DE60110374T2

DE60110374T2 - Filtrationsverfahren fuer einen milchstrom

Info

Publication number: DE60110374T2
Application number: DE60110374T
Authority: DE
Inventors: A. Stephen ROTH; Jonathan K. Weil; Michael Spade
Original assignee: Neose Technologies Inc
Current assignee: Neose Technologies Inc
Priority date: 2000-02-16
Filing date: 2001-02-06
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2021-02-07
Also published as: DE60110374D1; AR027387A1; EP1255445A4; ATE293890T1; CA2400346A1; WO2001060171A1; EP1255445B1; MXPA02007996A; BR0108353A; AU3280001A; TWI280101B; NO20023844D0; KR20020075402A; NO20023844L; US6288222B1; KR100781447B1; AU778614B2; JP2003522539A; NO324474B1; EP1255445A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Filtrieren eines Molkereistroms.
Diskussion des Standes der Technik
Molke ist bei der Käseherstellung eines der Hauptnebenprodukte, das aus umwelttechnischen Gründen ein großes Abfallentsorgungsproblem darstellt. Molke setzt sich üblicherweise aus etwa 5 Gew.-% Lactose, 1 Gew.-% Protein und etwa 0,5 Gew.-% Salzen zusammen, wobei der Rest der Mischung Wasser ist. Während die Proteinkomponente häufig durch Ultrafiltration zurückgewonnen und dementsprechend in Lebensmittelprodukten verwendet werden kann, war die Lactosekomponente bislang nur von geringem Wert.
Ein Verfahren zur Erhöhung des wirtschaftlichen Wertes der Molkeabfallströme ist die Isolierung von Sialyloligosacchariden aus dem Abfallstrom. Eine Anionenaustauschchromatographie bewirkt die Entfernung geladener Sialyloligosaccharid-Komponenten aus Lactose. Sind Salze vorhanden, insbesondere Citratsalze aus Säurezugabe, kann dies die Wirksamkeit der Abtrennung von Sialyloligosacchariden deutlich verringern. Daher ist es üblich, Salze aus einem Molkeabfallstrom zu entfernen, um eine effektive Rückgewinnung von Sialyloligosacchariden zu erreichen.
Es wurden bereits Verfahren zur Entfernung von Sialyloligosaccharid-Fraktionen beschrieben, die Extraktions- und Ionenaustauschverfahren waren jedoch hinsichtlich Durchsatz und Reinheit nicht vollständig zufriedenstellend.
Shimatani et al., US 5,118,516 , beschreiben die Isolierung von sialinsäurehaltiger Lactose aus Molke, entrahmter Milch oder einer entproteinierten Lösung durch (a) Elektrodialyse oder (b) Ionenaustausch mit einem Kationenaustauschharz und einem stark basischen Anionenaustauschharz oder (c) eine Kombination aus Elektrodialyse und Ionenaustausch mit dem Kationenaustauschharz und dem stark basischen Anionenaustauschharz zum Entsalzen des Permeats.
Shimatani et al., US 5,270,462 , beschreiben ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die eine hohe Konzentration an Sialinsäuren enthält, indem der pH der Käsemolke auf einen sauren Wert eingestellt wird, die Molke mit einem Kationenaustauscher in Kontakt gebracht wird, und anschließend das Eluens eingeengt und entsalzt wird.
JP Kokai 01-168,693 beschreibt die Herstellung einer Sialinsäurezusammensetzung, indem Milch, nicht fette Milch, Buttermilch oder Molke einer Ultrafiltration unterzogen werden, bei der bei 20.000 bis 500.000 Dalton bei einem pH von 4,0 bis 6,0 fraktioniert wird, gefolgt von einer zweiten Ultrafiltration, bei der bei 1.000 bis 10.000 Dalton bei einem pH von 6,0 bis 8,0 bei 0,2 bis 2,0 MPa fraktioniert wird, um Verunreinigungen, wie zum Beispiel Lactose, zu entfernen. Der Rückstand wird sprühgetrocknet oder lyophilisiert.
JP Kokai 03-143,351 beschreibt die Gewinnung von an Oligosaccharid bindender Sialinsäure aus einer alkalischen Reinigungsabfallflüssigkeit von einem Anionenaustauschharz, die beim Entsalzen von Molke gebildet wird, durch Neutralisieren, Ultrafiltrierung, Umkehrosmose, Entsalzen, Absorption der Sialinsäure an einem stark basischen Anionenaustauschharz gefolgt von Elution, Entsalzen und Trocknen.
JP Kokai 59-184,197 beschreibt die Herstellung von Oligosacchariden, die an Sialinsäuren gebunden sind, wobei eine sialyloligosaccharidhaltige Melasse entsalzt wird, die ent salzte Lösung durch eine Anionenaustauschsäule geleitet wird, das Eluat neutralisiert wird, und das Eluat durch Elektrophorese entsalzt wird.
Gregory et al., US-Patent 5,707,678, beschreiben ein Verfahren zur Mikrofiltration von Milch oder Kolostralmolke, bei dem Ultrafiltration bei einem pH von 4,5 bis 5,0 nach Abtrennung von Fett und Kasein ein Molkeprodukt liefert, das mikrofiltriert werden kann, ohne dass eine Mikrofiltermembran oder ein Tiefenfilter verstopft. Die Isolierung von Sialyloligosacchariden wird nicht beschrieben.
