CN116075517A - 改进的发酵液的脱矿化与诸如寡糖的精细化学品的纯化 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于对发酵液脱矿化的改进方法，其包括以下的步骤：提供包含一种或多种寡糖的所述溶液；实施第一膜过滤，并且优选是微滤或超滤；对所述第一膜过滤的渗透物进行第二膜过滤；第一纳滤步骤；具有浓缩子步骤和/或渗滤子步骤。本发明还涉及由发酵液纯化精细化学品的改进方法。

Description

改进的发酵液的脱矿化与诸如寡糖的精细化学品的纯化

技术领域

本发明涉及用于从包含生物质和至少一种寡糖的溶液中分离生物质的方法。

背景技术

人乳寡糖(HMO)是仅次于乳糖和脂质的人乳中第三丰富的固体组分。人乳中不同HMO的浓度及其总量在哺乳期和个体之间存在差异，据信这是部分基于遗传背景。然而，重要的是，在其他自然来源(如牛乳、羊乳或山羊乳)中发现HMO的含量并不丰富。已有人证明或建议HMO对婴儿的若干种有益作用，包括选择性增强双歧杆菌生长、对病原体的抗粘附作用以及对肠上皮细胞的糖组改变作用。三糖2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)是在人乳中发现的最丰富的寡糖之一。由于其益生元和抗感染特性，2'-FL被讨论为用于婴儿配方食品的营养添加剂。此外，含2'-FL的婴儿营养物与较低的腹泻率有关，因此，如果2'-FL的量足够且价格合理，它将成为一种潜在的营养补充剂和治疗剂。

以前，2'-FL是经由从人乳中提取或化学合成获得的，但人乳的有限可用性或化学合成中侧基的保护和脱保护的必要性分别限制了供应和成本效率。因此，2'-FL的替代来源引起了人们的兴趣。除了化学合成和从人乳中提取外，2'-FL可以在体外和体内通过酶法生产。大规模形成2'-FL的最有希望的方法是在大肠杆菌(Escherichia coli)中通过GDP-L-岩藻糖的细胞内合成以及随后用适当的α1,2-岩藻糖基转移酶对乳糖进行岩藻糖基化来进行全细胞生物合成。

因此，HMO可以通过发酵来生产，其中所述发酵提供包含生物质和至少一种寡糖(优选2'-FL)的溶液。这种溶液也可以被称为发酵液。

从来自HMO工艺的发酵液中分离生物质是HMO生产中的第一下游加工步骤。这一步骤的现有技术是离心和/或压滤机，有时使用絮凝剂。然而，也可以采用微滤，并且与其他分离技术相比，微滤具有若干优点。为了实现无基因修饰的有机体的产品解决方案，微滤是最好的选择，因为它可以完全保留所有未溶解的固体，包括基因修饰的细胞(如微生物)。

纳滤已被描述为从乳糖中分离HMO三糖和寡糖的纯化方法(参见公开号为WO2019/003133的国际专利申请)。

发明内容

本发明公开了用于加工发酵液的新颖方法，所述发酵液包含一种或多种精细化学品，例如寡糖和生物质，直至纯化的精细化学品溶液或固体精细化学品。这些方法在去除生物质之前采用特定顺序的步骤，去除生物质，然后对包含所需一种或多种精细化学品的溶液进行脱矿化。此外，本发明还提供了通过纳滤将包含一种或多种寡糖的溶液脱矿化的方法以及针对此类溶液的快速纯化方法。

膜过滤通常用于将溶液中的小分子与大分子分离。公开号为CN 100 549 019的中国专利申请披露了含寡糖溶液的一个实例，而专利申请CN 101 003 823公开了通过使用酶和膜技术从秸秆制备高纯度低聚木糖的方法。公开号为WO 2017/205705的国际申请公开了膜过滤针对半纤维素水解溶液的用途。另一个实例公开在EP 2 896 628中，所述专利申请公开了含寡糖发酵液的膜过滤，随后进行进一步的加工步骤，包括向滤液中添加活性炭。

发酵生产HMO后的生物质分离通常在pH值为7的情况下通过初始离心或压滤机和进一步离心进行。有时使用聚合物膜代替。

然而，当使用膜时，膜的性能相当低，并且渗透物含有大量的蛋白质和颜色组分，这些蛋白质和颜色组分必须在以下步骤中去除，从而导致复杂的下游工艺、高产品产量损失和一些质量问题。

通常，在从发酵液中进行生物质分离的这些初始步骤之后，进行的下一步骤是通常用10kDa聚醚砜膜完成的超滤，但并不是所有的蛋白质和多糖都可以由此分离。因此，将超滤渗透物送至活性炭柱以使溶液脱色并达到低于1000的APHA值。活性炭柱中的脱色是一个相当繁琐的过程，并且相对于发酵液的初始量，通常需要使用约14％重量/重量的活性炭。该步骤导致高的产品损失，并且需要巨大的活性炭柱。

在超滤和脱色之后，通常对包含精细化学品(如HMO)的溶液进行离子交换处理，以减少带电副组分。大容量的溶液可能需要大型离子交换设备和大量离子交换树脂。因此，浓缩步骤可用于在离子交换之前减少容积。

公布号为WO 2015106943的国际申请公开了一种方法，其中离子交换步骤可以在初始膜过滤之后跟随纳滤步骤。然而，需要重复脱色，并且离子交换步骤不去除盐。去除阳离子，用NaOH代替，并且将阴离子交换为氯离子。然后通过额外的电渗析步骤来实现盐的去除。

本发明涉及一种方法，所述方法有利地组合发酵后包含精细化学品(例如，HMO)的溶液的脱色与生物质分离过程以及在脱矿化(例如但不限于离子交换)之前的纳滤或无任何随后的脱矿化(例如，一个或多个离子交换步骤)的纳滤的特定顺序的纯化步骤。

本发明方法的第一部分允许生物质分离和脱色，这依赖于资源，并且允许所述方法的第二部分，在没有任何进一步制备或添加离子的情况下有利地纯化所需的精细化学品。

在本发明的方法中，除了浓缩产物之外，还使用纳滤去除盐，优选单价离子和低分子量副组分。通过这样做，离子交换剂可以在更高浓度的产品下运行，并且需要去除更少的副组分，这允许大大减小操作的规模。此外，包括纳滤在内的整个纯化过程的令人惊讶的有效性允许用纳滤代替离子交换步骤。

在本发明的优选的实施方案中，用于从包含生物质和一种或多种精细化学品的溶液中纯化一种或多种精细化学品(优选寡糖和/或芳香族化合物)的方法是包括以下步骤的方法：

i.提供包含生物质和一种或多种精细化学品的溶液；

ii.向所述包含生物质和所述至少一种寡糖的溶液中添加至少一种酸，由此将所述溶液的pH值调至低于7，优选低于pH 5.5或更低；

iii.向所述包含生物质和精细化学品的溶液中添加吸附剂；

iv.任选地实施孵育步骤；

v.实施膜过滤，本文中也被称为第一膜过滤，并且通常是微滤或超滤，以便于从包含所述至少一种精细化学品的溶液中分离所述生物质；

vi.任选地用所述第一膜过滤的渗透物实施至少一个第二或另外的膜过滤，优选至少一个超滤；

vii.任选地实施脱色步骤；

viii.实施纳滤(步骤S22，参见图1)，其中用该步骤S22之前的所述膜过滤的渗透物，用所述第一或所述第二或任何另外的膜过滤的渗透物，实施该纳滤；

ix.任选地实施脱色步骤；

x.任选地实施第二纳滤S24，其中用先前的纳滤步骤i中所述纳滤的渗余物进行该第二纳滤，其中所用的纳滤膜与先前纳滤步骤S22中的膜不同；

xi.任选地用与先前的纳滤步骤中的膜不同的膜实施第三或另外的纳滤；

xii.通过以下步骤中的任一个对先前的纳滤步骤中的渗余物进一步加工：

a.任选地实施脱色步骤；

b.任选地实施脱矿化步骤，更优选地实施阳离子交换和/或阴离子交换；或

c.任选地实施电渗析和/或反渗透和/或浓缩步骤和/或脱色步骤；

d.任选地实施模拟移动床色谱，和/或产生固体精细化学品产物的固化步骤，优选结晶步骤和/或精细化学品的喷雾干燥，随后根据需要进行干燥。

为了便于储存和运输，通常需要将诸如寡糖的精细化学品以固体形式而不是溶液形式储存。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的方法作为最终步骤，从溶液中除去所需的一种或多种精细化学品，例如一种或多种寡糖，如一种或多种HMO。这可以通过结晶来实现，其中借助例如但不限于一种或多种溶剂，诸如但不限于短链醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇、丁醇)和/或有机酸，优选食品级有机酸(诸如但不限于乙酸和/或丙酸)。可替代地，在本发明方法的所述最后步骤中，可以通过喷雾干燥或任何其他方法从所需精细化学品中除去水或溶剂，使精细化学品达到合适的干燥度来实现从溶液中的去除。此外，可以在所述最终步骤之前采用从溶液中去除精细化学品的此类步骤。例如，本发明的方法涵盖结晶或喷雾干燥步骤，随后再溶解精细化学品以产生新的溶液，任选的其他纯化步骤或重复从溶液中去除精细化学品并再溶解精细化学品以形成新的溶液，并然后作为最后的步骤再次从溶液中除去。

步骤S22的纳滤可以包括浓缩和渗滤的子步骤，也称为洗涤，以任何顺序交替开始。然而，当首先使用渗滤模式时，需要大体积量的渗滤介质，通常是去离子水。因此，在优选的实施方案中，纳滤步骤S22具有子步骤，其中执行第一浓缩子步骤，然后进行渗滤子步骤，并然后任选地再次进行浓缩子步骤。

在优选的实施方案中，在纳滤S22之后或第二纳滤之后，除了用于结晶的短链有机酸之外，在任何随后的步骤中都不添加阴离子和/或阳离子(例如，NaOH)。具体而言，本发明的方法允许在不使用电渗析的情况下除去盐，并且在优选的实施方案中不使用离子交换以获得固体产物。

根据本发明的方法，令人惊讶地发现，在实施第一膜过滤之前，当溶液的pH值降低到低于7时，可以显著提高第一膜过滤中的膜性能，并且可以显著提高蛋白质的去除。此外还发现，当在任何膜过滤之前将吸附剂添加至溶液中时，膜性能进一步提高，并且渗透物的颜色可以显著降低到低于所需规格的值。同样有利的是，当将pH值调至低于pH 7的所需目标值并添加至少一种吸附剂后进行膜过滤时，与已知方法相比，吸附剂(如活性炭)的所需量低得多，并且脱色所需的时间也比已知方法短得多。

优选地，吸附剂是活性炭。活性炭，也称为有活性的炭或有活性的木炭，是一种优选的吸附剂，因为它成本低、可大量获得、易于处理、并且与食品一起使用安全。

对本发明的方法有利的是，当进行第一膜过滤时，并且更优选地当添加吸附剂时，包含生物质和一种或多种寡糖、一种或多种二糖和/或一种或多种单糖的溶液的pH值低于pH 7.0。因此，由于发酵液的pH值通常处于或高于pH 7.0，根据需要通过添加至少一种酸来降低pH值以达到目标pH值。如果包含生物质和一种或多种寡糖、一种或多种二糖和/或一种或多种单糖的溶液的pH值在开始时已经低于pH 7.0，则可以根据需要使用至少一种酸将pH值稳定地调为低于pH 7.0。此外，优选地，在开始任何膜过滤之前，将溶液的pH值调至5.5或更低的pH值。优选将pH值降低至在3.0至5.5范围内、更优选3.5至5范围内的目标pH值，其中所给出的范围包括给定的数值。在甚至更优选的实施方案中，将溶液的pH值调至pH 3.5或更高，但不高于pH 4.5，并且最优选地将pH值调至在4.0至4.5的范围内(且含端值)。为此，向所述溶液中添加至少一种酸。所述至少一种酸是更优选地选自下组的酸：H₂SO₄、H₃PO₄、HCl、HNO₃和CH₃CO₂H。基本上，可以使用任何酸。然而，这些酸通常很容易处理。

