CN117480001A

CN117480001A - 从发酵液中分离人乳寡糖

Info

Publication number: CN117480001A
Application number: CN202280042213.3A
Authority: CN
Inventors: N·汉任; P·沙萨捏
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2021-06-15
Filing date: 2022-06-14
Publication date: 2024-01-30

Abstract

本发明涉及一种从发酵液中回收和纯化人乳寡糖(HMO)的方法，包括以下步骤：分离发酵液以形成分离的含HMO流和生物质废物流，纯化分离的含HMO流，浓缩纯化的含HMO流，以及干燥纯化的含HMO流以获得固化的HMO。此外，本发明还涉及通过本发明方法获得的人乳寡糖，及其在食品、饲料和医疗应用中的用途。

Description

从发酵液中分离人乳寡糖

技术领域

本发明涉及从生产人乳寡糖(HMO)的反应混合物中分开(separation)和分离(isolation)它们。

背景技术

在过去的几十年里，人们对人乳寡糖(HMO)的制备和商业化的兴趣一直在稳步增加。HMO的重要性与其独特的生物活性直接相关，因此HMO已成为营养和治疗用途的重要潜在产品。因此，人们寻求低成本的工业HMO生产方法。

迄今为止，已经确定了140多种HMO的结构，母乳中可能存在更多HMO(Urashima等人:Milkoligosaccharides,Nova Biomedical Books,2011；ChenAdv.Carbohydr.Chem.Biochem.72,113(2015))。HMO在还原端包含乳糖(Galβ1-4Glc)部分，并且可以用N-乙酰基葡糖胺、或一个或多个N-乙酰基乳糖胺部分(Galβ1-4GlcNAc)和/或乳-N-二糖部分(Galβ1-3GlcNAc)拉长。乳糖和N-乙酰基乳糖胺基化或乳-N-二糖基化乳糖衍生物可以进一步用一个或多个岩藻糖和/或唾液酸残基取代，或者乳糖可以用另外的半乳糖取代，以得到迄今已知的HMO。

由于HMO在许多人类生物过程中的作用，在过去十年中，开发合成HMO(包括唾液酸化HMO)的方法的努力显著增加。在这方面，已经开发了通过微生物发酵、酶法、化学合成或这些技术的组合来生产它们的方法。

HMO，特别是作为三糖的HMO的直接发酵生产最近变得可行(Han等人.Biotechnol.Adv.30,1268(2012)和其中引用的参考文献)。这种发酵技术已经使用了重组大肠杆菌系统，其中源自病毒或细菌的一种或多种类型的糖基转移酶已经被共表达以糖基化外源添加的乳糖，该乳糖已经被大肠杆菌的LacY渗透酶内化。然而，使用重组糖基转移酶，特别是一系列重组糖基转换酶来生产四个或更多单糖单元的寡糖，总是导致副产物的形成，从而在发酵液中产生寡糖的复杂混合物。此外，发酵液不可避免地含有广泛的非寡糖物质，例如细胞、细胞碎片、蛋白质、蛋白质碎片、DNA、DNA碎片、内毒素、焦糖化副产物、矿物质、盐或其他带电分子。因此，从复杂基质(如发酵液)中分离中性或唾液酸化HMO是一项具有挑战性的任务。

为了从碳水化合物副产物和其他污染组分中分离HMO，已经提出将活性碳(activecarbon)处理与凝胶过滤色谱相结合作为一种选择的方法(WO 01/04341，EP-A-2479263，Dumon等人,Glycoconj.J.18,465(2001)，Priem等人,Glycobiology 12,235(2002)，Drouillard等人,Angew.Chem.Int.Ed.45,1778(2006)，Gebus等人,Carbohydr.Res.361,83(2012)，等人,ChemBioChem 15,1896(2014))。尽管凝胶过滤色谱法是一种方便的实验室规模的方法，但它不能有效地扩大规模用于工业生产。

EP-A-2896628描述了一种从通过微生物发酵获得的发酵液中纯化2’-FL的方法，该方法包括以下步骤：超滤、强阳离子交换树脂色谱(H⁺-形式)、中和、强阴离子交换树脂色谱(乙酸盐形式)、中和、活性碳处理、电渗析、第二强阳离子交换树脂色谱(H⁺-或Na⁺-形式)，第二强阴离子交换树脂色谱(Cl^--形式)、第二活性碳处理，任选的第二电渗析和无菌过滤。这种纯化方法本质上局限于中性人乳寡糖。

WO 2017/182965和WO 2017/221208公开了一种从发酵液中纯化LNT或LNnT的方法，包括超滤、纳滤、活性碳处理和用强阳离子交换树脂(H⁺-形式)然后用弱阴离子交换树脂(碱形式)处理。

WO 2015/188834和WO 2016/095924公开了从纯化的发酵液中结晶2’-FL，纯化包括超滤、纳滤、活性碳处理和用强阳离子交换树脂(H⁺-形式)然后用弱碱性树脂(碱形式)处理。

其他现有技术文献已经公开了针对低乳糖或无乳糖发酵液而详细阐述的纯化方法。根据这些程序，在中性HMO的发酵生产过程中过量添加的乳糖在发酵完成后通过β-半乳糖苷酶的作用被原位水解，从而形成基本上不含残留乳糖的发酵液。因此，WO 2012/112777公开了一系列纯化2’-FL的步骤，包括离心、在碳上捕获寡糖，然后在离子交换介质上洗脱和快速色谱。WO 2015/106943公开了2’-FL的纯化，包括超滤、强阳离子交换树脂色谱(H⁺-形式)、中和、强阴离子交换树脂色谱(Cl^--形式)、中和、纳滤/渗滤、活性碳处理、电渗析、任选的第二强阳离子交换树脂色谱(Na⁺-形式)、第二强阴离子交换树脂色谱(Cl^--形式)、第二活性碳处理，任选的第二电渗析和无菌过滤。WO 2019/063757公开了一种纯化中性HMO的方法，包括从发酵液中分离生物质并用阳离子交换材料、阴离子交换材料和阳离子交换吸附树脂处理。

Antoine等人,Angew.Chem.Int.Ed.44,1350(2005)和US 2007/0020736公开了通过基因修饰的大肠杆菌生产3’-SL和伴随的二唾液酸化和三唾液酸化乳糖；对含有约0.8mM3’-SL的发酵液进行如下处理：将产物从离心上清液中吸附在炭/硅藻土上，用蒸馏水洗去水溶性盐，用梯度含水乙醇洗脱化合物，在Biogel柱上分离唾液酸化产物并脱盐，从1升发酵液中得到49mg 3’-SL。WO 01/04341和Priem等人,Glycobiology 12,235(2002)公开了通过基因修饰的大肠杆菌生产3’-SL；3’-SL通过以下操作顺序分离：生产细胞的热透化，然后离心，将产物从上清液中吸附在炭/硅藻土上，用蒸馏水洗去水溶性盐，用梯度含水乙醇洗脱化合物，将化合物与HCO₃ ^--形式的强阴离子交换剂结合，用线性梯度NaHCO₃溶液洗脱化合物，然后用阳离子交换剂(H⁺-形式)除去碳酸氢钠，得到分离的3’-SL，纯化产率为49％。WO2007/101862和Fierfort等人,J.Biotechnol.134,261(2008)公开了一种3’-SL发酵液的替代处理程序，该程序包括以下步骤：生产细胞的热透化，离心，通过添加酸形式的强阳离子交换树脂将细胞外pH调节至3.0，通过离心去除沉淀的蛋白质，通过添加碱形式的弱阴离子交换剂将上清液的pH调节至6.0，将唾液酸基乳糖与HCO₃ ^--形式的阴离子交换剂结合，在用蒸馏水洗涤后，用连续梯度的NaHCO₃溶液洗脱化合物，用阳离子交换剂(H⁺-形式)除去碳酸氢钠，直到pH达到3.0，然后用NaOH将pH调节至6.0。上述纯化允许从1升含有25.5克3’-SL的发酵液中分离出15克3’-SL。Drouillard等人,Carbohydr.Res.345,1394(2010))将Fierfort的上述程序应用于含有6’-SL(11g/l)和一些6,6’-二唾液酸基乳糖(DSL)的发酵液，从而以155/86的比例分离出3.34g 6’-SL+DSL。

WO 2006/034225描述了两种可供选择的从生产发酵液中纯化3’-SL的方法。根据第一种方法，用蒸馏水稀释来自培养物的裂解物，并用活性炭(active charcoal)/硅藻土搅拌。用水洗涤浆液，然后用含水乙醇从炭/硅藻土中洗脱产物。根据第二种方法，对培养细胞进行热处理，并通过离心从上清液中分离沉淀的固体。通过微过滤器处理所得上清液，使渗透物通过10kDa膜，然后进行纳滤。然后将得到的截留物渗滤以收集最终样品。两种纯化方法都从1升发酵液中提供90-100mg 3’-SL。