Marquardt et al., US 4,497,836 , beschreiben ein Verfahren zur Herstellung eines Produkts, das zur Verwendung in Säuglingsnahrung geeignet ist, bei dem eine mineralstoffreiche essbare Käsemolke einer Ultrafiltration unterzogen wird, um ein proteinreiches Retentat und ein lactosereiches Permeat zu erzeugen. Das lactosereiche Permeat wird dann teilweise demineralisiert, wie beispielsweise durch Elektrolyse, und mit dem proteinreichen Retentat vermischt. Auf diese Weise ist eine Demineralisierung möglich. Bei diesem Verfahren ist das Retentat zudem eine proteinreiche Zusammensetzung und das Permeat ist reich an Lactose und Mineralstoffen. Die Bildung eines Retentats, das reich an Sialyloligosacchariden ist, ist nicht offenbart.
Venkatsubramanian et al., US 4,376,023 , beschreiben ein Verfahren, bei dem ein Produktstrom, der Dextrose und Oligosaccharide umfasst, in einer Elektroosmosezelle aufgetrennt wird. Hierbei werden alternierende Ionenaustauschmembranen mit hoher und geringer Permeabilität verwendet, wodurch Dextrose selektiv entfernt wird, wodurch separate Abflussströme entstehen, die mit Dextrose bzw. Oligosaccharid angereichert sind.
Hall, US 4,081,326 , beschreibt ein Verfahren zum Erhalt einer Oliogosaccharidzusammensetzung, die im Wesentlichen frei von G₄ und niedrigeren Sacchariden ist, bei dem eine Oligo saccharidzusammensetzung, die G₄ und niedrigere Saccharide enthält, sowohl mit Bäckerhefe als auch mit Maltase behandelt wird.
Herrmann, US 4,844,923 , beschreibt ein Verfahren zum Entfernen von Serumproteinen aus Milchprodukten durch Säurefällung. Bei diesem Verfahren wurde gefunden, dass eine wenigstens teilweise Demineralisierung vor der Säurefällung die Effizienz des Verfahrens stark verbessert. Die Entfernung von Sialyloligosacchariden durch Umkehrosmose ist nicht offenbart.
Eustache, US 4,042,576 , beschreibt ein Verfahren zum Extrahieren von Glycoproteinen und Sialinsäure aus Molke, bei dem Proteine durch Wärmebehandlung ausgeflockt werden und der Überstand anschließend ultrafiltriert wird. Das Ultrafiltrationsretentat wird einer Hydrolyse ausgesetzt und die Sialinsäure anschließend aus dem Hydrolyseüberstand extrahiert. Eine Einstellung des pH bei der Ultrafiltration zur Steuerung der Retentatzusammensetzung ist nicht offenbart.
Brian et al., US 5,714,075 , beschreiben die Verarbeitung eines Abfallstroms aus der Käseverarbeitung, bei der Sialyloligosaccharide durch Ionenaustauschchromatographie unter Erhalt des Lithiumsalzes eines Sialyloligosaccharids und durch Extraktion mit einem Lösungsmittel erhalten werden.
Ein spezielles Problem, das hinsichtlich der Reinheit bei der Isolierung von Sialyloligosacchariden durch Filtrationsverfahren auftritt, ist die Abtrennung von Lactose. Aufgrund der ähnlichen Molekülgröße ist es häufig schwierig, Sialyloligosaccharide in Abwesenheit von Lactose durch Filtration aus einem Abfallstrom zu isolieren. Dementsprechend wären Filtrationsverfahren, durch die sehr reine Sialyloligosaccharide aus einem Molkereistrom erhalten werden können, begrüßenswert.
Die vorliegende Erfindung zielt auf dieses Problem ab, indem sie ein Verfahren zur Verarbeitung eines Molkereistroms bereit stellt, der Sialyloligosaccharide und Lactose umfasst, bei dem der Molkereistrom so behandelt wird, dass vor Abtrennung von Sialyloligosacchariden eine Hydrolyse von Lactose erfolgt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neuartiges Verfahren zur Verarbeitung von Sialyloligosacchariden aus einem Molkereistrom bereitzustellen.
Eine zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neuartiges Verfahren zur Verarbeitung von Sialyloligosacchariden aus einem Molkereistrom bereitzustellen, welcher vor Abtrennung der Sialyloligosaccharide einer Hydrolyse von Lactose unterzogen wurde.
Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden gelöst durch ein Verfahren zur Verarbeitung von Sialyloligosacchariden aus einem Molkereistrom, der Sialyloligosaccharid und Lactose enthält, welches umfasst:

i) Hydrolysieren einer Lactose eines Molkereistroms, der Lactose und Sialyloligosaccharid umfasst;
ii) Abtrennen von Sialyloligosacchariden.

Es wurde gefunden, dass die Reinheit von Siayloligosacchariden verbessert werden kann, wenn die Abtrennung mit einem Molkereistrom durchgeführt wird, bei dem Lactose zu Glucose und Galactose hydrolysiert wurde.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Entdeckung, dass Sialyloligosaccharide leichter abgetrennt werden können, wenn die Trennung an einem Abfallstrom durchgeführt wird, in dem die Lactose zu Glucose und Galactose hydrolysiert wurde.
Eine Filtration eines hydrolysierten Molkereistroms kann unter der Voraussetzung durchgeführt werden, dass der Abfallstrom Sialyloligosaccharide und Lactose umfasst. Die meisten Molkereiströme umfassen jedoch außer Oligosacchariden noch andere Komponenten, wie zum Beispiel Proteine, Salze und Fette, und deren Entfernung kann dementsprechend durch übliche Verfahren erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind.
Ein Molkereistrom kann zum Beispiel durch Filtration mittels herkömmlicher, dem Fachmann bekannter Verfahren zu einer Oligosaccharidfraktion aufgereinigt werden.