所述吸附剂、优选活性炭通常以按重量计在0.25％至3％的范围内、优选按重量计在0.5％至2.5％的范围内、并且更优选地按重量计在0.75％至2.2％的范围内、并且甚至更优选地按重量计在1.0％至2.0％的范围内的量添加，其中这些百分比值是基于吸附剂重量/溶液重量的基础。因此，相当少量的所述吸附剂(优选活性炭)足以将色数降低到低于上限规格，优选1000APHA。与活性炭柱相比，这允许显著减少活性炭消耗以及显著减少产品损失。在一个实施方案中，以逐渐增加的优选顺序，以适合于结合包含可能存在的生物质和/或多糖和/或蛋白质和/或核酸(如DNA或RNA)的起始溶液中至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、92％、94％、95％或更多颜色组分和/或蛋白质的量添加一种或多种吸附剂。此外，所述吸附剂、优选活性炭通常以具有如下粒度分布的粉末形式添加，所述粒度分布具有在2μm至25μm的范围内，优选在3μm至20μm的范围内的直径d50，例如具有10至15μm、并且更优选地在3μm至7μm的范围内、并且甚至更优选地在5μm至7μm的范围内的d50的那些。这种低d50值的粉末可以通过湿磨较大的粉末来制备。通过标准程序确定d50值。该尺寸范围内的粒度降低了膜磨耗的风险。此外，所述吸附剂(优选活性炭)仍优选地以粉末在水中的悬浮液的形式添加。这有利于吸附剂的处理，因为粉末的悬浮液可以更好地与包含生物质和寡糖的悬浮液混合。通常在向溶液中添加至少一种酸后进行向所述溶液中添加所述吸附剂(优选活性炭)。出乎意料地，当首先调节pH值，并随后添加吸附剂或至少大部分吸附剂时，颜色还原和蛋白质还原效果要好得多。可以在向溶液中添加至少一种酸之前，向发酵液中添加所述吸附剂、优选活性炭。

在另一实施方案中，通过添加至少一种合适的酸，将溶液的pH值降低至5.5，更优选地降低至5.0，并且甚至更优选地降低到4.5，然后添加吸附剂(优选活性炭)和另外的酸，直到实现所需的最终pH值。此外，可以在添加任何酸以降低pH值之前添加一些吸附剂，然后在pH值被调至低于pH 7.0的目标值之后添加更多的吸附剂。

优选地，所述包含生物质和至少一种精细化学品(优选寡糖或芳香族化合物)的溶液通常是发酵液，其是通过在培养基(优选包含至少一种碳源、至少一种氮源和无机营养物的培养基中)中培养一种或多种类型的细胞(优选细菌或酵母，更优选细菌，甚至更优选基因修饰的大肠杆菌(Escherichia coli)、土壤丝菌属(Amycolatopsis sp.)或类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides))而获得。因此，可以用成本有效的方法生产足量的所述一种或多种精细化学品、优选一种或多种寡糖。

第一膜过滤步骤的所述微滤或超滤通常作为错流微滤或错流超滤实施。因此，可以提高过滤效率。如果使用陶瓷单通道和多通道元件，所述错流微滤或错流超滤包括大于0.2m/s、优选地在0.5m/s至6.0m/s的范围内、更优选地在2.0m/s至5.5m/s的范围内、并且甚至更优选地在2.8m/s至4.5m/s的范围内、并且最优选地在3.0m/s至4.0m/s的范围内的错流速度。在另一个实施方案中，错流速度等于或低于3.0m/s。在聚合物膜用于第一膜过滤的情况下，可以使用2m/s或更小的错流速度；优选使用在0.5m/s至1.7m/s范围内的错流速度，但甚至可以使用0.5m/s或更小的错流速度。在另一个优选的实施方案中，如果使用聚合物膜，错流速度不超过1.7m/s、1.6m/s、1.5m/s、1.4m/s、1.3m/s、1.2m/s、1.1m/s或1.0m/s。因此，当与不包括pH值调节和添加吸附剂的过滤过程相比时，过滤速度可以优化。通过这样做，与先前已知的方法相比，通过以更低的错流速度操作，可以减少膜过滤设备上的磨损和撕裂和/或能量损耗，同时实现良好的分离。

所述第一膜过滤，优选微滤或超滤，通常在4℃至55℃的范围内、优选在10℃至50℃的范围内、并且更优选地在30℃至40℃范围内的溶液温度下实施。因此，所述过滤步骤期间的温度可以与发酵期间的温度相同，这进一步提高了膜性能并降低了包含生物质和寡糖的溶液的粘度。然而，第一膜过滤还优选地通过陶瓷微滤膜或陶瓷超滤膜实施，所述膜具有在20nm至800nm范围内、优选在40nm至500nm的范围内、并且更优选地在50nm至200nm范围内的孔径。还可以使用设计成具有改进的耐磨耗性的多层膜，例如Al₂O₃的400nm和200nm和50nm孔径层。因此，可以去除足够量的蛋白质和多糖，以便于符合所需规格。同样典型地，第一膜过滤通过聚合物超滤膜实施，所述聚合物超滤膜具有大于或等于4kDa、优选大于或等于10kDa、更优选等于或大于50kDa且甚至更优选地等于或大于100kDa的截止。同样典型地，第一膜过滤通过聚合物微滤膜实施，所述聚合物微滤膜具有200nm或更小、优选100nm或更小的孔径。因此，可以去除足够量的蛋白质和多糖以符合所需的规格。

聚合物微滤膜或聚合物超滤膜的聚合物材料优选地是至少一种选自下组中的聚合物材料：聚醚砜、聚砜、聚丙烯、聚偏氟乙烯、聚丙烯腈、聚偏氟乙烯。还可以使用改进的聚合物材料，例如亲水性聚醚砜。

陶瓷微滤膜或陶瓷超滤膜的陶瓷材料优选地是选自下组中的至少一种陶瓷材料：TiO₂、ZrO₂、SiC和Al₂O₃。

第一膜过滤(优选微滤或超滤)通常在吸附剂(优选活性炭)添加至溶液后的预定时间之后进行。这允许提供吸附颜色组分的吸附时间。所述预定时间为至少2min、优选至少10min、并且更优选至少20min。因此，颜色组分的吸附相当快。

所述方法可以优选地进一步包括实施第二或另外的膜过滤(优选超滤)，使用通过所述第一膜过滤的微滤或超滤获得的基本上不含生物质的溶液，并且包含一种或多种寡糖、一种或多种二糖和/或一种或多种单糖，优选地包含来自起始溶液(例如，发酵液)的这些糖类的大部分，所述起始溶液还包含生物质。优选地，第二膜过滤用第一膜过滤的渗透物和具有比第一膜低的截止的膜进行。因此，实现了对通过第一膜过滤获得的渗透物的有利的进一步加工。第二膜过滤通常是通过超滤膜实施的超滤，优选至少部分由聚合物材料组成，并且具有在1kDa至10kDa范围内、优选地在2kDa至10kDa范围内、并且更优选地在4kDa至5kDa范围内的截止。聚合物膜通常具有比致密陶瓷膜更坚固且更便宜的优点。

第二膜过滤可以用具有1至25kDa、优选2至10kDa、更优选2至5kDa截止的陶瓷膜进行。在另外的实施方案中，优选膜至少部分地由聚合物材料制成。所述聚合物材料更优选地是选自下组中的至少一种聚合物材料：聚醚砜、聚砜、聚丙烯腈、乙酸纤维素。所述第二膜过滤通常在将溶液的温度调节至低于20℃的温度、优选地在溶液处于4℃至15℃范围内、优选地在8℃至13℃的范围内、并且更优选地在8℃至12℃的范围内的温度下之后实施。

在优选的实施方案中，本发明的方法中采用的第一膜过滤包括两个或优选三个步骤，下面将进一步详细说明。第一步骤包括第一渗滤，所述第一渗滤具有从0.5或更小至3或更大的范围内的渗滤因数DF(渗滤水的量＝发酵液的开始量x渗滤因数)。例如，对于包含2'-FL的溶液，具有DF为0.5是有利的，而对于其他HMO分子，如果随后进行浓缩步骤，则证明DF值为3更好。在渗滤过程中，添加的水或合适的水性溶液的量与排出的渗透物的量是相同的。在分批渗滤中，进料容器中的容积因此保持恒定。第二步骤包括，通过停止渗滤水的进料来优选2倍或更多倍地浓缩发酵液，并且水平将降低至目标值(目标值＝在发酵液开始时的容积或质量/浓缩倍数)。任选地，随后的第三步骤包括第二渗滤。通过这三个步骤，实现了产品在渗透物中的稀释度和产率增加≥95％。通过增加第二渗滤的因数，产率甚至可以进一步增加。然而，产品的稀释度也会增加。然后渗透物通常是在这三个步骤中通过膜的所有溶液的组合。在分批工艺中，每个步骤以分开时间的方式产生渗透物部分，可将其收集在一个容器中进行混合或单独处理。在一个连续的过程中，三个步骤中的每一个都产生一个不在时间上分开的渗透物部分，并且如果需要，可以将这些部分组合以形成经合并或单独处理的渗透物。

任选地，第一膜过滤的第一步骤可以在浓缩的第二步骤完成之前重复一次或多次。任选地，可以进行第二步骤，或者如果不需要浓缩溶液，可以跳过所述第二步骤。例如，当发酵液具有高粘度和/或非常高的生物质含量时，这是有用的。任选地，可以跳过第一步骤，并且可替代地在没有第一步骤的情况下进行第二步骤，从而首先在产生渗透物的同时进行发酵液的浓缩，并接着通过向包含生物质和一种或多种寡糖、二糖或单糖的溶液中进料水或水性溶液来进行最后步骤的渗滤。

优选地，所述至少一种寡糖包括人乳寡糖，优选中性的或唾液酸化的人乳寡糖，并且更优选乳-N-四糖、乳-N-新四糖、3'-唾液酸基乳糖、6'-唾液酸基乳糖和/或2'-岩藻糖基乳糖，并且甚至更优选地2'-岩藻糖基乳糖、6'-唾液酸基乳糖和/或乳-N-四糖。

在本发明的一个实施方案中，本发明的方法应用于从来自含有单糖和/或二糖和生物质的溶液中的生物质中分离单糖和/或二糖，例如用于从生物质中分离乳糖、岩藻糖、麦芽糖或蔗糖以及随后对单糖和/或二糖进行纯化。

另外的实施方案是适于进行本发明方法的本发明的装置。

本发明的其他特征和实施方案将在随后的描述中更详细地公开，特别是结合从属权利要求。其中，如技术人员将认识到的，各个特征能以单独的方式以及任何任意可行的组合来实现。这些实施方案在附图中示意性地示出。其中，这些图中同一的参考编号表示同一的元件或功能上同一的元件。

具体实施方式

如下文所用，术语“具有”、“包含”或“包括”或其任意语法变体均以非排他性方式使用。因此，这些术语既可以指如下情形，其中除了由这些术语引入的特征之外，在此上下文中描述的实体中不存在另外的特征的情况，并且其中也存在一个或多个另外特征的情形。作为一个实例，表述“A具有B”、“A包含B”和“A包括B”可以指如下情形，其中除B之外，A中不存在其他元件的情形(即，其中A仅有且排他地由B组成的情形)，并且也指如下情形，其中除B之外，一个或多个另外的元件存在于实体A中的情形，如元件C、元件C和元件D或甚至其他元件。

此外，应注意的是，术语“至少一个(种)”、“一个(种)或多个(种)”或指示特征或元件可以出现一次或多次的类似表达将通常仅在引入各自的特征或元件时使用一次。下文中，在大多数情况下，当提及各自的特征或元件时，尽管各自的特征或元件可能出现一次或多次的事实，表述“至少一个(种)”或“一个(种)或多个(种)”将不会重复。