Gilbert等人,NatureBiotechnol.16,769(1998)和WO 99/31224公开了使用CMP-Neu5Ac合成酶/α-2,3-唾液酸转移酶融合蛋白提取物从乳糖、唾液酸、磷酸烯醇式丙酮酸、ATP和CMP开始的3’-SL的酶促生产。通过超滤(3000MWCO)、C18反相色谱、在pH＝3和pH＝7的纳滤/渗滤、用强阳离子交换(H⁺)树脂酸化、用NaOH溶液中和和活性炭脱色的顺序纯化产物。

WO 2009/113861公开了一种从脱脂且不含蛋白质的奶流中分离唾液酸基乳糖的方法，包括：使所述奶流与游离碱形式且具有30-48％水分含量的第一阴离子交换树脂接触，使得带负电荷的矿物质结合到树脂上，且唾液酸基乳糖不结合，然后用游离碱形式的第二阴离子交换树脂处理，该树脂是大孔树脂或凝胶型树脂，并且具有在50％和70％之间的水分含量，使得唾液酸基乳糖结合到树脂上。在该方法中，含有唾液酸基乳糖的流被相当稀释(几百ppm的浓度)，并且从第一树脂中唾液酸基乳糖的回收是有限的。

WO 2017/152918公开了一种从发酵液中获得唾液酸化寡糖的方法，其中所述唾液酸化寡糖通过培养能够从内化的碳水化合物前体产生所述唾液酸化寡糖的遗传修饰微生物来产生，包括以下步骤：

i)超滤(UF)，

ii)纳滤(NF)，

iii)任选的活性炭处理，以及

iv)用强阴离子交换树脂和/或阳离子交换树脂处理发酵液。

EP-A-3456836公开了一种从水性介质中分离唾液酸化寡糖的方法，该方法包括用至少两种类型的离子交换树脂处理含有所述唾液酸化寡糖的水溶液，一种是Cl^--形式的强阴离子交换树脂，另一种是强阳离子交换树脂。

WO 2019/043029公开了一种纯化通过微生物发酵或体外生物催化产生的唾液酸化寡糖的方法，该方法包括以下步骤：

i)从发酵液中分离生物质，

ii)从发酵液或反应混合物中去除阳离子，

iii)从发酵液或反应混合物中去除阴离子杂质，以及

iv)从发酵液或反应混合物中去除分子量低于待纯化唾液酸化寡糖分子量的化合物。

WO 2019/229118公开了一种从其他碳水化合物中纯化唾液酸基乳糖的方法，该唾液酸基乳糖通过发酵产生，包括：

a)用超滤分离细胞块，

b)对滤液进行强阳离子离子交换剂处理，然后进行强阴离子离子交换剂(Cl--形式)处理，

c)第一纳滤，

d)第二纳滤，

e)电渗析，

f)反渗透，

g)活性炭处理，

h)无菌过滤，以及

i)喷雾干燥。

然而，需要从生产中性或唾液酸化HMO的发酵液的非碳水化合物组分中分离和纯化中性或唾液酸化HMO的替代和/或改进的方法，特别是那些适合工业规模的方法，以提高中性或唾液酸化HMO的回收率和/或简化现有技术的方法，同时至少保持并优选提高中性或唾液酸化HMO纯度。此外，这种可替代的纯化方法优选产生纯化的中性或唾液酸化HMO，其不含源自所用重组微生物菌株的蛋白质和重组材料，因此非常适合用于食品、医疗食品和饲料应用。

发明内容

本发明涉及一种从发酵液中回收和纯化中性或唾液酸化人乳寡糖(HMO)的方法，包括以下步骤：

a.分离发酵液以形成分离的含HMO流和生物质废物流；

b.通过纳滤纯化分离的含HMO流；

c.浓缩纯化的含HMO流；和

d.干燥纯化的含HMO流以获得固化的HMO。

在另一个方面，本发明涉及通过根据本发明的方法获得的中性或唾液酸化人乳寡糖。

本发明的另一个方面涉及通过根据本发明的方法获得的中性或唾液酸化人乳寡糖用于医药。

本发明的另一个方面涉及通过根据本发明的方法获得的中性或唾液酸化人乳寡糖用于食品和/或饲料应用的用途。

本发明的另一个方面涉及食品或化妆品，其包含通过根据本发明的方法获得的用于医药的中性或唾液酸化人乳寡糖。

具体实施方式

1.术语和定义

本说明书中使用的术语“发酵液”是指通过微生物发酵获得的产物。因此，发酵产物包括细胞(生物质)、发酵培养基、盐、残余基质材料和发酵过程中产生的任何分子/副产物，例如所需的中性或唾液酸化HMO。在纯化方法的每个步骤之后，去除发酵产物的一种或多种组分，得到更多的中性或唾液酸化纯化的HMO。

术语“单糖”是指具有5-9个碳原子的糖，其为醛糖(例如D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖等)、酮糖(例如D-果糖、D-山梨糖、D-塔格糖等)、脱氧糖(例如L-鼠李糖、L-岩藻糖等)、脱氧氨基糖(例如N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基甘露糖胺、N-乙酰基半乳糖胺等)、糖醛酸、酮糖酸(例如唾液酸)或等效物。

术语“二糖”是指由两个单糖单元通过糖苷间键连接而成的碳水化合物。

术语“三-或更高的寡糖”是指由至少三个，优选三到八个，更优选三到六个单糖单元组成的糖聚合物(见上文)。寡糖可以具有含有单糖单元的线性或支链结构，单糖单元通过糖苷间键相互连接。

术语“人乳寡糖”或“HMO”是指在人母乳中发现的一种复杂碳水化合物(Urashima等人.:Milk Oligosaccharides,NovaMedical Books,NY,2011；ChenAdv.Carbohydr.Chem.Biochem.72,113(2015))。HMO的核心结构在还原端是乳糖单元，其i)被β-N-乙酰基-葡糖胺基或ii)被一个或多个β-N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个或多个β-乳-N-二糖基单元拉长，并且该核心结构可被α-L-岩藻吡喃糖基和/或α-N-乙酰基-神经氨酰(唾液酸)部分取代。在这方面，非酸性(或中性)HMO缺乏唾液酸残基，并且酸性HMO在其结构中具有至少一个唾液酸残基。非酸性(或中性)HMO可以是岩藻糖基化的或非岩藻糖基化的。这种中性非岩藻糖基化HMO的实例包括乳-N-三糖II(LNTri，GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc)、乳-N-四糖(LNT)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-新六糖(LNnH)、对-乳-N-新六糖(pLNnH)、对-乳-N-六糖(pLNH)和乳-N-六糖(LNH)。中性岩藻糖基化HMO的实例包括2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、乳-N-岩藻五糖I(LNFP-I)、乳-N-二岩藻六糖I(LNDFH-I)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、二岩藻糖基乳糖(DFL)、乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II)、乳-N-岩藻五糖III(LNFP-III)、乳-N-二岩藻六糖III(LNDFH-III)、岩藻糖基-乳-N-六糖II(FLNH-II)、乳-N-岩藻五糖V(LNFP-V)、乳-N-二岩藻六糖II(LNDFH-II)、岩藻糖基-乳-N-六糖I(FLNH-I)、岩藻糖基-对-乳-N-六糖I(FpLNH-I)、岩藻糖基-对-乳-N-新六糖II(F-pLNnH II)和岩藻糖基-乳-N-新六糖(FLNnH)。酸性HMO的实例包括3’-唾液酸基乳糖(3’-SL)、6’-唾液酸基乳糖(6’-SL)、3-岩藻糖基-3’-唾液酸基乳糖(FSL)、LST a、岩藻糖基-LST a(FLST a)、LST b、岩藻糖基-LSTb(FLSTb)、LST c、岩藻糖基-LST c(FLST c)、唾液酸基-LNH(SLNH)、唾液酸基-乳-N-六糖(SLNH)、唾液酸基-乳-N-新六糖I(SLNH-I)、唾液酸基-乳-N-新六糖II(SLNH-II)和二唾液酸基-乳-N-四糖(DSLNT)。

术语“唾液酸基”或“唾液酸基部分”是指唾液酸(N-乙酰-神经氨酸，Neu5Ac)的糖基残基，优选用α-键连接：

术语“岩藻糖基”是指L-岩藻吡喃糖基，优选用α-糖苷间键连接：

“N-乙酰基-葡糖胺基”是指N-乙酰基-2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖基(GlcNAc)，优选用β-键连接：

