JP2003522539A

JP2003522539A - 酪農水流の濾過方法

Info

Publication number: JP2003522539A
Application number: JP2001559275A
Authority: JP
Inventors: スティーブン・エー・ロス; ジョナサン・ケー・ウェイル; マイケル・スペイド
Original assignee: ネオステクノロジーズインコーポレイテッド
Priority date: 2000-02-16
Filing date: 2001-02-06
Publication date: 2003-07-29
Also published as: AR027387A1; WO2001060171A1; AU778614B2; BR0108353A; NO20023844D0; TWI280101B; US6288222B1; MXPA02007996A; EP1255445A4; EP1255445B1; NO324474B1; NO20023844L; AU3280001A; KR20020075402A; ATE293890T1; KR100781447B1; CA2400346A1; DE60110374D1; DE60110374T2; EP1255445A1

Abstract

(57)【要約】濾過法によるシアリルオリゴサッカリドの単離で遭遇される純度に関する特別な問題は、ラクトースからの分離である。分子サイズの類似性のため、濾過による廃棄水流から、ラクトースの存在しないシアリルオリゴサッカリドを単離することはしばしば困難である。従って、酪農水流から高い純度で、シアリルオリゴサッカリドを得るための濾過方法が所望されるであろう。本発明は、シアリルオリゴサッカリドとラクトースとを含む酪農水流をプロセッシングする方法を提供することによりこの問題を解決し、ここでは酪農水流が、シアリルオリゴサッカリドの分離の前に、ラクトースの加水分解を果たすように処理される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、酪農水流の濾過方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】

ホエーはチーズ作製の主要な副産物であり、それは環境的な理由のため、難し
い廃棄物の廃棄の問題を提供する。ホエーは典型的に、約５重量％のラクトース
、１重量％のタンパク質、及び約０．５重量％の塩からなり、ここで混合物のバ
ランスは水である。タンパク質構成成分が、しばしば超濾過によって回収され、
従って食料製品において使用できる一方で、ラクトース構成成分は今までほとん
ど価値を有していない。

【０００３】ホエー廃棄水流の経済的価値を増大する一つの方法は、破棄水流からシアリル
オリゴサッカリドを単離することである。アニオン交換クロマトグラフィーは、
ラクトースから荷電したシアリルオリゴサッカリド構成成分を除去するために有
効である。塩の存在、特に酸の添加から由来するクエン酸塩の存在は、シアリル
オリゴサッカリドの除去の有効性を著しく減少し、そのためシアリルオリゴサッ
カリドの有効な回収を達成するために、ホエー廃棄水流から塩を除去することが
従来法となっている。

【０００４】シアリルオリゴサッカリド分画の除去方法が報告されているが、抽出及びイオ
ン交換法は、スループット及び純度の観点から完全に満足なものとはなっていな
い。

【０００５】 Shimatani等, 米国特許第5,118,516号は、(a)電気透析、または(b)カチオン交
換樹脂と強力な塩基性アニオン交換樹脂によるイオン交換、または(c)電気透析
と、透過物を脱塩するためのカチオン交換樹脂と強力な塩基性アニオン交換樹脂
によるイオン交換との組み合わせによる、ホエー、スキムミルク、または脱タン
パク質化溶液からのシアル酸含有ラクトースの単離を報告している。

【０００６】 Shimatani等, 米国特許第5,270,462号は、チーズホエーのpHを酸性に調節し、
ホエーをカチオン交換因子と接触させ、溶出物を濃縮して脱塩することによる、
高濃度のシアル酸を含む組成物の製造方法を報告している。

【０００７】日本国特開平1-168,693号は、ミルク、ノンファットミルク、バターミルク、
またはホエーを超濾過にかけ、4.0から6.0のpHで20,000から500,000ドルトンで
分画し、第二の超濾過で、0.2から2.0MPaの下で6.0から8.0のpHで1,000から10,0
00ドルトンで分画し、ラクトースのような不純物を除去することによる、シアル
酸組成物の調製を報告している。残余物はスプレードライまたは凍結乾燥される
。

【０００８】日本国特開平3-143,351号は、中和し、超濾過し、逆浸透し、脱塩し、強力な
塩基性タイプのアニオン交換樹脂にシアル酸を吸着し、その後溶出して脱塩して
乾燥することによる、ホエーの脱塩で形成されたアニオン交換樹脂のアルカリ洗
浄廃液からのオリゴサッカリド結合タイプのシアル酸の回収を報告している。

【０００９】日本国特開昭59-184,197号は、シアリルオリゴサッカリド含有糖蜜を脱塩し、
脱塩した溶液をアニオン交換カラムに通し、溶出物を中和し、電気透析により溶
出物を脱塩することによる、シアル酸に結合したオリゴサッカリドの製造を報告
している。

