KR20220116001A - 발효액으로부터 시알릴화된 올리고사카라이드의 분리 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 시알릴화된 모유 올리고사카라이드(HMO)를 그것이 생성된 반응 혼합물로부터 분리 및 단리하는 것에 관한 것이다.

Description

발효액으로부터 시알릴화된 올리고사카라이드의 분리
본 발명은 시알릴화된 모유 올리고사카라이드(HMO)를 그것이 생성된 반응 혼합물로부터 분리 및 단리하는 것에 관한 것이다.
지난 수십년 동안, 모유 올리고사카라이드(HMO)의 제조 및 상업화에 대한 관심이 꾸준히 증가해 왔다. HMO의 중요성은 그의 독특한 생물 활성과 직접 연관되므로, HM)는 영양 및 치료 용도로 중요한 잠재적 생산물이 되었다. 결과적으로, HMO를 산업적으로 생산하는 저비용 방식이 모색되었다.
지금까지, 140개보다 많은 HMO의 구조가 측정되었으며, 아마도 훨씬 더 많은 구조가 모유에 존재한다(문헌[Urashima et al.: Milk oligosaccharides, Nova Biomedical Books, 2011]; 문헌[Chen Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)]). HMO는 환원 말단에 락토스(Galβ1-4Glc) 모이어티를 포함하며, N-아세틸글루코사민, 또는 하나 이상의 N-아세틸락토사민 모이어티/모이어티들(Galβ1-4GlcNAc) 및/또는 락토-N-비오스 모이어티(Galβ1-3GlcNAc)로 연장될 수 있다. 락토스 및 N-아세틸락토스아민화 또는 락토스-N-비오실화 락토스 유도체는 하나 이상의 푸코스 및/또는 시알산 잔기(들)로 더 치환될 수 있거나, 또는 락토스는 추가의 갈락토스로 치환되어, 지금까지 알려진 HMO들을 제공할 수 있다.
다이시알릴락토-N-테트라오스, 3'-O-시알릴-3-O-푸코실락토스, 6'-O-시알릴락토스, 3'-O-시알릴락토스, 6'-O-시알릴화-락토-N-네오테트라오스 및 3'-O-시알릴화-락토-N-테트라오스와 같은 시알릴화된 모유 올리고사카라이드가 모유의 주요 성분에 속한다. 상기 시알릴화된 모유 올리고사카라이드에서, 시알산 잔기는 항상 α-글리코시드 결합을 통해 말단 D-갈락토스의 3-O- 및/또는 6-O-위치에, 또는 비-말단 GlcNAc 잔기의 6-O-위치에 결합된다. 시알릴화된 HMO는, 병원체에 대한 내성, 장 성숙, 면역 기능 및 인지 발달을 뒷받침하는데 있어서의 그들의 역할로 인해, 신생아에 상당한 건강 이점을 갖는 것으로 생각된다(문헌[ten Bruggencate et al. Nutr. Rev. 72, 377 (2014)]).
시알릴화된 HMO를 포함하여 HMO를 합성하기 위한 공정을 발전시키려는 노력이 많은 인간 생물 공정에서의 그들의 역할로 인해 지난 10년동안 상당히 증가되었다. 이와 관련하여, 미생물 발효, 효소 공정, 화학적 합성, 또는 이들 기법의 조합에 의해 HMO를 생산하기 위한 공정들이 개발되었다. 생산성과 관련하여, 3'-SL 및 6'-SL을 생산하기 위한, 실험실 규모의 발효 공정이 유망한 것으로 입증되었다.
그러나, 발효액과 같은 복잡한 기질로부터 시알릴화된 락토스 또는 시알릴화된 올리고사카라이드를 단리하는 것은 어려운 과제이다. 문헌[Antoine et al. Angew. Chem. Int. Ed. 44, 1350 (2005)] 및 US 2007/0020736 호는 유전자 변형된 이. 콜라이(E. coli)에 의한 3'-SL 및 부수적 다이- 및 트라이시알릴화된 락토스의 생성을 개시하였으며; 약 0.8 mM 3'-SL을 함유하는 발효액을 다음과 같이 처리하였다: 숯/셀라이트 상에서 생성물을 원심분리 상등액으로부터 흡착시키고, 수용성 염을 증류수로 세척하고, 화합물을 구배 수성 에탄올에 의해 용출시키고, 시알릴화된 생성물을 바이오겔(Biogel) 컬럼 상에서 분리하고, 탈염시켜 1 리터의 발효액으로부터 49 mg의 3'-SL을 수득한다. WO 01/04341 호 및 문헌[Priem et al. Glycobiology 12, 235 (2002)]은 유전자 변형된 이. 콜라이에 의한 3'-SL의 생성을 개시하였으며; 3'-SL을 하기의 작업 순서에 의해 단리하였다: 생성 세포를 열 투과화시킨 후 원심분리하고, 숯/셀라이트 상에서 생성물을 상등액으로부터 흡착시키고, 수용성 염을 증류수로 세척하고, 화합물을 구배 수성 에탄올에 의해 용출시키고, 화합물을 HCO3 --형태의 강 음이온 교환체에 결합시키고, 화합물을 선형 구배 NaHCO3-용액으로 용출시킨 다음, 중탄산나트륨을 양이온 교환체(H+-형태의)로 제거시켜, 49% 정제 수율하에 단리된 3'-SL을 수득한다. WO 2007/101862 호 및 문헌[Fierfort et al. J. Biotechnol. 134, 261 (2008)]호는 3'-SL 발효액의 대안적 후처리 절차를 개시하엿으며, 상기 절차는 생성 세포를 열 투과시키고, 원심분리하고, 산 형태의 강 양이온 교환 수지를 첨가하여 세포외 물질의 pH를 3.0으로 조정하고, 침전된 단백질을 원심분리에 의해 제거하고, 염기 형태의 약 음이온 교환체를 첨가하여 상등액의 pH를 6.0으로 조정하고, 시알릴락토스를 HCO3 --형태의 음이온 교환체에 결합시키고, 증류수로 세척한 다음, 화합물을 NaHCO3-용액의 연속 구배로 용출시키고, pH 3.0에 도달할 때까지 양이온 교환체(H+-형태의)를 사용하여 중탄산나트륨을 제거한 다음, NaOH를 사용하여 pH를 6.0으로 조정하는 단계를 포함한다. 상기 정제에 의해 25.5 g의 3'-SL을 함유하는 발효액 1 리터로부터 15 g의 3'-SL을 단리하였다. 문헌[Drouillard et al. Carbohydr. Res. 345, 1394 (2010)]은 상기 파이어포트(Fierfort)의 절차를 6'-SL(11 g/l) 및 일부 6,6'-다이시알릴락토스(DSL)를 함유하는 발효액에 적용하여, 3.34 g 6'-SL + DSL을 155/86의 비로 단리하였다.
WO 2006/034225 호는 생성 발효액으로부터 3'-SL을 정제하는 2가지 대체 방법을 기술하고 있다. 첫 번째 절차에 따르면, 배양물로부터의 용해물을 증류수로 희석하고 활성탄/셀라이트와 함께 교반하였다. 슬러리를 물로 세척한 다음, 생성물을 활성탄/셀라이트로부터 수성 에탄올로 용출시켰다. 두 번째 방법에 따르면, 배양 세포를 열처리하고, 침전된 고체를 원심분리에 의해 상등액으로부터 분리하였다. 생성된 상등액을 마이크로필터를 통해 처리하고, 투과액을 10 kDa 막에 통과시킨 다음, 나노여과시켰다. 이어서, 생성된 잔류액을 정용여과시켜 최종 샘플을 수거하였다. 두가지 정제 방법 모두 1 리터의 발효액으로부터 90 내지 100 mg의 3'-SL을 생성하였다.
문헌[Gilbert et al. Nature Biotechnol. 16, 769 (1998)] 및 WO 99/31224 호는 둘 다 CMP-Neu5Ac 합성효소/α-2,3-시알릴 트랜스퍼라제 융합 단백질 추출물을 사용하여 락토스, 시알산, 포스포엔올피루베이트, ATP 및 CMP로부터 3'-SL을 효소적으로 생산하는 방법을 개시하고 있다. 생성물을 일련의 한외여과(3000 MWCO), C18 역상 크로마토그래피, pH=3 및 pH=7에서의 나노여과/정용여과, 강 양이온 교환(H+) 수지를 사용한 산성화, NaOH 용액을 사용한 중화 및 활성탄 탈색에 의해 정제하였다.
WO 2009/113861 호는 탈지 및 무단백질 우유 스트림으로부터 시알릴락토스를 단리하는 방법을 개시하고 있는데, 상기 방법은 상기 우유 스트림을 유리 염기 형태이며 30 내지 48%의 수분 함량을 갖는 1차 음이온 교환 수지와 접촉시켜 음으로 하전된 무기질을 수지에 결합시키고 시알릴락토스는 결합되지 않게 한 다음, 거대다공성 또는 겔 타입 수지이고 50 내지 70%의 수분 함량을 갖는 유리 염기 형태의 2차 음이온 교환 수지로 처리하여 시알릴락토스를 수지에 결합시키는 것을 포함한다. 상기 공정에서, 시알릴락토스 함유 스트림은 다소 희석되고(몇백 ppm의 농도), 1차 수지로부터 시알릴락토스의 회수율은 중간정도이다.
WO 2017/152918 호는, 하기의 단계를 포함하는, 발효액으로부터 시알릴화된 올리고사카라이드를 수득하는 방법을 개시하고 있으며, 여기서 상기 시알릴화된 올리고사카라이드는 내재화된 탄수화물 전구체로부터 상기 시알릴화된 올리고사카라이드를 생성할 수 있는 유전자 변형 미생물을 배양함으로써 생성된다:
i) 한외여과(UF),
ii) 나노여과(NF),
iii) 선택적인 활성탄 처리, 및
iv) 강 음이온 교환 수지 및/또는 양이온 교환 수지를 사용한 발효액의 처리.
EP-A-3456836 호는 수성 매질로부터 시알릴화된 올리고사카라이드를 분리하는 방법을 개시하고 있는데, 상기 방법은 상기 시알릴화된 올리고사카라이드를 함유하는 수용액을 적어도 2가지 유형의 이온 교환 수지, 즉 Cl--형태의 강 음이온 교환 수지 및 강 양이온 교환 수지로 처리하는 것을 포함한다.
WO 2019/043029 호는 하기의 단계를 포함하는, 미생물 발효 또는 시험관내 생체촉매작용에 의해 생성된 시알릴화된 올리고사카라이드를 정제하는 방법을 개시하고 있다:
i) 발효액으로부터 바이오매스를 분리하고,
ii) 발효액 또는 반응 혼합물로부터 양이온을 제거하고,
iii) 발효액 또는 반응 혼합물로부터 음이온성 불순물을 제거하고,
iv) 발효액 또는 반응 혼합물로부터 정제될 시알릴화된 올리고사카라이드보다 낮은 분자량을 갖는 화합물을 제거한다.
WO 2019/229118 호는 다음을 포함하는, 발효에 의해 생성되는 시알릴락토스를 다른 탄수화물로부터 정제하는 방법을 개시하고 있다:
a) 한외여과에 의한 세포덩어리의 분리,
b) 여액의 강 양이온 교환체 처리 후 강 음이온 교환체(Cl--형태) 처리,
c) 1차 나노여과,
d) 2차 나노여과,
e) 전기투석,
f) 역삼투,
g) 활성탄 처리,
h) 멸균 여과, 및
i) 분무-건조.
그러나, 시알릴화된 HMO가 생성된 발효액의 비-탄수화물 성분들로부터 상기 시알릴화된 HMO를 단리하고 정제하기 위한 대체 절차, 특히 산업적 규모에 적합한 절차가 HMO의 순도는 적어도 유지, 바람직하게는 개선하면서 HMO의 회수율을 개선하고/하거나 선행 기술의 방법을 단순화시키기 위해 필요하다.