Die Nanofiltrationsmembran ist eine Umkehrosmosemembran, die eine Molekulargewichts-Ausschlussgröße von etwa 35.000 aufweist, wie zum Beispiel G20 von Desal.
Die Nanofiltration wird bei einem Überdruck von 10 bis 1.000 lbs/psi durchgeführt, bevorzugt von 50 bis 800 lbs/psi, besonders bevorzugt von 100 bis 400 lbs/psi.
Die Nanofiltrationstemperatur unterliegt keiner besonderen Einschränkung und kann bei 10°C bis etwa 40°C liegen. Bei niedrigem pH und hoher Temperatur beginnt das Sialyloligosaccharid sich zu zersetzen.
Die Größe (Oberfläche) der Nanofiltrationsmembran kann nach Ermessen des Fachmanns gewählt werden, je nach Volumen des behandelten Molkereistroms, der Konzentration des Materials, das sich in der zu nanofiltrierenden Lösung befindet, und dem erwünschten Durchsatz.
Nach Erhalt einer oligosaccharidhaltigen Fraktion können die Sialyloligosaccharide durch Hydrolyse von Lactose und Abtrennung weiter gereinigt werden.
Hinsichtlich des Verfahrens, das zum Hydrolysieren von Lactose in dem Abfallstrom, der verarbeitet werden soll, verwendet wird, bestehen keine besonderen Einschränkungen. Die Behandlung mit einem hydrolytischen Enzym, das für die Spaltung der Glucose-Galactose-Bindung von Lactose selektiv ist, ist bevorzugt. Die Verwendung einer Hydrolysebehandlung genügt, um Lactose ohne wesentliche Hydrolyse der Sialyloligosacchrid-Komponente zu den Monosacchariden Glucose und Galactose zu hydrolysieren.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst ein Sialyloligosaccharid 3'-Sialyllactose, 6'-Sialyllactose, 6'-Sialyllactosamin, 3'-Sialylactosamin und Disialolactose, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
Die Hydrolyse wird bevorzugt unter Bedingungen durchgeführt, bei denen das Verhältnis der Hydrolysegeschwindigkeit von Lactose zur Hydrolysegeschwindigkeit von Sialyloligosaccharid > 10:1, besonders bevorzugt > 15:1, ganz besonders bevorzugt > 20:1, besonders bevorzugt > 500:1, und ganz besonders bevorzugt > 50.000:1 ist.
Bei einer Ausführungsform wird die Hydrolyse durch ein Enzym katalysiert, insbesondere durch ein β-Galactosidase-Enzym. Ein geeignetes β-Galactosidase-Enzym kann ohne unzumutbare Versuche durch übliche Verfahren erhalten werden, die dem Fachmann bekannt sind. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird eine β-Galactosidase durch Fermentation von Aspergillus hergestellt. Ein geeignetes Enzym kann von der Enzym Development Corp, New York, erhalten werden. Ein geeignetes Enzym ist ferner auch als Lactaid^® von der McNeil Consumer Products Division der Firma Johnson und Johnson erhältlich.
Üblicherweise wird die enzymatische Hydrolyse in einem wässrigen Medium, wie zum Beispiel Wasser, durchgeführt, das außerdem weitere dem Fachmann bekannte Komponenten umfassen kann.
Der pH des Molkereistroms kann durch herkömmliche, dem Fachmann bekannte Verfahren eingestellt werden, um die Differenzierung hinsichtlich der Hydrolysegeschwindigkeit von Lactose zu Sialyloligosacchariden zu maximieren. Beispielsweise kann ein pH im Bereich von 3-8, bevorzugt von 4-7, besonders bevorzugt von etwa 5,5, gewählt werden. Der gewünschte pH-Bereich kann erhalten werden, indem eine Brönsted-Säure wie HCl, H₂SO₄, HOAc, Oxalsäure, Zitronensäure oder Milchsäure zugegeben wird.
Falls nötig kann der pH auch durch Zugabe einer geeigneten Base wie NaOH, NaHCO₃ oder Ammoniak eingestellt werden.
Das Reaktionsmedium kann gepuffert sein, um den pH auf die optimale Aktivität für die Spaltung der Glucose-Galactose-Bindung einzustellen. Geeignete Puffer können vom Durchschnittsfachmann ausgewählt werden. Unter dem Gesichtspunkt einer Minimierung der Ionenstärke des Reaktionsmediums wird jedoch ein Puffer mit hoher Kapazität gewählt.
Molke ist ein geeignetes Hydrolysemedium, da sie typischerweise als Folge der Einwirkung Milchsäure produzierender Bakterien auf Lactose sauer ist.
Die Enzymmenge, die zur Hydrolyse des Molkereistroms verwendet wird, unterliegt keinen besonderen Einschränkungen und kann für ein gegebenes Enzym mit einer gegebenen Aktivität so gewählt werden, dass man eine kostengünstige und zeitlich effiziente Hydrolyse erhält. 4.500 Aktivitätseinheiten einer β-Galactosidase sind effektiv, um > 99 % einer Lösung, die 0,45 g Lactose enthält, in etwa 1h, zu hydrolysieren, wobei eine Aktivitätseinheit 1 μmol (342 μg) Lactose in einer Minute hydrolysiert. Angemessene Hydrolysegeschwindigkeiten werden mit so wenig wie 40 Aktivitätseinheiten beobachtet, die auf 0,45 g Lactose einwirken.