【００１０】 Gregory等, 米国特許第5,707,678号は、脂肪及びカゼインの除去の後、4.5か
ら5.0のpHで超濾過することにより、ミクロフィルター膜またはデプスフィルタ
ーのファウリングなくミクロ濾過できるホエー産物を提供する、ミルクまたは初
乳ホアーのミクロ濾過の方法を報告している。シアリルオリゴサッカリドの単離
は報告されていない。

【００１１】 Marquardt等, 米国特許第4,497,836号は、ミネラルが豊富な食用のチーズホエ
ーを超濾過にかけて、タンパク質が豊富な残余物とラクトースが豊富な濾過物を
生産する、幼児用の食料処方における使用に適した産物の調製方法を報告してい
る。次いでラクトースが豊富な濾過物は、電気透析によるように、部分的に脱ミ
ネラル化され、タンパク質が豊富な残余物と混合される。この方式では、脱ミネ
ラル化が可能である。さらにこの方法では、残余物はタンパク質が豊富な組成物
であり、濾過物はラクトースとミネラルが豊富である。シアリルオリゴサッカリ
ドの豊富な残余物の作製は開示されていない。

【００１２】 Venkatsubramanian等, 米国特許第4,376,023号は、デキストロースとオリゴサ
ッカリドを含む産物水流を、高い透過性及び低い透過性のイオン交換膜の変化を
使用することによって、電気浸透セルにおいて分離し、デキストロースを選択的
に除去して、デキストロースとオリゴサッカリドの豊富な別個の流出水流をそれ
ぞれ得ることを達成する方法を報告している。

【００１３】 Hall, 米国特許第4,081,326号は、Ｇ₄及び低級サッカリドを含むオリゴサッカ
リド組成物を、パン酵母及びマルターゼの両者で処理することによる、Ｇ₄及び
低級サッカリドを特に含まないオリゴサッカリド組成物の取得方法を報告してい
る。

【００１４】 Hermann, 米国特許第4,844,923号は、酸性沈降によるミルク産物からの血清タ
ンパク質を除去方法を報告しており、そこでは酸沈降の前の少なくとも部分的な
脱ミネラル化が、この方法の効率を著しく増大することが見出された。逆浸透に
よるシアリルオリゴサッカリドの除去は開示されていない。

【００１５】 Eustache, 米国特許第4,042,576号は、タンパク質を熱処理により綿状沈殿し
、次いで上清を超濾過する、ホエーからの糖タンパク質とシアル酸の抽出方法を
報告している。超濾過残余物は加水分解によって処理され、次いでシアル酸が加
水分解上清から抽出される。残余物組成物を制御するための超濾過におけるpHの
調節は開示されていない。

【００１６】 Brian等, 米国特許第5,714,075号は、イオン交換クロマトグラフィーによりシ
アリルオリゴサッカリドのリチウム塩を得て、溶媒で抽出することによってシア
リルオリゴサッカリドを得る、チーズ加工廃棄水流のプロセッシングを報告して
いる。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】

濾過法によるシアリルオリゴサッカリドの単離で遭遇される純度に関する特別
な問題は、ラクトースからの分離である。分子サイズの類似性のため、濾過によ
る廃棄水流から、ラクトースの存在しないシアリルオリゴサッカリドを単離する
ことはしばしば困難である。従って、酪農水流から高い純度で、シアリルオリゴ
サッカリドを得るための濾過方法が所望されるであろう。

【００１８】本発明は、シアリルオリゴサッカリドとラクトースとを含む酪農水流をプロセ
ッシングする方法を提供することによりこの問題を解決し、ここでは酪農水流が
、シアリルオリゴサッカリドの分離の前に、ラクトースの加水分解を果たすよう
に処理される。

【００１９】

【課題を解決するための手段】

従って、本発明の一つの目的は、酪農水流からシアリルオリゴサッカリドをプ
ロセッシングする新規な方法を提供することである。

【００２０】本発明の第二の目的は、シアリルオリゴサッカリドの分離の前に、ラクトース
の加水分解にかけられている酪農水流からシアリルオリゴサッカリドをプロセッ
シングする新規な方法を提供することである。

【００２１】本発明の目的は、以下の工程： i)ラクトースとシアリルオリゴサッカリドを含む酪農水流のラクトースを加水分
解する工程； ii)シアリルオリゴサッカリドを分離する工程；を含む、シアリルオリゴサッカリドとラクトースを含む酪農水流からシアリルオ
リゴサッカリドをプロセッシングする方法によって達成される。

【００２２】分離が、ラクトースがグルコースとガラクトースに加水分解されている酪農水
流で実施される場合に、シアリルオリゴサッカリドの純度が増大できることが発
見された。

【００２３】

【発明の実施の形態】

本発明は、ラクトースがグルコースとガラクトースに加水分解されている廃棄
水流で分離が実施される場合、シアリルオリゴサッカリドがより容易に分離され
るという発見に部分的に基づく。