“N-乙酰基-乳糖胺基”是指N-乙酰乳糖胺(LacNAc，Galpβ1-4GlcNAc)的糖基残基，优选用β-键连接：

此外，术语“乳-N-二糖基”是指乳-N-二糖(LNB，Galpβ1-3GlcNAc)的糖基残基，优选用β-键连接：

在发酵的背景下，术语“生物质”是指源自发酵细胞的悬浮、沉淀或不溶性物质，如完整细胞、破碎细胞、细胞碎片、蛋白质、蛋白质碎片、多糖。

术语“Brix”是指白利度，即水溶液中的糖含量(100g溶液中的糖g)。在这方面，本申请的人乳寡糖溶液的Brix是指溶液的总碳水化合物含量，包括人乳寡糖及其伴随的碳水化合物。Brix是用经过校准的折射计测量的。

“去矿化(Demineralization)”优选是指从液体中去除矿物质或矿物盐的过程。在本发明的上下文中，去矿化可以在纳滤步骤中发生，特别是当它与渗滤结合时，或者通过使用阳离子和阴离子交换树脂(如果适用)。

术语“不含蛋白质的水性培养基”优选地是指来自提供中性或唾液酸化HMO的发酵或酶促过程的水性培养基或培养液，其已被处理以去除基本上所有的蛋白质以及肽、肽碎片、RNA和DNA，以及可能干扰从发酵液或酶促过程混合物中最终纯化一种或多种中性或唾液酸化HMO和/或它们的一种或多种组分，特别是它们的混合物的内毒素和糖脂。

术语“含HMO流”优选是指含有从发酵过程中获得的中性或唾液酸化HMO的水性培养基，该培养基已经过处理去除过程中的悬浮颗粒和污染物，特别是可能干扰一种或多种中性或唾液酸化HMO和/或一种或多种HMO组分、特别是它们的混合物的最终纯化的细胞、细胞组分、不溶性代谢产物和碎屑。

术语“生物质废物流”优选指发酵过程中的悬浮颗粒和污染物，特别是细胞、细胞组分、不溶性代谢产物和碎屑。

盐的截留因子(以百分比计)计算为(1-κ_p/κ_r)·100，其中κ_p是渗透物中盐的电导率，κ_r是截留物中盐的电导率。

碳水化合物的截留因子(百分比)计算为(1-C_p/C_r)·100，其中C_p是渗透物中碳水化合物的浓度，C_r是截留物中碳水化合物的浓度。

术语“截留分子量或MWCO”是指膜制造商在膜说明书列表中提供的膜描述符，作为表征膜孔径的一种方式。根据定义，MWCO意味着在给定条件(如温度、横流、跨膜压力TMP等)下，对于制造商使用的分子量等于MWCO的标准溶质之一的截留因子为90％。本领域技术人员众所周知，MWCO是许多膜描述符之一，其只能提供特定溶质截留行为的粗略估计。

术语“渗滤”是指在膜过滤过程中添加溶剂(水)。如果在超滤过程中应用渗滤，则可提高渗透物中所需HMO的产率。如果在纳滤过程中应用渗滤，它可以改善小尺寸杂质和盐与渗透物的分离。溶质产率以及因此的产物富集度可以基于本领域技术人员已知的基于截留因子和相对添加水量的公式来计算。

根据本发明的方法的步骤c)中使用的术语“浓缩”是指去除液体，主要是水，从而在纯化的含中性或唾液酸化HMO的产物流中产生更高浓度的中性或唾液酸化HMO。

2.从发酵液中纯化中性或唾液酸化人乳寡糖的方法

a.分离发酵液以形成分离的含HMO流和生物质废物流；

b.通过纳滤纯化分离的含HMO流；

c.任选地浓缩纯化的含HMO流；和

d.干燥所述纯化的含HMO流以获得固化的HMO。

优选地，步骤b)中的纳滤膜具有500-3000Da的截留分子量(MWCO)，所述膜的活性层由聚酰胺组成，并且其MgSO₄截留率为约50-90％。

同样优选地，该方法不包含离子交换树脂处理和/或电渗析。特别优选该方法不包含离子交换树脂处理和/或电渗析，并且步骤b)中的纳滤膜具有500-3000Da的截留分子量(MWCO)，所述膜的活性层由聚酰胺组成，并且其MgSO₄截留率为约50-90％。

在另一个优选实施方式中，根据本发明的方法由步骤a)-d)组成。

在另一个优选实施方式中，离子交换树脂处理和/或电渗析被排除在本发明的方法之外。

在另一个优选实施方式中，方法步骤a)-d)按如上所述的连续顺序a)-d)进行。

发酵液

在一个实施方式中，存在于发酵液中的中性或唾液酸化人乳寡糖是通过培养能够从内化的碳水化合物前体产生所述中性或唾液酸化人乳寡糖的遗传修饰微生物而获得的。微生物有机体是遗传修饰的细菌或酵母，例如大肠杆菌属(E.coli)菌株、芽孢杆菌属(Bacillus)菌株、酵母属(Saccharomyces)菌株、假丝酵母属(Candida)菌株、汉逊酵母属(Hansenula)菌株、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)菌株、毕赤酵母属(Pichia)菌株、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)菌株、施旺酵母属(Schwanniomyces)菌株、有孢圆酵母属(Torulaspora)菌株、亚罗酵母属(Yarrowia)菌株或接合酵母属(Zygosaccharomyces)菌株。优选地，所述酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、柄毕赤酵母(Pichia stipites)、博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、西方施旺酵母(Schwannomyces occidentalis)、德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)；并且芽孢杆菌是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

在一个实施方式中，存在于发酵液中的至少一种中性或唾液酸化人乳寡糖不是通过微生物发酵获得，而是在通过非微生物方法(例如化学和/或酶促合成)生产后例如添加到发酵液中。

在一个实施方式中，发酵液中中性或唾液酸化HMO的纯度≤70％，优选≤60％，更优选≤50％，最优选≤40％。

优选地，所述HMO是中性HMO。在一个实施方式中，中性HMO优选选自2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2’,3-二岩藻糖基乳糖、乳-N-三糖II、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-新岩藻五糖V(又名：乳-N-岩藻五糖VI)、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、乳-N-二岩藻六糖III、6’-半乳糖基乳糖、3’-半乳糖基乳糖、乳-N-六糖、乳-N-新六糖、及其任何混合物。更优选地，HMO是2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2’,3-二岩藻糖基乳糖、乳-N-三糖II、乳-N-四糖、乳-N-新四糖或乳-N-岩藻五糖，更优选2’-岩藻糖基乳糖、LNT、LNnT或乳-N-岩藻五糖。

在一个实施方式中，唾液酸化HMO选自3’-唾液酸基乳糖(3’-SL)和6’-唾液酸基乳糖(6’-SL)。

在一个实施方式中，发酵液中的中性或唾液酸化HMO是单一的HMO。

在一个实施方式中，发酵液中的HMO是各种单独的HMO的混合物。

在一个实施方式中，HMO是两种单独的HMO的混合物。在另一个实施方式中，HMO是三种单独的HMO的混合物。在另一个实施方式中，HMO是四种单独的HMO的混合物。在另一个实施方式中，HMO是五种单独的HMO的混合物。

在一个实施方式中，发酵液中的中性或唾液酸化HMO是通过微生物发酵获得的中性或唾液酸化HMO和未通过微生物发酵但例如通过化学和/或酶促合成获得的HMO的混合物。

在根据本发明的方法的步骤a)中分离发酵液以形成分离的含中性或唾液酸化HMO 流和生物质废物流

在根据本发明的方法的步骤a)中，将含中性或唾液酸化HMO流与生物质废物流分离。

除了所需的中性或唾液酸化HMO外，发酵液通常还含有所用微生物的细胞生物质以及蛋白质、蛋白质碎片、肽、DNA、RNA、内毒素、生物胺、氨基酸、有机酸、无机盐、未反应的碳水化合物受体如乳糖、类糖副产物、单糖、着色体等。在根据本发明的方法的步骤a)中，将生物质与中性或唾液酸化HMO分离。

在优选的实施方式中，在步骤a)中通过微滤将生物质与中性或唾液酸化HMO分离。微滤步骤是将生物质和优选地还有高分子量组分和悬浮固体与发酵液的低分子量可溶性组分(其通过微滤膜到渗透物中)分离。该微滤渗透物是含有中性或唾液酸化人乳寡糖(也称为含HMO流)的水溶液，而微滤截留物包括生物质废物流。可以使用孔径在0.1至10μm范围内的任何传统微滤膜。根据本发明的方法的步骤a)可以包括使用具有不同孔径的膜的多于一个的微滤步骤，例如应用两个微滤分离，其中第一膜的孔径比第二膜的孔径大。这种布置可以提供发酵液的高分子量组分的更好的分离功效。在该分离步骤之后，渗透物包含目的中性或唾液酸化人乳寡糖。