Die Reaktionstemperatur unterliegt keinen besonderen Einschränkungen und kann so gewählt werden, dass man eine kostengünstige und zeitlich effiziente Hydrolyse erhält, typischerweise liegt sie im Bereich von 10 bis 55°C, bevorzugt von 20-40°C, besonders bevorzugt von 25-38°C, ganz besonders bevorzugt bei etwa 37°C. Obwohl am oberen Ende des Temperaturbereichs keine Abnahme der Selektivität beobachtet wird, kann die Kombination aus hoher Temperatur und niedrigem pH (einem pH von etwa 2) zum Abbau von Sialyloligosacchariden und β-Galactosidase-Enzym führen.
Nach Hydrolyse der Lactosekomponente des Molkereistroms kann die Trennung des hydrolysierten Materials in eine Fraktion, die Sialyloligosaccharid enthält, und eine Fraktion, die Glucose/Galactose enthält, erfolgen.
Die Abtrennung der Sialyloligosaccharid-Komponente aus dem hydrolysierten Molkereistrom kann durch herkömmliche, dem Fachmann bekannte Verfahren, erfolgen, wie zum Beispiel durch Filtration (Nanofiltration und Ultrafiltration, Kristallisation und Chromatographie).
Die Abtrennung kann durch Nanofiltration durch eine Membran erfolgen, wobei die Trennung auf Basis des Molekulargewichts und/oder der Ladung erfolgt. Eine geeignete Membran ist zum Beispiel die Desal GK „Spiral Wound Sheet Membrane" aus Keramik, Polyethersulfon, Polyvinyldifluorid und regenerierter Cellulose. Eine typische Membranselektivität bei der Selektion von Glucose und Galactose gegenüber Sialyloligosaccharid ist im Allgemeinen > 50:1, bevorzugt > 75:1, besonders bevorzugt > 100:1, ganz besonders bevorzugt > 500:1.
Die Bedingungen für die Nanofiltration können vom Fachmann so gewählt werden, dass man ein akzeptables Trennniveau bei einer angemessener Geschwindigkeit erhält. Die Einstellung von Druck (typischerweise 10 bis 1.000 psig, bevorzugt 200-300 psig), Temperatur, typischerweise 10 bis 60°C, bevorzugt 25-38°C, und der Durchflussgeschwindigkeit genügt für eine akzeptable Trennung. Der pH unterliegt keiner besonderen Einschränkung, bei einem pH unter 3 läuft Sialyllactose jedoch typischerweise durch die Membran.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform weist die resultierende Sialyloligosaccharid enthaltende Komponente eine Anreicherung des Verhältnisses von Sialyloligosaccharid zu Lactose von > 50:1 auf, bevorzugt von > 75:1, besonders bevorzugt von > 100:1, ganz besonders bevorzugt von > 500:1, im Vergleich mit der Oligosaccharidkomponente vor der Hydrolyse.
Das Retentat kann nach der Nanofiltration einen restlichen Lactosegehalt von ≤ 5 Gew.-%, bevorzugt von ≤ 3 Gew.-%, besonders bevorzugt von ≤ 1 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt von ≤ 0,5 Gew.-%, aufweisen.
Das Retentat kann nach der Nanofiltration einen restlichen kombinierten Glucose- und Galactosegehalt von ≤ 5 Gew.%, bevorzugt von ≤ 3 Gew.-%, besonders bevorzugt von ≤ 1 Gew.%, ganz besonders bevorzugt von ≤ 0,5 Gew.-% aufweisen.
Der erfindungsgemäß verarbeitete Molkereistrom kann aus jedem beliebigen Abfallstrom erhalten werden, der bei einem Käseherstellungsverfahrens gebildet wird. So wird zum Beispiel Sauermolke durch Abtrennung der Feststoffe gebildet, wenn entrahmte Milch zu Hüttenkäse koaguliert wird. Sauermolke ist durch einen hohen Milchsäuregehalt charakterisiert. Wird Käse aus Vollmilch hergestellt, ist die verbleibende Flüssigkeit Süßmolke, die durch Eindampfen zu trockenem Molkepulver weiter verarbeitet werden kann. Süßmolke kann auch zu demineralisiertem Molkepermeat getrocknet, demineralisiert und eingedampft werden. Süßmolke kann sowohl zur Bildung von Molkepermeat als auch von Molkepermeat-Konzentrat auch einer Ultrafiltration unterzogen werden. Molkepermeat kann durch Auskris tallisieren von Lactose unter Bildung von Lactose und einer Mutterlauge weiter verarbeitet werden. Die Mutterlauge, die durch das Auskristallisieren von Lactose aus einem Molkepermeat resultiert, ist in Fachkreisen als "Delac" bekannt. Geeignete Molkereiströme umfassen Colostrum, Milch, Milchpulver, ganze Molke, demineralisiertes Molkepermeat, den Regenerationsstrom aus demineralisiertem Molkepermeat, Molkepermeat, kristallisierte Lactose, sprühgetrocknete Lactose, Molkepulver, essbare Lactose, Lactose, raffinierte Lactose und USP Lactose. Bevorzugt wird das wässrige Mutterlaugenmaterial, das aus der Kristallisation von Lactose (d.h. Delac) resultiert, verwendet.
Vor Abtrennung einer Sialyloligosaccharid-Fraktion kann der Molkereistrom zur Erhöhung des Sialyloligosaccharidgehalts prozessiert werden. So kann zum Beispiel ein Molkereistrom, der noch eine Proteinfraktion enthält, mit einem Transsialidase-Enzym behandelt werden, das die Konzentration an Sialyloligosacchariden erhöht, indem es Sialinsäuregruppen von einem sialylierten Protein auf Lactose überträgt. Ein geeignetes Transsialidase-Enzym ist aus Trypanosoma erhältlich. Geeignete Reaktionsbedingungen sind eine Temperatur von 25 bis 40°C, bevorzugt von etwa 37°C, bei einer Enzymkonzentration von 500 μ/l, und eine Konzentration an gelöster Substanz von 5-10 Gew.-%, bevorzugt von etwa 7 Gew.-%, und ein pH von 4-11, bevorzugt von etwa 6.