【００２４】加水分解化酪農水流の濾過は、廃棄水流がシアリルオリゴサッカリドとラクト
ースを含むことを条件に実施されて良い。しかしながらほとんどの酪農水流は、
タンパク質、塩及び脂肪のようなオリゴサッカリド以外のさらなる構成成分を含
み、従ってそれらの除去は、当業者に知られた一般的方法によって達成されて良
い。

【００２５】例えば酪農水流は、濾過、当業者に知られた従来法によってオリゴサッカリド
分画に精製されて良い。

【００２６】ナノ濾過膜は、Desalによって製造されたG20のような約35,000の分子量カット
オフを有する逆浸透膜であろう。

【００２７】ナノ濾過は、10から1,000lbs/psi、好ましくは50から800lbs/psi、より好まし
くは100から400lbs/psiの正圧で実施される。

【００２８】ナノ濾過の温度は特に制限されず、10℃から約40℃で実施されて良い。低pH及
び高温では、シアリルオリゴサッカリドは分解し始めるであろう。

【００２９】ナノ濾過膜のサイズ（比表面積）は、処理される酪農水流の容量、ナノ濾過さ
れる溶液中の物質の濃度、及び所望のスループットに依存して、当業者によって
適切なように選択されて良い。

【００３０】オリゴサッカリド含有分画を得た後に、シアリルオリゴサッカリドは、ラクト
ースの加水分解と分離によってさらに精製されて良い。

【００３１】プロセッシングされる廃棄水流においてラクトースを加水分解するために使用
される方法については、特に制限されない。ラクトースのグルコース−ガラクト
ース結合の切断について選択的な加水分解酵素での処理が好ましい。加水分解処
理の使用は、シアリルオリゴサッカリド構成成分を顕著に加水分解せずに、モノ
サッカリドグルコースとガラクトースにラクトースを加水分解するのに十分であ
る。

【００３２】本発明の文脈の範囲内で、シアリルオリゴサッカリドは、3'シアリルラクトー
ス、6'シアリルラクトサミン、3'シアリルラクトサミン、及びジシアロラクトー
スを制限することなく含むであろう。

【００３３】好ましくは、ラクトースの加水分解の速度：シアリルオリゴサッカリドの加水
分解の速度の比が、>10:1、より好ましくは>15:1、さらにより好ましくは>20:1
、より好ましくは>500:1、及びさらにより好ましくは>50,000:1のような条件の
下で、加水分解が実施される。

【００３４】一つの実施態様では、加水分解は、酵素、特にβ-ガラクトシダーゼ酵素によ
って触媒される。適切なβ-ガラクトシダーゼ酵素は、過度の実験なくして当業
者に知られた従来法によって得られて良い。好ましい実施態様では、β-ガラク
トシダーゼは、Aspergillusの発酵によって作製される。適切な酵素は、New Yor
kのEnzyme Development社から得られても良い。適切な酵素は、Johnson and Joh
nsonのMcNeil Consumerプロダクト部門から得られるLactaid(登録商標)として入
手可能である。

【００３５】典型的な酵素的加水分解は、水のような水性媒体で実施され、その媒体は当業
者に知られているさらなる構成成分をさらに含んでも良い。

【００３６】酪農水流のpHは、シアリルオリゴサッカリドに対するラクトースの加水分解速
度の差異を最大化するために、当業者に知られた従来法によって調節されて良い
。例えば3-8、好ましくは4-7、より好ましくは約5.5のpHが選択されて良い。所
望のpHの範囲は、HCl、H₂SO₄、HOAc、シュウ酸、クエン酸、または乳酸のような
プロトン酸を加えることによって得られて良い。

【００３７】もし必要であれば、pHは、NaOH、NaHCO₃、アンモニアのような適切な塩基を加
えることによって調節されても良い。

【００３８】グルコース−ガラクトース結合の切断の最適な活性にpHを調節するために、反
応媒体は緩衝されて良い。適切なバッファーは、当業者によって選択されて良い
。しかしながら、反応媒体のイオン強度を最小化する観点から、高い能力を有す
るバッファーが選択される。

【００３９】ホエーはラクトースに対する乳酸生産細菌の機能の結果として典型的に酸性で
あるため、ホエーは適切な加水分解媒体である。

【００４０】酪農水流の加水分解に作用するために使用される酵素の量は特に制限されず、
所定の活性の所定の酵素に対して、コスト的に有効で時間的に有効な加水分解を
得るように選択されて良い。4,500活性ユニットのβ-ガラクトシダーゼは、約１
時間で0.45gのラクトースを含む溶液の>99%を加水分解するのに有効であり、こ
こで活性ユニットは、１分間に１マイクロモル(342μg)のラクトースを加水分解
するであろう。加水分解の許容可能な速度は、0.45gのラクトースに対して作用
する40活性ユニット程度で観察される。