此外，如下文所用，术语“特别地”、“更特别地”，“具体地”、“更具体地”、“通常地”、“更通常地”、“优选地”、“更优选地”或类似术语与额外的/替代性特征一起使用，而不限制替代的可能性。因此，由这些术语引入的特征是额外的/替代性的特征，并且不旨在以任何方式限制权利要求的范围。如技术人员将认识到的，本发明可以通过使用替代性特征来进行。类似地，由“在本发明的一个实施方案中”或类似表述引入的特征旨在是额外的/替代性特征，而不受关于本发明的替代性实施方案的任何限制，没有关于本发明范围的任何限制，并且也没有关于以这种方式引入的特征与本发明的其他额外的/替代性或非额外的/替代性特征组合的可能性的任何限制。

如本文所用，术语“生物质”是指包含在一种或多种精细化学品的溶液中的生物材料的质量。通常，根据本发明的所述生物材料是一种或多种类型的原核有机体或真核有机体，或其高分子量的部分，例如，细胞壁、蛋白质、磷脂、细胞膜、多核苷酸以及由该有机体产生的其他大的有机化合物。生物质可以在悬浮液中和/或也可以在溶液中。

优选地，生物质应被理解为非复杂生物质，通常具有低或没有将细胞组织成特殊或复杂结构的组织。非限制性实例是单个细胞、细胞对、细胞块、寡细胞或多细胞结构、细胞层、生物膜。由于人类对非复杂生物质的干预所提供的基质，非复杂生物质可以是三维结构，例如但不限于，在培养皿中形成层或在生物反应器中形成生物膜衬里的细胞；附着在表面上或在由人等制造的生物传感器中的细胞或蛋白质。非复杂生物质可能是非天然的三维结构，但有时模仿天然存在的结构，但只能通过人类干预实现。与此相反，复杂的生物量被理解为由自然产生的复杂结构，通常是复杂的三维结构，并且在复杂的组织中包含数百、数千、数万，但更典型的是数十万或数百万或更多的细胞结构，通常为具有不同专业分工的各种细胞类型。非限制性实例是具有用裸眼可见机体的高等植物或动物、器官和组织，包括骨头和肉或植物部分，如水果、蔬菜、秸秆、甘蔗渣、干草、木材、木料。复杂生物质可以是非复杂生物质的来源，例如细胞系通常来源于组织或器官，但在培养中不保持复杂结构。

在更优选的实施方案中，生物质是指一种或多种生物有机体的一种或多种细胞，所述一种或多种有机体更优选地是细菌或真菌(包括酵母)有机体或植物或非人动物，以及它们的细胞部分(例如但不限于细胞壁、细胞器、蛋白质、磷脂、细胞膜、多核苷酸或多糖)。在更优选的实施方案中，一种或多种有机体是选自以下组中的细胞：a)革兰氏阴性细菌，例如红细菌属(Rhodobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、副球菌属(Paracoccus)或埃希氏杆菌属(Escherichia)；b)选自革兰氏阳性细菌的细菌细胞，例如芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、拟无枝菌酸菌属(Amycolatopis)；c)选自以下的真菌细胞：曲霉属(Aspergillus)(例如，黑曲霉(Aspergillus niger))、布拉霉属(Blakeslea)、青霉属(Peniciliium)、法夫酵母属(Phaffia)(红法夫酵母(Xanthophyllomyces))、毕赤酵母属(Pichia)、酿酒酵母属(Saccharamoyces)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)和汉逊酵母属(Hansenula)；或d)转基因植物或包含转基因植物细胞的培养物，其中所述细胞是选自以下的转基因植物的细胞：烟草属物种(Nicotiana spp)、菊苣(Cichorum intybus)、莴苣(lacuca sativa)、薄荷属物种(Mentha spp)、黄花蒿(Artemisia annua)、形成块茎的植物、油料作物和树木；或e)转基因蘑菇或包含转基因蘑菇细胞的培养物，其中所述微生物选自裂褶菌属(Schizophyllum)、伞草属(Agaricus)和Pleurotisi。更优选的有机体是属于埃希氏杆菌属(Escherichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、拟无枝菌酸菌属(Amycolatopsis)、红细菌属(Rhodobacter)的微生物；并且甚至更优选的物种是大肠杆菌(E.coli)、酿酒酵母(S.cerevisae)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)或拟无枝菌酸菌属物种(Amycolatopis sp.)的那些微生物，例如但不限于地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)，例如菌株NCIM 5008，西唐氏链霉菌(Streptomycessetonii)、沙链霉菌(Streptomyces psammoticus)，并且例如但不限于拟无枝菌酸菌属物种(Amycolatopsis sp)菌株IMI390106、Zyl 926、ATCC39116、DSM 9991、9992或Zhp06。

更优选地，所述生物质包括在培养基中培养的有机体或其细胞及其细胞部分，甚至更优选基因修饰的有机体或细胞，所述培养基是优选地包含至少一种碳源、至少一种氮源和无机营养物的培养基。

评估生物质和精细化学品(优选一种或多种寡糖、二糖和/或单糖)分离成功的最简单方法是监测第一膜过滤的渗透物是否光学透明。不成功的分离将导致在渗透物的光学检查中检测到生物质，并且渗透物中存在的吸附剂(如黑色活性炭)也将很容易在光学检查中被检测到，并表明膜过滤设备存在泄漏或故障。

如本文所用，术语“精细化学品”是指寡糖、二糖、单糖、芳香族化合物、聚合物、单体、维生素、氨基酸、肽、葡萄糖苷、核酸、核苷酸。在优选的实施方案中，精细化学品是指寡糖或二糖或单糖，更优选指寡糖，并且甚至更优选地指人乳寡糖。

如本文所用，术语“寡糖”是指含有少量通常为三至十个单糖(简单糖类)的糖聚合物。优选地，所述寡糖包括人乳寡糖，优选中性、酸性非岩藻糖化的和/或酸性岩藻糖基化的，更优选2'-岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、LNDFH I、LNDFH II和/或含有人乳寡糖的唾液酸，例如但不限于3'-唾液酸基乳糖和/或6'-唾液酸基乳糖，甚至更优选2'-岩藻糖基乳糖。

如本文所用，术语“二糖”由两个单糖组成的糖，例如由葡萄糖和半乳糖部分组成的乳糖，或由一个葡萄糖和一个果糖分子组成的蔗糖。

如本文所用，术语“单糖”是指简单糖，优选包含5或6个碳原子的糖分子，例如葡萄糖、果糖、半乳糖或岩藻糖。

如本文所用，术语“芳香族化合物”是指任何具有气味、香气、香味或风味的物质，并且优选地是具有嗅觉或气味的化合物。优选地，芳香族化合物是通常具有作为分子量的分子质量高达1000Da、优选高达800Da、更优选高达600Da、甚至更优选高达400Da的有机化合物。优选地，芳香族化合物是极性芳香族化合物，甚至更优选地选自以下的列表：呋喃醇、苯甲酸、苯乙醇、覆盆子酮、吡嗪类化合物、香兰醛、香草醇和香草糖苷，并且仍甚至更优选地选自香草醛、香草醇和香草糖苷。

如本文所用，术语“吸附剂”是指配置成提供原子、离子或分子从气体、液体或溶解固体粘附到表面的元件。术语“粘附”是指不同的颗粒或表面相互粘附的趋势。优选地，吸附剂被配置成为颜色组分提供粘附。优选地，吸附剂是活性炭。

如本文所用，术语“微滤”是指一种物理过滤过程，其中包含不希望的颗粒的流体(例如，被污染的流体)通过一种特殊孔径的膜以将细胞(诸如微生物)和悬浮颗粒与工艺液体分离，特别是较大的细菌、酵母和任何固体颗粒。微滤膜具有0.1μm至10μm的孔径。因此，此类膜具有大于250kDa的分子量的截止。

如本文所用，术语“超滤”是指一种物理过滤过程，其中包含不希望的颗粒的流体(例如，被污染的流体)通过一种特殊孔径的膜以将细胞(诸如微生物)和悬浮颗粒与工艺液体分离，特别是细菌、大分子、蛋白质和较大的病毒。超滤膜通常具有2nm至100nm的孔径，并且具有2kDa至250kDa的分子质量的截止。超滤潜在的基本原理与微滤潜在的基本原理没有本质上的区别。这两种方法都基于尺寸排阻或颗粒保留进行分离，但它们的分离能力根据颗粒的尺寸不同。

如本文所用，术语“纳滤”是指一种物理过滤过程，其中包含不希望的颗粒的流体(例如，被污染的流体)通过一种特殊孔径的膜以将溶液中较大的化合物与较小的化合物分离。它使用具有比超滤膜更小孔径的膜。纳滤膜的一个实例是具有1-10nm孔径的那些。纳滤膜的特征在于其至少部分但不完全保留诸如NaCl或MgSO₄的无机盐。由于这些低分子物质的保留，它们通常在比超滤膜更高的压力下操作。在本文中，“纳滤”被定义为用具有对NaCl保留5％至90％的膜进行的过滤，其中所述保留在2,000ppm的盐浓度、25℃的温度、8bar的进料压力和15％的回收率下测定。

本领域应理解，如果膜过滤被认为是微滤、超滤、纳滤或反渗透，则过滤膜的孔径不是唯一的决定因素。技术人员将能够区分这些方法。

如本文所用，术语“固化”是指将化合物(例如，精细化学品)从物质的非固态转移到固态的过程。该化合物可以作为悬浮液或非悬浮固体存在。非限制性实例是结晶、喷雾干燥、煮沸至干燥、沉淀和絮凝。固体颗粒可以在固化过程之后或作为固化过程的一部分被部分或完全地干燥，并且仍然含有溶剂(如水)，或甚至悬浮在此类溶剂中。对于一些应用，悬浮液或浆料是优选的，对于其他更多或更少的干燥固体，例如作为粉末或晶体是优选的。对于在室温下不是固态的化合物，或者为了支持在室温下处于固态的化合物的固化过程，可以在较低的温度下进行固化。非限制性实例是冷却以从溶液中沉淀固体，但也包括涉及更强温度降低的过程，诸如但不限于冷冻干燥。在另一方面，如果化合物在室温下处于溶液或悬浮液中，也可以在固化过程中使用通过升高的温度除去溶剂。

如本文所用，术语“脱矿化”是指至少部分脱矿化，去除优选地至少90mol％、更优选地至少95mol％的所有盐。

根据本发明的方法，第一膜过滤优选地通过具有等于或大于4kDa、优选等于或大于10kDa、且更优选等于或大于50kDa的截止的聚合物超滤膜，或具有200nm或更小、优选100nm或更小的孔径的聚合物微滤膜的方式实施。进一步，所述第二膜过滤优选地通过超滤膜实施，所述超滤膜具有在1kDa至10kDa的范围内、优选地在2kDa至10kDa的范围内、并且更优选地在4kDa至5kDa的范围内的截止。

过滤膜的截止通常是指90％给定尺寸或分子质量的溶质的保留，例如，90％具有xkDa的球状蛋白质被具有x kDa截止的膜保留。这些截止值可以例如如下来测量：在本领域常见的条件和参数下过滤所定义的葡聚糖或聚乙二醇，并使用本领域常用的方法和参数，利用GPC凝胶渗透色谱分析仪分析渗余物、渗透物和原始溶液(也称为进料)。

如本文所用，术语“错流过滤”是指一种过滤类型，其中在相对于渗透物侧的正压下，大部分进料流切向穿过过滤器的表面，而不是进入过滤器。这样做的主要优点是，在过滤过程中不会建立在其他方法中可以屏蔽过滤器的滤饼，从而增加了过滤装置运行的时间长度。它可以是一个连续的过程，不像分批式的死端型过滤。对于大规模应用，优选连续工艺。通常选择这种类型的过滤用于含有高比例、小粒度固体的进料，其中渗透物是最有价值的，因为固体材料可以迅速地堵塞(屏蔽)死端型过滤的过滤器表面。根据本公开，所述错流微滤或错流超滤包括在0.5m/s至6.0m/s的范围内、优选地在2.0m/s至5.5m/s的范围内、并且更优选地在3.0m/s至4.5m/s的范围内的错流速率。在由陶瓷制成的膜的情况下，根据膜的相应几何形状，错流速率可能高于由聚合物材料制成的膜的情况。例如，在扁平聚合物膜(诸如平板模块中的聚合物膜)的情况下，错流速率为0.5m/s至2.0m/s，并且优选1.0m/s至1.7m/s，并且更优选1.0至1.5m/s。根据特定的设置和包含生物质的特定溶液，在一些情况下甚至可以使用1.0m/s或更小的错流速率，但当错流速率太低时，过滤可能会变成死端型过滤。错流速率和错流速度在本文中互换使用。