Flüssige Käsemolke wird typischerweise getrocknet, um ein nicht-hygroskopisches, hoch dispergierbares Pulver zu erhalten. Frische flüssige Molke wird geklärt, indem sie durch eine Klärvorrichtung nach Art eines Entschlammers geleitet wird. Die Molke wird zur Entfernung von Fett getrennt und dann in Doppel- oder Dreifachverdampfern auf einen Feststoffgehalt von etwa 62 Gew.-% konzentriert. Die Feststoffe können durch Abtrennung bei Raumtemperatur entfernt werden, oder besonders bevorzugt wird die konzentrierte Molke gekühlt, bevor die Feststoffe entfernt werden.
Besteht der zu verarbeitende Molkereistrom aus den Feststoffen, die durch das Trocknen der Molke erhalten wurden, werden die Feststoffe zuerst in Wasser gelöst, bevorzugt in einer Menge von etwa 1 bis 620 g, bevorzugt von 50 bis 200 g, besonders bevorzugt von etwa 100 g Feststoffe pro Liter Wasser. Das Auflösen der Feststoffe, die durch Trocknen der Käsemolke erhalten wurden, kann bei Raumtemperatur oder erhöhten Temperaturen durchgeführt werden, um den Lösungsprozess zu beschleunigen und die Menge an gelösten Feststoffen zu erhöhen. Bevorzugt sind Temperaturen von 20-80°C geeignet.
Zur Entfernung von positiv geladenen Materialien kann jede beliebige, dem Fachmann bekannte Methode verwendet werden. So ist zum Beispiel eine geeignete Methode, die zur Absorption von Molkeprotein führt, das In-Kontakt-bringen mit einem Kationenaustauschharz, wie von J. N. DeWitt et al. (Neth. Milk Dairy J., 40:41-56 (1986)) und J. S. Ayers et al. (New Zealand J. Dairy Sci. & Tech., 21:21-35 (1986)), sowie diejenigen Verfahren, die in JP Kokai 52-151200 und 63-39545 und JP 2-104246 und 2-138295 beschrieben sind.
Geeignete Kationenaustauschharze können durch herkömmliche, dem Fachmann bekannte Methoden hergestellt werden. So kann zum Beispiel ein geeignetes Kationenaustauschharz aus einer Mischung aus polymerisierbaren monofunktionellen und polyfunktionellen Monomeren durch radikalische Emulsionspolymerisation und anschließende Funktionaklisierung mit sauren Gruppen, wie zum Beispiel Carbonsäuregruppen oder Sulfonsäuregruppen, die in protonierter Form vorliegen, hergestellt werden.
Der Vernetzungsgrad in dem Kationenaustauschharz kann je nach den Einsatzbedingungen der Kationenaustauschsäule gewählt werden. Ein stark vernetztes Harz bietet den Vorteil, dass es haltbar ist, und ein hohes Maß an mechanischer Integrität aufweist, es hat jedoch den Nachteil einer geringeren Porosität und eines Abfalls im Massedurchsatz. Ein gering vernetztes Harz ist fragiler und neigt dazu, durch Absorption von mobiler Phase zu quellen. Die Vernetzung eines geeigneten Harzes kann 2 bis 12 % betragen, bevorzugt 8 %.
Die Teilchengröße des Kationenaustauschharzes wird so gewählt, dass ein effizienter Fluss des Molkereistroms gewährleistet ist, wobei die positiv geladenen Materialien immer noch effektiv entfernt werden. Eine geeignete Teilchengröße für eine 30 × 18 cm-Säule beträgt 100-200 mesh.
Geeignete Kationenaustauschharze umfassen CM-Sephadex, SP-Sephadex, CM-Sepharose, S-Sepharose, CM-Cellulose, Cellulosephosphat, Sulfoxyethylcellulose, Amberlite, Dowex-50W, Dowex HCR-S, Dowex Macroporous Resin, Duolit C433, SP Trisacryl Plus-M, SP Trisacryl Plus-LS, Oxycellulose, AG 50W-X2, AG 50W-X4, AG 50W-X8, AG 50W-X12, AG 50W-X16, AG MP-50-Harz, Bio-Rex 70, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein. Besonders bevorzugte geeignete Harze sind DOWEX^TM 50x8 (eine aromatische Sulfonsäure, die an ein vernetztes Polystyrolharz gebunden ist, von Dow Chemical) und die sauren Harze AMBERLYST^TM-15, AMBERLITE^TM IR-120 und AMBERLITE^TM-200.
Der Molkereistrom kann auf jede beliebige geeignete Art und Weise, die eine Absorption der Molkeproteine und anderer positiv geladener Materialien an das Kationenaustauschharz ermöglicht, mit dem Kationenaustauschharz in Kontakt gebracht werden. Das Kationenaustauschharz wird bevorzugt in eine Säule gefüllt und der Molkereistrom wird zur Entfernung der Molkeproteine durch die Säule geleitet. Die Menge an Kationenaustauschharz wird so gewählt, dass die positiv geladenen Materialien entfernt werden, und sie variiert stark je nach dem zu behandelnden Molkereistrom. Ist der Abfallstrom Molkepermeat, kann das Beladungsverhältnis von Molkereistrom zu Kationenaustauschharz üblicherweise im Bereich von 5 bis 20, bevorzugt von 8-15, besonders bevorzugt von 9 bis 12:1 v/v, liegen.
