处理后，再次将溶液中和至pH 7。因此，引入了大量的盐，然后必须通过电渗析将其去除。

WO 2019/043029披露了通过以下方式从发酵液中的其他碳水化合物中纯化唾液乳糖：通过离心、微滤或超滤从发酵液中分离生物质，使用呈H⁺形式的强阳离子交换树脂去除阳离子，将所得含有唾液乳糖的洗脱液的pH提高至7，使用呈Cl^-形式的强阴离子交换树脂去除阴离子杂质，以及通过纳滤或渗滤去除分子量低于唾液乳糖的分子量的化合物。

此外该方法包括在两次离子交换处理之间将唾液乳糖用NaOH中和至pH 7，从而产生大量必须去除的盐。

EP 3 456 836 A1披露了用于从发酵液中分离唾液乳糖的两种方法。两种方法都包括离子交换步骤，随后是超滤、纳滤、和/或活性炭处理。根据第一种方法，这些离子交换步骤开始于使用呈Cl^-形式的强阴离子交换树脂的阴离子交换，随后是使用呈H⁺或Na⁺形式的阳离子交换树脂的阳离子交换步骤。该实施例的所披露的优点是这两个离子交换步骤之间不需要中和。

然而，该实例的缺点是阴离子交换步骤可能提高溶液的pH，这可能导致任何盐(像Ca盐)沉淀。因此，更希望开始于阳离子交换而不是阴离子交换，以便在金属离子可能沉淀之前去除它们。

第二种方法开始于使用呈H⁺或Na⁺形式的树脂的阳离子交换，随后是使用呈Cl^-形式的强阴离子交换树脂的阴离子交换。如果使用呈H⁺形式的阳离子交换树脂，则在递送至强阴离子交换树脂之前需要用NaOH进行中和以形成唾液乳糖的钠盐。否则，唾液乳糖将与强阴离子交换树脂结合。这种中和需要引入盐。

现已发现，通过引入较少的盐和/或在离子交换步骤之间没有中和步骤，可能使用离子交换方法从发酵液中分离并纯化酸性HMO到令人满意的程度。因此，可以减少脱盐操作(如电渗析)的次数和/或程度。甚至可以避免此类操作。

因此，本发明涉及一种用于从发酵液中纯化酸性母乳寡糖(HMO)的方法，该方法包括以下步骤：

(i)从该发酵液中分离生物质以提供粗溶液；

(ii)使该粗溶液经受使用呈H⁺形式的阳离子交换材料的阳离子交换，从而获得pH在1-3范围内的溶液；

(iii)使该pH在1-3范围内的溶液经受使用呈Cl^-形式的弱碱性阴离子交换材料的阴离子交换，从而获得pH在1.5-5.5、优选1.5-4范围内的溶液；

(iv)使该pH在1.5-5.5、优选1.5-4范围内的溶液经受使用吸附性材料的吸附以便去除中性有机化合物；

(v)任选地将该已经受吸附的溶液的pH调节至在5-6范围内的值；

(vi)任选地使该溶液经受使用阴离子交换树脂的阴离子交换，从而将该酸性母乳寡糖与该树脂结合，随后使用盐溶液从该树脂中洗脱该酸性母乳寡糖，该任选的步骤在步骤(iii)与步骤(iv)之间或在步骤(iv)与步骤(v)之间进行；

从而获得包含所述酸性母乳寡糖的纯化溶液。

可以用该方法纯化的酸性母乳寡糖的实例包括唾液酸化寡糖，其优选地选自由以下组成的组：6’-唾液乳糖(6’-SL)、3’-唾液乳糖(3’-SL)、二唾液乳糖-N-四糖、3’-唾液酸(sialyl)-3-岩藻糖基乳糖、唾液乳糖-N-四糖、岩藻糖基唾液乳糖-N-新六糖、二-岩藻糖基唾液乳糖-N-六糖、唾液乳糖-N-四糖a、唾液乳糖-N-四糖b、岩藻糖基唾液乳糖-N-六糖、以及3’-岩藻糖基唾液乳糖-N-四糖。更优选的有待通过该方法纯化的HMO是6’-唾液乳糖(6’-SL)、3’-唾液乳糖(3’-SL)、二唾液乳糖-N-四糖、3’-唾液酸-3-岩藻糖基乳糖、以及唾液乳糖-N-四糖。最优选地，本发明的方法用于纯化6’-唾液乳糖(6’-SL)或3’-唾液乳糖(3’-SL)。