在优选的实施方式中，在步骤a)中通过超滤将生物质与中性或唾液酸化HMO分离。超滤步骤是将生物质和优选地还有高分子量组分和悬浮固体与发酵液的低分子量可溶性组分(其通过超滤膜到渗透物中)分离。该超滤渗透物是含有中性或唾液酸化人乳寡糖(也称为含HMO流)的水溶液，而超滤截留物包括生物质废物流。

可以使用任何常规超滤膜，其截留分子量(MWCO)为高于10kDa而低于500kDa，例如10-50kDa、50-100kDa、100-250kDa、300-400kDa或任何其他合适的子范围。膜材料可以是陶瓷或由合成或天然聚合物制成，例如聚砜、聚偏二氟乙烯、聚丙烯腈、聚丙烯、纤维素、乙酸纤维素或聚乳酸。超滤步骤可以应用于死端或错流模式。根据本发明的方法的步骤a)可以包括使用如上所定义的具有不同MWCO的膜的不止一个的超滤步骤，例如应用两个超滤分离，其中第一膜具有比第二膜更高的MWCO。这种布置可以提供发酵液的高分子量组分的更好的分离效果。在该分离步骤之后，渗透物包含分子量低于第二膜的MWCO的材料，包括目的中性或唾液酸化人乳寡糖。

在另一个实施方式中，在根据本发明的方法的步骤a)中，对从发酵获得的发酵液进行离心以将生物质与中性或唾液酸化HMO(含HMO流)分离。在所述实施方式中，上清液代表含HMO流，而剩余材料，即“生物质废物流”可以分离出来。通过离心，可以获得包含中性或唾液酸化HMO的澄清上清液，其代表含HMO流。

离心可以是实验室规模的，或者有利地，相对于以前的离心方法，可以是商业规模的(例如工业规模、全生产规模)。

在一些实施方式中，可以使用多步骤离心。例如，可以执行一系列的2、3、4、5、6、7、8、9或10个离心步骤。在其他实施方式中，离心可以是单个步骤。离心可以快速去除生物质。

在某些实施方式中，可以使用Flottweg设计和制造的离心机。

离心机的特定类型不是限制性的，可以使用许多类型的离心机。离心可以是一个连续的过程。在一些实施方式中，离心可以添加进料。例如，离心可以具有连续的进料添加。在某些实施方式中，离心可以包括固体去除，例如湿固体去除。湿固体去除在一些实施方式中可以是连续的，而在其他实施方式中是周期性的。

例如，可以使用锥形板离心机(例如盘式碗式离心机或盘式堆叠分离器)。锥形板离心机可用于从液体中去除固体(通常是杂质)，或通过高离心力将两个液相彼此分离。受到这些力的密度较大的固体或液体向外朝向旋转的碗壁移动，而密度较小的流体则朝向中心移动。特殊的板(称为盘式堆叠)增加了表面沉降面积，从而加快了分离过程。根据存在的进料类型，不同的堆叠设计、布置和形状用于不同的工艺。然后，根据锥形板离心机的设计，可以连续、手动或间歇地去除浓缩的密度较大的固体或液体。这种离心机非常适合于澄清悬浮固体比例较小的液体。

离心机利用斜板沉降器原理进行工作。安装一组相对于水平面倾斜角度为θ的平行板，以缩小颗粒沉降的距离。倾斜角度的原因是允许板上沉降的固体在离心力的作用下向下滑动，这样它们就不会积聚并堵塞相邻板之间形成的通道。

这种类型的离心机可以有不同的设计，如喷嘴型、手动清洁、自清洁和密封型。特定的离心机不受限制。

影响离心机的因素包括圆盘角度、重力的影响、圆盘间距、进料固体、排放锥角、排放频率和液体排放。

或者，也可以使用固体碗式离心机(例如卧螺离心机(decanter centrifuge))。这是一种使用沉淀原理的离心机。离心机用于利用连续旋转产生的离心力分离由两种密度不同的物质组成的混合物。它通常用于分离固-液、液-液和固-固混合物。工业用固体碗式离心机的一个优点是与其他类型的离心机相比安装简单。固体碗式离心机有三种设计类型，分别是锥形(conical)、圆柱形(cylindrical)和锥形-圆柱形(conical-cylindrical)。

固体碗式离心机可以具有许多不同的设计，其中任何一种都可以用于所公开的方法。例如，可以使用锥形固体碗离心机、圆柱形固体碗离心机和锥形-圆柱形碗离心机。

离心可以以多种速度和停留时间进行。例如，离心可以在20000g、15000g、10000g或5000g的相对离心力(RCF)下进行。在一些实施方式中，离心可以在小于20000g、15000g、10000g或5000g的相对离心力(RCF)下进行。在一些实施方式中，离心可以在大于20000g、15000g、10000g或5000g的相对离心力(RCF)下进行。

在一些实施方式中，离心可以通过工作体积来表征。在一些实施方式中，工作体积可以是1、5、10、15、20、50、100、300或500l。在一些实施方式中，工作体积可以小于1、5、10、15、20、50、100、300或5001。在一些实施方式中，工作体积可以大于1、5、10、15、20、50、100、300或5001。

在一些实施方式中，离心可以通过进料流速来表征。在一些实施方式中，进料流速可以是100、500、1000、1500、2000、5000、10000、20000、40000或100000l/hr。在一些实施方式中，进料流速可以大于100、500、1000、1500、2000、5000、10000、20000、40000或100000l/hr。在一些实施方式中，进料流速可以小于100、500、1000、1500、2000、5000、10000、20000、40000或100000l/hr。

离心所花费的时间(例如停留时间)也可以变化。例如，停留时间可以是0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟。在一些实施方式中，停留时间可以大于0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟。在一些实施方式中，停留时间可以小于0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟。

上述上清液性质中的任何一种都可以通过单次离心产生。或者，它可以通过多次离心产生。

鉴于上述情况，根据本发明的方法的步骤a)可以通过如上定义的微滤、如上定义的超滤或离心进行，或者通过以下的组合进行：超滤和离心、微滤和超滤、微滤和离心、微滤和超滤以及离心。优选地，方法步骤a)通过如上定义的超滤进行，以获得与生物质废物流分离的含HMO流。

在优选的实施方式中，在步骤a)中进行的微滤、超滤或离心步骤或其任何组合之后，渗透物/上清液中所需中性或唾液酸化HMO的产率大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％。

在超滤和/或微滤和/或离心步骤之前，可以对发酵液进行预处理步骤。发酵液的预处理可以包括pH调节、和/或稀释和/或热处理。在某些实施方式中，可以进行pH调节、稀释和热处理这所有三种操作。在替代实施方式中，可以进行pH调节和稀释。在替代实施方式中，可以进行pH调节和热处理。在替代实施方式中，可以进行热处理和稀释。有利地，多种预处理方法的组合可以提供在单独的预处理中没有的改进的协同效应。

在某些实施方式中，上述预处理步骤中的一个或多个可以在步骤a)中通过如上所定义的离心和/或超滤和/或微滤去除生物质的过程中进行。例如，在多步骤离心中的步骤之间，或者离心容器能够在离心期间加热发酵液。

有利地，预处理可以将发酵液中固体颗粒(生物质)的沉降速度提高100至20000倍，使得通过离心分离生物质的效率高得多，因此可应用于工业规模。除了沉降速度外，由于预处理，至少三个其他参数也得到了显著改善，即含HMO流中中性或唾液酸化HMO产量提高，上清液中蛋白质和DNA含量降低，以及进一步残余悬浮固体含量可以显著降低。

在步骤b)中通过纳滤纯化分离的含中性或唾液酸化HMO流

在根据本发明的方法的步骤b)中，含中性或唾液酸化HMO流通过纳滤纯化。

纳滤(NF)可用于去除小于所需中性或唾液酸化HMO的低分子量分子，如单糖和二糖、短肽、小有机酸、水和盐。

产物流，即含中性或唾液酸化HMO流，是NF截留物。因此，纳滤膜具有确保目的中性或唾液酸化人乳寡糖的截留的MWCO或孔径，即，相应地调节纳滤膜的MWCO。

通常，纳滤膜的孔径为0.5nm至2nm和/或150道尔顿(Da)的截留分子量(MWCO)至3000Da的MWCO。

在一个实施方式中，膜在150-300Da MWCO的范围内，其被定义为“紧密”NF膜。

在优选实施方式中，膜高于300DaMWCO，并且优选不高于3000Da MWCO。在所述实施方式中，膜被认为是“松散”NF膜。

在另一个优选实施方式中，“松散”纳滤膜具有500-3000Da的截留分子量(MWCO)，并且膜的活性(顶)层优选由聚酰胺，更优选哌嗪基聚酰胺组成。因此，确保了三-或更高寡糖的截留，并且允许至少一部分二糖通过膜。在该实施方式中，所应用的纳滤膜对于三寡糖和更高寡糖应是紧密的，以便有效地保留它们。同时，膜对MgSO₄应相对松散，其截留率约为50-90％，以便二糖能够通过膜。通过这种方式，可以从中性或唾液酸化的人乳寡糖产物中分离例如乳糖，其是例如通过发酵制备人乳寡糖的前体，具有良好的功效，此外，相当一部分二价离子也进入渗透物。在一些实施方式中，MgSO₄截留因子为60-90％、70-90％、50-80％、50-70％、60-70％或70-80％。优选地，所述膜上的MgSO₄截留因子为80-90％。优选地，膜对NaCl的截留因子低于对MgSO₄的截留因子。在一个实施方式中，NaCl的截留因子不超过50％。在另一个实施方式中，NaCl的截留因子不超过40％。在另一个实施方式中，NaCl的截留因子不超过30％。在后一个实施方式中，截留物中所有单价盐的显著减少也是可以实现的。在所述实施方式中，所述膜是薄膜复合物(TFC)膜。合适的哌嗪基聚酰胺TFC膜的例子是合适的NF膜的其他实例包括SynderNFG(600-800Da)、SynderNDX(500-700Da)和/>(500Da)。