如本文所用，术语“截止”是指膜的排阻极限，通常以MWCO的形式规定，分子量截止，其中单位为道尔顿。它被定义为溶质的最小分子量，例如被膜保留到90％的球状蛋白质。根据方法，可以将截止转换为所谓的D90，然后用公制单位表示。

本发明方法的关键部分是通过至少一个被称为S22的纳滤步骤，使包含一种或多种精细化学品的溶液脱矿化。该纳滤步骤S22优选地用包含精细化学品(优选寡糖)的溶液进行，其中将所述溶液的pH调至低于pH 7的值，优选低于pH 5，因为这将使离子(如磷酸盐或硫酸盐)的去除更容易。

然而，在更优选的实施方案中，所述方法涉及在步骤S22的纳滤步骤实施之前的有益步骤。在该改进的本发明的方法中，在第一步骤(图2，步骤S10)中，提供包含生物质和至少一种寡糖的溶液。所述至少一种寡糖包括人乳寡糖，优选2'-岩藻糖基乳糖。优选地，所述包含生物质和寡糖的溶液通过在培养基中培养一种或多种类型的细胞而获得。因此，在优选的实施方案中，所述溶液也可以被称为发酵液。培养基优选地是包含至少一种碳源、至少一种氮源和无机营养物的培养基。更优选地，包含生物质和至少一种寡糖的发酵液或溶液通过微生物发酵，优选需氧微生物发酵获得。能够产生寡糖的微生物可以是酵母或细菌，例如来自下组中：埃希氏杆菌属(Escherichia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、螺杆菌属(Helicobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)和克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)，或如国际专利申请公开WO2015/032412或欧洲专利申请公开EP 2 379 708中所述的，优选经基因修饰的大肠杆菌(E.coli)菌株，更优选经基因修饰的、lacZ基因缺陷(lacZ-)的大肠杆菌菌株，并且适合生产用于人类营养的物质，所述物质在受控的条件下，有利于生物合成寡糖的水性营养培养基中培养，例如在EP 2 379 708、EP 2 896 628或US 9 944 965中公开的。水性营养培养基包含至少一种碳源(例如，甘油或葡萄糖)，其被微生物用于生长和/或生物合成寡糖。此外，营养培养基还含有至少一种氮源，优选为铵盐形式，例如硫酸铵、磷酸铵、柠檬酸铵、氢氧化铵等，这对于细胞(如微生物)的生长是必需的。培养基中的其他营养物质包括例如一种或若干种磷酸盐作为磷源，硫酸盐作为硫源，以及其他无机或有机盐，例如向细胞提供Mg、Fe和其他微量营养素。在许多情况下，必须在营养培养基中添加一种或多种维生素(例如，硫胺素)以获得最佳性能。营养培养基可以任选地含有复杂的混合物，例如酵母提取物或蛋白胨。此类混合物通常含有富含氮的化合物(如氨基酸)以及维生素和一些微量营养素。

可以在培养开始时将营养物质添加到培养基中，和/或也可以在工艺进程中进料。最常见地，在培养开始时，将一种或多种碳源添加至培养基中，达到所定义的低浓度。然后连续或间歇地进料一种或多种碳源，以便于控制生长速率，并因此控制细胞的需氧量。通常通过用氨控制pH值来获得额外的氮源(见下文)。也可以在培养进程中添加以上提及的其他营养素。

在一些情况下，将前体化合物添加至培养基，这对于寡糖生物合成是所必需的。例如，在2'-岩藻糖基乳糖的情况下，通常添加乳糖作为前体化合物。可以在培养开始时将前体化合物添加至培养基，或可以在培养期间将前体化合物连续或间歇地进料，或可通过初始添加和进料的组合添加前体化合物。

在搅拌槽生物反应器中，在能够生长和生物合成寡糖的条件下培养细胞。向微生物细胞提供50mmol O2/(l*h)至180mmol O2/(l*h)范围内的良好氧气供应对于生长和生物合成是必不可少的，因此对培养基充气并剧烈搅拌，以便于实现氧气向液体培养基的高转移速率。任选地，进入培养基的空气流可以被纯氧气流富集，以便于提高氧向培养基中细胞的转移速率。在24℃至41℃，优选32℃至39℃实施培养，将pH值调在6.2至7.2，优选地通过自动添加NH₃(气态或NH₄OH的水性溶液)。

在一些情况下，寡糖的生物合成需要通过添加化合物(例如，异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))来诱导，例如欧洲专利申请公开EP 2 379 708中所述。可以在培养开始时将诱导剂化合物添加至培养基，或可以在培养期间将前体化合物连续或间歇地进料，或可通过初始添加和进料的组合添加前体化合物。

随后，本发明的方法在第二步骤中进行对pH值的调节(图2，步骤S12)。在所述步骤中，通常将溶液的pH值调至7或更低。如果需要，通过向包含生物质和至少一种寡糖的溶液中添加至少一种酸来降低pH值。优选地，将溶液的pH值降低至目标pH值，优选地在3.0至5.5的范围内、更优选地在3.5至5的范围内、并且甚至更优选地在4.0至4.5的范围内，如4.0或4.1。所述至少一种酸是选自下组中的酸：H₂SO₄、H₃PO₄、HCl、HNO₃(优选地不是浓缩形式)和CH₃CO₂H，或在食品生产或进料中被认为安全的任何其他酸；优选选自下组中的酸：H₂SO₄、H₃PO₄、HCl和CH₃CO₂H。在一个实施方案中，可以使用这些酸的混合物而不是这些酸的单个一种。

此外，在本发明方法的另一个实施方案中，如包含生物质和至少一种寡糖、至少一种二糖或至少一种单糖的溶液的pH值已经低于7、优选低于pH 5.5、更优选等于或低于pH5.0、并且甚至更优选地等于或低于pH 4.5，将不会添加任何这些酸，并且可以跳过步骤S12，而且用于此类溶液的本发明的方法继续到步骤S14。

所述方法然后进行到下一步骤(图2，S14)。在所述步骤中，将一种或多种吸附剂添加至包含生物质和至少一种寡糖的溶液。优选地，吸附剂是活性炭。将所述吸附剂(优选活性炭)以按重量计0.5％至3％的范围内、优选地按重量计0.6％至2.5％的范围内、并且更优选地按重量计在0.7％至2.0％的范围内的量(如1.5％)添加。在这方面，必须注意，吸附剂的颗粒越小，吸附特性越好。将所述吸附剂(优选活性炭)作为具有如下粒度分布的粉末添加，所述粒度分布具有在2μm至25μm的范围内、优选在3μm至20μm的范围内(例如10至15μm的那些)、并且更优选地在3μm至7μm的范围内(如5μm)的直径d50。更优选地，所述吸附剂(优选活性炭)作为粉末在水中的悬浮液添加。优选地，在向溶液中添加至少一种酸后实施向所述溶液中添加所述吸附剂(优选活性炭)。可替代地，在向溶液中添加至少一种酸之前实施向所述溶液中添加所述吸附剂(优选活性炭)。换言之，步骤S12和S14的顺序可以改变，并且其顺序不固定。然而，如果顺序是首先将pH调为低于7至所需pH值，并然后添加一种或多种吸附剂，优选活性炭，将产生关于蛋白质去除和脱色的最佳结果。在优选的实施方案中，至少一种酸的添加先于至少一种吸附剂(优选活性炭)的添加。

在本发明方法的优选的实施方案中，均进行步骤S12和S14，并且顺序为S12、接着S14。

然后，所述方法进行第一膜过滤，优选在另外的步骤中的微滤或超滤(图2，步骤S16)，包括适合于在分离之前将颜色组分粘附到一种或多种吸附剂上的时间。实施第一膜过滤以便于从包含至少一种寡糖、至少一种二糖和/或至少一种单糖的溶液中分离生物质和一种或多种吸附剂，并且通过这样去除生物质并且还减少所得溶液中的颜色组分和蛋白质，所述溶液也称为包含寡糖、二糖和/或单糖的渗透物。基本上，步骤S16包括微滤或超滤。然而，由于在微滤和超滤之间存在平滑的过渡，并且这两者都可以被本领域技术人员用于在一侧分离生物质、吸附剂和蛋白质，而在另一侧分离含有大量所需的一种或多种寡糖、一种或多种二糖和/或一种或更多种单糖的渗透物的目的。步骤S16中的过滤还可以是超滤，作为微滤的替代。所述微滤或超滤优选作为错流微滤或错流超滤实施，以改善膜性能并减少膜磨耗。下面将说明步骤S16中的过滤的细节。所述错流微滤或错流超滤包括在0.5m/s至6.0m/s的范围内、优选地在2.0m/s至5.5m/s的范围内、并且更优选地在3.0m/s至4.5m/s的范围内(如4.0m/s)的错流速度。在一个实施方案中，错流速度为等于或低于3.0m/s，优选地在1.0和2.0之间(且包括端值)。本发明的方法、用途和设备的一个优点是，较低的错流速度可用于实现溶液的蛋白质组分与任何寡糖、二糖或单糖的良好分离。因此，能源和设备成本可以降低，设备的磨损和撕裂以及过滤膜的磨耗也可以降低。所述第一膜过滤(优选微滤或超滤)在8℃至55℃的范围内、优选地在10℃至50℃的范围内、并且更优选地在30℃至40℃的范围内(如38℃)的溶液温度下实施。所述微滤或超滤通过陶瓷微滤膜或聚合物微滤膜或陶瓷超滤膜实施，所述膜具有在20nm至800nm的范围内、优选地在40nm至500nm的范围内、并且更优选地在50nm至200nm的范围内(如100nm)的孔径。所述陶瓷材料是至少一种陶瓷材料的至少一层或具有其至少一层，所述陶瓷材料选自下组中：二氧化钛(TiO₂)、二氧化锆(ZrO₂)、碳化硅(SiC)和氧化铝(Al₂O₃)。可替代地，所述微滤或超滤通过聚合物超滤膜(具有等于或大于10kDa，优选等于或大于50kDa的截止)或聚合物微滤膜(具有100nm或更小的粒度)的方式实施。所述聚合物材料是至少一种选自下组中的聚合物材料：聚醚砜、聚砜、聚丙烯、聚偏氟乙烯、聚丙烯腈、聚偏氟乙烯。在向溶液中添加吸附剂(优选活性炭)后的预定时间后，实施所述第一膜过滤(优选微滤或超滤)，并因此确保颜色组分的粘附。通常，将溶液与所添加的吸附剂混合直到吸附剂(优选活性碳)在溶液中已经达到的均匀分布所需的时间可能足以允许颜色组分的粘附，但可以使用更长的孵育时间来最大化这一点。在一个实施方案中，所述预定时间为至少2min、优选至少10min，并且更优选至少20min，诸如25min或30min。

在优选的实施方案中，本发明的方法中的第一膜过滤包括三个步骤，如在下面将进一步详细解释。第一步骤包括具有因数为0.5的第一渗滤(渗滤水的量＝发酵液的开始量x渗滤因数)。在渗滤过程中，添加的水的量与排出的渗透物的量是相同的。第一步骤是连续步骤，并因此进料容器中的容积保持恒定。第二步骤包括，通过停止渗滤水的进料来2倍地浓缩发酵液，并且水平将降低至目标值(目标值＝在发酵液开始时的容积或质量/浓缩倍数)。随后，第三步骤包括第二渗滤。在这三个步骤中收集的渗透物通常被合并以形成下表中提到的渗透物。通过这三个步骤，实现了产品在渗透物中的稀释度和产率增加≥95％。通过增加第二渗滤的因数，甚至可以提高产率。