在步骤(ii)和(iii)中用离子交换材料处理期间，酸性HMO停留在溶液中，而其他带电组分被有效去除。酸性HMO将不-或者只在较小的程度上-与步骤(iii)中使用的弱碱性阴离子交换材料结合。

据推理，由于溶液在经受步骤(iii)中的弱碱性阴离子交换树脂时的低pH条件，HMO变成质子化的并且从而表现为中性HMO。另一方面，溶液中其他带负电的组分将与弱碱性阴离子交换材料结合并因此从溶液中被去除。

发酵液典型地包含用于生产HMO的微生物或其残留物，以及用于这些微生物的营养物。还可能存在由其生产HMO的残余碳源。此外，可能存在由微生物产生的一种或多种副产物。

HMO的发酵生产可以基于已知的用于微生物生产寡糖的方法来进行，例如如以上提及的现有技术或其中引用的现有技术中所述。乳糖优选地用作碳源，其通过发酵液中的微生物转化成HMO。

从液相中分离生物质(步骤(i))可以以对已经用于生产HMO的发酵液类型而言本身已知的方式来实现。可以使用净化和/或过滤。在步骤(i)之前或期间，可以使发酵液经受脱气步骤。合适的脱气步骤通常是本领域已知的。脱气的有利之处在于它降低了在后续步骤期间形成气泡的风险。此类气泡可能会不利地影响溶液通过填充柱的流动，并且在使用松散珠粒的情况下，气体形成可能导致吸附性或离子交换材料的浮动。

可以使通过分离步骤(i)获得的粗溶液经受微滤(MF)和/或超滤(UF)。MF通常用孔径小于1μm、优选约0.1-0.2μm的膜来进行。MF特别适合于去除细胞材料(完整细胞、其碎片)和其他超分子碎片。MF可以在约环境温度下进行。通常，温度是在20℃-75℃的范围内。优选地，MF在至少30℃的温度下、更优选在35℃-70℃范围内的温度下进行。已经发现相对高的温度有利于提高HMO产率。特别有利的是在约40℃-50℃范围内的温度，如约45℃的温度，或者在约60℃-70℃范围内的温度，如约65℃。不受理论束缚，诸位发明人认为从生物质到液相中的分泌在高温下得以改善。此外，高温、特别是约60℃至70℃的温度有利于在微滤期间实现较高的细胞材料浓缩系数，这对HMO的产率有积极影响。

超滤步骤特别适合于从渗透物中去除蛋白质、DNA和/或内毒素。热处理用来使蛋白质改性，例如使它变性，由此它变得较不可渗透通过UF膜。UF膜优选地具有5kDa或更少、特别是约3kDa或更少的截留。截留通常为至少约1kDa。

在优选的实施例中，MF渗透物在经受超滤之前被冷却至低于20℃、更优选低于15℃、最优选8℃-12℃范围内的温度。

为了提高发酵液中HMO的回收率，MF和/或UF可以与渗滤一起施用。

在以上讨论的任选过滤步骤之后，然后将粗溶液用以下项进行处理：阳离子交换材料(步骤(ii))；弱碱性阴离子交换材料(步骤(iii))；和吸附性材料(步骤(iv))。

术语‘弱’离子交换和‘强’离子交换在本领域中通常是已知的。一旦离子交换剂达到平衡，强离子交换剂将不会显著释放其基质上的电荷，并且因此可以使用宽pH范围-通常从强酸性pH至强碱性pH。强阴离子交换树脂通常以存在季铵基团为特征。

弱离子交换剂具有它们将维持它们的电荷的更具体的pH值范围，通常在弱阴离子交换材料的情况下为酸性至约中性pH并且在弱阳离子交换材料的情况下为碱性至约中性pH。弱阴离子交换基团通常以不存在季铵基团为特征。常见的弱阴离子交换基团是叔胺基团。