Erfolgt das In-Kontakt-bringen in einer Säule, wird der Molkereistrom bevorzugt mit einer Geschwindigkeit von 1 bis 70 cm/min, bevorzugt von 2 bis 15 cm/min, besonders bevorzugt mit einer Geschwindigkeit von 4,6 cm/min durchgeleitet. Um die gewünschte Durchflussgeschwindigkeit zu erhalten, kann ein geeigneter Druck gewählt werden. Typischerweise wird ein Druck von 0 bis 100 PSIG gewählt. Geeignete Durchflussgeschwindigkeiten können auch erhalten werden, indem an das eluierende Ende der Säule ein Unterdruck angelegt wird und das Eluens aufgefangen wird. Auch eine Kombination aus Über- und Unterdruck kann angewandt werden.
Die Temperatur, bei welcher der Molkereistrom mit dem Kationenaustauschharz in Kontakt gebracht wird, unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, so lange die Temperatur nicht zu hoch ist, um zu einer Zersetzung der Komponenten des Abfallstroms zu führen. Im Allgemeinen wird eine Umgebungsraumtemperatur von 17 bis 25°C verwendet.
Alternativ können die positiv geladenen Materialien mit Methoden wie Elektrophorese, Ultrafiltration, Umkehrosmose oder Salzfällung entfernt werden.
Sialyloligosaccharide, wie zum Beispiel 3'-Sialyllactose, 6'-Sialyllactose und 6'-Sialyllactosamin, sind als bakterielle Antiklebmittel, als Mittel gegen Infektionen und als Zusatz für Säuglingsnahrung verwendbar. Über den Nutzen von Zusammensetzungen, die Sialinsäure enthalten, wird in der US 5,270,462 berichtet. Es wird ferner beschrieben, dass Sialyllactose bei einem Verfahren zur Behandlung von Arthritis verwendet werden kann ( US 5,164,374 ). 3'-Sialyllactose kann verwendet werden, um Magengeschwüre zu verhindern oder zu behandeln, die durch Helicobacter pylori hervorgerufen wurden.
Die Umkehrosmose wird bevorzugt bei einem Druck von 300-1.600 psi durchgeführt, besonders bevorzugt bei einem Druck von 400-600 psi, ganz besonders bevorzugt bei einem Druck von 450 psi.
Nachdem die Salze durch Umkehrosmose entfernt wurden, kann das resultierende Material konzentriert werden, um ein festes Material zu liefern, das Sialyloligosaccharide, wie zum Beispiel 3'-Sialyllactose und 6'-Sialyllactose enthält und aus einer Mischung aus Wasser und organischen Lösungsmitteln umkristallisiert werden kann.
Die Lösungsmittel für die Fällung werden bevorzugt aus der Gruppe Ethanol, Aceton, Methanol, Isopropanol, Diethylether, tert.-Butylmethylether, Ethylacetat, Hexan, Tetrahydrofuran und Wasser ausgewählt.
Ferner kann das Eluens aus der Anionenaustauschssäule, das eine Mischung aus Sialyloligosacchariden enthält, die 3'-Sialyllactose, 6'-Sialyllactose und 6'-Sialyllactosamin umfasst, einer Trennung der darin enthaltenen Sialyloligosaccharide unterzogen werden. Diese Trennung erfolgt durch Säulenchromatographie an einem DOWEX 1 × 2-Anionenaustauschharz bei pH 4 bis 6, wobei ein Puffer mit einem geeigneten Salz, wie zum Beispiel Natriumacetat, Ammoniumacetat oder einem Lithiumsalz, wie zum Beispiel Lithiumacetat, Lithiumperchlorat, Lithiumchlorid und Lithiumbromid als Eluens verwendet wird. Eine Lithiumacetatlösung ist bevorzugt.
Geeignete Anionenaustauschharze können mit herkömmlichen, dem Fachmann bekannten Methoden, wie sie oben beschrieben wurden, hergestellt werden.
Der Vernetzungsgrad im Anionenaustauschharz kann je nach Einsatzbedingungen der Anionenaustauschsäule gewählt werden. Die Vernetzung eines geeigneten Harzes kann 2 bis 12 % betragen, bevorzugt 8 %.
Die Teilchengröße des Anionenaustauschharzes wird so gewählt, dass ein effizienter Fluss des Molkereistroms gewährleistet ist, wobei die negativ geladenen Materialien immer noch effektiv chromatographisch abgetrennt werden. Eine geeignete Teilchengröße für eine 20 × 100 cm-Säule beträgt 200-400 mesh.
Geeignete Anionenaustauschharze umfassen DEAE Sephadex, QAE Sephadex, DEAE Sepharose, Q Sepharose, DEAE Sephacel, DEAE Cellulose, Ecteola Cellulose, PEI Cellulose, QAE Cellulose, Amberlite, Dowex 1-X2, Dowex 1-X4, Dowex 1-X8, Dowex 2-X8, Dowex Macroporous Resins, Dowex WGR-2, DEAE Trisacryl Plus-M, DEAE Trisacryl Plus-LS, Amberlite LA-2, AG 1-X2, AG 1-X4, AG 1-X8, AG 2-X8, AG MP-1-Harz, AG 4-X4, AG 3-X4, Bio-Rex 5 und ALIQUAT-336 (Tricaprylylmethylammoniumchlorid von Henkel Corp.), ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Bevorzugte Harze sind DOWEX 1 × 2 (ein Trimethylbenzylammonium, das an ein vernetztes Polystyrolharz gebunden ist, von Dow Chemical) und die basischen AMBERLYST- und AMBERLYTE-Harze.