然后，本发明的方法实施第二膜过滤步骤(图2，步骤S18)。优选地，对通过步骤S16的第一膜过滤获得的包含寡糖、二糖和/或单糖的溶液实施超滤。换言之，对来源于步骤S16中第一膜过滤的渗透物实施超滤。优选地，所述第二膜过滤(优选超滤)通过超滤膜实施，所述超滤膜具有在1kDa至10kDa的范围内、优选地在2kDa至10kDa的范围内、并且更优选地在4kDa至5kDa的范围内的截止。在特别优选的实施方案中，具有4kDa或5kDa截止的膜是合适的。所述超滤膜至少部分地由聚合物材料制成。所述聚合物材料是至少一种选自下组中的聚合物材料：聚醚砜、聚丙烯腈、乙酸纤维素。所述第二膜过滤(优选超滤)在5℃至15℃的范围内、优选地在8℃至13℃的范围内、并且更优选地在8℃至12℃的范围内(如10℃)的溶液温度下实施。

图1显示了本发明方法的步骤顺序，其中在分离之前，适合于将颜色组分粘附到一种或多种吸附剂的时间显示为单独的可选步骤(步骤S15)。当需要长时间将不希望的化合物充分粘附到吸附剂上时，这种单独的孵育步骤可能是有利的。此外，图2将第一膜过滤描述为具有三个子步骤的步骤；第一膜过滤的三个子步骤是第一渗滤、浓缩、以及然后任选地第二渗滤。这些在图2中分别显示为S16/1、S16/2和S16/3。

如果需要，本发明的方法接着进行任选的脱色步骤20，或直接进行如上所解释的第一纳滤步骤(S22)。

纳滤步骤可包括浓缩操作和渗滤操作，有时称为洗涤。根据设备设置和工艺提供的限制，可以先进行渗滤或洗涤操作，然后进行浓缩操作，并且任选地，可以重复一次或若干次渗滤或两个操作的顺序。

优选地，用相同的设备和相同的膜进行浓缩操作和渗滤操作，但是存在用于浓缩操作和用于渗滤操作的不同膜的设置是可能的。

在优选的实施方案中，纳滤步骤包括浓缩操作，随后是渗滤操作。CF优选地至少是3，更优选地至少是5，并且最优选地至少是10。

渗滤因数通常不超过10。在另一个优选的实施方案中，DF至少是0.5或更大，更优选地从1.5至7(且包括端值)，甚至更优选地在从2至4的范围内，又甚至更优选地从2.5至3.5、并且最优选2.5、2.6、2.7、2.8.、2.9或3.0。

所要求保护的方法以所描述的方式应用纳滤膜，并且提供了以下一个或多个益处：有效地去除单价盐和二价盐，因此不需要离子交换步骤，或如果仍然需要脱矿化，则离子交换处理需要基本上更少的离子交换树脂；与现有技术中用于相同或类似目的的其他膜相比，在纳滤期间可以保持更高的通量，这减少了操作时间；与现有技术的解决方案相比，在要求保护的方法中应用的膜不易堵塞；所要求保护的应用的膜可以因此完全清洁和再生，因此可以重复使用而不会明显降低其性能；如果需要，纳滤能以从三聚寡糖或更高寡糖(优选HMO)中选择性且有效地去除二糖(优选乳糖)的方式进行，产生富集的三聚寡糖或更高寡糖(优选HMO级分)。

在优选的实施方案中，第一和任选的第二纳滤步骤在连续设置中进行。

在另一个实施方案中，可以将通过纳滤进行的脱矿化与其他脱矿化方法组合。例如，如图1中S22和S26所示，可以在第一纳滤后实施离子交换步骤。此外，在本发明的方法中，可以在第一纳滤S22之后用不同的膜进行第二纳滤。这可以在图1、4和5中的第一纳滤(如S22和S24所示)之后直接进行。一个实施方案是，在第一纳滤中，在渗滤模式下使用更开放的膜，然后用更紧密的膜和浓缩模式进行随后的第二纳滤。第二纳滤可以在另一个脱矿化步骤之后进行，例如在第一纳滤之后通过离子交换进行。因为在离子交换步骤后使用膜浓缩时可以使用更紧密的膜，所以产品损失将略低。

根据需要，可在步骤20、26之前或在步骤26之后进行吸附剂的任选的脱色步骤。

在另一个实施方案中，进行步骤S10至S26，其中代替至少一种寡糖、至少一种单糖、至少一种二糖、或者至少一种单糖的混合物，存在至少一种二糖和/或至少一种寡糖代替至少一种寡糖。

优选的实施方案针对用于对溶液脱矿化的改进的方法，所述溶液包含一种或多种精细化学品，优选一种或多种HMO或一种或多种芳香族化合物，其中所述方法包括如针对步骤S22所述的第一纳滤，随后进行任选的第二纳滤和随后的脱矿化步骤，优选地通过离子交换，优选地如针对本文步骤S26所述进行脱矿化步骤，其中与未在脱矿化之前用一个或多个纳滤步骤处理的溶液或通过除本发明纳滤之外的其他方法脱矿化的溶液相比，所述精细化学品的脱矿化提高了至少50％、100％或150％，更优选地至少200％、甚至更优选地至少300％。

此类方法包括以下的步骤：

a)提供包含一种或多种精细化学品的溶液；

b)将pH调节至所需低于7的值；

c)优选地通过添加吸附剂，优选活性炭进行脱色的步骤；

d)任选实施的孵育步骤；

e)第一膜过滤；

f)对所述第一膜过滤的渗透物的第二膜过滤；

g)使用所述第二膜过滤的渗透物，在任选的脱色步骤中，优选地通过添加吸附剂(优选活性炭)，随后进行第一纳滤步骤或被第一纳滤步骤替代；

h)用第一个的渗余物进行的任选的第二纳滤；

i)如图4所示，对渗余物进行任选的进一步的加工步骤。

进一步公开了用于纯化在溶液中的精细化学品的方法，所述方法包括以下步骤：任选地将pH调至pH 7或以下，任选的脱色，通过任何方法的生物质分离，随后进行一系列由以下组成的一个或多个步骤：第一纳滤S22，任选的第二纳滤S24，任选的脱色和/或浓缩步骤，随后进行任选的固化步骤。

另外的实施方案是适用于通过发酵或酶或化学合成或其混合物生产的精细化学品的方法：一种纯化在溶液中的精细化学品的方法，所述方法包括通过任何方式任选地进行生物质分离和任选地将pH调为所需值的步骤，其中这两个任选的步骤可以按任何顺序进行，随后是由以下组成的一个或多个步骤的序列：第一纳滤S22，任选的第二纳滤S24，任选的脱色和/或浓缩步骤，随后进行任选的固化步骤。

在另外的实施方案中，本发明涉及适用于通过发酵或酶或化学合成或其混合物生产的精细化学品的快速纯化方法(图5)：用于纯化在溶液中的精细化学品的本发明的方法包括任选地将pH调为所需值的步骤，以及由以下组成的一个或多个步骤的序列：第一纳滤S22，任选的第二纳滤S24，任选的脱色和/或浓缩步骤，随后进行任选的固化步骤。

为避免疑义，对溶液或渗透物或渗余物的蛋白质含量的任何参考都是指溶液/渗透物/渗余物中的游离蛋白，即细胞外存在的蛋白质，而不是生物质中所含的蛋白质(如果有的话)。在发酵以及随后的处理和膜过滤过程中，蛋白质可以从生物质中释放出来，并然后被认为是游离蛋白质。

为避免疑义，对溶液或渗透物或渗余物中的至少一种寡糖、至少一种二糖和/或至少一种单糖的任何参考都是指在溶液/渗透物/渗余物中不含有至少一种寡糖、至少一种二糖和/或至少一种单糖(即，细胞外存在的至少一种寡糖、至少一种二糖和/或至少一种单糖，而不是生物质中所含的那些(如果有的话)。在发酵过程中以及随后的处理和膜过滤过程中，至少一种寡糖、至少一种二糖和/或至少一种单糖可从生物质中释放出来，并然后被认为在溶液中不含有至少一种寡糖、至少一种二糖和/或至少一种单糖。

在优选的实施方案中，实施第一膜过滤(优选微滤或超滤)，以便于从包含至少一种寡糖、至少一种二糖和/或至少一种单糖的溶液中分离生物质的步骤被理解为从至少一种寡糖、至少一种二糖和/或至少一种单糖中分离生物质的步骤，其中在第一膜过滤的渗透物中存在至少一种寡糖、至少一种二糖和/或至少一种单糖中的大多数，随后分离生物质。

在优选的实施方案中，第一膜过滤之后是超滤，然后任选地接着是纳滤或反渗透，优选纳滤，然后是离子交换。

如果在步骤S26或S24之后进行反渗透，以实现溶液的至少一些纯化而不仅仅是浓缩，在一个实施方案中，这被认为是本申请意义上的纳滤，并因此本发明的方法将包括作为纳滤步骤的膜和还可用于反渗透的装置。

此外，当需要对溶液浓缩而不是纯化时，步骤22的纳滤可以用反渗透代替，并然后与第二纳滤步骤S24组合，优选地包括至少一个去过滤子步骤。

在另一个实施方案中，公开了用于纯化一种或多种HMO的方法，所述方法包括以下的步骤：

i.提供包含生物质和一种或多种精细化学品的溶液；

ii.通过向包含生物质和所述至少一种寡糖的所述溶液中添加至少一种酸，将所述溶液的pH值调至低于7，优选低于pH 5.5或更低；

iii.向包含生物质和精细化学品的溶液中添加吸附剂；

iv.任选地孵育步骤；

v.实施膜过滤，本文中也被称为所述第一膜过滤，并且通常是微滤或超滤，以便于从包含所述至少一种精细化学品的溶液中分离所述生物质；

vi.任选地用所述第一膜过滤的渗透物实施至少一个第二或另外的膜过滤，优选至少一个超滤；

vii.用一个或多个纳滤对所述溶液脱矿化；

viii.完成对HMO的纯化，而无需任何另外的脱矿化，如离子交换步骤。

在优选的实施方案中，本发明的方法是用于改进中性或酸性人乳寡糖纯化的方法，更优选用于单独或组合地纯化2'-岩藻糖基乳糖、LNT和6'SL。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法用于纯化溶液，所述溶液包含一种或多种芳香族化合物代替寡糖、二糖或单糖，或除寡糖、二糖或单糖之外还包含一种或多种芳香族化合物。

优选地，本发明方法的纳滤步骤是以具有螺旋缠绕膜的错路纳滤进行。

一个实施方案涉及用于从溶解于进料溶液、特别是来自发酵或酶促过程的水性介质中的盐中分离寡糖和/或二糖的方法，所述方法包括：a)使所述进料溶液与具有分子量截止的纳滤膜接触，保证寡糖和二糖的保留，并允许至少一部分盐通过，其中膜是薄膜复合膜，其中所述膜的活性层(顶层)例如由聚酰胺组成，并且其中所述膜的NaCl保留小于30％、优选小于20％、更优选小于15％，并且甚至更优选小于10％；b)用所述膜进行随后任选的渗滤；和c)收集富集寡糖和/或二糖的渗余物。