优选地，在纳滤步骤之后，截留物中所需的中性或唾液酸化HMO的产率大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％。

在优选实施方式中，步骤b)还包括渗滤步骤，即以渗滤模式进行的纳滤步骤。优选地，渗滤步骤遵循上述(常规进行的)纳滤步骤。

渗滤是一种在膜过滤过程中向溶液中加入纯化水以更有效地去除膜可渗透成分的过程。因此，渗滤可用于基于组分的性质，特别是分子大小、电荷或极性，通过使用合适的膜来分离组分，其中一种或多种物质被有效地保留，而其他物质是膜可渗透的。

在一个优选的实施方式中，渗滤和纳滤在一个步骤(称为纳滤/渗滤或NF/DF)内结合，在该步骤中，在使用对从中性或唾液酸化HMO分离低分子量化合物和/或盐有效的纳滤膜的同时执行渗滤。如上所述，使用“松散”NF膜的渗滤对于从中性或唾液酸化HMO中去除一价盐和二价盐以及去除二糖都特别有效。

在优选实施方式中，进行DF步骤或NF/DF步骤，使得pH设定为低于5.0，优选低于4.5，有利地低于4.0，但优选不低于3.0。在这种条件下，由单价阳离子如钠盐(即钠离子与共阴离子(co-anion))组成的盐被有效去除，产生低盐或实际上无盐的纯化溶液，该溶液在截留物中含有中性或唾液酸化HMO。

在一个实施方式中，第二纳滤步骤在根据本发明的方法中进行，从而将其包括在步骤b)中。在所述第二纳滤步骤中，纳滤膜或是“松散”NF膜，或是“紧密”NF膜。第二任选的纳滤步骤在第一纳滤步骤(步骤b)之后进行，但优选在根据本发明的方法的步骤c)之前进行。

同样地，第二渗滤可在根据本发明的方法中进行。该第二任选的渗滤步骤也可以与第二纳滤步骤结合。当如上所述施用“松散”NF膜时，进行该第二NF/DF步骤，使得pH设定为低于5.0，优选低于4.5，有利地低于4.0，但优选不低于3.0。

在一个实施方式中，在根据本发明的方法的步骤b)之后获得的纯化溶液含有纯度≥80％、优选≥85％、更优选≥90％的中性或唾液酸化HMO。

在一个实施方式中，在根据本发明的方法的步骤b)之后获得的纯化溶液不含蛋白质和/或重组遗传物质。

在根据本发明的方法的步骤c)中浓缩纯化的含中性或唾液酸化HMO流

浓缩步骤用于使用例如蒸发、纳滤或反渗透过滤从含中性或唾液酸化HMO流中经济地去除大量液体，主要是水。蒸发过程可以包括例如降膜蒸发、升膜蒸发和旋转蒸发。蒸发也可以在真空下进行。进入该工艺的固体浓度优选约为5-30wt.％。从该过程排出的固体浓度通常大于30wt.％，优选大于50wt.％。更优选地，离开脱水操作的固体浓度为60-80wt.％。回收材料的固体部分优选为大于80wt.％的中性或唾液酸化HMO。

在一个实施方式中，将纯化的含中性或唾液酸化HMO流浓缩至≥100g/l的中性或唾液酸化HMO的浓度，优选≥200g/L，更优选≥300g/l。

当通过蒸发浓缩纯化的含中性或唾液酸化HMO流时，蒸发优选在约20℃至约80℃的温度下进行。在一些实施方式中，蒸发在25℃至75℃的温度下进行。在一些实施方式中，蒸发在30℃至70℃的温度下进行。在一些实施方式中，蒸发在30℃至65℃的温度下进行。优选地，蒸发在真空下进行。

当通过膜过滤浓缩纯化的含中性或唾液酸化HMO流时，任何膜，通常是纳滤膜，都适合充分截留中性或唾液酸化HMO。通过膜过滤浓缩通常提供约30-35wt％的HMO溶液。该浓度可以适合于进行随后的干燥固化步骤，例如冷冻干燥。然而，其他干燥方法可能需要更浓的溶液，例如喷雾干燥或结晶。在这种情况下，优选在真空下通过蒸发进行浓缩。或者，使用纳滤膜将在前一步骤中获得的含中性或唾液酸化HMO流浓缩至约30-35wt％，并通过蒸发进一步浓缩溶液。

在通过膜过滤浓缩的一个实施方式中，选择的膜是具有150-300Da MWCO的“紧密”NF。

在通过膜过滤浓缩的其他实施方式中，所选择的膜是具有500-3500Da的截留分子量(MWCO)和聚酰胺活性(顶)层的纳滤膜(“松散”NF膜)；并且进行浓缩步骤，使得pH设定为低于5.0，优选低于4.5，有利地低于4.0，但优选不低于3.0。在后一个实施方式中，截留物中所有单价盐的显著减少也是可以实现的。在所述实施方式中，膜优选为薄膜复合物(TFC)膜，其为哌嗪基聚酰胺膜，更优选其MgSO₄截留率为约50-90％，甚至更优选其NaCl截留率不超过50％。就是这种膜的一个例子。在这种条件下，剩余的盐也被有效地去除，产生低盐或实际上无盐的纯化的中性或唾液酸化HMO浓缩物。在该实施方式中，在完成浓缩步骤之后，在进行下一步骤(例如蒸发、干燥固化、无菌过滤)之前，将中性或唾液酸化HMO浓缩物的pH有利地设定在4-6之间。

当步骤d)是冷冻干燥时，浓缩步骤可以是任选的。

在步骤d)中干燥纯化的含中性或唾液酸化HMO流以获得固化的HMO

优选地，在根据方法步骤a)-c)的分离/纯化/浓缩步骤和任何一个下述任选方法步骤之后，通过干燥步骤(步骤d))以其固体形式提供目的中性或唾液酸化HMO。

在优选实施方式中，干燥步骤d)包括喷雾干燥含中性或唾液酸化HMO流，优选由喷雾干燥含中性或唾液酸化HMO流组成。

优选地，喷雾干燥导致具有无定形结构的固化的中性或唾液酸化HMO，即获得无定形粉末。

在一个实施方式中，喷雾干燥在20-60％(w/v)、优选30-50％(w/v)、更优选35-45％(w/v)的中性或唾液酸化HMO浓度和110-150℃、优选120-140℃、更优选125-135℃和/或60-80℃，优选65-70℃的出口温度下进行。

在一些实施方式中，送入喷雾干燥器的含中性或唾液酸化HMO流具有约8％至约75％Brix的Brix值。在一些实施方式中，Brix值为约30％至约65％Brix。在一些实施方式中，Brix值为约50％至约60％Brix。在一些实施方式中，进入喷雾干燥器的进料在即将在喷雾干燥器中分散成液滴之前处于约2℃至约70℃的温度。在一些实施方式中，进入喷雾干燥器的进料在即将在喷雾干燥器中分散成液滴之前处于约30℃至约60℃的温度。在一些实施方式中，进入喷雾干燥器的进料在即将在喷雾干燥器中分散成液滴之前处于约2℃至约30℃的温度。在一些实施方式中，喷雾干燥使用空气入口温度为120℃至280℃的空气。在一些实施方式中，空气入口温度为120℃至210℃。在一些实施方式中，空气入口温度为约130℃至约190℃。在一些实施方式中，空气入口温度为约135℃至约160℃。在一些实施方式中，喷雾干燥使用空气出口温度为约80℃至约110℃的空气。在一些实施方式中，空气出口温度为约100℃至约110℃。在一些实施方式中，喷雾干燥在约20℃至约90℃的温度下进行。在一些实施方式中，喷雾干燥器是并流喷雾干燥器。在一些实施方式中，喷雾干燥器附接到外部流化床。在一些实施方式中，喷雾干燥器包括转盘、高压喷嘴或二流体喷嘴。在一些实施方式中，喷雾干燥器包括雾化器轮。在一些实施方式中，喷雾干燥是所需中性或唾液酸化HMO的最终纯化步骤。