【００４１】反応温度は特に制限されず、典型的に10から55℃、好ましくは20-40℃、より
好ましくは25-38℃、より好ましくは約37℃で、コストと時間的に有効な加水分
解を得るように選択されて良い。温度範囲の高温端部で観察される選択性の損失
は存在しない一方で、高温と低pH（約2のpH）の組み合わせは、シアリルオリゴ
サッカリドとβ-ガラクトシダーゼ酵素の分解を引き起こし得る。

【００４２】酪農水流のラクトース構成成分の加水分解の後、加水分解化物質の、シアリル
オリゴサッカリド含有分画とグルコース／ガラクトース含有分画への分離が実施
されて良い。

【００４３】加水分解化酪農水流からのシアリルオリゴサッカリド構成成分の分離は、濾過
（ナノ濾過及び超濾過、結晶化及びクロマトグラフィー）によるような、当業者
に知られた従来法によっても良い。

【００４４】分離は、分子量及び／または荷電に基づいて分離して、膜を通じたナノ濾過に
よっても良い。例えば適切な膜は、Desal GKシート膜スパイラルウーンド、セラ
ミック、ポリエーテルスルホン、ポリビニルジフルオリド、、及び再生セルロー
スである。一般的な条件の下での典型的な膜選択性は、>50:1、好ましくは>75:1
、より好ましくは>100:1、さらにより好ましくは>500:1の、シアリルオリゴサッ
カリドに対するグルコース及びガラクトースの選択である。

【００４５】ナノ濾過条件は、許容可能な速度で許容可能なレベルの分離を生ずるように、
当業者によって選択されて良い。圧力（典型的に10から1,000psig、好ましくは2
00-300psig）、典型的に10から60℃、好ましくは25-38℃の温度、及び流速の調
節は、許容可能なレベルの分離を得るのに十分であろう。pHは特に制限されない
が、3より低いpHでは、シアリルラクトースは典型的に膜を通過する。

【００４６】好ましい実施態様では、生成したシアリルオリゴサッカリド含有構成成分は、
加水分解前のオリゴサッカリド構成成分に対する、>50:1、好ましくは>75:1、よ
り好ましくは>100:1、さらにより好ましくは>500:1のラクトースに対するシアリ
ルオリゴサッカリドの富化を有する。

【００４７】ナノ濾過の後の残余物は、≦５重量％、好ましくは≦３重量％、より好ましく
は≦１重量％、さらにより好ましくは≦０．５重量％の残余ラクトース含量を有
して良い。

【００４８】ナノ濾過の後の残余物は、≦５重量％、好ましくは≦３重量％、より好ましく
は≦１重量％、さらにより好ましくは≦０．５重量％の残余のグルコースとガラ
クトースの組み合わせを有して良い。

【００４９】本発明に従ってプロセッシングされた酪農水流は、チーズ作製工程の間で生成
したいずれの廃棄水流から得られても良い。例えば、スキムミルクをカッテージ
チーズを形成するために凝集する際に、酸ホエーが固体を分離することによって
生成する。酸ホエーは、高い乳酸含量によって特徴付けされる。チーズを全乳か
ら調製する場合、残余の液体はスイートホエーであり、それは乾燥ホエーパウダ
ーを形成するように蒸発によってさらにプロセッシングできる。スイートホエー
はまた、乾燥し、脱ミネラル化し、蒸発して脱ミネラル化ホエー透過物を形成で
きる。スイートホエーはまた超濾過にかけることができ、ホエー透過物とホエー
透過物濃縮物の両者を形成できる。ホエー透過物は、ラクトースを結晶化するこ
とによってさらにプロセッシングでき、ラクトースと母液の両者を形成できる。
ホエー透過物からラクトースを結晶化することにより生成した母液は、当該技術
分野で「Delac」として知られている。適切な酪農水流は、初乳、ミルク、ミル
クパウダー、全ホエー、脱ミネラル化ホエー透過物、脱ミネラル化ホエー透過物
から生成した水流、ホエー透過物、結晶化ラクトース、スプレー乾燥化ラクトー
ス、ホエーパウダー、食用ラクトース、ラクトース、精製ラクトース、及びUSP
ラクトースを含む。好ましくは、ラクトースの結晶化から生成する水性母液物質
（即ちDelac）が使用される。

【００５０】シアリルオリゴサッカリド分画の除去の前に、酪農水流は、シアリルオリゴサ
ッカリドの含量を増大するためにプロセッシングされて良い。例えば、タンパク
質分画を未だ含む酪農水流は、トランスシアリダーゼ酵素で処理されて良く、そ
れはシアリル化タンパク質由来のシアル酸基をラクトースに変換することによっ
て、シアリルオリゴサッカリドの濃度を増大する。適切なトランスシアリダーゼ
酵素は、Trypanosomeから入手可能である。適切な反応条件は、25から40℃、好
ましくは約37℃の温度、500μ/Lの酵素濃度、5-10重量％、好ましくは約7重量％
の可溶性濃度、及び4-11、好ましくは約6のpHである。