离子交换材料可以作为膜、作为电荷改性的深度滤芯提供在填充柱中，或者用作悬浮或流化材料。离子交换材料典型地包含具有固定官能团(用于阴离子交换材料的阳离子，用于阳离子交换材料的阴离子)的基质。合适基质的实例是纤维状凝胶、微晶凝胶、或珠状凝胶。这些可以由例如基于多糖的材料(例如琼脂糖、琼脂糖凝胶、纤维素)、基于二氧化硅的材料、或有机(共)聚合物(例如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯)制成。官能团可以通过衍生化引入。

离子交换材料可以以对于所关注的特定材料本身已知的方式(例如如由供应商所指定的)采用。强离子交换剂的优点是它们可以在宽pH范围内捕获离子。弱离子交换剂的优点是它们容易再生：再生需要较少的化学品。本发明方法中使用的离子交换材料应满足食品级标准-即允许用于生产食品成分-并且优选地还满足各种宗教食品标准(例如清真食品(halal)和犹太食品(kosher))。

步骤(ii)中的阳离子交换材料用作阳离子交换剂，即用于去除带正电的组分。阳离子交换步骤(ii)优选地包括用强阳离子交换材料处理。优选地，阳离子交换材料是选自由以下组成的组的强酸阳离子交换材料：苯乙烯-二乙烯基苯阳离子交换树脂、更优选凝胶型苯乙烯-二乙烯基苯阳离子交换树脂。使用呈H⁺形式的阳离子交换材料进行阳离子交换(步骤(ii))。在优选的实施例中，阳离子交换材料包含磺酸官能团。最优选地，阳离子交换材料是具有苯乙烯/二乙烯基苯凝胶型基质和磺酸官能团的强酸阳离子交换树脂。

用阳离子交换材料处理后，含有HMO的溶液将具有在1-3范围内的pH。随后使该溶液经受阴离子交换材料(步骤(iii))，而不需要提高pH和在溶液中引入额外的离子。如以上提及的，由于阴离子交换期间的低pH条件，HMO被质子化并且从而表现为中性HMO。

步骤(iii)中的弱碱性阴离子交换材料用作阴离子交换剂以去除带负电的组分、更特别地去除多价离子如磷酸根和硫酸根。阴离子交换材料呈Cl^-形式，这意味着阴离子交换材料含有Cl^-抗衡离子，任选地与其他阴离子(例如OH^-)组合。优选地，至少90％的阴离子是Cl^-阴离子。还可以使用两种阴离子交换材料，一种呈Cl^-形式的阴离子交换材料以及一种呈另一种形式(例如OH^-)的阴离子交换材料。在用该材料处理经过滤的溶液期间，溶液中的强阴离子将与材料结合，而大部分酸性HMO仍在溶液中。

阴离子交换材料是弱碱性阴离子交换材料，其优选地选自由以下组成的组：苯乙烯-二乙烯基苯阴离子交换树脂和交联丙烯酸阴离子交换树脂，更优选凝胶型苯乙烯-二乙烯基苯阴离子交换树脂和凝胶型交联丙烯酸阴离子交换树脂。树脂优选地具有叔胺官能团、更优选二甲胺官能团。阴离子交换材料呈Cl^-形式。

在质子化HMO流动通过柱时，强阴离子交换树脂将捕获质子化HMO而有利于有机酸杂质，而弱阴离子交换树脂优先捕获阴离子杂质。

阴离子交换树脂的再生可以由HCl进行，随后其可以用作阳离子交换树脂的再生剂。

阴离子交换处理后，含有HMO的溶液具有在1.5-5.5、优选1.5-4范围内的pH。在使溶液经受步骤(iv)的吸附性材料之前不需要提高或降低pH。此外，如果在此阶段提高pH，则有机酸杂质-其可能仍存在于溶液中-将变成带负电的并且将在任选的步骤(vi)的阴离子交换材料上与带负电的HMO竞争。