或者，干燥固化步骤包括间接干燥方法。为了本说明书的目的，间接干燥器包括那些不利用待干燥材料与加热的工艺气体直接接触进行干燥的装置，而是依赖于通过干燥器的壁的热传递，例如在滚筒干燥器的情况下通过壳体壁的热传递，或者交替地通过桨叶干燥器的中空桨叶的壁的热传递，当它们在固体中旋转时，传热介质在桨叶的中空内部循环。间接干燥器的其它实例包括接触式干燥器和真空滚筒干燥器。

或者，干燥固化步骤包括冷冻干燥。

或者，干燥固化步骤包括结晶(前提是HMO可以以结晶形式获得)。

任选步骤

在一个优选的实施方式中，根据本发明的方法还包括通过活性碳(activecarbon)处理进行纯化。

用活性碳处理代表脱色步骤(去除着色组分)和/或在中性固相上的色谱步骤，优选反相色谱以去除疏水性污染物。优选地，可以使用活性碳，例如Norit CA1活性碳。

活性碳处理可以用于去除着色剂，并且可以进一步减少水溶性污染物(例如盐)的量。此外，活性碳处理可用于去除可能存在于含HMO流中的蛋白质、DNA、RNA或内毒素。

因此，活性碳处理导致含HMO流中的着色剂和/或盐和/或蛋白质和/或DNA和/或RNA和/或内毒素的减少。

在某些条件下，中性或唾液酸化人乳寡糖不吸附或至少基本上不吸附到碳颗粒上，并且用水洗脱产生中性或唾液酸化人乳寡糖的水溶液，而其量没有显著损失，同时着色剂、蛋白质、DNA、RNA、内毒素等保持吸附。确定中性或唾液酸化人乳寡糖与水溶液中的碳结合的条件只是一个常规技能问题。

因此，进行任选的活性炭(active charcoal)处理步骤，使得中性或唾液酸化HMO不被或至少基本上不被活性碳吸附。在“基本上不被吸附”的情况下，可以理解，活性碳吸附了少于10％、优选少于5％、更优选少于1％的中性或唾液酸化HMO。在该方面中使用的活性碳的量相对于存在于含HMO流中的中性或唾液酸化HMO为＜100％，优选＜10％。这可以允许大多数中性或唾液酸化HMO通过，而残留的生物分子、有色化合物和其他疏水分子被活性碳保留。在一个实施方式中，所施加的活性碳的量为约2-6wt.％。这是经济的，因为用非常低的碳量可以方便地实现上面公开的所有益处。在另一个实施方式中，活性碳的添加量为0.25wt.％至3wt.％，优选0.5wt.％至2.5wt.％，更优选0.75wt.％至2.2wt.％，甚至更优选1.0wt.％至2.0wt.％，其中该百分比值基于经受活性碳处理步骤的含HMO流的总重量。这种相当少量的活性碳允许显著减少活性碳消耗以及显著减少产物损失(中性或唾液酸化HMO)。

在一个方面，活性碳处理可以通过在搅拌下向含HMO流中加入碳粉并滤出碳来进行。

在另一个方面，为了更大规模的纯化，优选将含有中性或唾液酸化人乳寡糖的水溶液(含HMO流)装载到填充有碳的柱中，所述碳可以是颗粒状碳或可以任选地与惰性助滤剂混合，然后用所需的洗脱液洗涤所述柱。收集含有中性或唾液酸化人乳寡糖的级分。

在一个实施方式中，所使用的活性碳是颗粒状的。这确保了在不施加高压的情况下方便的流速。

在一个实施方式中，优选包括活性碳色谱的活性碳处理在升高的温度下进行。在高温下，着色剂、残留蛋白质等与碳颗粒的结合在较短的接触时间内发生，因此可以方便地提高流速。此外，在升高的温度下进行的活性碳处理显著减少了含HMO流中的活微生物的总数(微生物总数)。升高的温度可以至少为30-35℃，例如至少40℃、至少50℃、约40-50℃或约60℃。

在一个实施方式中，活性碳以具有直径d50在2μm至25μm范围内，优选在3μm至20μm范围内，更优选在3μm至7μm范围内，甚至更优选在5μm至7μm范围内的粒度分布的粉末的形式加入。d50值通过标准程序测定。

在一个实施方式中，在进行活性碳处理之前调节含HMO流的pH，以在根据本发明的方法的步骤b)期间提高着色剂和/或蛋白质的减少。优选地，通过加入合适的酸将pH调节至5.5，更优选调节至5.0，甚至更优选调节至4.5。

任选的活性碳处理可以在纳滤步骤b)之后，并且优选在根据本发明的方法的步骤c)之前进行。在如上所述进行任选的第二纳滤步骤的情况下，任选的活性碳处理可以在所述任选的第二纳滤步骤之前或之后进行，但优选在之前进行。

在另一个优选的实施方式中，根据本发明的包括其优选和更优选的实现方式的方法还包括一个步骤，其中优选在根据步骤d)浓缩之后和根据步骤e)干燥步骤之前，将纯化的含中性或唾液酸化HMO的溶液无菌过滤和/或进行内毒素去除，优选通过3kDa过滤器或使用孔径小于0.5μm、小于0.4μm、小于0.3μm或小于0.2μm的膜过滤纯化的溶液。然而要注意的是，无菌过滤步骤无助于技术问题(即提供适合人给药的一种或多种纯化HMO)的解决。

根据一个实施方式，上述活性炭处理和无菌过滤步骤是本发明方法的一部分。

本发明的特定实施方式

在一个优选的实施方式中，根据本发明的方法不包括离子交换树脂处理步骤，即该方法不包括阳离子和/或阴离子离子交换剂处理步骤。

在一个优选的实施方式中，根据本发明的方法不包括电渗析步骤。

在一个优选的实施方式中，根据本发明的方法不包括离子交换剂处理步骤，也不包括电渗析步骤。

在一个实施方式中，根据本发明的方法包括以下步骤或由以下步骤组成(按连续顺序)：

i.通过超滤分离发酵液以形成分离的含中性或唾液酸化HMO流和生物质废物流；

ii.通过组合的纳滤和渗滤纯化分离的含中性或唾液酸化HMO流，其中纳滤膜优选在500-3000Da MWCO的范围内；

iii.通过活性碳处理纯化含中性或唾液酸化HMO流；

iv.通过第二纳滤步骤纯化分离的含中性或唾液酸化HMO流，优选与渗滤结合，其中纳滤膜优选在150-300Da MWCO的范围内；

v.通过蒸发浓缩纯化的含中性或唾液酸化HMO流；和

vi.喷雾干燥纯化的含中性或唾液酸化HMO流以获得固化的中性或唾液酸化HMO。

ii.通过纳滤纯化分离的含中性或唾液酸化HMO流，其中纳滤膜优选在500-3000DaMWCO的范围内；

iii.通过渗滤纯化分离的含中性或唾液酸化HMO流；

iv.通过活性碳处理纯化含中性或唾液酸化HMO流；

v.任选地通过第二纳滤步骤纯化分离的含中性或唾液酸化HMO流，其中纳滤膜优选在150-300Da MWCO的范围内；

vi.任选地通过第二渗滤步骤纯化分离的含中性或唾液酸化HMO流；

vii.通过蒸发浓缩纯化的含中性或唾液酸化HMO流；和

viii.喷雾干燥纯化的含中性或唾液酸化HMO流以获得固化的中性或唾液酸化HMO。

在一个方面，根据本发明的包括上面公开的优选和更优选的实施方式的方法包括至少一个纳滤步骤，其中纳滤膜具有500-3000Da的截留分子量(MWCO)，所述膜的活性(顶)层由聚酰胺、更优选哌嗪基聚酰胺组成，所述膜具有约50-90％的MgSO₄截留因子，和优选不大于50％的NaCl截留因子，并且进行所述纳滤步骤使得pH设定为低于5.0，优选低于4.5，有利地低于4.0，但优选不低于3.0，确保待纯化的中性或唾液酸化HMO的截留，并允许一价盐和二价盐通过并积聚在渗透物中，还允许至少一部分乳糖通过并积聚于渗透物中。

ii.通过组合的纳滤和渗滤纯化分离的含中性或唾液酸化HMO流；

iii.通过活性碳处理纯化含中性或唾液酸化HMO流；

iv.任选地通过第二纳滤步骤纯化分离的含中性或唾液酸化HMO流，任选地与渗滤结合，其中纳滤膜在500-3000Da MWCO的范围内，具有由聚酰胺、优选哌嗪基聚酰胺组成的活性(顶)层，约50-90％的MgSO₄截留因子，优选不大于50％的NaCl截留因子，并且进行所述纳滤步骤使得pH设定为低于5.0，优选低于4.5，有利地低于4.0，但优选不低于3.0；

v.通过蒸发浓缩纯化的含中性或唾液酸化HMO流；和

3.通过根据本发明的方法生产的中性或唾液酸化人乳寡糖

根据本说明书中描述的方法回收和纯化的中性或唾液酸化HMO可以是无定形的或结晶的，优选无定形的。

在优选的实施方式中，对于基于干物质的单个中性或唾液酸化HMO，中性或唾液酸化HMO基于干物质的纯度大于80wt.％；或者对于HMO的混合物，对于组合，基于干物质的纯度大于70％。更优选地，单一中性或唾液酸化HMO的纯度大于90wt.％。