【００５１】液体チーズホエーは典型的に、非吸湿性の非常に分散性のパウダーを生産する
ように典型的に乾燥される。新鮮な液体ホエーは、脱スラッジタイプのクラリフ
ァイヤーを通過することによって清浄化される。ホエーは脂肪を除去するように
分離され、次いで約62重量％の固体含量に二重または三重作用蒸発器において濃
縮される。固体は室温での分離によって除去でき、またはより好ましくは濃縮ホ
エーは固体を除去する前に冷却される。

【００５２】プロセッシングされる酪農水流がホエーの乾燥から得られる固体である場合、
約1から620g、好ましくは50から200g、より好ましくは約100gの固体／水のリッ
トルの量に、固体は最初に水中に溶解される。チーズホエーの乾燥から得られる
固体の溶解は、溶解工程を加速し、溶解される固体の量を増大するために、室温
または高温で実施できる。好ましくは、20-80℃の温度が適している。

【００５３】正に荷電した物質を除去するために、当業者に知られたいずれの方法も使用で
きる。例えば、ホエータンパク質の吸着を引き起こすための一つの適切な方法は
、J. N. DeWitt等(Neth. Milk Dairy J., 40: 41-56 (1986))及びJ. S. Ayers等
(New Zealand J. Dairy Sci. & Tech., 21: 21-35 (1986))、並びに日本国特開
昭52-15120号及び特開昭63-39545号、及び特開平2-104246号及び特開平2-138295
号に記載されたように、カチオン交換樹脂と接触させることによる。

【００５４】適切なカチオン交換樹脂は、当業者に知られた従来法によって調製されて良い
。例えば適切なカチオン交換樹脂は、ラジカルエマルション重合法によって重合
可能な一官能性及び多官能性モノマーの混合物から生産され、次いでプロトン化
形態で存在するカルボン酸基またはスルホン酸基のような酸性基で官能化されて
も良い。

【００５５】カチオン交換樹脂中の架橋の度合いは、カチオン交換カラムの操作条件に依存
して選択できる。高度に架橋された樹脂は、耐久性と高い度合いの機械的強度の
利点を与えるが、減少した多孔性とマストランスファーの下降という欠点を有す
る。低い架橋の樹脂はより脆弱で、移動相の吸着によって膨潤する傾向を有する
。適切な樹脂は、2から12%の架橋、好ましくは8%の架橋を有して良い。

【００５６】カチオン交換樹脂の粒径は、酪農水流の有効な流れを許容する一方で、正に荷
電した物質を有効に除去するように選択される。30×18cmのカラムについての適
切な粒径は、100-200メッシュである。

【００５７】適切なカチオン交換樹脂は、CM-Sephadex、SP-Sephadex、CM-Sepharose、S-Se
pharose、CM-Cellulose、Cellulose Phosphate、Sulfoxyethyl-Cellolose、Ambe
rlite、Dowex-50W、Dowex HCR-S、Dowex Macroporous Resin、Duolit C433、SP
Trisacryl Plus-M、SP Trisacryl Plus-LS、Oxycellulose、AG 50W-X2、AG 50W-
X4、AG 50W-X8、AG 50W-X12、AG 50W-X16、AG MP-50 REsin、Bio-Rex 70を制限
することなく含む。より好ましい適切な樹脂は、DOWEX(登録商標)50x8(Dow Chem
ical社製のポリスチレン架橋樹脂に結合した芳香族スルホン酸)及びAMBERLYST(
登録商標)-15、AMBERLITE(登録商標)IR-120、及びAMBERLITE(登録商標)-200酸性
樹脂である。

【００５８】酪農水流は、ホエータンパク質及び他の正に荷電した物質を、カチオン交換樹
脂に吸着させるであろういずれかの適切な態様で、カチオン交換樹脂と接触でき
る。好ましくはカチオン交換樹脂はカラムに搭載され。酪農水流はカラムを通過
させられて、ホエータンパク質を除去する。カチオン交換樹脂の量は、正に荷電
した物質の除去を達成するように選択され、処理される酪農水流に依存して大き
く変化するであろう。典型的に廃棄水流がホエー透過物である場合、カチオン交
換樹脂に対する酪農水流の搭載比は、5から20、好ましくは8-15、より好ましく
は9から12:1v/vであって良い。

【００５９】接触がカラムで実施される場合、酪農水流は好ましくは1から70cm/分、好まし
くは2から15cm/分、より好ましくは4.6cm/分の速度で通過する。適切な圧力は、
所望の流速を得るように選択されて良い。典型的に0から100PSIGの圧力が選択さ
れる。適切な流速はまた、カラムの溶出の最後に負の圧力を適用し、溶出物を回
収することによって得られて良い。正圧と負圧の両者の組み合わせもまた使用さ
れて良い。