본 발명은, 시알릴화된 모유 올리고사카라이드(HMO), 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL을, 이들이 생성되는 반응 혼합물 또는 발효액으로부터 수득하거나 단리하거나 정제하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 HMO는, 내재화된 탄수화물 전구체로부터 상기 HMO를 생성할 수 있는 유전자 변형 미생물을 배양함으로써 생성된 것이고, 상기 방법은,
- 상기 반응 혼합물을 pH-조정, 희석 및/또는 열 처리에 의해 전처리하는 단계, 및
- 상기 전처리 후에 상기 반응 혼합물을 원심분리하거나, 또는 상기 전처리 후에 상기 반응 혼합물을, 약 5 내지 1000 kDa의 분획분자량(MWCO)을 갖고 바람직하게는 비-중합체 물질로 이루어진 한외여과(UF) 막과 접촉시키는 단계
를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 방법은,
- 상기 반응 혼합물의 pH를 산성, 예를 들면, 약 3 내지 약 6, 바람직하게는 약 5 이하로 설정하고/하거나, 상기 반응 혼합물을 실온(또는 주위 온도)보다 높은 온도, 바람직하게는 약 30 내지 90℃, 보다 바람직하게는 약 35 내지 85℃로 가온시키는 단계, 및
- 이전 단계에서 수득된 반응 혼합물을, 약 5 내지 1000 kDa, 예를 들면, 10 내지 1000 kDa의 분획분자량(MWCO)을 갖고 바람직하게는 비-중합체 물질로 이루어진 한외여과(UF) 막과 접촉시키는 단계
를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 방법은,
a) 선택적으로, 상기 반응 혼합물을 원심분리 또는 미세여과시키거나, 또는 상기 반응 혼합물을 필터 프레스 또는 드럼 필터 상에서 여과시키는 단계,
b) 전처리로서, 단계 a)의 여액 또는 상등액 또는 반응 혼합물의 pH를 바로 3 내지 6으로 설정하고/하거나, 단계 a)의 여액 또는 상등액 또는 반응 혼합물을 바로 35 내지 65℃로 가온시키는 단계, 및
c) 단계 b)에서 수득된 반응 혼합물을 5 내지 1000 kDa, 예를 들면, 10 내지 1000 kDa의 분획분자량(MWCO)을 갖는 한외여과(UF) 막과 접촉시키고, 투과액을 수거하는 단계
를 포함하되, 단, 단계 a)가 수행되지 않는 경우, UF 막은 비-중합체 막이다.
하나의 실시태양에서, 단계 a)가 수행되지 않으며, 비-중합체 막은 세라믹 막이다.
하나의 실시태양에서, 상기에 개시된 방법은 나노여과 단계를 추가로 포함한다.
다른 실시태양에서, 상기에 개시된 방법은 하나 이상의 이온 교환 수지에 의한 처리를 추가로 포함한다.
다른 실시태양에서, 상기에 개시된 방법은 활성탄 상에서의 크로마토그래피에 의한 처리를 추가로 포함한다.
상기 방법의 하나의 실시태양은, 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL을, 이들이 생성된 반응 혼합물로부터 수득하거나 단리하거나 또는 정제하는 것에 관한 것이며,
i) 상기 반응 혼합물의 pH를 산성, 예를 들면, 약 3 내지 약 6, 바람직하게는 약 5 이하로 설정하고/하거나, 상기 반응 혼합물을 실온(또는 주위 온도)보다 높은 온도, 바람직하게는 약 30 내지 90℃, 보다 바람직하게는 약 35 내지 85℃로 가온시키는 단계,
ii) 단계 i)에서 수득된 반응 혼합물을, 약 5 내지 1000 kDa, 예를 들면, 10 내지 1000 kDa의 분획분자량(MWCO)을 갖고 바람직하게는 비-중합체 물질로 이루어진 한외여과(UF) 막과 접촉시키는 단계, 및
iii) 단계 ii)에서 수득된 투과액을 나노여과 막과 접촉시키는 단계
를 포함한다.
상기 방법의 하나의 실시태양은, 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL을, 이들이 생성된 반응 혼합물로부터 수득하거나 단리하거나 또는 정제하는 것에 관한 것이며,
i) 상기 반응 혼합물을 pH-조정, 희석 및/또는 열처리에 의해 전처리하는 단계,
ii) 상기 전처리 후에 반응 혼합물을 원심분리하거나, 또는 상기 전처리 후에 반응 혼합물을, 약 5 내지 1000 kDa, 예를 들면, 10 내지 1000 kDa의 분획분자량(MWCO)을 갖고 바람직하게는 비-중합체 물질로 이루어진 한외여과(UF) 막과 접촉시키는 단계, 및
iii) 단계 ii)에서 수득된 청정화된 상등액 또는 UF 투과액을 나노여과 막과 접촉시키는 단계
를 포함한다.
상기 방법의 하나의 실시태양은, 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL을, 이들이 생성된 반응 혼합물로부터 수득하거나 단리하거나 또는 정제하는 것에 관한 것이며,
i) 상기 반응 혼합물의 pH를 산성, 예를 들면, 약 3 내지 약 6, 바람직하게는 약 5 이하로 설정하고/하거나, 상기 반응 혼합물을 실온(또는 주위 온도)보다 높은 온도, 바람직하게는 약 30 내지 90℃, 보다 바람직하게는 약 35 내지 85℃로 가온시키는 단계,
ii) 단계 i)에서 수득된 반응 혼합물을, 약 5 내지 1000 kDa, 예를 들면, 10 내지 1000 kDa의 분획분자량(MWCO)을 갖고 바람직하게는 비-중합체 물질로 이루어진 한외여과(UF) 막과 접촉시키는 단계,
iii) 단계 ii)에서 수득된 투과액을 나노여과(NF) 막과 접촉시키는 단계, 및
iv) 단계 iii)에서 수득된 NF 잔류액을 이온 교환 수지, 예를 들어, 강 양이온성 이온 교환 수지 및 약염기성 이온 교환 수지로 처리하여 잔류액을 탈염시키는 단계
를 포함한다.
상기 방법의 하나의 실시태양은, 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL을, 이들이 생성된 반응 혼합물로부터 수득하거나 단리하거나 또는 정제하는 것에 관한 것이며,
i) 상기 반응 혼합물을 pH-조정, 희석 및/또는 열처리에 의해 전처리하는 단계,
ii) 상기 전처리 후에 반응 혼합물을 원심분리하거나, 또는 상기 전처리 후에 반응 혼합물을, 약 5 내지 1000 kDa, 예를 들면, 10 내지 1000 kDa의 분획분자량(MWCO)을 갖고 바람직하게는 비-중합체 물질로 이루어진 한외여과(UF) 막과 접촉시키는 단계,
iii) 단계 ii)에서 수득된 청정화된 상등액 또는 UF 투과액을 나노여과 막과 접촉시키는 단계, 및
iv) 단계 iii)에서 수득된 NF 잔류액을 이온 교환 수지, 예를 들어, 강 양이온성 이온 교환 수지 및 약염기성 이온 교환 수지로 처리하여 잔류액을 탈염시키는 단계
를 포함한다.
상기 방법의 하나의 실시태양은, 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL을, 이들이 생성된 반응 혼합물로부터 수득하거나 단리하거나 또는 정제하는 것에 관한 것이며,
i) 상기 반응 혼합물의 pH를 산성, 예를 들면, 약 3 내지 약 6, 바람직하게는 약 5 이하로 설정하고/하거나, 상기 반응 혼합물을 실온(또는 주위 온도)보다 높은 온도, 바람직하게는 약 30 내지 90℃, 보다 바람직하게는 약 35 내지 85℃로 가온시키는 단계,
ii) 단계 i)에서 수득된 반응 혼합물을, 약 5 내지 1000 kDa, 예를 들면, 10 내지 1000 kDa의 분획분자량(MWCO)을 갖고 바람직하게는 비-중합체 물질로 이루어진 한외여과(UF) 막과 접촉시키는 단계,
iii) 단계 ii)에서 수득된 투과액을 나노여과(NF) 막과 접촉시키는 단계,
iv) 단계 iii)에서 수득된 NF 잔류액을 이온 교환 수지, 예를 들어, 강 양이온성 이온 교환 수지 및 약염기성 이온 교환 수지로 처리하여 잔류액을 탈염시키는 단계, 및
v) 단계 iv)에서 수득된 용액을 활성탄(AC)과 접촉시키는 단계
를 포함한다.
상기 방법의 하나의 실시태양은, 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL을, 이들이 생성된 반응 혼합물로부터 수득하거나 단리하거나 또는 정제하는 것에 관한 것이며,
i) 상기 반응 혼합물을 pH-조정, 희석 및/또는 열처리에 의해 전처리하는 단계,
ii) 상기 전처리 후에 반응 혼합물을 원심분리하거나, 또는 상기 전처리 후에 반응 혼합물을, 약 5 내지 1000 kDa, 예를 들면, 10 내지 1000 kDa의 분획분자량(MWCO)을 갖고 바람직하게는 비-중합체 물질로 이루어진 한외여과(UF) 막과 접촉시키는 단계,
iii) 단계 ii)에서 수득된 청정화된 상등액 또는 UF 투과액을 나노여과 막과 접촉시키는 단계,
iv) 단계 iii)에서 수득된 NF 잔류액을 이온 교환 수지, 예를 들어, 강 양이온성 이온 교환 수지 및 약염기성 이온 교환 수지로 처리하여 잔류액을 탈염시키는 단계, 및
v) 단계 iv)에서 수득된 용액을 활성탄(AC)과 접촉시키는 단계
를 포함한다.
바람직하게, 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL이 생성되는 반응 혼합물은 발효액이다. 상기 발효액은 전형적으로, 그의 생산을 위해 유전자 변형 미생물, 바람직하게는 이. 콜라이가 적절히 설계된 주 화합물로서 관심 시알릴화된 HMO 이외에, 전구체로서 락토스, 바람직하게는 외인적으로 첨가된 락토스로부터 관심 시알릴화된 HMO의 생합성 경로에서의 탄수화물 중간체와 같은 탄수화물 부산물 또는 오염물, 및/또는 생합성 경로중에 결핍되거나, 결함이 있거나 손상된 글리코실화의 결과로 생성된 것들, 및/또는 배양 조건 또는 발효후 작업하에 재배열 또는 분해의 결과로 생성된 것들, 및/또는 발효시 과량으로 첨가된, 소비되지 않은 유리물로서 락토스를 함유한다. 추가로, 발효액은 세포, 단백질, 단백질 단편, DNA, 카라멜화 부산물, 무기질, 염, 유기산, 내독소 및/또는 기타 하전된 분자들을 함유할 수 있다.
바람직하게, 발효액이 UF 전에 원심분리, 미세여과, 또는 필터 프레스 또는 드럼 필터 상에서의 여과에 적용되지 않는 경우, UF 막은 비-중합체 물질로 이루어진다(예를 들어, UF 막은 세라믹 막이다).
본 발명의 특정한 실시태양은 하나 이상의 추가의 선택적인 단계들을 포함한다. 바람직하게, 상기 추가의 선택적인 단계는 전기투석이 아니다.
하나의 실시태양에서, 바람직하게, UF 투과액이 락토스가 부족하거나 근본적으로 락토스가 결여된 경우, 단계 iii)에 따른 NF 단계는 관심 시알릴화된 모유 올리고사카라이드의 잔류를 보장하는 MWCO를 갖는 나노여과 막의 사용을 포함한다, 즉, 상기 막의 MWCO는 시알릴화된 모유 올리고사카라이드의 분자량의 약 25 내지 50%, 전형적으로 약 150 내지 500 Da이다. 이와 관련하여, 시알릴화된 모유 올리고사카라이드는 FN 잔류액(NFR)에 축적되는 반면, 1가 이온 또는 모노사카라이드와 같은 염은 투과액에 축적된다.
다른 실시태양에서, 바람직하게, UF 투과액이 실질적인 양의 락토스를 함유하는 경우, 단계 iii)에 따른 NF 단계는 약 600 내지 3500 Da, 바람직하게는 약 1000 Da의 MWCO를 갖는 나노여과 막의 사용을 포함하며, 이것은 시알릴화된 HMO의 잔류를 보장하고 1가- 및 2가 염 및 적어도 일부의 락토스가 막을 통과하게 하며, 이때 NF 막의 활성 (상부) 층은 폴리아미드로 이루어지고, NF 막의 MsSO4 배제율은 약 50 내지 90%이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은, 수성 매질을 단계 i), ii), iii), iv), 및 선택적으로 단계 v)에 적용하는 단계를 포함하는, 발효 또는 효소 공정으로부터 수성 매질 중에 용해된 무기 및 유기 염, 산 및 염기로부터 시알릴화된 HMO를 분리하는 것에 관한 것이다.
세 번째 태양에서, 본 발명은, 상기 시알릴화된 HMO를 함유하는 수용액을 적어도 2가지 유형의 이온 교환 수지, 즉 염기 형태의 약 음이온 교환 수지 및 H+-형태의 강 양이온 교환 수지로 처리하는 것을 포함하는, 수성 매질로부터 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL을 분리하는 것에 관한 것이다.
바람직하게, 상기 수성 매질은 상기 시알릴화된 HMO를 함유하는 발효액 또는 효소 반응 혼합물이다.
바람직하게, 상기 분리된 시알릴화된 HMO는 그의 알칼리 금속염, 바람직하게는 나트륨염의 형태로 수득된다.
바람직하게, 약 음이온 교환 수지 처리는 강 양이온 교환 수지 처리 후에, 바람직하게는 바로 후에 이어진다.
본 발명의 세 번째 태양의 한 실시태양에서, 이온 교환체 처리는 시알릴화된 올리고사카라이드를 함유하는 수성 매질 또는 수용액의 전처리 단계가 선행되며, 이때 상기 전처리 단계는 한외여과, 나노여과 및 선택적인 활성탄 처리를, 바람직하게는 다음의 순서로 포함한다: 한외여과, 나노여과 및 선택적인 활성탄 처리.