在优选实施方式中，中性或唾液酸化HMO具有以下特征中的至少一个(按重量计)：<2％乳果糖、<3％岩藻糖、<1％半乳糖或<3％葡萄糖。

在一个实施方式中，中性或唾液酸化HMO的细粒级分(小于或等于10μm)小于10％，优选小于5％，更优选小于1％，最优选小于0.1％。中性或唾液酸化HMO的平均粒径(d50)也优选大于100μm，更优选大于150μm，甚至更优选大于200μm。

通过根据本发明的方法制备的中性或唾液酸化HMO显示出良好的流动性。优选地，中性或唾液酸化HMO的Carr指数小于30，其中Carr指数(C)由公式C＝100(1-ρB/ρT)确定，其中ρB是粉末的自由沉降堆积密度，ρT是粉末“叩下(tapping down)”后的振实堆积密度(tappedbulk density)。对于自由流动的固体，松密度(bulk density)和振实密度(tappeddensity)的值相似，因此该值较小。对于流动性较差的固体，这些值之间的差异会更大，因此Carr指数会更大。

在一个优选的实施方式中，中性或唾液酸化HMO具有小于15wt.％、小于10wt.％、小于9wt.％、小于8wt.％、小于7wt.％以及小于6wt.％的水含量。为了优化产物回收率，优选HMO在至少5％的溶液中的pH值大于3.0，更优选中性或唾液酸化HMO具有大于4.0的pH。通常，这是通过在干燥步骤之前将含中性或唾液酸化HMO流的pH调节至大于3.0来实现的。优选地，中性或唾液酸化HMO的pH为4-7，更优选4.5-5.5。

在一个实施方式中，通过根据本发明的方法获得的HMO是干燥的中性或唾液酸化HMO，优选具有小于6wt.％的水含量。

优选地，HMO是中性HMO。在一个实施方式中，中性HMO优选选自2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2’,3-二岩藻糖基乳糖、乳-N-三糖II、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-新岩藻五糖V(又名：乳-N-岩藻五糖VI)、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、乳-N-二岩藻六糖III、6’-半乳糖基乳糖、3’-半乳糖基乳糖、乳-N-六糖、乳-N-新六糖、及其任何混合物。更优选地，HMO是2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2’,3-二岩藻糖基乳糖、乳-N-三糖II、乳-N-四糖、乳-N-新四糖或乳-N-岩藻五糖，更优选2’-岩藻糖基乳糖、LNT、LNnT或乳-N-岩藻五糖。

在一个实施方式中，将通过根据本发明的方法获得的中性或唾液酸化HMO掺入食品(例如人或宠物食品)、膳食补充剂或医药产品中。

在一些实施方式中，将中性或唾液酸化HMO掺入人类婴儿食品(例如婴儿配方奶粉)中。婴儿配方奶粉通常是一种人造食品，用于喂养婴儿，完全或部分替代母乳。在一些实施方式中，婴儿配方奶粉以粉末形式出售，并通过与水混合制备用于奶瓶或杯子喂养婴儿。婴儿配方奶粉的成分通常设计为大致模仿母乳。在一些实施方式中，通过本说明书中的工艺纯化的中性或唾液酸化HMO被包括在婴儿配方奶粉中，以提供与母乳中的一种或多种中性或唾液酸化HMO所提供的营养益处相似的营养益处。在一些实施方式中，将中性或唾液酸化HMO与婴儿配方奶粉的一种或多种成分混合。婴儿配方奶粉成分的例子包括脱脂奶、碳水化合物来源(如乳糖)、蛋白质来源(如乳清蛋白浓缩物和酪蛋白)、脂肪来源(如植物油，如棕榈油、高油酸红花油、油菜籽、椰子油和/或葵花油；以及鱼油)、维生素(如维生素A、B、B2、C和D)，矿物质(如柠檬酸钾、柠檬酸钙、氯化镁、氯化钠、柠檬酸钠和磷酸钙)。

因此，本发明的另一个方面涉及通过根据本发明的方法获得的中性或唾液酸化人乳寡糖用于医药。

因此，本发明的另一个方面涉及通过根据本发明的方法获得的中性或唾液酸化人乳寡糖用于食品和/或饲料应用的用途。

因此，本发明的另一个方面涉及食品或化妆品，其包含通过根据本发明的方法获得的用于医药的中性或唾液酸化人乳寡糖的。

实施例

实施例1

概述：碳水化合物和杂质含量通过校准的HPLC和/或HPAEC进行定量。可溶性蛋白质通过Bradford测定法进行定量。通过在具有1cm路径的小杯中在400nm处的UV吸收测量来定量颜色。根据以下公式计算颜色指数CI_400：CI_400＝1000*Abs_400/Brix。

发酵：LNT是使用遗传修饰的大肠杆菌菌株通过微生物发酵产生的。通过在外源添加的乳糖和合适的碳源存在下培养菌株来进行发酵，从而产生LNT，其伴随着三糖乳-N-三糖II、六糖pLNH II和未反应的乳糖作为发酵液中的主要碳水化合物杂质。在发酵结束时，通过加入25％的硫酸将pH调节至4。

发酵液预处理和通过离心去除生物质：用蒸馏水将一部分获得的发酵液(4.3kg，储存后pH 4.45)稀释至总计11.1kg，然后在40分钟内加热至80℃，并立即冷却至环境温度。将pH调节至3.2，并将发酵液离心。小心地泵出所获得的上清液(9.0kg)以与沉淀物(2130g)分离。所获得的澄清上清液具有以下参数：Brix＝8.1，电导率7.50mS/cm，pH 3.27。

膜过滤：在配备Synder-XT2B-1812F膜元件(UF-PES膜，MWCO 1000Da，面积0.32m²)的MMS SW18系统中，在TMP＝3.0bar、T＝23-25℃和400l/h的错流下，对部分获得的上清液(4.5kg)进行膜过滤。在35分钟内收集3.5kg膜渗透物。然后通过在相同条件下连续加水(3.0l，5.4l/h流速)渗滤剩余的截留物(Brix 9.7，电导率7.28mS/cm)，得到最终的膜渗透物(6.9kg，Brix 5.4)和截留物，该截留物主要从HMO(Brix 1.0)中去除并富含蛋白质和残余悬浮固体。

松散的NF：在配备有Trisep UA60-1812膜元件(哌嗪酰胺，MWCO 1000-3500Da，面积0.23m²，LNT截留因子>99％)的相同SW18系统中，通过在26分钟内去除5.44kg的渗透物(TMP＝30bar，T＝40-42℃，错流400l/h)，首先浓缩上述获得的含有产物的膜渗透物(6.8kg，电导率5.84mS/cm，pH 3.40)，然后在相同条件下渗滤，以5.0l/h的流速加入4l水，得到总计9.4kg的NF渗透物(Brix 0.6，电导率4.28mS/cm，pH 3.21)。用另外10l水进一步渗滤所获得的截留物(Brix 20.2，电导率1.67mS/cm、pH 3.54)，得到第二NF渗透物(10.3kg、Brix 0.1、电导率0.458mS/cm、pH 3.71)和实际上不含盐的最终NF截留物(约1500g，Brix18.2，电导率0.48mS/cm，pH 4.28)。

AC处理：将一部分获得的NF截留物(379g)以约6ml/min的进料速率通过填充有Silcarbon CW20的短柱(6.00g，ID＝2.1cm，床高＝5.3cm，用200ml去离子水预洗)，然后进行50ml水洗脱，得到407g无色溶液(Brix 16.2，电导率0.455mS/cm，pH 4.17，Abs_4000.0130对应于CI_400＝0.80)。通过冷冻干燥分离固体产物：62g白色固体。

实施例2

发酵：2’-FL是使用遗传修饰的大肠杆菌菌株通过微生物发酵产生的，该菌株包含编码α-1,2-岩藻糖基转移酶的重组基因。发酵是通过在外源添加的乳糖和合适的碳源存在下培养菌株来进行的，从而产生2’-FL，其伴随着DFL和未反应的乳糖作为发酵液中的主要碳水化合物杂质。