【００６０】カチオン交換樹脂と酪農水流の接触のために使用される温度は、廃棄水流の構
成成分の分解を引き起こさないようにあまり高温でない範囲で、特に制限されな
い。一般的に、17から25℃の環境室温が使用される。

【００６１】別法として、正に荷電した物質は、電気泳動、超濾過、逆浸透、または塩沈降
のような方法によって除去できる。

【００６２】 3'シアリルラクトース、6'シアリルラクトース、及び6'シアリルラクトサミン
のようなシアリルオリゴサッカリドは、細菌抗接着、抗感染として、及び幼児用
処方のための添加剤として有用である。シアル酸含有組成物の有用性は、米国特
許第5,270,462号に報告されている。シアリルラクトースはまた、関節炎の治療
方法において有用であると報告されている（米国特許第5,164,374号）。3'-シア
リルラクトースは、Helicobacter pyloriによって引き起こされる潰瘍の予防と
治療のために使用されても良い。

【００６３】逆浸透は好ましくは、300-1,600psi、より好ましくは400-600psi、さらにより
好ましくは450psiの圧力で実施される。

【００６４】塩を逆浸透によって除去した後、精製した物質を濃縮して、3'-シアリルラク
トース及び6'-シアリルラクトースのようなシアリルオリゴサッカリドを含む固
体物質を提供でき、これらは水と有機溶媒の混合物から結晶化できる。

【００６５】好ましくは沈降溶媒は、エタノール、アセトン、メタノール、イソプロパノー
ル、ジエチルエーテル、t-ブチルメチルエーテル、エチルアセタート、ヘキサン
、テトラヒドロフラン、及び水の群から選択される。

【００６６】さらに、3'シアリルラクトース、6'シアリルラクトース、及び6'シアリルラク
トサミンを含むシアリルオリゴサッカリドの混合物を含む、アニオン交換カラム
からの溶出液は、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウムのような適切な塩、または
酢酸リチウム、過塩素酸リチウム、塩化リチウム、及び臭化リチウムの様なリチ
ウム塩を溶出液としてバッファーで使用して、4から6のpHで、DOWEX 1x2アニオ
ン交換樹脂でのカラムクロマトグラフィーによって、ここに含まれるシアリルオ
リゴサッカリドの分離にかけることができる。酢酸リチウムの溶液が好ましい。

【００６７】適切なアニオン交換樹脂は、前述のような当業者に知られた従来法によって調
製されて良い。

【００６８】アニオン交換樹脂における架橋の度合いは、アニオン交換カラムの操作条件に
依存して選択できる。適切な樹脂は、2から12%の架橋、好ましくは2%の架橋を有
して良い。

【００６９】アニオン交換樹脂の粒径は、酪農水流の有効な流れが可能な一方で、負に荷電
した物質のクロマトグラフィーでの分離に有効に作用するように選択される。20
×100cmのカラムについての適切な粒径は、200-400メッシュである。

【００７０】適切なアニオン交換樹脂は、DEAE Sephadex、QAE Sephadex、DEAE Sepharose
、Q Sepharose、DEAE Sephacel、DEAE Cellulose、Ecteola Cellulose、PEI Cel
lulose、QAE Cellulose、Amberlite、Dowex 1-X2、Dowex 1-X4、Dowex 1-X8、Do
wex 2-X8、Dowex Macroporous Resins、Dowex WGR-2、DEAE Trisacryl Plus-M、
DEAETrisacrylPlus-LS、Amberlite LA-2、AG 1-X2、AG 1-X4、AG 1-X8、AG 2-X8
、AG MP-1 Resin、AG 4-X4、AG 3-X4、Bio-Rex 5、及びALIQUAT-336(Henkel Cor
p.社製のトリカプリルメチルアンモニウムクロリド)を制限することなく含む。
好ましい樹脂は、DOWEX 1x2(Dow Chemical社製のポリスチレン架橋樹脂に結合し
たトリ-メチルベンジルアンモニウム)、並びにAMBERLYST及びAMBERLYST塩基性樹
脂である。

【００７１】分離されるシアリルオリゴサッカリドの混合物は、アニオン交換樹脂でのカラ
ムクロマトグラフィーにかけられる。アニオン交換樹脂の量は、異なるシアリル
オリゴサッカリドの分離を実施するように選択される。典型的には、アニオン交
換樹脂に対するシアリルオリゴサッカリドの搭載比は、0から10mMの塩の搭載濃
度で、0.1から5、好ましくは0.2から4、より好ましくは１グラムの物質／樹脂の
リットルである。クロマトグラフィーは、1から20cm/h、好ましくは4.6cm/hの見
掛け流速で実施される。適切な圧力は、所望の流速を得るように選択されて良い
。典型的には、0から22PSIGの圧力が選択される。適切な流速はまた、カラムの
溶出の最後に負圧を適用し、溶出物を回収することによって得られて良い。正圧
と負圧の両者の組み合わせもまた使用されて良い。