1. 용어 및 정의
용어 "시알릴화된 모유 올리고사카라이드"는, 하나 이상의 β-N-아세틸-락토스아미닐 및/또는 하나 이상의 β-락토-N-비오실 단위에 의해 연장될 수 있는 환원 말단에서의 락토스 단위이며 α-N-아세틸-뉴라미닐 (시알릴) 모이어티로 치환되고 선택적으로 α L-푸코피라노실 모이어티로 치환될 수 있는 코어 구조를 포함하는, 모유에서 발견된 시알릴화된 복합 탄수화물(문헌[Urashima et al.: Milk oligosaccharides, Nova Biomedical Books, 2011]; 문헌[Chen Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)])을 의미한다. 이와 관련하여, 산성 HMO는 그의 구조에 적어도 하나의 시알릴 잔기를 갖는다. 산성 HMO의 예는 3'-시알릴락토스 (3'-SL), 6'-시알릴락토스 (6'-SL), 3-푸코실-3'-시알릴락토스 (FSL), LST a, 푸코실-LST a (FLST a), LST b, 푸코실-LST b (FLST b), LST c, 푸코실-LST c (FLST c), 시알릴-LNH (SLNH), 시알릴-락토-N-헥사오스 (SLNH), 시알릴-락토-N-네오헥사오스 I (SLNH-I), 시알릴-락토-N-네오헥사오스 II (SLNH-II) 및 다이시알릴-락토-N-테트라오스 (DS-LNT)를 포함한다.
용어 "유전자 변형 세포" 또는 "유전자 변형 미생물"은 바람직하게는, 그의 DNA 서열에 적어도 하나의 변이를 포함하도록 유전자 조작된 미생물의 세포, 예를 들면, 세균 또는 진균 세포, 예를 들어, 이. 콜라이 세포를 의미한다. 용어 "적어도 하나의 유전자 변이"는 야생형 세포의 원래의 특성에 변화를 야기할 수 있는 유전자 변이를 의미한다, 예를 들어, 변형된 세포는 야생형 세포에는 존재하지 않는 효소의 발현을 암호화하는, 도입된 새로운 유전 물질로 인해 추가의 화학적 전환을 수행할 수 있거나, 또는 유전자/유전자들의 제거(녹아웃)로 인해 분해와 같은 전환을 수행할 수 없다. 유전자 변형 세포는 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있는 유전자 조작 기법에 의해 통상적인 방식으로 생성할 수 있다.
"내재화된 탄수화물 전구체로부터 시알릴화된 올리고사카라이드를 생성할 수 있는 유전자 변형 미생물"이란 용어는 바람직하게는, 상기 시알릴화된 올리고사카라이드의 합성에 필요한 시알릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 재조합 유전자, 상기 글리코실 트랜스퍼라제에 의해 탄수화물 전구체(수용체)에 전달되기에 적합한 시알산 뉴클레오티드 공여체를 생성하기 위한 생합성 경로, 및/또는 시알릴화되어 관심 시알릴화된 올리고사카라이드를 생성하는 세포내에 배양 배지로부터의 탄수화물 전구체(수용체)의 내재화된 메카니즘을 포함하도록 유전자 조작된(상기 참조) 세포 또는 미생물을 의미한다.
용어 "바이오매스"는, 발효의 맥락에서, 온전한 세포, 파괴된 세포, 세포 단편, 단백질, 단백질 단편, 폴리사카라이드와 같이, 발효 세포로부터 유래하는, 현탁되거나, 침전되거나 또는 불용성인 물질을 지칭한다. 용어 "바이오매스"는, 효소 반응의 맥락에서, 사용된 효소로부터 유래하는 (주로 변성 및/또는 침전된) 단백질 또는 단백질 단편을 지칭한다. 바이오매스는, 예를 들어, 원심분리, 미세여과, 한외여과, 또는 필터 프레스 또는 드럼 필터 상에서의 여과에 의해 상기의 반응 혼합물(현탁액)로부터 분리될 수 있다.
용어 "브릭스(Brix)"는 수용액의 당 함량(용액 100 g 중 당 g)인 브릭스 당도를 지칭한다. 이와 관련하여, 본 출원의 시알릴화된 올리고사카라이드 용액의 브릭스는 시알릴화된 올리고사카라이드 및 그의 부수 탄수화물을 포함하는 용액의 전체 탄수화물 함량을 지칭한다. 브릭스는 보정된 굴절계로 측정한다.
염의 배제율(%)은 (1-κp/κr)·100으로 계산되며, 여기서 κp는 투과액 중 염의 전도도이고, κr은 잔류액 중 염의 전도도이다. 잔류액 농도는 염에 관한 공급물 농도와 실질적으로 동일하다. 염의 배제율을 측정하는 절차는 하기의 실시예에 개시되어 있다.
탄수화물의 배제율(%)은 (1-Cp/Cr)·100으로 계산되며, 여기서 Cp는 투과액 중 탄수화물의 농도이고, Cr은 잔류액 중 탄수화물의 농도이다. 잔류액 농도는 탄수화물에 관한 공급물 농도와 실질적으로 동일하다. 탄수화물의 배제율을 측정하는 하나의 예시적인 절차가 하기의 실시예에 개시되어 있다.
2개의 탄수화물에 관한 분리율은 (Cp1/Cr1)/(Cp2/Cr2)로 계산되고, 여기서 Cp1 및 Cp2는 투과액 중 제1 및 제2 탄수화물 각각의 농도이고, Cr1 및 Cr2는 잔류액 중 제1 및 제2 탄수화물 각각의 농도이다.
"순수(pure water) 플럭스"는 명시된 조건하에서(약 23 내지 25℃, 10 바 및 300 l/h의 일정 교차흐름에서) 단위 시간 당, 단위 면적 당 및 막투과 압력 단위 당 막을 통과하는 정제수(예를 들어, 증류수, RO수)의 부피로 정의된다.
"탈염"은 바람직하게는 액체로부터 무기질 또는 무기염을 제거하는 과정을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 탈염은 바람직하게는 이온 교환 처리, 특히 2차 이온 교환체로부터의 용출액이 무기질 또는 무기염을 함유하지 않거나 매우 소량으로 함유하도록 양이온 및 음이온 교환 수지의 후속 적용의 단계를 지칭한다. 또한, 탈염은 나노여과 단계에서, 특히 정용여과와 병행될 때 일어날 수 있다.
"미세여과"는 바람직하게는 약 0.1 내지 10 ㎛ 범위의 기공을 갖는 막을 통해 발효액 또는 효소 반응 혼합물을 여과시키는 전처리 분리 과정을 의미한다. 대략적인 분자량 면에서, 상기 막들은 일반적으로 100,000 g/몰 미만의 분자량을 갖는 거대분자를 분리할 수 있다.
본 발명 명세서 전체에 걸쳐 수치와 관련하여 사용된 용어 "대략" 또는 "약"은 상기 수치가 나타낸 값의 10%까지 벗어날 수 있음을 의미한다.
2. 시알릴화된 HMO를 그것이 생성된 반응 혼합물로부터 수득하거나 단리하는 방법
본 발명은 시알릴화된 HMO가 생성된 발효액 또는 효소 반응 혼합물인 수성 매질로부터 상기 시알릴화된 HMO를 수득하거나 단리하거나 또는 정제하는 방법에 관한 것이다. 상기 반응 혼합물은 시알릴화된 HMO가 상기 시알릴화된 HMO의 합성에 필수적인 부산물 및 잔류 물질과 같은 여러 물질들이 부수되거나 그로 오염되는 복잡한 매트릭스이다. 따라서, 시알릴화된 HMO는, 상기 시알릴화된 HMO가 반응 혼합물 중에 존재하는 것보다 훨씬 더 순수한 형태로 수득되거나 단리되게 하는 여러 연속 단계들을 이용하여 상기 HMO를 부산물 및 잔류 물질로부터 분리함으로써 반응 혼합물로부터 수득하거나 단리하거나 또는 정제한다. 따라서, 본 발명은 관심 시알릴화된 HMO를 선행 기술에 비해 더 유리한 방식으로 수득하거나 단리할 수 있는 정제 방법을 제공한다. 상기 이점들은 상응하는 방법의 단계들과 관련하여 하기에 개시된다.
생물공학 방법을 이용할 때, 시알릴화된 HMO가 생산되는 어떤 방식이든(발효 또는 시험관내 효소적 방식), 반응 혼합물은 바이오매스를 함유한다. 그러므로, 본 발명의 방법은 바이오매스를 반응 혼합물로부터 분리하여 관심 시알릴화된 HMO를 포함하는 수용액을 제공하는 단계를 필수적으로 포함한다. 바이오매스를 반응 혼합물로부터 분리하는 것은 한외여과(UF, 하기 세부사항 참조)를 포함하며, 상기 한외여과는 선택적으로 전-여과(즉, 원심분리, 미세여과, 또는 필터 프레스 또는 드럼 필터상에서의 여과) 또는 원심분리가 선행된다. UF 또는 원심분리 다음에 통상적으로 나노여과 단계(NF, 하기 세부사항 참조)가 뒤따른다. 추가로, 본 발명의 방법은 선택적으로 이온 교환 수지, 유리하게는 양이온 및 음이온 교환 수지에 의한 처리를 포함할 수 있다. 게다가, 본 발명의 방법은 선택적으로 탈색을 위한 활성탄 처리를 포함할 수 있다. 선택적인 단계들 중 어느 단계든지 UF 및 NF 후에 임의의 순서로 수행할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 방법은 선택적으로 적어도 1회 이상의 NF 단계, 특히 시알릴화된 HMO의 수용액을 농축 및/또는 염분제거/탈염하기 위한 NF 단계를 포함할 수 있다. 또는, 탈염이 필요하지 않은 경우(예를 들어, 공급물의 저염 농도로 인해), 선택적인 추가의 NF는 증발로 대체될 수 있다.
UF, NF, "이온 교환 수지에 의한 처리" 및 "활성탄 처리"의 단계들은 하기의 상응하는 서브챕터에서 상세히 논의된다.
따라서, 상기 방법은 하기의 분리/정제 단계를 임의의 순서로 포함한다:
aa) 원심분리(CF) 또는 한외여과(UF),
bb) 나노여과(NF), 및
cc) 이온 교환 수지에 의한 처리.
유리하게, 단계 aa)는 단계 bb) 전에 수행된다. 보다 유리하게, 단계 aa)는 단계 bb) 및 cc) 중 어느 한 단계 전에 수행된다. 바람직하게, 상기 방법은 단계 aa) 다음에 단계 bb)가 뒤따르고, 단계 bb) 다음에 단계 cc)가 뒤따르는 순서로 수행된다.
하나의 실시태양에서, 상기 방법은 다음을 포함한다:
- 반응 혼합물 또는 원심분리된 반응 혼합물의 한외여과(UF) 및 상기 한외여과 투과액(UFP)의 수거,
- UFP의 나노여과(NF) 및 나노여과 잔류액(NFR)의 수거, 및
- 이온 교환 수지에 의한 NFR 처리 및 수지 용출액(RE)의 수거.
하나의 실시태양에서, 상기 방법은 다음을 포함한다:
- 반응 혼합물의 원심분리(CF) 및 청정화된 상등액의 수거,
- 청정화된 상등액의 나노여과(NF) 및 나노여과 잔류액(NFR)의 수거, 및
- 이온 교환 수지에 의한 NFR의 처리 및 수지 용출액(RE)의 수거.
본 발명의 방법은 UF, NF 또는 이온 교환 수지 처리 후에 활성탄 처리를 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 방법은 다음을 포함한다:
- 반응 혼합물 또는 원심분리된 반응 혼합물의 한외여과(UF) 및 상기 한외여과 투과액(UFP)의 수거,
- UFP의 나노여과(NF) 및 나노여과 잔류액(NFR)의 수거,
- NFR의 활성탄 처리 및 활성탄 용출액(CCE)의 수거, 및
- 이온 교환 수지에 의한 CCE의 처리.
하나의 실시태양에서, 상기 방법은 다음을 포함한다:
- 반응 혼합물의 원심분리(CF) 및 청정화된 상등액의 수거,
- 청정화된 상등액의 나노여과(NF) 및 나노여과 잔류액(NFR)의 수거,
- NFR의 활성탄 처리 및 활성탄 용출액(CCE)의 수거, 및
- 이온 교환 수지에 의한 CCE의 처리.
바람직하게, 상기 방법은 다음을 포함한다:
- 반응 혼합물 또는 원심분리된 반응 혼합물의 한외여과(UF) 및 상기 한외여과 투과액(UFP)의 수거,
- UFP의 나노여과(NF) 및 나노여과 잔류액(NFR)의 수거,
- NFR의 활성탄 처리 및 활성탄 용출액(CCE)의 수거, 및
- H+-형태의 강 양이온 교환 수지 및 유리 염기 형태의 약 음이온 교환 수지에 의한 CCE의 처리.