Die Mischung der zu trennenden Sialyloligosaccharide wird einer Säulenchromatographie an einem Anionenaustauschharz unterzogen. Die Menge an Anionenaustauschharz wird so gewählt, dass die unterschiedlichen Sialyloligosaccharide getrennt werden. Üblicherweise beträgt das Beladungsverhältnis von Sialyloligosaccharid zu Anionenaustauschharz 0,1 bis 5, bevorzugt 0,2 bis 4, besonders bevorzugt 1 Gramm Material pro Liter Harz bei einer Beladungskonzentration von 0 bis 10 mM Salz. Die Chromatographie wird bei einer Geschwindigkeit von 1 bis 20 cm/h durchgeführt, bevorzugt bei einer Oberflächengeschwindigkeit von 4,6 cm/h. Um die gewünschte Durchflussgeschwindigkeit zu erhalten, kann ein geeigneter Druck gewählt werden. Typischerweise wird ein Druck von 0 bis 22 PSIG gewählt. Geeignete Durchflussgeschwindigkeiten können auch erhalten werden, indem an das eluierende Ende der Säule ein Unterdruck angelegt wird und das Eluens aufgefangen wird. Auch eine Kombination aus Über- und Unterdruck kann angewandt werden.
Zum In-Kontakt-bringen des Molkereistroms mit dem Anionenaustauschharz kann jede Temperatur verwendet werden, so lange die Temperatur nicht zu hoch ist, um zu einer Zersetzung der Komponenten der Sialyloligosaccharide zu führen. Im Allgemeinen wird eine Umgebungsraumtemperatur von 17 bis 25°C verwendet.
Ist der Elutionspuffer ein Lithiumsalz, können die einzelnen Sialyloligosaccharide durch Einengen des Elutionsmittels unter Bildung eines Feststoffs und Auswaschen der Lithiumsalze mit einem organischen Lösungsmittel isoliert werden. Die Isolierung des Lithiumsalzes eines Sialyloligosaccharids aus einem Lithiumsalz-Elutionsmittel erfolgt wie oben beschrieben.
Das Natriumsalz des Sialyloligosaccharids kann mit üblichen Ionenaustauschverfahren erhalten werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Ist der Elutionspuffer kein Lithiumsalz, können die einzelnen Sialyloligosaccharide durch Umkehrosmoseverfahren isoliert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Sialyloligosaccharid-haltigen Zusammensetzung, umfassend:

i) Hydrolysieren einer Lactosekomponente eines Molkereistroms, der Lactose und ein Sialyloligosaccharid umfasst;
ii) Isolieren einer Sialyloligosaccharidkomponente; und
iii) Zugeben dieser Sialyloligosaccharid-Komponente zu einer Zusammensetzung.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist eine Sialyloligosaccharid-haltige Zusammensetzung eine beliebige nicht natürlich vorkommende Zusammensetzung, die ein Sialyloligosaccharid enthält. Im Rahmen des vorliegenden Verfahrens kann eine Sialyloligosaccharidkomponente zu einer Zusammensetzung gegeben werden, oder es können zusätzliche Komponenten zu einer Sialyloligosaccharid-Komponente gegeben werden, um die fertige Zusammensetzung zu bilden.
Beispiele für Sialyloligosaccharid-haltige Zusammensetzungen, die hergestellt werden können, umfassen Säuglingsnahrung, Kosmetikzusammensetzungen, pharmazeutische Zusammensetzungen und Nahrungsmittel, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein. Sialyloligosaccharide kommen in Humanmilch vor und die Einarbeitung von Sialyloligosacchariden in eine Säuglingsnahrung würde eine Säuglingsnahrung liefern, deren Zusammensetzung Humanmilch mehr ähneln würde. Die topische Anwendung von Sialyloligosacchariden auf der Haut hat positive Wirkungen und dementsprechend sind Kosmetikzusammensetzungen, die Sialyloligosaccharide umfassen, erwünscht. Es wurde berichtet, dass Sialylologosaccharide bei Verfahren zur Behandlung von Arthritis und bei der Behandlung und Prävention von Magengeschwüren, die durch Helicobacter pylori hervorgerufen werden, nützlich waren, und dementsprechend ist die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die Sialyloligosaccharide umfassen, nützlich. Der Verzehr von Sialyloligosacchriden kann sich günstig auf die Gesundheit der Nervenzellen auswirken, und daher wäre ein Nahrungsmittel, das Sialyloligosacchride umfasst, nützlich.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung, die umfasst:

i) ein Sialyloligosaccharid;
ii) Glucose; und
iii) Galactose,

Als Folge der Hydrolyse von Lactose wird eine Molkereistromkomponente gebildet, die Sialyloligosaccharide, Glucose und Galactose umfasst, wobei Glucose und Galactose nahezu im Verhältnis von 1:1, üblicherweise im Verhältnis von 0,95 bis 1,05:1, vorliegen. Eine solche Zusammensetzung kann ferner ein β-Galactosidase-Enzym und/oder Lactose umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Glucose und Galactose durch Hydrolyse der Lactosekomponente eines Molkereistroms. Mittels der oben beschriebenen Bedingungen für die Hydrolyse einer Lactosekomponente eines Molkereistroms, gefolgt von der Isolierung einer Sialyloligosaccharid-Komponente, wird ein Verfahren zur Herstellung von Glucose und Galactose aus einem Molkereistrom beschrieben. Die Isolierung von Glucose und Galactose aus einem hydrolysierten Molkereistrom kann durch Filtration erfolgen, wie zum Beispiel durch die oben beschriebenen Nanofiltrationsprozesse. Das Verfahren zur Herstellung von Glucose und Galactose kann ferner die Isolierung eines Sialyloligosaccharid-Komponente umfassen, was zu einem Produktstrom führt, der Glucose und Galactose umfasst, und zu einem Produktstrom, der ein Sialyloligosaccharid umfasst. Das Verfahren zur Herstellung von Glucose und Galactose kann ferner das Abtrennen der Glucose von der Galactose mit üblichen, den Fachmann bekannten Verfahren umfassen, was zu einem Produktstrom führt, der Glucose umfasst, und zu einem Produktstrom, der Galactose umfasst. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst ein Produktstrom, der Glucose umfasst, ein Produktstrom, der Galactose umfasst, ein Produktstrom, der Glucose und Galactose umfasst, und ein Produktstrom, der Sialyloligosaccharid umfasst, wenigstens 60 Gew.-%, bevorzugt wenigstens 75 Gew.-%, besonders bevorzugt wenigstens 90 Gew.%, und ganz besonders bevorzugt wenigstens 95 Gew.-% der angegebenen Komponente, wobei Gew.-% auf den Feststoffgehalt des Produktstroms bezogen ist.