【００７２】シアリルオリゴサッカリドの構成成分の分解を引き起こさない程度に高い温度
の範囲で、アニオン交換樹脂と酪農水流を接触するためのいずれかの温度が使用
されて良い。一般的には、17から25℃の環境室温が使用される。

【００７３】バッファー溶出液がリチウム塩である場合、個々のシアリルオリゴサッカリド
は溶出液を濃縮して固体を形成し、有機溶媒でリチウム塩を洗い流すことによっ
て単離できる。リチウム塩溶出液からのシアリルオリゴサッカリドのリチウム塩
の単離は、前述の通りである。

【００７４】シアリルオリゴサッカリドのナトリウム塩は、当業者に知られている従来のイ
オン交換法によって得ることができる。

【００７５】バッファー溶出液がリチウム塩ではない場合、個々のシアリルオリゴサッカリ
ドは、逆浸透法によって単離できる。

【００７６】本発明はまた、以下の工程： i)ラクトースとシアリルオリゴサッカリドを含む酪農水流のラクトース構成成分
を加水分解する工程； ii)シアリルオリゴサッカリド構成成分を単離する工程；並びに iii)組成物に前記シアリルオリゴサッカリド構成成分を添加する工程；を含む、シアリルオリゴサッカリド含有組成物の調製方法に関する。

【００７７】本発明の文脈の範囲内で、シアリルオリゴサッカリド含有組成物は、シアリル
オリゴサッカリドを含むいずれかの天然に存在しない組成物である。本発明の方
法の文脈の範囲内で、シアリルオリゴサッカリド構成成分は組成物に添加されて
も良く、またはさらなる構成成分がシアリルオリゴサッカリド構成成分に添加さ
れて最終組成物を形成しても良い。

【００７８】調製可能であるシアリルオリゴサッカリド含有組成物の非制限的な例は、幼児
用処方、化粧品組成物、製薬組成物、及び食料を含む。シアリルオリゴサッカリ
ドは母乳に見出され、幼児用処方内へのシアリルオリゴサッカリドの取り込みは
、母乳により類似する組成物を幼児用処方に提供するであろう。皮膚に対するシ
アリルオリゴサッカリドの局所的投与から生ずる利益が存在し、従ってシアリル
オリゴサッカリドを含む化粧品組成物が所望される。シアリルオリゴサッカリド
は、関節炎の治療方法、並びにHelicobacter pyloriによって引き起こされる胃
潰瘍の治療と予防において有用であることが報告されており、従ってシアリルオ
リゴサッカリドを含む製薬組成物の調製は有用である。シアリルオリゴサッカリ
ドの消費は、神経細胞の発達に対して有益であり、それ故シアリルオリゴサッカ
リドを含む食料は有用であろう。

【００７９】本発明はまた、以下のもの： i)シアリルオリゴサッカリド； ii)グルコース；並びに iii)ガラクトースを含む組成物であって、グルコースとガラクトースが0.9から1.1:1、好ましくは
0.95から1.05:1の比で存在する組成物に関する。

【００８０】ラクトースの加水分解の結果、シアリルオリゴサッカリドとグルコースとガラ
クトースを含む酪農水流構成成分が作製され、ここでグルコースとガラクトース
は、ほぼ1:1、典型的に0.95から1.05:1の比で存在する。そのような組成物は、
β-ガラクトシダーゼ酵素及び／またはラクトースをさらに含んでも良い。

【００８１】本発明はまた、酪農水流のラクトース構成成分の加水分解による、グルコース
とガラクトースの生産方法に関する。酪農水流のラクトース構成成分の加水分解
、引き続きシアリルオリゴサッカリド構成成分の単離のための前述の条件を使用
して、酪農水流からのグルコースとガラクトースの生産方法が記載される。加水
分解化酪農水流からのグルコースとガラクトースの単離は、前述のようなナノ濾
過法といった濾過によっても良い。グルコースとガラクトースの生産方法は、シ
アリルオリゴサッカリドの単離をさらに含んでも良く、グルコースとガラクトー
スとを含む産物水流と、シアリルオリゴサッカリドを含む産物水流を生成しても
良い。グルコースとガラクトースの生産方法は、当業者に知られている従来法に
よってガラクトースからのグルコースの分離をさらに含んでも良く、グルコース
を含む産物水流とガラクトースを含む産物水流を生成しても良い。本発明の文脈
の範囲内で、グルコースを含む産物水流、ガラクトースを含む産物水流、グルコ
ースとガラクトースを含む産物水流、及びシアリルオリゴサッカリドを含む産物
水流は、少なくとも60重量％、好ましくは少なくとも75重量％、より好ましくは
少なくとも90重量％、さらにより好ましくは少なくとも95重量％の指摘された構
成成分を含み、ここで重量％は産物水流の固体含量に基づく。

【００８２】本発明の他の特徴点は、以下の例示的な実施態様の記載の過程で明らかとなり
、この例示的な実施態様は、本発明の説明のために与えられ、本発明を制限する
ことを企図するものではない。