步骤(iv)中的吸附性材料用来去除非离子有机组分和未解离分子并且可以是常规吸附性材料如活性炭，但优选地是阳离子交换类型的材料。与步骤(ii)中使用的阳离子交换材料相比，这种阳离子交换材料优选地具有更高的孔隙率和更低的离子基团密度。

可以用于步骤(iv)中的阳离子交换材料的孔隙率优选地是在0.8至1.2ml/g、更优选0.9至1.1ml/g、并且最优选0.95至1.05ml/g范围内。BET表面积优选地为≥600m²/g、更优选≥650m²/g、甚至更优选≥670m²/g并且最优选≥700m²/g。

吸附性材料优选地是苯乙烯/二乙烯基苯共聚物基质，其亲水性因磺酸基团的存在而增加。在本发明的方法中，它用来吸附组分、典型地有机组分、特别地非阳离子组分、更特别地在溶液的pH下为中性的组分。与吸附性材料(像活性炭)相比，这种材料的优点是其对酸性寡糖的吸附的惰性。出人意料地，已经发现吸附性材料还适合于从含有HMO的溶液中去除颜色。特别地，已经发现它在去除美拉德反应产物和羟醛反应产物方面有效。步骤(iv)的吸附性材料-其优选地在阳离子交换(步骤(ii))和阴离子交换(步骤(iii))步骤之后使用-还能够去除(残余的)阳离子。因此，步骤(iv)中的吸附性材料用于去除(经由吸附)组分、特别是中性组分。

在步骤(iii)与(iv)之间或在步骤(iv)和(v)之后，任选地使酸性溶液经受使用阴离子交换树脂的进一步阴离子交换，从而使酸性母乳寡糖与树脂结合。

为了能够结合HMO，所述阴离子交换树脂上的阴离子应具有合适的pKa。也就是：对应于所述阴离子的酸的pKa应大于有待纯化的HMO的酸形式的pKa。例如，大部分唾液乳糖的pH范围最高达约2.9。因此，阴离子交换树脂优选地包含阴离子，其相应酸的pKa大于此值、更优选大于4、并且最优选大于4.5。

合适阴离子的实例是羟基(OH^-)、碳酸氢根(HCO₃ ^-)和单价有机酸阴离子如乙酸根。在最优选的实施例中，阴离子是OH^-。

阴离子交换树脂优选地是弱碱性阴离子交换材料，因为弱阴离子交换树脂通常具有比强阴离子交换树脂更多的官能团数目并因此能够结合更多HMO。弱阴离子交换树脂优选地选自由以下组成的组：苯乙烯-二乙烯基苯阴离子交换树脂和交联丙烯酸阴离子交换树脂，更优选凝胶型苯乙烯-二乙烯基苯阴离子交换树脂和微孔或凝胶型交联丙烯酸阴离子交换树脂。树脂优选地具有叔胺官能团、更优选二甲胺官能团。

随后用盐溶液、优选NaCl溶液从所述树脂中洗脱酸性母乳寡糖。

上述步骤(i)-(iv)之后-任选地包括步骤(iii)与(iv)之间的步骤(vi)或在步骤(iv)之后-可以将所得溶液的pH调节至大于5、优选在5-6范围内的值。这用来减少和/或防止HMO的水解。优选地，使用KOH或NaOH、最优选NaOH来提高pH。

在未进行步骤(vi)时，特别优选这种pH调节。

使粗溶液经受单次处理顺序的强阳离子交换、弱阴离子交换、吸附、以及任选地阴离子交换和洗脱通常是足够的。然而，如果需要，可以将纯化溶液进一步处理，例如进一步纯化和/或浓缩。这种进一步处理优选地包括纳滤(NF)和/或反渗透(RO)，任选地与渗滤组合。NF或RO处理典型地用于去除水，从而浓缩HMO。如果希望高通量(需要较少的膜面积)，则NF被认为是特别适合的。已经发现在相对高的压力下操作的RO特别适合于获得具有高HMO含量(如35-50wt.％的HMO含量)的高度浓缩糖浆。