纯化：

1.UF/DF：用硫酸将所得发酵液酸化至pH＝3.8，然后在T＝+60℃的工业连续UF系统中通过15kDa陶瓷膜元件进行超滤渗滤，其中DF水流量约为进料流量的2倍，UF截留物流量约为进料流量的一半。

2.NF/DF：在配备有Trisep UA60膜(哌嗪酰胺，MWCO 1000-3500Da)元件(TMP＝30bar，T＝15℃)和DF水流量约为进料(UF渗透物)流量两倍的工业连续NF系统中，通过松散的纳滤和渗滤立即处理含有产物(Brix约为5)的UF渗透物流。

3.强阳离子交换树脂处理：将获得的NF截留物的样品(4.7kg，Brix 23.8，电导率：2.20mS/cm，pH＝3.9，CI_400：134)以2床体积/小时的流速通过填充有800ml H⁺-形式的Dowex-88树脂的柱(容量1.8eq/l)，然后用水(730ml)洗脱。收集400ml级分。用1M NaOH将各级分滴定至pH＝4.5，并分析糖、颜色和蛋白质含量。将调节pH后的级分#2-13合并，得到5.4kg黄色溶液(Brix 20.2，电导率：3.48mS/cm，pH＝4.55，CI_400：67.3)。

4.活性炭脱色：将部分所得溶液(3.5kg)在+60℃以2床体积/小时的流速通过填充在柱(ID＝16mm)中的颗粒状活性炭CPG LF(75g，150ml)，然后用水洗脱(300ml)。收集150ml级分。将级分#2-24合并，得到3.5kg几乎无色的溶液(Brix 19.7，电导率3.42mS/cm，pH＝5.19，CI_400：1.23)。

5.NF/DF：将获得的溶液(3.4kg)在配备有1812尺寸螺旋缠绕Trisep UA60膜的MMSSW18膜过滤系统中在以下条件下进行定容渗滤：错流＝400l/h，TMP＝30bar，T＝30-35℃，DF水流量4.0l/h。首先，在约5(10l)的pH进行DF，然后在3.8(额外的10l)进行。最后，在TMP＝39bar进一步浓缩截留物，然后用4％NaOH溶液将pH调节至4.5，并从系统中泵出，得到1.8kg的最终溶液(Brix 30.6，电导率：0.216mS/cm，pH＝4.49，CI_400：1.35)。

6.微滤和冷冻干燥：将上述获得的NF截留物通过PES 0.2μm微滤器，得到1.6kg溶液(Brix 30.6)，并冷冻干燥，得到492g白色粉末。

实施例3：MgSO₄和Na₂SO₄截留率的比较

将2.0升的0.2％的MgSO₄溶液装载到配备有1812尺寸的螺旋缠绕Trisep UA60元件(哌嗪酰胺，MWCO 1000-3500Da，膜面积0.23m²)的MMS SW18系统中。该系统以400l/h的错流运行，渗透物循环回到进料罐。将其平衡至少5分钟或直到在各条件下渗透物中的电导率恒定。通过加入少量的25％H₂SO₄溶液来调节pH。渗透物和截留物的电导率公开在下表中。

用0.2％的Na₂SO₄溶液进行相同的实验。

研究表明，在具有聚酰胺膜的NF的情况下，二价抗衡离子(counter-ion)(如硫酸盐)对钠盐的截留(rejection)强烈依赖于pH。因为在强阳离子交换树脂处理后由于用NaOH溶液中和(参见实施例2中的步骤#3)而在收集的级分中存在大量的钠盐，所以当DF在小于4.5、有利地小于4.0的pH下进行时，这些盐可以在第二NF/DF中有效地去除(参见实施例2中的步骤#5)，从而得到实际上无盐的溶液(根据电导率评估)。在这方面，不需要使用碱性阴离子树脂来获得无盐溶液。

实施例4-膜上物质截留因子的测定

膜上的NaCl和MgSO₄截留率测定如下：在膜过滤系统中，NaCl(0.1％)或MgSO₄(0.2％)溶液在选定的膜片(对于Tami：管状模块)上循环，同时渗透物流循环回到进料罐中。在从渗透物和截留物中取样之前，系统在10bar和25℃平衡10分钟。根据测量的样品电导率计算截留因子：(1-κ_p/κ_r)·100，其中κ_p是渗透物中NaCl或MgSO₄的电导率，κ_r是截留物中NaCl或MgSO₄的电导率。

碳水化合物截留因子以类似的方式确定，不同之处在于截留因子是根据样品的浓度(通过HPLC确定)计算的：(1-C_p/C_r)·100，其中C_p是渗透物中碳水化合物的浓度，C_r是截留物中碳水化合物浓度。

Claims

1.一种从发酵液中回收和纯化中性或唾液酸化人乳寡糖(HMO)的方法，其包括以下步骤：

a)分离所述发酵液以形成分离的含HMO流和生物质废物流；

b)通过纳滤纯化分离的含HMO流；

c)任选地浓缩纯化的含HMO流；和

d)干燥纯化的含HMO流以获得固化的HMO，

其中步骤b)中的纳滤膜具有500-3000Da的截留分子量(MWCO)，所述膜的活性层由聚酰胺、优选哌嗪基聚酰胺组成，并且其MgSO₄截留率为约50-90％，

并且其不包括离子交换树脂处理步骤和/或电渗析步骤。

2.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a)包括超滤和/或离心，优选地，由超滤组成。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中进行步骤b)使得pH设定为低于5.0，优选低于4.5，有利地低于4.0，但优选不低于3.0。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)还包括以渗滤模式进行的纳滤。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)包括第二纳滤步骤，其中纳滤膜优选具有150-300Da的截留分子量(MWCO)。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c)包括蒸发、纳滤和/或反渗透过滤，优选由蒸发组成。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c)包括用纳滤膜浓缩，其中所述纳滤膜优选具有150-300Da的截留分子量(MWCO)。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤c)包括用纳滤膜浓缩，所述纳滤膜在500-3000Da MWCO的范围内，具有由聚酰胺、优选哌嗪基聚酰胺组成的活性(顶)层、约50-90％的MgSO₄截留因子和优选不大于50％的NaCl截留因子，并且进行纳滤步骤，使得pH设定为低于5.0，优选低于4.5，有利地低于4.0，但优选不低于3.0。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中进行步骤c)，并且步骤d)包括喷雾干燥，优选由喷雾干燥组成，以获得固化的HMO。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括活性碳处理步骤，优选在步骤b)和/或步骤c)之后。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其包括以下步骤或由以下步骤组成，优选按以下顺序：

iii.通过活性碳处理纯化含中性或唾液酸化HMO流；

iv.通过第二纳滤步骤纯化分离的含中性或唾液酸化HMO流，优选与渗滤相结合，其中纳滤膜优选在150-300Da MWCO的范围内；

v.通过蒸发浓缩纯化的含中性或唾液酸化HMO流；和

12.根据权利要求1或2所述的方法，其包括以下步骤或由以下步骤组成，优选按以下顺序：

iii.通过活性碳处理纯化含中性或唾液酸化HMO流；

iv.任选地通过第二纳滤步骤纯化分离的含中性或唾液酸化HMO流，任选地与渗滤结合，其中纳滤膜优选在150-300DaMWCO的范围内；

v.通过蒸发浓缩纯化的含中性或唾液酸化HMO流；和

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述纳滤膜具有由聚酰胺、优选哌嗪基聚酰胺组成的活性(顶)层，所述膜具有约50-90％的MgSO₄截留因子，优选不大于50％的NaCl截留因子，并且进行所述纳滤步骤使得pH设定为低于5.0，优选低于4.5，有利地低于4.0，但优选不低于3.0。

14.根据权利要求1或2所述的方法，其包括以下步骤或由以下步骤组成，优选按以下顺序：

i.通过超滤分离所述发酵液以形成分离的含中性或唾液酸化HMO流和生物质废物流；

iii.通过活性碳处理纯化含中性或唾液酸化HMO流；

v.通过蒸发浓缩纯化的含中性或唾液酸化HMO流；和

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HMO是中性HMO。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述HMO选自：2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2’,3-二岩藻糖基乳糖、乳-N-三糖II、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-岩藻五糖VI、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、乳-N-二岩藻六糖III、6’-半乳糖基乳糖、3’-半乳糖基乳糖、乳-N-六糖和乳-N-新六糖。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述HMO为2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2’,3-二岩藻糖基乳糖、乳-N-三糖II、乳-N-四糖、乳-N-新四糖或乳-N-岩藻五糖，更优选2’-岩藻糖基乳糖、LNT、LNnT或乳-N-岩藻五糖。

18.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述HMO是唾液酸化HMO，优选3’-唾液酸基乳糖(3’-SL)或6’-唾液酸基乳糖(6’-SL)。