바람직하게, 상기 방법은 다음을 포함한다:
- 반응 혼합물의 원심분리(CF) 및 청정화된 상등액의 수거,
- 청정화된 상등액의 나노여과(NF) 및 나노여과 잔류액(NFR)의 수거,
- NFR의 활성탄 처리 및 활성탄 용출액(CCE)의 수거, 및
- H+-형태의 강 양이온 교환 수지 및 유리 염기 형태의 약 음이온 교환 수지에 의한 CCE의 처리.
또 다른 실시태양에서, 상기 방법은 다음을 포함한다:
- 반응 혼합물 또는 원심분리된 반응 혼합물의 한외여과(UF) 및 상기 한외여과 투과액(UFP)의 수거,
- UFP의 나노여과(NF) 및 나노여과 잔류액(NFR)의 수거,
- 이온 교환 수지에 의한 NFR의 처리 및 수지 용출액(RE)의 수거, 및
- RE의 활성탄 처리.
또 다른 실시태양에서, 상기 방법은 다음을 포함한다:
- 반응 혼합물의 원심분리(CF) 및 청정화된 상등액의 수거,
- 청정화된 상등액의 나노여과(NF) 및 나노여과 잔류액(NFR)의 수거,
- 이온 교환 수지에 의한 NFR의 처리 및 수지 용출액(RE)의 수거, 및
- RE의 활성탄 처리.
바람직하게, 상기 방법은 다음을 포함한다:
- 반응 혼합물 또는 원심분리된 반응 혼합물의 한외여과(UF) 및 상기 한외여과 투과액(UFP)의 수거,
- UFP의 나노여과(NF) 및 나노여과 잔류액(NFR)의 수거,
- H+-형태의 강 양이온 교환 수지 및 유리 염기 형태의 약 음이온 교환 수지에 의한 NFR의 처리 및 수지 용출액(RE)의 수거, 및
- RE의 활성탄 처리.
바람직하게, 상기 방법은 다음을 포함한다:
- 반응 혼합물의 원심분리(CF) 및 청정화된 상등액의 수거,
- 청정화된 상등액의 나노여과(NF) 및 나노여과 잔류액(NFR)의 수거,
- H+-형태의 강 양이온 교환 수지 및 유리 염기 형태의 약 음이온 교환 수지에 의한 NFR의 처리 및 수지 용출액(RE)의 수거, 및
- RE의 활성탄 처리.
하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 방법은 단계 A), B), C) 및 D)로 이루어진 하기 순서의 단계들을 포함하지만, 이온 교환 처리, 모사 이동층 크로마토그래피, 겔 여과/크로마토그래피 및 전기투석은 포함하지 않는다:
A) - 발효액인 반응 혼합물의 pH를 약 3 내지 5의 pH로 설정하는 단계,
B) - 단계 A)의 pH-조정된 발효액을 원심분리(CF)하여 청정화된 상등액을 수득하는 단계, 또는
- 단계 A)의 pH-조정된 발효액을 한외여과(FU)시켜 한외여과 투과액(UFP)을 수득하는 단계,
C) - 상기 청정화된 상등액 또는 UFP를 과립화된 활성 탄소로 처리하여 활성탄 용출액(CCE)을 수득하는 단계, 및
D) - CCE를 나노여과(NF)시키고 나노여과 잔류액(NFR)을 수거하는 단계.
본 발명의 방법은, 그로부터 HMO를 고수율로 및 바람직하게는 만족스러운 순도로 수득할 수 있는, 관심 시알릴화된 HMO가 고도로 농축된 용액, 예를 들면, 식품 용도를 위한 엄격한 규제 요건을 충족시키는 용액을 제공한다.
2.1. 시알릴화된 HMO의 생산
2.1.1 유전자 변형 미생물에 의한 시알릴화된 HMO의 생산
유전자 변형 세포를 배양함으로써 시알릴화된 HMO를 생산하는 것은 바람직하게는 하기와 같이 수행된다.
유전자 변형 세포를 포함하는 발효 생산은 바람직하게는 다음의 방식으로 일어난다. 외인적으로 첨가된 수용체는 배양 배지로부터 세포내로 내재화되며, 상기 세포에서 상기 수용체는 적절한 시알릴 트랜스퍼라제에 의해 매개된 효소적 시알릴화를 포함하는 반응에서 관심 시알릴 올리고사카라이드로 전환된다. 하나의 실시태양에서, 내재화는, 외인성 수용체가 세포의 원형질막을 가로질러 수동적으로 확산되는 수동적 수송 메카니즘을 통해 일어날 수 있다. 상기 흐름은 내재화될 수용체 분자와 관련하여 세포외 및 세포내 공간에서 농도 차이에 의해 유도되며, 상기 수용체는 농도가 더 높은 곳에서 농도가 더 낮은 구역으로 이동하여 평형을 이루는 경향이 있는 것으로 생각된다. 또 다른 실시태양에서, 외인성 수용체는, 상기 외인성 수용체가 세포의 수송 단백질 또는 퍼미아제의 영향하에 세포의 원형질막을 가로질러 확산되는 능동적 수송 메카니즘에 의해 세포에 내재화될 수 있다. 락토스 퍼미아제(LacY)는 갈락토스, N-아세틸-글루코사민, 갈락토실화 모노사카라이드(예를 들면, 락토스), N-아세틸-글루코사민화 모노사카라이드 및 그의 글루코시드 유도체로부터 선택된 모노- 또는 다이사카라이드에 대해 특이성을 갖는다. 이들 탄수화물 유도체는 모두 능동 수송에 의해 LacY 퍼미아제를 갖는 세포에 의해 용이하게 흡수되고, 글리코실화되기 전에 세포에 축적될 수 있다(WO 01/04341 호, 문헌[Fort et al. J. Chem. Soc., Chem. Comm. 2558 (2005)], EP-A-1911850 호, WO 2013/182206 호, WO 2014/048439 호 참조). 이것은, 세포가 그의 LacY 퍼미아제를 사용하여 상기 탄수화물 수용체를 세포내로 수송할 수 있으며, 상기 세포는 상기 수용체를 분해할 수 있는 임의의 효소, 특히 LacZ가 없기 때문이다. 내재화될 기질의 당 모이어티에 대한 특이성은 공지되어 있는 재조합 DNA 기법을 사용한 돌연변이에 의해 변화될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 외인적으로 첨가된 수용체는 락토스이며, 그의 내재화는 세포의 락토스 퍼미아제, 보다 바람직하게는 LacY에 의해 매개되는 능동 수송 메카니즘을 통해 일어난다. 세포에 내재화되면서, 상기 수용체는, 공지된 기법에 의해, 예를 들어, 세포의 염색체 내에 통합시킴으로써 또는 발현 벡터를 사용하여 세포 내에 도입되는 이종 유전자 또는 핵산 서열에 의해 발현된 시알릴 트랜스퍼라제에 의해 시알릴화된다. 유전자 변형 세포는 상응하는 시알릴 트랜스퍼라제에 의해 전달되기에 적합한 시알산 모노사카라이드 뉴클레오티드 공여체(전형적으로 CMP-시알산)를 생성하는 생합성 경로를 포함한다. 유전자 변형 세포는 2가지 방식으로 CMP-시알산을 생성할 수 있다. 하나의 방식으로, 외인적으로 첨가된 시알산은 시알산 퍼미아제에 의해, 보다 바람직하게는 nanT에 의해 암호화된 시알산 퍼미아제에 의해 능동적으로 또는 수동적으로, 바람직하게는 능동적으로 내재화되고, 이어서 CMP-NeuAc 신타제, 예를 들어, 이종 neuA에 의해 암호화된 CMP-NeuAc 신타제에 의해 CMP-시알산으로 전환된다. 또 다른 방식으로, UDP-GlcNAc를 중간체로서 ManNAc 및 시알산을 거쳐 CMP-시알산으로 전환시키는 이종 neuC, neuB 및 neuA를 발현시킴으로써, 내부적으로 이용가능한 상기 UDP-GlcNAc를 사용한다. 그 동안, 시알산 및 그 전구체에 대한 세포의 이화 활성은 알돌라제 유전자(nanA) 및/또는 ManNAc 키나제 유전자(nanK)의 불활성화/결실에 의해 억제된다. 내재화된 탄수화물 전구체는, 전술한 바와 같이 시알릴화되기 전에, 시알릴화가 아닌 글리코실화, 예를 들어, N-아세틸글루코사민화, 갈락토실화 및/또는 푸코실화의 대상이 될 수 있다.
유전자 변형 미생물에 의한 시알릴화된 HMO의 생산의 바람직한 실시태양에서, 시알릴화된 HMO를 생산할 수 있는 미생물은 이. 콜라이, 바람직하게는 neuBCA를 갖는 LacY+LacZ- 유전자형의 이. 콜라이이다. 상기 미생물의 이종 시알릴 트랜스퍼라제 유전자는 바람직하게는, 예를 들어, 탄수화물 수용체로서 외인적으로 첨가된 락토스로부터 3'-SL 또는 6'-SL을 각각 생성하는 것을 돕는 α-2,3- 또는 α-2,6-시알릴 트랜스퍼라제이다. 상기 미생물은, 예를 들어, WO 2007/101862 호, 문헌[Fierfort et al. J. Biotechnol. 134, 261 (2008)], 문헌[Drouillard et al. Carbohydr. Res. 345, 1394 (2010)] 및 WO 2017/101958 호에 개시되어 있다.
바람직한 실시태양에서, 유전자 변형 미생물은 이. 콜라이다.
따라서, 바람직한 실시태양에서, 생산 공정은 하기의 단계를 포함한다:
- 시알릴화된 HMO의 합성에 필요한 시알릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 재조합 유전자, 및
- 상기 시알릴 트랜스퍼라제에 대해 CMP-시알산의 생합성 경로를 암호화하는 하나 이상의 유전자
를 포함하는, LacY+ 표현형 또는 LacZ-, LacY+ 표현형의 유전자 변형 이. 콜라이 세포를 제공하고,
- 외인성 락토스 및 적합한 탄소 공급원의 존재하에 LacY+ 표현형 또는 LacZ-, LacY+ 표현형의 유전자 변형 이. 콜라이 세포를 배양함으로써, 시알릴화된 HMO를 포함하는 발효액을 생성한다.
상기와 같이 생성된 발효액은 생성 세포 및 배양 배지 둘 다에 시알릴화된 HMO를 포함한다. 세포내 시알릴화된 HMO를 수거하고 따라서 생성물의 역가를 상승시키기 위해, 전술한 방법은 세포를, 예를 들어, 가열에 의해 파괴하거나 투과시키는 선택적 단계를 추가로 포함할 수 있다.
시알릴화된 HMO를 포함하는 발효액은 다른 탄수화물 화합물들이 부수될 수 있다. 전형적으로, 또 다른 탄수화물 화합물은 시알릴화된 HMO를 제조하기 위한 발효 과정에서 수용체로 사용되고 전환되지 않은 채 남겨진 락토스이다. 또한, 또 다른 부수 탄수화물 화합물은 목적하는 시알릴화된 HMO, 예를 들어, LST를 제조하는 경우 락토-N-트리오스 II, LNT 또는 LNnT의 생합성 경로 중의 중간체 탄수화물일 수 있다. 이들의 양은, 예를 들어, WO 2012/112777 호 또는 WO 2015/036138 호에 개시된 바와 같이, 하기에 개시되는 분리/정제 단계에 적용되기 전에 발효액 중에서 실질적으로 감소시킬 수 있지만, 그렇게 할 필요는 없다. 하나의 실시태양에서, 청구된 방법은 비-탄수화물 오염물로부터 탄수화물 화합물이 부수되는 시알릴화된 HMO를 분리하기에 적합하지만, 탄수화물 화합물의 상대 비율은 청구된 방법의 과정에서 실질적으로 변하지 않는다. 그러므로, 하나의 태양에서, 청구된 방법의 목적은, 부수 탄수화물 화합물을 포함하는 임의의 오염물로부터 시알릴화된 HMO의 정제보다는, 발효액 또는 효소 반응 혼합물로부터 수성 매질 중의 비-탄수화물 오염물로부터 탄수화물 화합물이 부수되는 시알릴화된 HMO의 분리이다. 시알릴화된 모유 올리고사카라이드는 영양 목적으로 사용되기 위한 것이므로, 최종 영양 조성물 중 주요 시알릴화된 HMO 이외에 부수 탄수화물의 존재는 불리하지 않거나, 또는 심지어 유리할 수 있다. 그러나, 청구된 방법의 또 다른 실시태양은, 시알릴화된 HMO를 탄수화물 및 비-탄수화물 오염물로부터 분리함으로써 시알릴화된 HMO를 정제하여, 실질적으로 순수한 형태의 시알릴화된 HMO를 제공하기에 적합하다.