总之，本发明包括以下实施方案，其中这些实施方案包括由其中定义的各个相互依赖性所指示的实施方案的特定组合。

另外的实施方案：

1、一种用于从包含生物质和一种或多种寡糖的溶液中纯化一种或多种寡糖的方法，所述方法包括以下的步骤：

i.提供包含生物质和一种或多种精细化学品，优选寡糖或芳香族化合物的溶液；

ii.通过向包含生物质和所述至少一种寡糖的所述溶液中添加至少一种酸，将所述溶液的pH值调至低于7，优选低于pH 5.5或更低；

iii.通过向包含生物质和精细化学品，优选寡糖或芳香族化合物的溶液中添加吸附剂，使所述溶液至少部分地脱色；

iv.任选地孵育步骤；

v.实施膜过滤，本文中也被称为所述第一膜过滤，并且通常是微滤或超滤，以便于从包含所述至少一种精细化学品(优选寡糖或芳香族化合物)的溶液中分离所述生物质；

vi.任选地用所述第一膜过滤的渗透物实施至少一个第二或另外的膜过滤，优选至少一个超滤；

vii.任选地实施脱色步骤；

viii.用该步骤viii之前的所述膜过滤的渗透物，用所述第一或所述第二或任何另外的膜过滤的渗透物，实施纳滤；

ix.任选地实施脱色步骤；

x.任选地用先前的纳滤步骤viii中所述纳滤的渗余物进行第二纳滤，其中所用的纳滤膜与先前纳滤步骤中的膜不同；

xi.任选地用与先前的纳滤步骤中的膜不同的膜进行第三或另外的纳滤。

2、根据实施方案1所述的方法，其中在步骤xi后，优选地以此顺序进行通过以下步骤中的任一个进一步加工所述先前的纳滤步骤的渗余物：

a.实施脱色步骤；和/或

b.实施脱矿化步骤，更优选地阳离子交换和/或阴离子交换；和/或

c.实施电渗析和/或反渗透和/或浓缩步骤和/或脱色步骤；和/或

d.实施模拟移动床色谱，和/或产生固体精细化学品(优选寡糖或芳香族化合物产品)的固化步骤，优选精细化学品(优选寡糖或芳香族化合物)的结晶步骤和/或喷雾干燥，随后根据需要进行干燥。

3、根据实施方案2所述的方法，其中在步骤viii、x和xi中一个或多个纳滤的最后一个之后进行脱矿化步骤，其中通过离子交换进行脱矿化，并且其中与没有步骤viii、x和xi的一个或多个纳滤的离子交换步骤的生产量相比，所述脱矿化步骤的另外的生产量优选增加了至少2，更优选2.5、3.0、3.5、4.0、4.25或4.5或更高的倍数。

4、一种用于对溶液脱矿化的方法，所述溶液包含一种或多种寡糖、优选一种或多种HMO，其中所述方法包括以下的步骤：

a.提供所述包含一种或多种寡糖的溶液；

b.向所述包含至少一种寡糖的溶液中添加至少一种酸，由此优选地将pH调节至低于7的所需值，优选低于pH 5.5或更低；

c.优选的脱色步骤，优选地通过添加吸附剂(优选活性炭)进行；

d.任选的孵育步骤；

e.实施第一膜过滤，并且优选是微滤或超滤；

f.对所述第一膜过滤的渗透物进行第二膜过滤；

g.对所述第二膜过滤的渗透物进行任选的脱色步骤，优选地通过添加吸附剂进行；

h.第一纳滤步骤，包含：浓缩的子步骤和/或渗滤的子步骤，优选浓缩的子步骤和渗滤的子步骤，更优选浓缩的第一子步骤、随后是渗滤的第二子步骤。

5、根据实施方案4所述的方法，其中进行步骤h)的浓缩子步骤，使得所述浓缩倍数为至少3，优选至少3.5至10，并且更优选10或更高。

6、根据实施方案4或5所述的方法，其中进行步骤h)的渗滤子步骤，使得渗滤因数为大约3。

7、如实施方案4至6中任一项所述的方法，其中与在脱矿化之前未用一个或多个纳滤步骤处理的溶液或除根据步骤e和任选地步骤f的纳滤之外通过其他方法脱矿化的溶液相比，实施包含一种或多种寡糖的溶液的脱矿化提高了至少150％、更优选至少200％、甚至更优选至少300％。

8、如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述纳滤膜具有在5％和30％之间、优选在5％和20％之间、更优选在5％和15％之间、并且甚至更优选地在5％和10％之间的膜的NaCl保留。

9、根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中将溶液的pH值降低至在3.0至5.5的范围内、优选3.5至5的范围内、并且更优选4.0至4.5范围内的pH值。

10、根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述至少一种酸是选自下组中的酸：H₂SO₄、H₃PO₄、HCl、HNO₃和CH₃CO₂H。

11、根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中将所述吸附剂、优选活性炭按重量计以0.5％至3％范围内，优选按重量计在0.75％至2.5％的范围内，并且更优选地按重量计在1.0％至2.0％的范围内的量添加。

12、根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中将所述吸附剂、优选活性炭作为具有如下粒度分布的粉末添加，所述粒度分布具有在2μm至25μm的范围内、优选地在3μm至20μm的范围内、并且更优选地在3μm至7μm或10μm至15μm的范围内的直径d50。

13、根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一膜过滤作为错流微滤或错流超滤实施。

14、根据实施方案13所述的方法，其中所述错流微滤或错流超滤包括在0.5m/s至6.0m/s的范围内、优选在2.0m/s至5.5m/s的范围内、并且更优选地在3.0m/s至4.5m/s的范围内的错流速度。

15、根据实施方案14所述的方法，其中所述错流速度等于或低于3m/s，并且优选地对于聚合物膜等于或低于1.7m/s。

16、根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一膜过滤是在8℃至55℃的范围内、优选地在10℃至50℃的范围内、并且更优选地在30℃至40℃的范围内的溶液温度下实施。

17、根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一膜过滤通过陶瓷微滤膜或超滤膜实施，所述膜具有在20nm至800nm的范围内、优选地在40nm至500nm的范围内、并且更优选地在50nm至200nm的范围内的孔径，或其中所述第一膜过滤通过具有等于或大于10kDa、优选等于或大于50kDa的截止的聚合物超滤膜或具有100nm或更小孔径的聚合物微滤膜实施。

18、根据前述实施方案中任一项所述的方法，所述方法进一步包括用包含通过所述第一膜过滤获得的寡糖的溶液实施第二膜过滤，优选用具有与所述第一膜过滤的膜相比更低截止的膜进行超滤。

19、根据实施方案18所述的方法，其中所述第二膜过滤是超滤，并且通过超滤膜实施，所述超滤膜具有在1kDa至10kDa的范围内、优选地在2kDa至10kDa的范围内、并且更优选地在4kDa至5kDa的范围内的截止。

20、根据实施方案18或19中任一项所述的方法，其中所述第二膜过滤在5℃至15℃的范围内、优选地在8℃至13℃的范围内、并且更优选地在8℃至12℃的范围内的溶液温度下实施。

21、根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述至少一种寡糖包括人乳寡糖，优选2'-岩藻糖基乳糖、6'-唾液酸基乳糖和/或乳-N-四糖，更优选2'-岩藻糖基乳糖。

实施方案22：一种用于从溶解于进料溶液、特别是在来自发酵或酶促过程的水性介质中的盐中分离寡糖和/或二糖的方法，所述方法包括：

i.使所述进料溶液与具有分子量截止的纳滤膜接触，保证寡糖和二糖的保留，并允许至少一部分盐通过，其中所述膜的NaCl保留小于30％、优选小于20％；

ii.用所述膜进行随后的任选的渗滤，以及

iii.收集富集寡糖和/或二糖的渗余物。

实施方案23：根据实施方案22中任一项所述的方法，其中所述膜的顶层由聚酰胺组成。

实施方案24：根据实施方案23中任一项所述的方法，其中所述聚酰胺纳滤膜是薄膜复合(TFC)膜。

实施方案25：根据实施方案22至24中任一项所述的方法，其中所述膜的纯水通量为至少3L/(m².h.bar)。

实施方案26：根据实施方案22至25中任一项所述的方法，其中所述聚酰胺纳滤膜是基于哌嗪的聚酰胺膜。

实施方案27：根据实施方案22中任一项所述的方法，其中所述活性层是聚电解质多层。

实施方案28：根据实施方案22至27中任一项所述的方法，其中所述三聚寡糖或更高的寡糖在其结构中包含所述二糖。

实施方案29：根据实施方案22至28中任一项所述的方法，其中所述二糖是乳糖。

实施方案30：根据实施方案28所述的方法，其中所述三聚寡糖或更高的寡糖是人乳寡糖(HMO)，优选三糖至八糖HMO。

实施方案31：根据实施方案30所述的方法，其中所述HMO是中性的HMO。

实施方案32：根据实施方案31所述的方法，其中所述中性的HMO是岩藻糖化的HMO，优选2'-FL、3-FL、DFL或LNFP-I。

实施方案33：根据实施方案31所述的方法，其中所述中性的HMO是非岩藻糖化的HMO，优选乳-N-丙糖II、LNT、LNnT、pLNnH或pLNH II。

实施方案34：根据实施方案30所述的方法，其中所述HMO是唾液酸化的HMO，优选3'-SL或6'-SL。

实施方案35：根据实施方案30至34中任一项所述的方法，其中所述HMO是通过发酵或酶解从作为前体的乳糖产生的。

附图说明

图1显示了根据本发明从包含例如生物质和至少一种精细化学品的溶液中纯化一种或多种精细化学品的方法的框图。虚线轮廓表示任选的部分，而虚线轮廓表示在根据权利要求1的脱矿化情况下任选的但在其他情况下非任选的。S10表示提供包含精细化学品(优选HMO或芳香族化合物)的溶液；S12将pH值调节至所需pH，优选低于pH 7；S14是脱色步骤；S15是用吸附剂进行的任选的孵育步骤；S16是第一膜过滤(MF)步骤；S18是第二膜过滤步骤；S20是脱色步骤；S22是第一纳滤(NF)步骤；S24是第二纳滤步骤；S26是任选的脱矿化步骤，通常显示为离子交换步骤(IEX)；Decol.；Conc.；ED；RO表示以任何顺序的任选的脱色、浓缩、电渗析和/或反渗透步骤；SMB是模拟移动床色谱的缩写；固化表示如果需要产生精细化学品固体颗粒的步骤，一些应用可能替代地更优选所述精细化学品是在经纯化的溶液中。Perm.代表渗透物；Ret.代表渗余物；Reg.代表离子交换剂的再生；FT代表主要包含所需的一种或多种精细化学品的离子交换剂的流通。

图2显示用于纯化寡糖或其他精细化学品的更优选的方法的框图。缩写、描述和步骤如图1所示，具有以下变化：S10是提供包含精细化学品(优选寡糖和生物质)、呈发酵液形式的溶液。第一膜过滤S16在第一膜过滤的三个子步骤(S16/1至S16/3)中示出，所述三个子步骤是第一渗滤DF、浓缩C、以及然后可选的第二渗滤。第二膜过滤S18优选地是超滤(UF)；步骤22更详细地显示为纳滤的第一浓缩子步骤(S22/1)，随后是渗滤模式的第二子步骤(S22/2)。离子交换的脱矿化步骤显示在两个子步骤中，第一(S26/1)中使用阳离子交换剂树脂(CIEX)，优选强的，以及随后的子步骤S26/2使用阴离子交换树脂(AIEX)，优选弱的；随后在优选的方法中进行步骤S26，不需要进一

脱色。

图3显示了使用螺旋缠绕膜元件测试纳滤的单元的示意性设置。该单元配有两台泵，一台用于进料压力，而另一台用于产生所需的错流。

图4显示了用于从发酵液中纯化精细化学品的另一种优选方法的框图。在提供发酵液S10后，其以与图1中相同的方式连续进行，但不再包括脱矿化步骤S26，因为生物质分离和去除离子的纳滤的组合已产生适合使用或如图4中所示的任选的进一步加工步骤的纯化溶液。

图5显示了从包含所述精细化学品的溶液中快速纯化精细化学品(如寡糖)的另一种优选方法的框图，其中所述方法开始于将pH调节至低于7的所需值的任选的步骤，然后是本文分别描述为S22和S24的第一膜过滤步骤和任选的第二膜过滤步骤，以及对纯化溶液的任选的进一步加工步骤。

实施例

下面将进一步详细描述根据本发明的方法。无论如何，这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。

分析方法：

已经实施了以下分析方法。

-HPLC，用于测定产品，即人乳寡糖、二糖、单糖和次级组分；

-干燥平衡，用于测量干含量；

-APHA，使用标准方法，例如DIN EN ISO 6271，用于测量颜色；

-Bradford蛋白质测定，用于测量蛋白质浓缩。

缩写和符号：

在下文中，使用以下缩写：

-AC＝活性炭

-UF＝超滤

-NF＝纳滤

-DP＝沿模块的压力降(p_进料–p_渗余物)