可替代地或另外地，可以使纯化溶液经受蒸发步骤以便浓缩溶液，从而产生浓缩溶液(糖浆)。

在具体的实施例中，浓缩步骤(例如通过NF、RO或蒸发)之后是灭菌级微滤步骤以便确保溶液中不存在细菌或孢子。

糖浆优选地具有至少25wt.％、优选25-50wt.％、特别是25-35wt.％的HMO含量。

如果需要，可以使用吸附性材料(如活性炭或电荷改性的深度过滤器)使通过本发明方法获得的HMO经受抛光步骤。如果使纯化溶液经受浓缩步骤，则抛光步骤通常在浓缩步骤之前进行。抛光步骤特别地可用于进一步减少或去除有机化合物(如残余的DNA片段)和/或残余的颜色。

可以使由本发明方法产生的溶液或糖浆经受结晶步骤以便获得结晶HMO。合适的结晶条件可以是基于本领域已知的通常用于寡糖、或特别关注的HMO的那些。

可替代地，可以使溶液或糖浆经受干燥步骤以便获得呈粉末形式的HMO。合适的干燥条件可以是基于本领域已知的通常用于寡糖、或特别关注的HMO的那些。优选的干燥步骤包括喷雾冷却、喷雾干燥和冷冻干燥(冻干)。用喷雾干燥已经获得了特别良好的结果。HMO粉末的水含量优选小于10wt.％、更优选小于8wt.％、甚至更优选小于5wt.％。最优选地，基于干物质(DM)，这种粉末的水含量是在2％至4％的范围内。

本发明的方法允许获得70％或更高(基于发酵液中的HMO含量)的HMO产率和90wt.％或更高(基于干物质)的HMO纯度。在优选的实施例中，产率在75-99wt.％的范围内，在具体实施例中是在80-97wt.％的范围内(基于发酵液中的HMO含量)。

优选地，从发酵液中以70％或更高、更优选75％或更高、甚至更优选80％或更高、还甚至更优选85％或更高并且最优选90％或更高的产率获得6’-SL，全部基于发酵液中的6’-SL含量。

实例

将含有超过15g/l 3’-SL的发酵液(20kg)进行微滤以便从液体中去除细菌生物质。用5kDa截留陶瓷UF膜(塔米工业公司(Tami Industries))对MF渗透物进行错流超滤，以便去除蛋白质和残留的DNA。

然后通过离子交换色谱法进一步纯化UF渗透物。在第一柱中，在呈H⁺形式的强阳离子交换树脂(苯乙烯-二乙烯基苯凝胶基质与磺酸盐官能团)上去除阳离子。离开柱的溶液的pH为1.7-1.9。在第二色谱柱中，用呈Cl^-形式的弱碱性阴离子交换树脂(具有叔胺官能团的交联丙烯酸凝胶基质)处理溶液，从而在将pH保持在1.7与1.9之间的同时与Cl^-交换阴离子。3’-SL在这些条件下没有与树脂结合。第三色谱纯化步骤用吸附剂树脂进行，以便去除着色剂和其他吸附性杂质，从而不改变溶液的pH。吸附剂树脂是具有呈H⁺形式的磺酸官能团的苯乙烯二乙烯基苯共聚物基质，其具有约1.0ml/g的孔隙率、600-900埃的平均孔径、和≥700m²/g的表面积。

通过以下分析结果示出离子交换处理的纯化效果(所有量基于干物质以％计；“n.d.”代表“未检测到”并且意指浓度低于各自分析方法的检测极限)。

组分	在IEX之前	在AEX之后	在吸附剂之后
				3’-SL	67.79	80.26	80.42
磷	1.20	n.d.	n.d.
				硫酸盐(无机的)	0.66	n.d.	n.d.
氯化物	n.d.	2.63	2.10
				钠	0.67	n.d.	0.42
钾	3.37	n.d.	n.d.
				钙	0.06	n.d.	n.d.
镁	0.23	n.d.	n.d.