더욱이, 발효액에는 추가로 비-HMO 탄수화물 오염물이 존재할 수 있다. 이들은 전형적으로 락툴로스 및 그의 글리코실화 유도체이다. 락툴로스는, 락토스가 발효에 첨가되기 전에 및/또는 발효 중에 가열-멸균될 때 재배열에 의해 락토스로부터 생성될 수 있다. 락툴로스는 또한 세포에 의해 내재화되므로, 락토스와 유사하게, 동시 생체전환 반응에서 글리코실화될 수 있다. 그러나, 락툴로스 및 그의 글리코실화 유도체의 양은 바이오매스 분리 후 발효액의 전체 건조 고체 물질의 십분의 일 중량%를 초과하지 않는다.
본 발명에 따라서, 상기 발효액은 추가로, 다른 비-탄수화물 화합물로부터 및 선택적으로 하기에 설명되는 발효액의 탄수화물 화합물로부터 시알릴화된 HMO의 분리/정제 절차에 적용된다.
2.1.2 생체외 효소 반응에 의한 시알릴화된 HMO의 생산
트랜스시알리다제를 사용한 시알릴화된 락토스의 생체외 효소적 합성에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Maru et al. Biosci. Biotech. Biochem. 56, 1557 (1992)], 문헌[Masuda et al. J. Biosci. Bioeng. 89, 119 (2000)], WO 2012/007588 호, WO 2012/156897 호 또는 WO 2012/156898 호를 참조하시오. 시알릴트랜스퍼라제를 사용한 3'-SL의 생체외 효소적 합성에 대해서는, 예를 들어, WO 96/32492 호, 문헌[Gilbert et al. Nature Biotechnol. 16, 769 (1998)], WO 99/31224 호 또는 문헌[Mine et al. J. Carbohydr. Chem. 29, 51 (2010)]을 참조하시오.
본 발명에 따라서, 효소 반응 혼합물은 추가로, 다른 비-탄수화물 화합물로부터 및 선택적으로 하기에 설명되는 탄수화물 화합물로부터의 시알릴화된 HMO의 분리/정제 절차에 적용된다.
2.2 시알릴화된 HMO가 생성된 반응 혼합물로부터 시알릴화된 HMO의 수득
2.2.1. 한외여과 전 반응 혼합물의 선택적인 전처리
발효액은 전형적으로, 생성된 시알릴화된 HMO 이외에, 단백질, 단백질 단편, DNA, DNA 단편, 내독소, 생체 아민, 무기염, 미반응 탄수화물 수용체, 예를 들면, 락토스, 당-유사 부산물, 모노사카라이드, 착색 물체 등과 함께, 사용된 미생물 세포의 바이오매스를 함유한다. 선택적으로, 발효액 또는 효소 반응 혼합물의 거대분자를 보다 용이하게 여과할 수 있게 하기 위해, 반응 혼합물을 약 2.5 내지 7.5로의 pH 조정에 적용하고/하거나 30 내지 75℃의 열 처리에 적용하고/하거나 응집/응고에 의해 청정화시킨다. 또한 선택적으로, 반응혼합물은, 상기 개시된 바와 같이 처리되었든지 아니든지, 원심분리하거나, 미세여과시키거나 또는 필터 프레스 또는 드럼 필터 상에서 여과시킴으로써, 바이오매스 또는 침전/응집/변성된 효소(들)의 적어도 일부를 제거한다.
따라서, 본 발명의 맥락에서 사용된 "전처리된 반응 혼합물"이란 용어는 상기 단계들 중 적어도 하나를 포함한다.
2.2.2 원심분리 전 전처리
상기 방법은 현탁액으로부터 바이오매스를 분리하기 위한 원심분리를 포함할 수 있다. 추가로, 상기 현탁액은 임의의 원심분리에 앞서 전처리될 수 있다. 유리하게, 본 개시내용의 실시태양은 용해되지 않은 입자의 침강 속도를, 전처리를 하지 않은 원심분리에 비해 단지 몇배까지 증가시킬 수 있을 뿐 아니라, 실질적으로 수십배, 예를 들어, 1000 내지 10000배까지 증가시킬 수 있다. 추가로, 용해된 시알릴화된 HMO를 함유하는 투명한 현탁액(예를 들어, 용액)이 생성될 수 있다.
특정한 구현에서, 현탁액은 pH 조정에 의해 전처리될 수 있다. 특정한 구현에서, 현탁액은 희석에 의해 전처리될 수 있다. 특정한 구현에서, 현탁액은 가열에 의해 전처리될 수 있다. 특정한 변형에서, 개시된 전처리들 중 2 또는 3 가지가 수행될 수 있다. 하기에 개시되는 모든 전처리는 원심분리 전에 수행될 수 있다.
특히, 본 개시내용의 실시태양은 발효액과 같은 현탁액으로부터 시알릴화된 HMO를 함유하는 액체, 바람직하게는 수성 상의 분리에 사용될 수 있다.
유리하게, 전처리는 응집제(예를 들어, 무기 다가 금속 염 또는 하전된 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌이민(PEI) 또는 키토산)와 같은, 침강 속도와 같은 공정을 가속화시키는 물질)를 첨가하지 않고 수행할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 일부 또는 모든 실시태양에서 응집제가 사용되지 않을 수 있다.
개시된 전처리의 실시태양의 부재하에서 용액의 전형적인 원심분리는 단백질 및 다른 생체분자의 불특정 수율 및 불특정 제거 효율 및 예를 들면, OD600 측정에 의한 불특정 청정화된 정도 하에 실험실 규모의 시험에서 높은 중력에서 긴 원심분리 (체류) 시간을 요하였다. 따라서, 실험실 규모의 작업만 수행할 수 있기 때문에, 알려진 공정을 이용하여 제조를 효과적으로 상업화할 수 없었다.
그러나, 개시된 전처리 방법의 실시태양들을 이용하여, 다음과 같은 여러 이점이 야기되었다: 1) 실질적으로 더 높은 처리량이 달성된다; 2) 희석 및 열 처리(이들 둘 다 바이오매스/상등액 비를 최소화하고 바이오매스로부터 생성물의 추출을 촉진한다)로 인해, 용해된 시알릴화된 HMO의 더 높은 수율이 달성된다; 3) 전처리 후 미세 입자 제거가 OD600으로 정량화시 훨씬 더 효과적이다; 4) 생체분자 제거도 또한 더 효과적이다(예를 들어, 보다 낮은 pH에서의 변성 및 침전, 및 열 처리로 인한 단백질); 5) 미세여과 또는 한외여과와 같은 후속의 선택적인 막 여과 단계에서 더 높은 처리량, 즉, 더 높은 플럭스가 달성될 수 있다.
추가로, 본 개시내용의 실시태양은 더 짧은 단계 지속시간, 더 작고 덜 복잡한 장비, 더 적은 세척 화학물질을 가지며, 더 짧고 덜 잦은 세척을 필요로 한다.
하기의 추가의 세부사항에서 논의되는 바와 같이, 현탁액의 전처리는 pH 조정, 및/또는 희석, 및/또는 열 처리를 포함할 수 있다. 특정한 구현에서, pH 조정, 희석 및 열 처리의 3가지가 모두 수행될 수 있다. 대안적 실시태양에서, pH 조정 및 희석이 수행될 수 있다. 대안적 실시태양에서, pH 조정 및 열 처리가 수행될 수 있다. 대안적 실시태양에서, 열 처리 및 희석이 수행될 수 있다.
유리하게, 다수의 전처리 방법의 조합은 개별적 전처리에서 찾을 수 없는 개선된 상승 효과를 제공할 수 있다.
모든 전처리는 전처리된 현탁액의 원심분리 전에, 또는 그렇지 않으면 전처리된 현탁액의 시알릴화된 HMO의 분리 전에 수행될 수 있다. 특정한 실시태양에서, 하나 이상의 전처리 단계가 원심분리동안 일어날 수 있다. 예를 들어, 다단계 원심분리의 단계들 사이에 일어날 수 있다. 대안으로, 원심분리 용기가 원심분리동안 현탁액을 가열할 수 있다.
유리하게, 전처리는 현탁액(발효액) 중 고체 입자(바이오매스)의 침강 속도를 100 내지 20000배까지 증가시켜 원심분리에 의한 바이오매스 분리를 훨씬 더 효과적이 되게 하며 따라서 산업적 규모에 적용할 수 있게 만든다. 침강 속도 이외에, 적어도 3가지의 다른 파라미터들이 전처리로 인해 실질적으로 개선된다:
1) 액체 상(상등액) 중 용해된 시알릴화된 HMO의 수율이 단일 원심분리후 전처리 부재하에서의 단지 약 50 내지 70%에 비해 >90%로 증가될 수 있다;
2) 상등액 중 단백질 및 DNA 함량이 약 10배까지 감소될 수 있다;
3) 잔류 현탁 고체 함량이 또한, 미처리 발효액의 경우 약 10000g/10분에서의 OD600>1에 비해, 낮은 RCF= 약 3000g에서 3분동안의 원심분리에 의해 실질적으로 OD600 <0.1, 예를 들면, OD600 <0.05로, 예를 들어, 약 0.024의 OD600으로 감소될 수 있다.
2.2.2.1 pH 조정에 의한 전처리
하나 이상의 예시적 방법에서, 현탁액(예를 들어, 배양액, 발효액, 반응 혼합물)의 pH는 원심분리 전에/중에 조정할 수 있다.
발효액을 사용하는 많은 경우에서, 현탁액의 pH는 6 내지 7의 범위이다. 예를 들어, pH는 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 또는 6.9일 수 있다. 그러나, 다른 현탁액은 6 미만 7 초과와 같이 다른 시작 pH를 가질 수 있다. 현탁액의 특정 시작 pH는 제한되지 않는다.
유리하게, 원심분리 전에 현탁액의 pH를 감소시키면, 따라서 현탁액을 산성으로 만들면 침강 속도, 및 따라서 속도 및 수율 공정을 개선시킬 수 있다. 추가로, pH 조정은 외인적 응집 과정의 역할을 할 수 있기 때문에 응집제가 배제될 수 있다.
현탁액의 pH는 여러 방법을 통해 조정할 수 있다. 예를 들어, 산을 현탁액에 혼입시켜 현탁액의 pH를 감소시킬 수 있다. 산은 유기산일 수 있다. 다른 실시태양에서, 산은 무기산일 수 있다.
사용될 수 있는 산의 한 예는 황산, 예를 들면, 화학식 H2SO4를 갖는 황산이다. 예를 들어, 산은 20% H2SO4-용액일 수 있다. 그러나, 다른 산도 또한 사용할 수 있으며, 사용되는 특정 산은 제한되지 않는다. 예를 들어, 산은 H2SO4, HCl, H3PO4, 폼산, 아세트산 및 시트르산 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 이들 산 각각은 단독으로 또는 임의의 다른 산과 함께 사용될 수 있다.
pH 조정을 통해, 현탁액은 2 내지 5, 특히 3 내지 4의 pH로 낮춰질 수 있다. 예를 들어, pH 조정 전처리 후에, 현탁액은 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 5.0의 pH를 가질 수 있다. 특정한 구현에서, pH 조정 전처리 후에, 현탁액은 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 또는 4.9보다 큰 pH를 가질 수 있다. 몇몇 구현에서, pH 조정 전처리 후에, 현탁액은 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 5.0 미만의 pH를 가질 수 있다.
하나의 실시태양에서, 현탁액의 pH를 산성으로 조정한 후에, 전처리된 현탁액을, 예를 들어, 5 내지 15℃로 냉각시키고, 원심분리 전에 1 내지 15일동안 저장한다.
유리하게, 현탁액의 pH 조정은 입자(예를 들어, 바이오매스의 입자)의 표면 전하를 환원시킬 수 있다. 그러므로, pH 조정은, 예를 들면, 원심분리동안 바이오매스의 자가-응집을 촉진할 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, pH 조정은 단독으로, 희석과 함께, 열 처리와 함께, 또는 열 처리 및 희석 둘 다와 함께 수행할 수 있다.
2.2.2.2 희석에 의한 전처리
개시된 방법들의 하나 이상의 예시적 방법에서, 현탁액(예를 들어, 배양액, 발효액, 반응 혼합물)을 원심분리 전에/중에 희석할 수 있다.
특정한 실시태양에서, 희석된 현탁액의 질량이 현탁액의 원래 질량의 1.1 내지 10배, 바람직하게는 1.5 내지 10배, 보다 바람직하게는 2 내지 4배, 보다 바람직하게는 2.5 내지 3.5배가 되도록 현탁액을 희석할 수 있다. 예를 들어, 현탁액의 원래 질량의 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 또는 10.0 배까지 현탁액을 희석할 수 있다. 일부 실시태양에서, 현탁액의 원래 질량의 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 또는 10.0 배 미만까지 현탁액을 희석할 수 있다. 일부 실시태양에서, 현탁액의 원래 질량의 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 또는 9.5 배 이상까지 현탁액을 희석할 수 있다.
희석은 바람직하게는 물을 사용하여 수행할 수 있다. 물은 수돗물, 탈이온수 또는 증류수일 수 있다.