【００８３】

【実施例】

実施例１ 4,500ユニットのβ-ガラクトシダーゼを、３７℃で5.5のpHでの水性媒体中に
約0.45gのラクトースと0.1gの3'シアリルラクトースとを含む、超濾過ホエー透
過物に添加した。60分後、ホエー透過物の組成を、BioRad HPX-87HカラムでのHP
LCによる分析によって測定し、１重量％未満の最初のラクトース含量と、>99重
量％の最初の3'シアリルラクトース含量を含んだ。

【００８４】実施例２実施例１の加水分解化ホエー透過物からのグルコースとガラクトースの分離を
、200-300psigの圧力でのナノ濾過によって実施した。固体の除去の有効性は、
以下に記載される：

【表１】

【００８５】実施例３比較の目的のため、約0.45gのラクトースと0.1gの3'シアリルラクトースとを
含むホエー透過物を、200-300psigの圧力でDesal GK膜を使用してナノ濾過にか
けた。ホエー透過物は、β-ガラクトシダーゼ酵素での処理によっては加水分解
されていなかった。固体の除去の有効性は、以下に記載される：

【表２】

【００８６】本発明の明らかな数多くの変更及び変形例が、前述の教示に照らして可能であ
る。それ故、添付した特許請求の範囲の範囲内で、本発明はここに特別に記載さ
れたもの以外で実施できることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｐ 19/26 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ジョナサン・ケー・ウェイルアメリカ合衆国・ペンシルベニア・ 19446・ランズデイル・ダースタイン・アヴェニュ・535・セカンド・フロア (72)発明者マイケル・スペイドアメリカ合衆国・ペンシルベニア・ 19030・フェアレス・ヒルズ・カッシンガム・ロード・522 Ｆターム(参考） 4B001 AC02 BC14 BC99 4B064 AF02 AF21 CA21 CB07 CC03 CD23 CE06 CE11 DA10 DA11 4C076 EE30 4C083 AD211 FF01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 i)ラクトースとシアリルオリゴサッカリドを含む酪農水流の
ラクトース構成成分を加水分解する工程； ii)シアリルオリゴサッカリド構成成分を単離する工程；を含む、酪農水流のプロセッシング方法。
【請求項２】加水分解が、β-ガラクトシダーゼ酵素で実施される、請求
項１記載の方法。
【請求項３】ラクトース加水分解速度：シアリルオリゴサッカリド加水分
解速度の比が、10:1である、請求項１記載の方法。
【請求項４】前記シアリルオリゴサッカリド構成成分が、膜濾過によって
単離される、請求項１記載の方法。
【請求項５】前記膜濾過が、ナノ濾過である、請求項４記載の方法。
【請求項６】ナノ濾過が、Desal Gk膜を使用して実施される、請求項４記
載の方法。
【請求項７】前記シアリルオリゴサッカリド構成成分が、≦５重量％のラ
クトース含量を有する、請求項１記載の方法。
【請求項８】前記シアリルオリゴサッカリド構成成分が、≦５重量％のグ
ルコースとガラクトース含量を有する、請求項１記載の方法。
【請求項９】前記シアリルオリゴサッカリド構成成分が、3'シアリルラク
トース、6'シアリルラクトース、6'シアリルラクトサミン、3'シアリルラクトサ
ミン、ジシアロラクトース、及びこれらの混合物からなる群から選択されるシア
リルオリゴサッカリドを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】ラクトースの加水分解が、グルコースとガラクトースを生
産し、前記グルコースと前記ガラクトースの単離をさらに含む、請求項１記載の
方法。
【請求項１１】ガラクトースからのグルコースの分離をさらに含む、請求
項１０記載の方法。
【請求項１２】 i)ラクトースとシアリルオリゴサッカリドを含む酪農水流
のラクトース構成成分を加水分解する工程； ii)シアリルオリゴサッカリド構成成分を単離する工程；並びに iii)組成物に前記シアリルオリゴサッカリド構成成分を添加する工程；を含む、シアリルオリゴサッカリド含有組成物の調製方法。
【請求項１３】前記シアリルオリゴサッカリド含有組成物が、幼児用処方
、化粧品組成物、製薬組成物、及び食料からなる群から選択される、請求項１２
記載の方法。
【請求項１４】 i)シアリルオリゴサッカリド； ii)グルコース；並びに iii)ガラクトースを含む組成物であって、グルコースとガラクトースが0.95から1.05:1の比で存在
する組成物。
【請求項１５】 i)ラクトースとシアリルオリゴサッカリドとを含む酪農水
流のラクトース構成成分を加水分解し、グルコースとガラクトースを形成する工
程；並びに ii)グルコースとガラクトースを単離する工程；を含む、グルコースとガラクトースの製造方法。
【請求項１６】ガラクトースからのグルコースの分離をさらに含む、請求
項１５記載の方法。