在色谱法步骤之后，可以将溶液的pH例如通过添加氢氧化钠来增加到希望的水平。还残留的物质如氯化物、有机酸、和小分子糖可以借助于错流纳滤来进一步去除，例如通过使用截留分子量在150与500Da之间的聚合物聚哌嗪或聚酰胺膜来进一步去除。通过这样做，可以达到基于干物质88％并且显著更高的3’-SL纯度。

Claims (15)

1.一种用于从发酵液中纯化酸性母乳寡糖(HMO)的方法，该方法包括以下步骤：

(i)从该发酵液中分离生物质以提供粗溶液；

(ii)使该粗溶液经受使用呈H⁺形式的阳离子交换材料的阳离子交换，从而获得pH在1-3范围内的溶液；

(iii)使该pH在1-3范围内的溶液经受使用呈Cl^-形式的弱碱性阴离子交换材料的阴离子交换，从而获得pH在1.5-5.5、优选1.5-4范围内的溶液；

(iv)使该pH在1.5-5.5、优选1.5-4范围内的溶液经受使用吸附性材料的吸附以便去除中性有机化合物；

(v)任选地将该已经受吸附的溶液的pH调节至在5-6范围内的值；

(vi)任选地使该溶液经受使用阴离子交换树脂的阴离子交换，从而将该酸性母乳寡糖与该树脂结合，随后使用盐溶液从该树脂中洗脱该酸性母乳寡糖，该任选的步骤在步骤(iii)与步骤(iv)之间或在步骤(iv)与步骤(v)之间进行；

从而获得包含所述酸性母乳寡糖的纯化溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，该酸性母乳寡糖选自由以下组成的组：6’-唾液乳糖(6’-SL)、3’-唾液乳糖(3’-SL)、二唾液乳糖-N-四糖、3’-唾液酸-3-岩藻糖基乳糖、和唾液乳糖-N-四糖，更优选地选自6’-唾液乳糖(6’-SL)和3’-唾液乳糖(3’-SL)。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，步骤(ii)中的该阳离子交换材料是强酸阳离子交换材料，优选选自由凝胶型苯乙烯/二乙烯基苯阳离子交换树脂组成的组的强酸阳离子交换材料，更优选具有苯乙烯/二乙烯基苯凝胶型基质和磺酸官能团的强酸阳离子交换树脂。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(iii)中的该弱碱性阴离子交换材料选自由以下组成的组：具有叔胺、优选二甲胺官能团的丙烯酸凝胶型基质和苯乙烯/二乙烯基苯凝胶型基质。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(iv)中的该吸附性材料是弱阳离子交换材料，其优选地选自由苯乙烯/二乙烯基苯共聚物基质和磺酸官能团组成的组并且具有0.8至1.2ml/g、更优选0.9至1.1ml/g、并且最优选0.95至1.05ml/g的孔隙率，和/或≥600m²/g、更优选≥650m²/g、甚至更优选≥670m²/g并且最优选≥700m²/g的BET表面积。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(vi)中的该阴离子交换树脂是弱碱性阴离子交换树脂，其优选地选自由以下组成的组：具有叔胺、优选二甲胺官能团的丙烯酸凝胶型基质和苯乙烯/二乙烯基苯凝胶型基质。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(i)包括使用截留分子量为5kDa或更少、优选3kDa或更少、最优选3kDa的膜。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(i)包括微滤步骤，其在20℃-75℃范围内、优选在30℃-70℃范围内、特别地在40℃-50℃范围内或在60℃-70℃范围内的温度下进行。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，在步骤(ii)之前使MF渗透物经受冷却步骤。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(vi)中的该阴离子交换树脂呈OH^-形式。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，该方法进一步包括使该纯化溶液经受纳滤和/或反渗透。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使该纯化溶液–任选地在一个或多个另外的处理步骤之后–经受干燥或结晶步骤、优选喷雾干燥步骤。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，该母乳寡糖以粉末的形式获得，其具有小于10wt.％、优选小于8wt.％、更优选小于5wt.％的水含量。

14.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，该酸性母乳寡糖以糖浆的形式获得。

15.一种用于生产酸性母乳寡糖的方法，该方法包括通过在发酵液中进行微生物发酵来生产该酸性母乳寡糖以及使用根据前述权利要求中任一项所述的方法纯化所生产的酸性母乳寡糖。