특정한 구현에서, 희석은 상등액 용액의 밀도를 저하시키고 점도를 저하시킬 수 있다. 희석의 또 다른 이점은 상등액 중 이용가능한 HMO 생성물의 수율을 증가시키는 것이다. 예를 들어, 희석하지 않으면, 발효에 의해 생성된 HMO의 약 50 내지 70% 만이 상등액으로 이동한다.
특정한 구현에서, 희석 후에 현탁액은 약 2 내지 10, 바람직하게는 2 내지 8, 보다 바람직하게는 2 내지 4, 보다 바람직하게는 2.5 내지 3.5의 희석율을 가질 수 있다. 희석율은 현탁액의 최종 부피(즉, 희석 후)와 현탁액의 초기 부피(즉, 희석 전)의 비이다. 예를 들어, 현탁액의 원래 부피의 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 또는 10.0 배까지 현탁액을 희석할 수 있다.
바람직하게, 현탁액은 특정한 생체-습윤-질량(BWM)을 달성하도록 희석될 수 있다. BWM은 원심분리 후 단리된 습윤 고체 펠릿 대 초기 발효액 질량의 비이다. BWM을 측정하기 위해, 교반 현탁액으로부터 샘플을 취하고, 투명한 상등액이 수득될 때까지(약 10분) 약 10000g의 상대 원심력(RCF) 하에 원심분리시킨다. 상등액을 경사분리하고, 고체 습윤 펠릿의 질량을 계량한다. BWM은 고체 습윤 펠릿 대 현탁액으로부터 취한 샘플의 중량의 백분율 비이다. 전형적인 현탁액은 상기 개시된 조건하에서 측정시, 25 내지 35%, 또는 최대 50%까지의 BWM을 갖는다. 따라서, 일부 실시태양에서, 현탁액은 그의 BWM이 20, 15, 10 또는 5% 미만, 바람직하게는 약 10 내지 15%가 되도록 희석될 수 있다(희석 후의 BWM은 희석 전과 동일한 조건하에서 측정한다). 보다 바람직하게, 상기 BWM은 약 2.5 내지 3.5의 희석율 하에서, 또는 희석된 현탁액의 질량이 현탁액의 원래 질량의 2.5 내지 3.5배가 되도록 희석함으로써 달성된다. 일부 실시태양에서, 원래 현탁액의 BWM이 30 내지 90%까지 감소되도록, 예를 들어, BWM이 희석 전에 측정된 원래 BMW의, 예를 들어, 2/3, 1/2, 1/3, 1/5 또는 1/10로 감소되도록 현탁액을 희석할 수 있다.
일부 실시태양에서, 희석은 다단계 원심분리, 예를 들면, 2-단계 원심분리동안 수행할 수 있다. 예를 들어, 물을 1차 원심분리 후에, 그러나 2차 원심분리 전에 첨가할 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 희석은 단독으로, pH 조정과 함께, 열 처리와 함께, 또는 열 처리 및 pH 조정 둘 다와 함께 수행할 수 있다.
2.2.2.3 열 처리에 의한 전처리
하나 이상의 예시적 방법에서, 현탁액을 원심분리 전에/중에 열 처리(예를 들어, 열 조정, 온도 처리, 온도의 변화)할 수 있다.
본 개시내용의 특정한 실시태양에서, 현탁액을 20 내지 120℃, 예를 들면, 30 내지 90, 30 내지 85, 또는 35 내지 65℃, 바람직하게는 45 내지 120℃, 바람직하게는 60 내지 90℃, 보다 바람직하게는 60 내지 80℃의 온도까지 가열함으로써 현탁액을 전처리할 수 있다. 에를 들어, 현탁액을 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 또는 120℃의 온도로 가열할 수 있다. 일부 실시태양에서, 현탁액은 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 또는 120℃보다 높은 온도로 가열할 수 있다. 일부 실시태양에서, 현탁액은 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 또는 120℃ 미만의 온도로 가열할 수 있다.
열 처리는 공지된 방법을 통해, 예를 들면, 오븐, 버너, 수조, 유조, 가열 맨틀, 또는 다른 가열 시스템을 사용하여 수행할 수 있다. 바람직하게, 열 처리는 다음의 열 전달 방법: 전도, 대류, 복사 중 하나 또는 그의 조합을 이용하는 산업용 가열기를 사용하여 수행한다. 상기 가열기는, 예를 들어, 순환 가열기, 덕(duck) 가열기, 수중 가열기, 증기를 사용한 가열 또는 가열 맨들을 통한 가열일 수 있다.
일부 실시태양에서, 현탁액은 특정 시간동안 열 처리 온도에서 유지시킬 수 있다. 예를 들어, 현탁액은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 또는 30 분동안 임의의 상기 나열된 가열 온도에서 유지시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 현탁액은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 또는 30 분 이상동안 임의의 상기 나열된 가열 온도에서 유지시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 현탁액은 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 또는 30 분 미만동안 임의의 상기 나열된 가열 온도에서 유지시킬 수 있다.
특정한 실시태양에서, 현탁액은 임의의 상기 열거된 온도로 직접 가열함으로써 전처리된다. 다른 구현에서, 현탁액은 단계적 가열을 포함할 수 있으며, 이때 상기 현탁액은 1차 시간동안 1차 온도로 가열될 수 있다. 이어서, 현탁액은 2차 시간동안 2차 온도로 가열될 수 있다. 1차 온도는 2차 온도보다 낮을 수 있다. 1차 온도는 2차 온도보다 높을 수 있다(예를 들어, 가열대신 냉각됨). 1차 시간은 2차 시간보다 길 수 있다. 1차 시간은 2차 시간보다 짧을 수 있다. 1차 온도는 전술한 온도 중 임의의 온도일 수 있다. 2차 온도는 전술한 온도 중 임의의 온도일 수 있다. 1차 시간은 전술한 시간 중 임의의 시간일 수 있다. 2차 시간은 전술한 시간 중 임의의 시간일 수 있다.
유리하게, 열 처리는 단백질 및 DNA와 같은 바이오매스의 일부를 변성시킬 수 있다. 추가로, 열 처리는 단백질 및 DNA와 같은 생체분자를 침전시킬 수 있다. 이것은 높은 초기 발효액 점도를 낮추는데 기여할 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 열 처리는 단독으로, 희석과 함께, pH 조정과 함께, 또는 pH 조정 및 희석 둘 다와 함께 수행할 수 있다.
2.2.2.4 pH 조정 및 희석에 의한 전처리
하나 이상의 예시적 방법에서, 현탁액의 pH 조정 및 희석을 둘 다 수행할 수 있다. 상기 두 방법의 병행은 투명한 상등액 및 용이한 원심분리를 가능하게 하는 상승 효과를 제공할 수 있다. 예를 들어, pH 조정은 표면 전하를 환원시킬 수 있으며, 희석과 병행되는 경우 더 우수한 HMO 수율을 제공해야 한다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 상기에서 상세히 논의된 바와 같이, 현탁액의 pH 조정을 먼저 수행할 수 있다. 일단 pH가 바람직한 대로 조정되었으면, 상기에서 상세히 논의된 바와 같이, 목적하는 수준으로 현탁액을 희석할 수 있다. 희석이 pH에 영향을 미치는 경우, pH는 적절한 pH를 유지하기 위해 재조정될 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 상기에서 상술한 바와 같이, 현탁액의 희석을 먼저 수행할 수 있다. 일단 현탁액을 목적하는 수준으로 희석하였으면, 현탁액을 pH 조정할 수 있다. 따라서, 최종 희석된 현탁액은 pH 조정될 수 있으며, 상기 pH 조정은 현탁액의 더 큰 부피로 인해 pH 조정 단독에 비해 더 많은 산이 사용되어야 할 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 희석 및 pH 조정은 동시에(예를 들어, 일반적으로 동시에, 함께, 일제히) 일어날 수 있다. 예를 들어, 물을 현탁액에 첨가할 수 있으며, 이 동안에 산도 또한 첨가할 수 있다. 대안으로, 산을 먼저 첨가할 수 있고 거의 동시에 물을 첨가할 수 있다. 하나 이상의 예시적 방법에서, pH 조정 및 희석은 반복 단계로 일어날 수 있다. 예를 들어, 일부의 산을 첨가한 다음, 일부의 물을 첨가할 수 있으며, 이것은 목적하는 pH 및 희석이 달성될 때가지 반복될 수 있다.
pH 조정 및 희석은 둘 다 원심분리 전에 또는 원심분리 중에 일어날 수 있다.
2.2.2.5 pH 조정 및 가열에 의한 전처리
하나 이상의 예시적 방법에서, 현탁액의 pH 조정 및 가열을 둘 다 수행할 수 있다. 상기 두 방법의 병행은 투명한 상등액 및 용이한 원심분리를 가능하게 하는 상승 효과를 제공할 수 있다. 예를 들어, pH 조정은 표면 전하를 환원시킬 수 있으며, 가열의 변성과 병행되는 경우 더 우수한 HMO 수율이 달성될 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 상기에서 상세히 논의된 바와 같이, 현탁액의 pH 조정을 먼저 수행할 수 있다. 일단 pH가 바람직한 대로 조정되었으면, 상기에서 상세히 논의된 바와 같이, 현탁액을 목적하는 온도(들)로 가열할 수 있다. 가열이 pH에 영향을 미치는 경우, pH는 적절한 희석을 유지하기 위해 재조정될 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 상기에서 상술한 바와 같이, 현탁액의 가열을 먼저 수행할 수 있다. 일단 현탁액을 목적하는 온도(들)로 가열하였으면, 현탁액을 pH 조정할 수 있다. 열 처리와 함께 필요한 산의 양은 pH 조정 단독을 기반으로 달라질 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 가열 및 pH 조정은 동시에(예를 들어, 일반적으로 동시에, 함께, 일제히) 일어날 수 있다. 예를 들어, 현탁액을 함유한 용기를 상기 논의된 하나 이상의 방법에서 가열할 수 있다. 용기가 가열되는 동안, 현탁액의 pH를 조정하기 위해 산을 현탁액에 첨가할 수 있다.
pH 조정 및 희석은 둘 다 원심분리 전에 또는 원심분리 중에 일어날 수 있다.
2.2.2.6 희석 및 가열에 의한 전처리
하나 이상의 예시적 방법에서, 현탁액의 희석 및 가열을 둘 다 수행할 수 있다. 상기 두 방법의 병행은 투명한 상등액 및 용이한 원심분리를 가능하게 하는 상승 효과를 제공할 수 있다. 예를 들어, 가열에 의해 달성된 단백질의 변성은 희석으로부터 보다 용이한 분리를 가능하게 할 수 있고, 이것은 더 우수한 HMO 수율로 이어질 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 상기에서 상세히 논의된 바와 같이, 현탁액의 희석을 먼저 수행할 수 있다. 일단 현탁액을 희석하였으면, 상기에서 상세히 논의된 바와 같이, 현탁액을 목적하는 온도(들)로 가열할 수 있다. 가열이 증발을 통한 물질의 손실과 같이 희석에 영향을 미치는 경우, 적절한 희석을 유지하기 위해 추가로 물을 첨가할 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 상기에서 상술한 바와 같이, 현탁액의 가열을 먼저 수행할 수 있다. 일단 현탁액을 목적하는 온도(들)로 가열하였으면, 물을 현탁액에 첨가할 수 있다. 물은 가열된 현탁액과 동일한 온도일 수 있거나, 또는 더 낮거나 높은 온도일 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 가열 및 희석은 동시에(예를 들어, 일반적으로 동시에, 함께, 일제히) 일어날 수 있다. 예를 들어, 현탁액을 함유한 용기를 상기 논의된 하나 이상의 방법에서 가열할 수 있다. 용기가 가열되는 동안, 현탁액의 희석을 조정하기 위해 물을 현탁액에 첨가할 수 있다. 대안으로, 차가운 현탁액에 첨가한 후에 희석된 현탁액의 목표 온도보다 높은 온도로 예열된 온수를 첨가함으로써 희석 및 가열이 동시에 일어날 수 있다.
가열 및 희석은 둘 다 원심분리 전에 또는 원심분리 중에 일어날 수 있다.