-错流速率＝膜通道中悬浮液的线性速度(m/s)

-膜加载＝由1m²膜面积产生的渗透物的量(m³/m²)

此外，对于液体分离，使用以下符号和解释。

通过以下计算特定化合物i的保留：

即，一减去渗透物中组分i的浓度与渗余物中组分i的浓度的比率。

当混合物渗滤时，根据以下关系组分i的浓度C随渗滤因数DF呈指数下降：

其中C_i ⁰是化合物I在时间0处的浓度。

初始纯化步骤-脱色、去除生物质和初始膜过滤：

通过标准方法制备了作为包含生物质和至少一种寡糖的复合溶液的发酵液。通过添加10％的硫酸的方式，其pH值已降至4±0.1。此后，按每2.5kg复合溶液添加约100g或更多的食品安全的活性炭Carbopal Gn-P-F 30％悬浮液(Donau Carbon GmbH,Gwinnerstrasse 27-33,60388Frankfurt am Main,Germany)，然后搅拌20min。

将这样制备的溶液供应到工艺设备，其是来自Sartorius AG,Otto-Brenner-Str.20,37079Goettingen,Germany的半自动MF实验室装置，为此目的进行了改进，并用封闭渗透物以循环加热方式加热至37℃。出于分离目的，工艺设备包括具有外径为10mm、内径为6mm、长度为1.2m的陶瓷单通道元件(来自Atech Innovations GmbH,Gladbeck,Germany)以及由Al₂O₃制成的具有孔径为50nm的膜。一旦溶液的循环运行，且溶液达到37℃的目标温度，就开始排放渗透物，并启动对跨膜压力的控制。

在本发明方法终止后，工艺设备已停止，浓缩物已处置，并且工艺设备已经清洁。已经通过在50℃至80℃温度下的0.5％至1％ NaOH实施清洁，其中NaOH随后通过吹扫去除。

i)使用尤其含有2-岩藻糖基乳糖(2-FL)的发酵液，仅进行DF＝1的第一渗滤步骤和CF＝2的浓缩步骤，各自通过50nm Al₂O₃膜(可购自Atech Innovations GmbH,Germany)，并且温度为40℃下，跨膜压(TMP)为1.2bar，且错流速率为4m/s。然后，停止第一膜过滤，分析所得溶液和剩余的起始溶液，并比较结果。

表A显示了取决于pH值和活性炭的分析结果。DC是干含量的缩写。OD表示光密度。

表A：

从表A可得出以下结果：

向发酵液中添加1％的活性炭会降低渗透物的色值。在pH值为7时，1％的活性炭使色值降低约65％。在pH值为4时，1％的活性炭使色值降低约84％。因此，色值低于1000的上限，并且不需要进一步的脱色。在pH值为7时添加活性炭可将渗透物中的蛋白质浓度降低约40％，而在pH值为4时通过添加活性炭在这方面的影响不能超过pH对蛋白质浓度的影响。然而，如果与pH值为7且添加1％活性炭的渗透物中的蛋白质浓度相比，在pH值为4时且添加1％的活性炭的渗液物中的蛋白浓度小了4倍。在两个pH值下的渗透物内，添加活性炭对寡糖3.2-二-岩藻糖基乳糖(3.2-二-Fl)、2'岩藻糖基乳果糖(2F-乳果糖)和2'-岩藻糖基乳糖(2FL)的浓度没有显著影响。因此可以得出这些组分不以显著的量粘附到活性碳上。在本实验中，当使用活性炭时，二糖乳糖显示浓度略有降低。然而，降低的pH和活性碳的有益效果允许本发明方法应用于这种二糖。

ii)用包含6'-唾液酸基乳糖或乳糖-N-四糖的标准方法生产的若干批次的发酵液已经经过本发明的方法处理。降低pH值和用吸附剂脱色是第一步骤。

首先，进行步骤S10至S18。包含乳-N-四糖的发酵液，从高浓度的导致发酵液中APHA值为7000或更高的颜色组分开始，在第一膜过滤后得到渗透物，其中通过50nm Al₂O₃膜(可购自Atech Innovations GmbH,Germany)并且温度为40℃，跨膜压(TMP)为1.2bar，以及错流速率为4m/s，该渗透物的APHA值为低于1000，但通常低于300。蛋白质浓度通常从大约3g/l降至低于0.01g/l。最初在发酵液中存在的绝大多数(通常超过95％)的乳-N-四糖存在于合并的渗透物中。类似地，对于存在的其他寡糖以及对于二糖乳糖，大多数存在于合并的渗透物中，而在第一次膜过滤结束时的渗余物中仅发现少量。应用的DF值低于或等于3.5。对于6-SL和LNT，首先使用渗滤因数为3的设置，然后使用浓缩倍数为2的设置被证明是有用的。

此外，在所述第一膜过滤之后，含有6'-唾液酸基乳糖且APHA值为大约7000的发酵液产生APHA值低于300的渗透物。在DF值低于3时，与发酵液中的起始值相比，蛋白质浓度降低了至少10或更多倍，甚至超过100倍。最初在发酵液中存在的绝大多数(通常超过90％)的6'-唾液酸基乳糖存在于合并的渗透物中。类似地，对于存在的其他寡糖以及对于二糖乳糖，大多数存在于合并的渗透物中，而在第一膜过滤结束时的渗余物中仅发现少量。

还发现，与较高的pH值(错流速度3.5m/s、温度30℃；DF＝3)相比，在pH值低于5.5的情况下进行该方法可改善第一膜过滤的通量。当包含生物质和6'-唾液酸基乳糖的溶液的pH值为pH 4.2时，这一点进一步改善。与pH 6.3相比，当使用pH 5.2时，通量为二倍以上，而当pH值为pH 4.2时，通量为三倍以上。

将第一膜过滤的合并渗透物进行超滤作为第二膜过滤。对于6'-SL和LNT二者，4kDa PES聚合物膜(50nm)UH004(MICRODYN-NADIR GmbH,Kasteler Strasse 45,

D512,65203Wiesbaden/Germany)给出具有高性能且几乎没有任何污染的良好性能。对于6'-SL，用10％至20％硫酸或磷酸将发酵液的pH调至pH 4，其中混合1.4％(w/w)活性炭，并在30℃-37℃、速率3.5m/s、DF1＝3至3.5下进行第一膜过滤，随后在该第一膜过滤时CF＝2，具有产率≥95％。然后作为第二膜过滤，在8℃-12℃和10bar下，用4kDa PES膜进行超滤，错流速率为1.5m/s，其中CF1>10(高达20)，随后DF≥3；总产率为95％。

对于LNT，用10％至20％的硫酸或磷酸将发酵液的pH调至pH 4，其中混合1.0％(w/w)活性炭，并且搅拌50分钟，然后用Al₂O₃膜(50nm)进行第一膜过滤，膜在30℃-37℃，以3.5m/s和DF为3进行，随后CF为2；产率为>97％。接下来的第二膜过滤是类似于在8℃-12℃和10bar下对于6'SL的超滤，其中浓缩因数高达80，并且随后的DF＝3；总产率超过99％。

所得渗透物在第一纳滤中使用之前冷藏储存，或如果储存更长时间，则在第一纳滤之前冻融并搅动。

纳滤：

用不同的寡糖测试许多纳滤膜。

表1:对所使用的膜和供应商的截止和/或保留指示的概述

大多数经测试的膜都显示出寡糖和经常还有乳糖的良好保留。然而，测试也表明，一些膜不适合让盐和其他离子(如磷酸)通过。其他(如UA60或XN45或AS3014)显示了令人鼓舞的结果，表明可以实现寡糖与离子(如磷酸)的分离。根据寡糖和设置，在渗余物中分别发现小于8％、小于27％或小于52％的磷酸。

TS80膜显示对LNT的非常高的保留。在使用相同设置的实验中，从提供发酵液开始到使用超滤的渗透物进行纳滤作为第二膜过滤，但使用来自产生中性HMO 2'-岩藻糖基乳糖的细菌菌株的发酵液，TS80膜显示对于较小的2'-FL分子的保留值>99％。然而，TS80还显示磷酸同样的强保留。

仅对中空纤维dNF 40(上表中未显示)进行了6'-SL测试，并显示该HMO的保留为99.1％，而在该测试中仅保留了62.6％的磷酸。

螺旋缠绕元件：

与例如使用平板膜的实验相比，纳滤膜的螺旋缠绕元件允许对大规模加工的更好的可扩展性。

实验在带有螺旋缠绕元件的错流设置中进行，参见表2。称为002和003的前两个实验使用UA60膜进行浓缩，其中CF为10，并且在实验003对于渗滤的情况下，其中DF为2.9。洗涤表明，去离子水以与渗透物去除量相同的量连续添加至渗余物。实验006和007与实验002和003相似，但在较低的浓缩因数下检查膜的性能。

表2：对带有螺旋缠绕元件的LNT实验的概述

表3给出了通过纳滤步骤进行的纯化的概述。根据LNT、乳糖和磷酸的产品保留量(HPLC分析)进行纯化，因为这些参数可以根据其他浓缩或渗滤因数进行缩放。

表3：膜保留和电导率变化的概述

¹R表明对渗余物的计算；P表明对渗透物的计算

²进料→最终的浓缩物(即，渗滤后，当可使用时)

如在表3中可以看出，UA60膜对LNT的保留通常很高(基于渗透物，对于所有数据的测量值均>98.5％，在许多情况下测量值>99％)。同时，记录了乳糖保留率为75％-95％，洗涤导致较低的乳糖保留。准确值根据本试验中应用的条件而变化。对于磷酸，测量在15％-25％范围内的非常低保留。这些数据对应于测试单元中的测量值，其中记录了类似的值。

与这些实验的进料相比，实验的最终渗余物的产率概述如下：

实验表明，使用UA60膜，渗余物中LNT的产率良好。渗余物中的乳糖产量几乎一样高，但磷酸盐大部分被渗透物去除。如果使用浓缩和渗滤模式，LNT的总产率也很好，但相比之下，乳糖产率要低得多。因此，通过选择纳滤的设置，可以引导LNT和乳糖是否都被保留，或与LNT相比，HMO是否被优选地保留并且减少乳糖。在这种类型的纳滤中，磷酸盐的去除效果甚至更好，并且在渗余物中只发现了极少量的磷酸盐。

选择实验002和003用于纳滤步骤后的脱矿化。

对于6'-SL，用平板膜测试：

用不同pH的UF渗透物进行了三次测试单元实验。所有实验运行DF＝3的渗滤，然后进行CF＝10的浓缩步骤。该序列未完全优化，但应显示出使用纳滤去除盐和潜在较小分子的潜力。当采用更高的渗滤因数时，可能达到更高的去除率。

表4呈现了对结果的概述。与进料pH无关，所有实验都成功地将乙酸去除到检测限以下。在所有测量的pH值下，渗余物中相对于6SL的磷酸盐水平显著降低，并且在pH 5.56时，渗余物中磷酸盐的绝对减少也具有显著意义。

最有趣的去除之一是去除乳糖，因为这可以显著减轻下游结晶或SMB步骤。在pH4.4和5.56的实验中，约一半的乳糖通过当前的运行方法被去除。使用更高的渗滤因数，可以预期会去除更多的乳糖。在pH为6.25时，去除了令人惊讶的大量的乳糖。这里，在渗滤后，乳糖与6'-SL的比率为0.30，在浓缩步骤后仅转为0.16，乳糖被强烈去除。更重要的是，如果采用更高的渗滤因数，则可以获得甚至更低的乳糖量。因此，如果需要，S10至S22的过程可用于纯化HMO，同时由于其在发酵中的作用而减少存在的乳糖量。