Weitere Merkmale der Erfindung werden in der nachfolgenden Beschreibung beispielhafter Ausführungsformen veranschaulicht, die lediglich der Veranschaulichung der Erfindung dienen und diese in keiner Weise einschränken sollen.
BEISPIEL 1
4.500 Einheiten β-Galactosidase wurden zu einem ultrafiltrierten Molkepermeat, das etwa 0,45 g Lactose und 0,1 g 3'-Sialyllactose enthielt, in einem wässrigen Medium bei einem pH von 5,5 bei 37 °C gegeben. Nach 60 Minuten wurde die Zusammensetzung des Molkepermeats durch HPLC-Analyse auf einer BioRad HPX-87H-Säule bestimmt. Sie enthielt bei > 99 Gew.-% des ursprünglichen Gehalts an 3'-Sialyllactose weniger als 1% des ursprüngliche Lactosegehalts.
BEISPIEL 2
Die Abtrennung von Glucose und Galactose aus dem hydrolysierten Molkepermeat von Beispiel 1 erfolgte durch Nanofiltration bei einem Druck von 200-300 psig. Die Effektivität der Entfernung der Feststoffe ist nachfolgend detailliert dargestellt:
BEISPIEL 3
Zum Vergleich wurde ein Molkepermeat, das etwa 0,45 g Lactose und 0,1 g 3'-Sialyllactose enthielt, einer Nanofiltration mit einer Desal GK Membran bei einem Druck von 200-300 psig unterzogen. Das Molkepermeat wurde durch Behandlung mit einem β-Galactosidase-Enzym nicht hydrolysiert. Die Effektivität der Entfernung der Feststoffe ist nachfolgend detailliert dargestellt:

Claims

Verfahren zur Verarbeitung eines Molkereistroms, umfassend: i) Hydrolysieren einer Lactosekomponente eines Molkereistroms, der Lactose und ein Sialyloligosaccharid umfaßt; und ii) Isolieren einer Sialyloligosaccharid-Komponente.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hydrolyse mit einem β-Galactosidase-Enzym durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Geschwindigkeitsverhältnis von Lactosehydrolyse zu Sialyloligosaccharidhydrolyse 10:1 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Sialyloligosaccharid-Komponente durch Membranfiltration isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Membranfiltration eine Nanofiltration ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Nanofiltration mit einer Desal Gk-Membran erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Sialyloligosaccharid-Komponente einen Lactosegehalt von ≤ 5 Gew.-% hat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Sialyloligosaccharid-Komponente einen Glucose- und Galactosegehalt von ≤ 5 Gew.-% hat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Sialyloligosaccharid-Komponente ein Sialyloligo-saccharid umfaßt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3'-Sialyllactose, 6'-Sialyllactose, 6'-Sialyllactosamin, 3'-Sialyllactosamin, Disialo-Lactose und Mischungen davon.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hydrolyse der Lactose Glucose und Galactose liefert und ferner die Isolierung dieser Glucose und dieser Galactose umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 10, welches ferner die Abtrennung der Glucose von der Galactose umfaßt.
Verfahren zur Herstellung einer Sialyloligosaccharidhaltigen Zusammensetzung, umfassend: i) Hydrolysieren einer Lactosekomponente eines Molkereistroms, der Lactose und ein Sialyloligosaccharid umfaßt; ii) Isolieren einer Sialyloligosaccharid-Komponente; und iii) Zugeben dieser Sialyloligosaccharid-Komponente zu einer Zusammensetzung.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Sialyloligosaccharidhaltige Zusammensetzung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Säuglingsnahrung, einer Kosmetikzusammensetzung, einer pharmazeutischen Zusammensetzung und einem Nahrungsmittel.
Zusammensetzung, umfassend: i) ein Sialyloligosaccharid; ii) Glucose; und iii) Galactose, wobei Glucose und Galactose in einem Verhältnis von 0,95 bis 1,05:1 vorliegen.
Verfahren zur Herstellung von Glucose und Galactose, umfassend: i) Hydrolysieren einer Lactosekomponente eines Molkereistroms, der Lactose und ein Sialyloligosaccharid umfaßt, unter Bildung von Glucose und Galactose; und ii) Isolieren von Glucose und Galactose.
Verfahren nach Anspruch 15, welches ferner die Abtrennung der Glucose von der Galactose umfaßt.