2.2.2.7 가열, pH 조정 및 희석에 의한 전처리
하나 이상의 예시적 방법에서, 현탁액의 희석, 가열 및 pH 조정의 3가지 전처리 모두를 수행할 수 있다. 상기 3가지 방법의 병행은 투명한 상등액 및 용이한 원심분리를 가능하게 하는 상승 효과를 제공할 수 있다. 따라서, 더 빠른 시간에 더 높은 수율이 달성될 수 있다. 3가지 전처리의 병행은 모든 전처리를 개별적으로 부가하는 것보다 더 큰 영향을 미칠 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 상기에서 상세히 논의된 바와 같이, 현탁액의 pH 조정을 먼저 수행할 수 있다. 일단 pH를 바람직한 대로 조정하였으면, 상기에서 상세히 논의된 바와 같이, 목적하는 수준으로 현탁액을 희석할 수 있다. 희석이 pH에 영향을 미치는 경우, pH는 적절한 pH를 유지하기 위해 재조정될 수 있다. 일단 희석이 수행되었으면, 상기에서 상세히 논의된 바와 같이, 현탁액을 목적하는 온도(들)로 가열할 수 있다. 가열이 pH 및/또는 희석에 영향을 미치는 경우, 적절한 pH 수준 및/또는 희석 수준을 유지하기 위해 pH 및/또는 희석을 재조정할 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 상기에서 상세히 논의된 바와 같이, 현탁액의 pH 조정을 먼저 수행할 수 있다. 일단 pH 조정이 수행되었으면, 현탁액을 목적하는 온도(들)로 가열할 수 있다. 가열이 pH에 영향을 미치는 경우, pH는 적절한 pH 수준을 유지하기 위해 재조정될 수 있다. 일단 가열이 수행되었으면, 현탁액을 목적하는 수준으로 희석할 수 있다. 희석이 pH에 영향을 미치는 경우, pH는 적절한 pH를 유지하기 위해 재조정될 수 있다. 물(예를 들어, 희석을 위한)은 가열된 현탁액과 동일한 온도일 수 있거나, 더 낮은 온도이거나 더 높은 온도일 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 상기에서 상술한 바와 같이, 현탁액의 가열을 먼저 수행할 수 있다. 일단 현탁액을 목적하는 온도(들)로 가열하였으면, 현탁액을 pH 조정할 수 있다. 열 처리와 함께 필요한 산의 양은 pH 조정 단독을 기반으로 달라질 수 있다. 일단 가열 및 pH 조정이 수행되었으면, 현탁액을 추가로 희석할 수 있다. 물은 가열된 현탁액과 동일한 온도일 수 있거나, 더 낮은 온도이거나 더 높은 온도일 수 있다. 희석후 필요한 경우, pH를 목적하는 수준으로 추가로 조정할 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 상기에서 상술한 바와 같이, 현탁액의 가열을 먼저 수행할 수 있다. 일단 현탁액을 목적하는 온도(들)로 가열하였으면, 현탁액을 희석할 수 있다. 물은 가열된 현탁액과 동일한 온도일 수 있거나, 더 낮은 온도이거나 더 높은 온도일 수 있다. 일단 가열 및 희석이 수행되었으면, 현탁액을 pH 조정할 수 있다. 열 처리 및 희석과 함께 필요한 산의 양은 pH 조정 단독을 기반으로 달라질 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 상기에서 상세히 논의된 바와 같이, 현탁액의 희석을 먼저 수행할 수 있다. 일단 현탁액을 희석하였으면, 현탁액을 목적하는 온도(들)로 가열할 수 있다. 가열이 증발을 통한 물질의 손실과 같이 희석에 영향을 미치는 경우, 적절한 희석을 유지하기 위해 추가로 물을 첨가할 수 있다. 가열 후에, 현탁액을 pH 조정할 수 있다. 열 처리 및 희석과 함께 필요한 산의 양은 pH 조정 단독을 기반으로 달라질 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 상기에서 상세히 논의된 바와 같이, 현탁액의 희석을 먼저 수행할 수 있다. 일단 희석되었으면, 현탁액을 pH 조정할 수 있다. 희석과 함께 필요한 산의 양은 pH 조정 단독을 기반으로 달라질 수 있다. pH 조정후에, 현탁액을 가열할 수 있다. pH 및 희석 수준을 유지하기 위해, 가열하는 동안 현탁액을 조정할 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 가열 및 희석은 동시에(예를 들어, 일반적으로 동시에, 함께, 일제히) 일어날 수 있다. 예를 들어, 현탁액을 함유한 용기를 상기 논의된 하나 이상의 방법에서 가열할 수 있다. 용기가 가열되는 동안, 현탁액의 희석을 조정하기 위해 물을 현탁액에 첨가할 수 있다. 가열 및 희석 후에, 현탁액의 pH를 조정할 수 있다. 대안으로, 현탁액의 pH는 동시에 수행되는 가열 및 희석 전에 조정될 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 가열 및 pH 조정은 동시에(예를 들어, 일반적으로 동시에, 함께, 일제히) 일어날 수 있다. 예를 들어, 현탁액을 함유한 용기를 상기 논의된 하나 이상의 방법에서 가열할 수 있다. 용기가 가열되는 동안, 현탁액의 pH를 조정하기 위해 산을 현탁액에 첨가할 수 있다. 가열 및 pH 조정 후에, 현탁액을 희석할 수 있다. 대안으로, 현탁액은 동시에 수행되는 가열 및 pH 조정 전에 희석될 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 희석 및 pH 조정은 동시에(예를 들어, 일반적으로 동시에, 함께, 일제히) 일어날 수 있다. 예를 들어, 물을 현탁액에 첨가할 수 있으며, 이 동안에 산도 또한 첨가할 수 있다. 대안으로, 산을 먼저 첨가할 수 있고, 물을 거의 동시에 첨가할 수 있다. 하나 이상의 예시적 방법에서, pH 조정 및 희석은 반복 단계로 일어날 수 있다. 예를 들어, 일부의 산을 첨가한 다음, 일부의 물을 첨가할 수 있으며, 이것은 목적하는 pH 및 희석이 달성될 때가지 반복될 수 있다. 희석 및 pH 조정 후에, 현탁액을 가열할 수 있다. 대안으로, 현탁액은 동시에 수행되는 희석 및 pH 조정 전에 가열될 수 있다.
하나 이상의 예시적 방법에서, 희석, pH 조정 및 가열은 동시에(예를 들어, 일반적으로 동시에, 함께, 일제히) 일어날 수 있다. 따라서, 3가지 전처리가 모두 동시에 일어날 수 있다.
가열, pH 조정 및 희석은 원심분리 전에 또는 원심분리 중에 일어날 수 있다.
2.2.3. 반응 혼합물 또는 전처리된 반응 혼합물의 한외여과(UF)
청구된 방법의 UF 단계는 다음을 포함한다:
i) 상기 반응 혼합물의 pH를 산성, 예를 들면, 약 3 내지 약 6, 바람직하게는 약 5 이하로 설정하고/하거나, 상기 반응 혼합물을 실온(또는 주위 온도)보다 높은 온도, 바람직하게는 약 30 내지 90℃, 보다 바람직하게는 약 35 내지 85℃로 가온시키고,
ii) 단계 i)에서 수득된 반응 혼합물을 약 5 내지 1000 kDa, 예를 들면, 10 내지 1000 kDa의 분획분자량(MWCO)을 갖고 바람직하게는 비-중합체 물질로 이루어진 한외여과(UF) 막과 접촉시킨다.
한외여과 단계는 발효액의 가용성 성분으로부터 바이오매스(또는 전처리된 반응 혼합물의 바이오매스의 잔류하는 부분) 및 바람직하게는, 또한 고분자량 현탁 고체를 분리하는 것으로, 상기 발효액의 가용성 성분은 투과액 중에서 한외여과 막을 통과한다. 상기 UF 투과액(UFP)은 생성된 시알릴화된 HMO를 함유하는 수용액이다.
바람직한 실시태양에서, 반응 혼합물을 원심분리하거나, 미세여과하거나 또는 필터프레스 또는 드럼 필터 상에서 여과하는 경우, UF 막은 비-중합체 물질, 보다 바람직하게는 세라믹 물질로 이루어진다.
하나의 실시태양에서, 반응 혼합물 또는 원심분리된 반응 혼합물의 pH는 산성, 예를 들면, 약 3 내지 약 6, 바람직하게는 약 5 이하의 값, 바람직하게는 약 3 내지 5의 값으로 설정된다. 상기 개시한 바와 같이 pH를 설정하는 것은, 보다 효과적인 변성 및 침전으로 인해 가용성 단백질 및 DNA와 같은 용해된 생체분자의 양의 실질적인 감소를 야기하기 때문에 특히 유리하다. 용해된 생체분자의 양이 적을수록 후속 단계에서 더 높은 MWCO UF 막을 사용하는 것이 가능하며 이것은 더 높은 생산성에 기여하는 요인인 더 우수한 플럭스를 제공한다.
다른 실시태양에서, 반응 혼합물 또는 원심분리된 반응 혼합물은 주위 온도, 즉, 실온 또는 반응 혼합물 온도보다 높은 온도까지, 예를 들어, 약 30 내지 약 90℃ 범위 내의 온도, 바람직하게는 약 35 내지 85℃, 예를 들어, 약 35 내지 75℃, 보다 바람직하게는 약 50 내지 75℃, 예를 들면, 약 60 내지 65℃로 가열한다. UF 전에 상기 열 처리는 반응 혼합물 중 생존 미생물의 총 수(총 미생물 수)를 실질적으로 감소시키므로 상기 방법의 나중 단계에서의 멸균 여과 단계는 필요하지 않을 수 있다. 더욱이, 상기 열 처리는 보다 효과적인 변성 및 침전으로 인해 가용성 단백질의 양을 감소시키고, 이것은 이온 교환 처리 단계(나중의 선택적 단계로서)에서 잔류 단백질 제거 효율을 증가시킨다.
바람직하게, 상기 단계 i)는 상기 반응 혼합물의 pH를 5 이하로 설정하고 상기 혼합물을 약 30 내지 90℃로 가온시키는 것을 포함하며, 이것은 특히 단백질 용해도를 감소시킴으로써 후속 UF 단계에서 UF 투과액내로의 단백질 누출을 감소시킨다.
청구된 방법의 단계 ii)에서는, 비-중합체 물질, 바람직하게는 세라믹 물질로 이루어진 UF 막을 사용한다. 상기 비-중합체 UF 막은 UF가 고온에서 수행되는 경우 상기 고온을 견딘다. 또한, 비-중합체 막, 유리하게는 세라믹 막의 적용가능한 플럭스는 통상적으로 동일하거나 유사한 MWCO를 갖는 중합체 UF 막보다 높다; 또한, 비-중합체 막, 유리하게는 세라믹 막은 오염되거나 막히는 경향이 적다. 산업적 용도에서, UF 막의 재생은 중요한 비용 및 기술 요인이다. 비-중합체 막, 유리하게는 세라믹 막은, 고온에서의 부식성/강한 산 처리(중합체 막에는 적용할 수 없음)를 포함한 거친 정치세척(CIP) 조건을 이용하게 하며, 이것은 높은 현탁 고체 함량을 갖는 발효 스트림을 한외여과시킬 때 필요할 수 있다. 더욱이, 비-중합체 막, 유리하게는 세라믹 막은 높은 교차흐름으로 순환하는 고체 입자에 대한 불활성 및 내마모성으로 인해 더 긴 수명을 갖는다.
약 5 내지 약 1000 kDa 범위, 예를 들면, 약 5-250, 5-500, 5-750, 50-250, 50-500, 50-750, 100-250, 100-500, 100-750, 250-500, 250-750, 500-750 kDa, 또는 임의의 다른 적합한 부분범위의 분획분자량(MWCO)을 갖는 임의의 통상적인 비-중합체 한외여과 막, 유리하게는 세라믹 막을 사용할 수 있다.
상기 방법의 단계 ii)는 저온에서(약 5℃ 내지 실온), 대략 실온에서, 또는 승온에서, 바람직하게는 승온에서 수행할 수 있다. 승온은 바람직하게는 약 65℃를 초과하지 않으며; 적합한 온도 범위는, 예를 들어, 약 35-50, 35-65, 45-65, 50-65, 55-65 또는 60-65℃일 수 있다. 승온에서 수행된 UF 단계는 실질적으로 반응 혼합물 중 생존 미생물의 총수(총 미생물 수)를 감소시키므로, 상기 방법의 나중 단계에서 멸균 여과 단계가 필요하지 않을 수 있다. 더욱이, 상기 단계는 보다 효과적인 변성 및 침전으로 인해 가용성 단백질의 양을 감소시키고, 이것은 이온 교환 처리 단계(나중의 선택적인 단계로서)에서 잔류 단백질 제거 효율을 증가시킨다.
바람직하게, 단계 ii)를 승온에서 수행하는 경우, 선행 단계 i)에서 반응 혼합물의 pH는 약 5 이하로 설정하는 것이 유리한데, 그 이유는 특히 단백질 용해도를 감소시켜 UF 투과액 내로의 단백질 누출을 감소시키기 때문이다.
한외여과 단계는 전량여과 또는 교차흐름 방식으로 적용할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 방법에서는 단일 UF 단계만을 수행한다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 방법은 상이한 MWCO를 갖는 막을 사용하여, 예를 들어, 첫 번째 막이 두 번째 막보다 높은 MWCO를 갖는 2개의 한외여과 분리를 이용하여 하나보다 많은 한외여과 단계를 포함할 수 있으나, 단, 적어도 하나의 UF 막은 비-중합체 막, 바람직하게는 세라믹 막이어야 한다. 상기 방식은 발효액의 더 높은 분자량 성분들의 보다 우수한 분리 효율을 제공할 수 있다.