表4：用具有不同pH的UF渗透物进行的3个测试单元实验的概述。所有实验运行DF＝3的渗滤，然后进行CF＝10的浓缩步骤

¹–未检测的

错流纳滤实验使用包含6'-SL的发酵液和通过其步骤S10至S18制备的溶液，其中使用具有高达12.6的CF、28-30bar的TMP，且随后2.25的DF、再次28-30bar的TMP下的纳滤进行。结果表明，在步骤S22的纳滤与浓缩以及随后的渗滤步骤中，实现了168g/l 6'-SL的浓缩，而诸如氯化物、硫酸盐、单价磷酸盐和磷酸盐的离子在最终的渗余物中均低于0.002wt％。这证明了包括步骤S10至S22的方法作为一种改进方法的潜力，所述方法将允许纯化和浓缩6'-SL和其他唾液酸化的HMOS以及其他HMO，而不再需要脱矿化步骤。如果需要，乳糖也可以通过该工艺保留，在最终的渗余物中，乳糖水平约为6'-Sl水平的一半(以g/l表示)。

对于下表B中的实验A至D，使用尤其含有2-岩藻糖基乳糖(2-FL)的发酵液。首先，从发酵液中除去生物质，然后将其调至给定的pH，并且在实验A和D的情况下，用活性炭(AC)处理。随后，使用具有截止为0.4kDa的纳滤膜AMS AS-3014(可购自AMS TechnologiesLtd.,Israel)对发酵液进行浓缩。在实验C的情况下，使用所述膜对实验A中获得的浓缩物渗滤。

表B：纳滤实验

在用于纳滤的进料和由纳滤产生的浓缩物中，通过HPLC分析了若干组分的浓度，如可以在下表C中看出：

表C：分析结果。值是以g/l表示的浓度.

n.a.＝不可用

在浓缩或渗滤后，从2-FL分别与磷酸、甲酸或乙酸的比率增加可以清楚地看出，纳滤导致相应脱质子化酸的去除，证实了发酵液的有效脱矿化。

离子交换实验：

在实验柱(内径20mm)中进行的脱矿化实验

对于脱矿化程序的初始测试，设置两个双夹套玻璃柱(内径20mm，高度1000mm)，并分别填充约0.28L Dowex Monosphere 88H和0.24L Dowex Monosphere 77。

使用表5中所示的条件实施脱矿化实验，其中在阴离子交换之前进行阳离子交换。预冲洗、加载、产品置换和冲洗后步骤用串联的柱实施，首先用阳离子交换剂，然后用阴离子交换剂。将用于进料和流出溶液的柱和容器冷却至约10℃。以逆流模式对每个柱单独地进行再生和随后的冲洗。树脂在首次使用前进行再生，以确保它们处于完全再生状态。

在实验过程中，收集并分析级分以监控过程。

表5：在20mm实验柱中进行的脱矿化实验的条件

LNT样品的脱矿化：

选择Dowex Monosphere 88H和Dowex Monosphere 77，因为它们在之前已经用于寡糖。它们的特性显示在表6中。供应商最近重新命名了这些产品，并且它们现在分别作为AmberLite FPC88 UPS H和AmberLite FPA77 UPS出售。

表6：用于脱矿化的离子交换剂的特征

对UF渗透物(即，第二膜过滤步骤S18的渗透物)的样品以及从用纳滤的两种不同的方法(步骤S22)处理的UF渗透物获得的NF渗余物的样品进行分析。来自实验002和003(参见上文)的最终渗余物用于离子交换实验。

表7中总结了脱矿化实验的结果。如从表中可以看出，在纳滤中，相对于产品的盐的量显著减少，并且用额外的洗涤可以甚至进一步减少。

表7：在用或不用额外洗涤的情况下UF渗透物和NF渗余物的特性

将对照样品(在超滤后不进行纳滤处理作为第二膜过滤)用作进料。将进料以相对于阳离子交换剂0.8BV/h的流速加载到离子交换柱上，直到流出物中电导率达到50μS/cm。这在大约18BV之后发生，然而在16BV之后已经观察到颜色的突破。在整个过程中，流出物的电导率大约为15μS/cm，表明离子的少量泄漏。因此，流出物的pH为微碱性，因为盐泄漏导致少量氢氧根离子从阴离子交换剂中排出。这种泄漏的原因尚不清楚，但可能是混合物中的其他成分可以与一些离子形成复合物。观察到阴离子交换剂在加载期间膨胀约5％，并且阳离子交换收缩百分之几。

在再生后，使用与对照样品相同的柱，以0.8BV/h的流速将经洗涤的NF渗余物(来自上述实验003)脱矿化。在该实验中，来自实验003的预定量的溶液进料通过柱，10BV。

LNT的洗脱比对照样品更早完成。对于对照样品，在6.2BV之后，颜色的突破稍早，并且与先前的对照样品一样，在运行期间也观察到少量离子泄漏。此外，在这种情况下，观察到阴离子交换剂在加载过程中膨胀约5％，并且阳离子交换收缩百分之几。

将每个脱矿化实验的无色级分按实验合并。然后分析对照样品的组合级分和来自实验003的纳滤样品的组合组分。结果(参见表8)表明，相对于精细化学品LNT，用纳滤和洗涤进行的预处理导致了更低的离子残留水平。

表8：对脱矿化产品的分析

观察到，当在脱矿化步骤中使用具有减少盐量的NF渗余物时，生产量要高得多，每循环多167％的LNT，其中循环时间减少了近60％，即总改善了约350％。因此，当使用包括洗涤样品的纳滤步骤时，与在作为第二膜过滤的超滤之后未经历任何纳滤的对照样品的脱矿化的生产量相比，脱矿化步骤中所需精细化学品的生产量提高了约4.5倍。如实验所示，脱矿化的效率也没有受到影响，并且与未经NF处理的对照样品相比，当经洗涤的NF渗余物脱矿化时，相对于精细化学品LNT获得的残留离子更少。

观察到，单独的浓缩步骤(实验002)基本上不会改变离子浓度；然而，由于LNT浓度增加了8.3倍，离子与LNT的相对浓度显著降低(参见表7)。对于实验003，超渗滤步骤导致离子浓度强烈降低，尤其是单价K⁺和H₂PO₄ ^-的浓度。二价SO₄ ^2-离子的减少程度较小，并且二价Mg²⁺仅减少至很小的程度。

如所证明的，离子交换前的纳滤可用于从溶液中除去几乎所有的磷酸和部分乳糖，或优选除去离子，但不除去乳糖或LNT。此外，根据浓缩步骤结束时的流速，发酵液可以浓缩至少10倍，可能更高。目前采用的浓缩倍数为10，随后是渗滤因数为3，可去除约65％的乳糖和>95％的磷酸。使用较高的渗滤因数，本领域技术人员可以实现较高的乳糖去除率。

脱矿化实验结果的总结：

已发现在脱矿化前实施NF具有以下若干优点：

在离子交换期间的生产量显著提高，高达350％；

如果需要，可以在纳滤过程中部分去除乳糖，这也证明了产品LNT的纯化得到了改善；

当采用纳滤时，发现脱矿化后相对于产品的残留盐更少。

总之，本发明中脱色、生物质去除、通过纳滤纯化和离子交换相结合的方法在资源和设备上被证明是非常有效的，同时能够快速回收许多精细化学品，诸如不同的HMO类型。

引用文献：

-WO 2015/032412

-EP 2 379 708

-CN 100 549 019&CN 101 003 823

-WO 2017/205705

-EP 2 896 628

-US 9 944 965

-WO 2019/003133

-WO2015106943

Claims (17)

1.一种用于对溶液脱矿化的方法，所述溶液包含一种或多种精细化学品，优选一种或多种寡糖，更优选一种或多种HMO，其中所述方法包括以下的步骤：

a.提供包含一种或多种寡糖的所述溶液；

b.任选地通过向包含至少一种寡糖的所述溶液中添加至少一种酸将pH调节至低于7的所需值，优选低于pH 5.5或更低；

c.任选的脱色步骤，优选地通过添加吸附剂，优选活性炭进行；

d.任选的孵育步骤；

e.实施第一膜过滤，并且优选是微滤或超滤；

f.对所述第一膜过滤的渗透物进行第二膜过滤；

g.任选地对所述第二膜过滤的渗透物进行脱色步骤，优选地通过添加吸附剂进行；

h.第一纳滤步骤；具有浓缩子步骤和/或渗滤子步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中进行所述步骤b)和c)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中不实施阳离子交换或阴离子交换。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在步骤h)中，实施浓缩子步骤和渗滤子步骤，优选第一子步骤浓缩、随后第二子步骤渗滤。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中进行步骤h)的所述浓缩子步骤，使得所述浓缩倍数为至少3，优选至少3.5至10，更优选10或更高。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中进行步骤h)的所述渗滤子步骤，使得所述渗滤因数为2.5至3.5，优选2.8至3.2。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述纳滤膜具有5％至30％的NaCl保留。

8.一种用于从溶液中纯化一种或多种精细化学品，优选一种或多种寡糖的方法，所述溶液包含生物质和一种或多种寡糖，所述方法包括以下的步骤：

i.提供包含生物质和一种或多种寡糖的溶液；

ii.通过向包含生物质和所述至少一种寡糖的所述溶液中添加至少一种酸，将所述溶液的pH值调至低于7，优选低于pH 5.5或更低；

iii.通过向包含生物质和一种或多种寡糖的所述溶液中添加吸附剂，使所述溶液至少部分地脱色；

iv.任选地实施孵育步骤；

v.实施膜过滤，本文中也被称为第一膜过滤，并且通常是微滤或超滤，以从包含所述一种或多种寡糖的所述溶液中分离所述生物质；

vi.任选地用所述第一膜过滤的渗透物实施至少一个第二或另外的膜过滤，优选至少一个超滤；

vii.任选地实施脱色步骤；

viii.用该步骤viii之前的所述膜过滤的渗透物，用所述第一或所述第二或任何另外的膜过滤的渗透物，实施纳滤；

ix.任选地实施脱色步骤；

x.任选地用先前的纳滤步骤viii中所述纳滤的渗余物进行第二纳滤，其中所用的纳滤膜与先前纳滤步骤中的膜不同；

xi.任选地用与先前的纳滤步骤中的膜不同的膜进行第三或另外的纳滤。

9.根据权利要求8所述的方法，其中在步骤xi后，优选地以此顺序进行通过以下步骤中的任一个进一步加工所述先前的纳滤步骤的渗余物：

a.实施脱色步骤；和/或

b.实施脱矿化步骤，更优选地实施阳离子交换和/或阴离子交换；和/或

c.实施电渗析和/或反渗透和/或浓缩步骤和/或脱色步骤；和/或

d.实施模拟移动床色谱，和/或产生固体寡糖产物的固化步骤，优选结晶步骤和/或寡糖的喷雾干燥，随后任选地进行干燥。

10.根据权利要求9所述的方法，其中在步骤viii、x和xi中一个或多个纳滤的最后一个之后进行脱矿化步骤，其中通过离子交换进行实施脱矿化，并且其中另外与没有之前的步骤viii、x和xi的一个或多个纳滤的相同离子交换步骤的生产量相比，所述脱矿化步骤的生产量优选增加了至少2倍，更优选2.5、3.0、3.5、4.0、4.25或4.5或更高的倍数。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述溶液的pH值降低至pH值为3.0至5.5，优选为3.5至5，并且更优选为4.0至4.5。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述吸附剂、优选活性炭以0.5重量％至3重量％，优选以0.75重量％至2.5重量％，并且更优选地以1.0重量％至2.0重量％的量添加。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一膜过滤作为错流微滤或错流超滤实施。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一膜过滤在处于8℃至55℃、优选10℃至50℃、并且更优选30℃至40℃的溶液温度下实施。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括用包含通过所述第一膜过滤获得的寡糖的溶液实施第二膜过滤，优选用具有与所述第一膜过滤的膜相比更低截止的膜进行超滤。

16.根据权利要求14或15中任一项所述的方法，其中所述第二膜过滤在处于5℃至15℃、优选8℃至13℃、并且更优选8℃至12℃的溶液温度下实施。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种寡糖包括人乳寡糖，优选2'-岩藻糖基乳糖、6'-唾液酸基乳糖和/或乳-N-四糖，更优选2'-岩藻糖基乳糖。

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