또한 하나의 실시태양에서, 한외여과는 정용여과와 병행될 수 있다.
상기 개시된 단계 i) 및 ii)를 포함하는 한외여과를 수행한 후에, UF 투과액은 관심 시알릴화된 HMO를 포함하여, 사용된 막의 MWCO, 선택적으로 일련의 막을 사용하는 경우 마지막 막의 MWCO보다 낮은 분자량을 갖는 물질을 함유한다.
2.2.4. 원심분리
일부 또는 모든 상기 전처리 후에, 원심분리에 의해 바이오매스를 현탁액으로부터 분리한다. 상기 분리는 한외여과와 같이 상당한 시간을 소요할 수 있는 다른 공정들에 비해 유리할 수 있다. 상기 원심분리는 실험실 규모이거나, 또는 이전의 원심분리 방법에 비해 유리하게, 상업적 규모(예를 들어, 산업적 규모, 전체 생산 규모)일 수 있다.
일부 실시태양에서, 다단계 원심분리를 이용할 수 있다. 예를 들어, 일련의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회의 원심분리 단계를 수행할 수 있다. 다른 구현에서, 원심분리는 단일 단계일 수 있다.
원심분리는, 긴 정치세척(CIP) 절차, 고가의 세라믹 막의 필요 및 큰 크기/큰 설치 면적 하에 실험실 및 전체 생산 규모 둘 다에서의 긴 한외여과에 비해 빠른 바이오매스-제거를 제공한다.
이어서, 한외여과에 비해 보다 효과적이고 경제적인 방식에 의해 바이오매스 분리가 달성된다. 산업용 연속 한외여과에 의한 현재의 바이오매스 제거는 낮은 투과 유량을 가져, 높은 체류 시간(> 1 시간), 높은 장비 설치 면적과 연관된 높은 막 면적, 강력한 교차흐름 펌프에 의한 높은 에너지 소비를 요하고, 발효액-의존성이면서 때때로 예측할 수 없는 성능을 가지며, 24 시간 이하의 작업 시간마다 긴 CIP(5 시간)를 필요로 하고, UF 유닛 및 세라믹 막 둘 다에 매우 높은 CapEx를 가지며, 큰 크기/설치공간을 갖는다.
특정한 실시태양에서, 플롯트웩(Flottweg)이 설계하고 제조한 세디칸터(Sedicanter)® 원심분리기를 사용할 수 있다.
원심분리기의 특정한 유형은 제한되지 않으며, 많은 유형의 원심분리기를 사용할 수 있다. 원심분리는 연속 공정일 수 있다. 일부 실시태양에서, 원심분리는 공급물 첨가를 가질 수 있다. 예를 들어, 원심분리는 연속 공급물 첨가를 가질 수 있다. 특정한 실시태양에서, 원심분리는 고체 제거, 예를 들면, 습윤 고체 제거를 포함할 수 있다. 습윤 고체 제거는 일부 구현에서는 연속적일 수 있고, 다른 구현에서는 주기적일 수 있다.
예를 들어, 원추형 판 원심분리기(예를 들어, 디스크 보울형 또는 디스크 스택형 분리기)를 사용할 수 있다. 상기 원추형 판 원심분리기를 이용하여 높은 원심력에 의해, 액체로부터 고체(통상적으로 불순물)를 제거하거나 또는 2개의 액체 상을 서로로부터 분리할 수 있다. 상기 원심력에 적용되는 더 조밀한 고체 또는 액체는 회전하는 보울 벽쪽으로 바깥쪽으로 이동하는 반면, 덜 조밀한 유체는 중심쪽으로 이동한다. 특정 판(디스크 스택으로 알려진)은 표면 침강 면적을 증가시켜, 분리 공정을 가속화시킨다. 다양한 스택 디자인, 배열 및 형태를 존재하는 공급물의 유형에 따라 다양한 공정에 사용한다. 이어서, 농축된 더 조밀한 고체 또는 액체는, 원추형 판 원심분리기의 디자인에 따라서, 연속적으로, 수동으로 또는 간헐적으로 제거할 수 있다. 상기 원심분리기는 작은 비율의 현탁 고체를 갖는 액체를 청정화하는데 매우 적합하다.
원심분리기는 경사판 침강기 원리를 이용하여 작동한다. 입자 침강 거리를 감소시키기 위해 수평면에 대해 경사각 θ를 갖는 평행판들의 세트를 장착한다. 경사각의 이유는 판 위에 침강된 고체가 원심력에 의해 아래로 미끄러져서 축적되지 않고 인접 판 사이에 형성된 통로를 막지 않도록 하기 위한 것이다.
상기 유형의 원심분리기는 노즐형, 수동-세척형, 자가-세척형, 및 밀폐형과 같은 다양한 디자인을 가질 수 있다. 특정 원심분리기는 제한되지 않는다.
원심분리기에 영향을 미치는 요인은 디스크 각도, 중력의 영향, 디스크 간격, 공급 고체, 배출을 위한 원추 각, 배출 빈도, 및 액체 배출을 포함한다.
대안으로, 고체 보울형 원심분리기(예를 들어, 디캔터 원심분리기)를 사용할 수 있다. 이것은 침강 원리를 이용하는 원심분리기의 한 유형이다. 원심분리기는 연속 회전으로부터 야기되는 원심력을 사용하여 상이한 밀도를 갖는 두가지 물질로 이루어진 혼합물을 분리하는데 사용된다. 원심분리기는 통상적으로 고체-액체, 액체-액체 및 고체-고체 혼합물을 분리하는데 사용된다. 산업적 용도의 고체 보울형 원심분리기의 한가지 이점은 다른 유형의 원심분리기에 비해 설치의 단순성이다. 원추형, 원통형 및 원추-원통형의 고체 보울형 원심분리기의 3가지 디자인 유형이 있다.
고체 보울형 원심분리기는 다수의 상이한 디자인을 가질 수 있으며, 상기 디자인 중 임의의 디자인을 개시된 방법에 사용할 수 있다. 예를 들어, 원추형 고체 보울형 원심분리기, 원통형 고체 보울형 원심분리기, 및 원추-원통형 보울형 원심분리기를 사용할 수 있다.
나선형 스크류 컨베이어의 도움으로, 고체 보울형 원심분리기는 빠른 회전하에서 형성된 원심력에 의해 상이한 밀도를 갖는 2가지 물질을 분리한다. 공급 슬러리는 컨베이어에 진입하고 배출구를 통해 회전 보울내로 전달된다. 컨베이어와 보울의 회전 사이에 약간의 속도 차이가 존재하여, 폐수가 보울 벽에 도입되는 정지 대역으로부터 컨베이어로 고체를 이동시킨다. 원심력에 의해, 수집된 고체는 보울 벽을 따라, 풀의 밖으로 보울의 테이퍼링된 끝에 위치한 탈수 비치 위로 이동한다. 결국, 분리된 고체는 고체 배출구로 이동하는 반면 액체는 액체 배출구로 이동한다. 청정화된 액체는 조절가능한 오버플로 부분을 통해 반대 방향으로 컨베이어를 통해 흐른다.
원심분리는 여러 속도 및 체류 시간으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 원심분리는 20000g, 15000g, 10000g, 또는 5000g의 상대 원심력(RCF) 하에 수행할 수 있다. 일부 실시태양에서, 원심분리는 20000g, 15000g, 10000g, 또는 5000g 미만의 상대 원심력(RCF) 하에 수행할 수 있다. 일부 실시태양에서, 원심분리는 20000g, 15000g, 10000g, 또는 5000g보다 큰 상대 원심력(RCF) 하에 수행할 수 있다.
일부 실시태양에서, 원심분리는 작업량으로 특징지을 수 있다. 일부 실시태양에서, 작업량은 1, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 300 또는 500 리터(l)일 수 있다. 일부 실시태양에서, 작업량은 1, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 300 또는 500 리터(l) 미만일 수 있다. 일부 실시태양에서, 작업량은 1, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 300 또는 500 리터(l)보다 클 수 있다.
일부 실시태양에서, 원심분리는 공급물 유량으로 특징지을 수 있다. 일부 실시태양에서, 공급물 유량은 100, 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10000, 20000, 40000 또는 100000 l/시간일 수 있다. 일부 실시태양에서, 공급물 유량은 100, 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10000, 20000, 40000 또는 100000 l/시간보디 클 수 있다. 일부 실시태양에서, 공급물 유량은 100, 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10000, 20000, 40000 또는 100000 l/시간 미만일 수 있다.
원심분리에 소모되는 시간(예를 들어, 체류 시간)의 정도도 또한 달라질 수 있다. 예를 들어, 체류 시간은 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 분일 수 있다. 일부 실시태양에서, 체류 시간은 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 분보다 클 수 있다. 일부 실시태양에서, 체류 시간은 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 분 미만일 수 있다.
2.2.4.1 상등액
전술한 원심분리 공정은 개선된 상등액을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 상등액은 시알릴화된 HMO를 함유할 수 있으나, 잔류 물질은 분리될 수 있다. 따라서, 상등액은 투명한(예를 들어, 청정화된, 일반적으로 투명한, 주로 투명한) 상등액일 수 있다. 잔류 물질(상등액의 투명도의 결여를 야기할 수 있음)은, 예를 들어, 바이오매스일 수 있으며, 상기 바이오매스는 세포, 세포 단편, 작은 입자 및 생체분자 중 하나 이상이다. 생체분자는, 예를 들어, 단백질, RNA 및 DNA일 수 있다. 따라서, 상등액은 정제된 시알릴화된 HMO를 함유하는 청정화된 상등액일 수 있다.
상등액의 투명도의 한 예로, 전형적인 발효액은 순수에 비해 10보다 큰, 매우 높은 600 nm에서의 광학 밀도(OD600)를 가질 수 있다. OD600은 통상적으로 분광광도계로 측정하며; OD600이 현탁된 입자의 높은 함량으로 인해 1보다 높으면 샘플의 희석이 필요할 수 있다(따라서 OD600 값은 희석과 관련하여 계산된다). 그러나, 상기 언급된 공정들 후에, OD600은 1.0, 0.7, 0.5, 0.3, 0.2, 0.1 또는 0.05보다 낮아질 수 있으며, 상기 값은 희석하지 않고, 수득된 상등액의 미세여과된 샘플에 대해 측정된 것이다. 일부 실시태양에서, OD600은 1.0, 0.7, 0.5, 0.3, 0.2, 0.1 또는 0.05보다 높아질 수 있다. 일부 실시태양에서, OD600은 1.0, 0.7, 0.5, 0.3, 0.2, 0.1 또는 0.05일 수 있다. OD600이 0.1 미만인 경우, 현탁된 입자는 육안으로 검출될 수 없으며, 상등액은 투명한 용액으로 보일 것이다.
추가로, 상등액 중의 단백질도 또한 감소되어, 추가의 투명도를 제공할 수 있다. 원심분리후 상등액 중의 단백질은 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 500, 400, 300, 200, 100 또는 50 mg/l 미만일 수 있다. 일부 실시태양에서, 원심분리후 상등액 중의 단백질은 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 500, 400, 300, 200, 100 또는 50 mg/l보다 클 수 있다. 일부 실시태양에서, 원심분리후 상등액 중의 단백질은 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 500, 400, 300, 200, 100 또는 50 mg/l일 수 있다.
추가로, 유리하게, 개시된 방법의 실시태양은 이전의 방법들에 비해 더 높은 생성물 수율을 제공할 수 있다. 청정화된 상등액은 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95%의 생성물 수율을 가질 수 있다. 청정화된 상등액은 > 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95%의 생성물 수율을 가질 수 있다. 청정화된 상등액은 < 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95%의 생성물 수율을 가질 수 있다.
임의의 상기 상등액의 성질은 단일 단계의 원심분리를 통해 수득될 수 있다. 대안으로, 상기 상등액의 성질은 여러 단계의 원심분리를 통해 수득될 수 있다.
2.2.5. 정제를 위한 후처리
전술한 UF 투과액(2.2.3) 또는 CF 상등액(2.2.4.1)을 생성한 후에, 추가의 후처리 단계를 수행할 수 있다. 이것은, 예를 들어, UF 투과액 또는 상등액으로부터 시알릴화된 HMO를 단리(예를 들어, 수득)하기 위해 수행할 수 있다. 여러 상이한 방법들이 하기에 논의된다. 상기 방법은 개시된 후처리 단계들 중 어느 하나를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 대안적 실시태양에서, 상기 방법은, 단계들의 임의의 구성하에, 개시된 후처리 단계들 중 하나보다 많은 단계를 포함할 수 있다.
2.2.5.1 원심분리후 UF
일부 실시태양에서, 후처리 방법은 원심분리후 수득된 청정화된 상등액의 한외여과(UF) 또는 미세여과(MF)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 여과는 <2 μm 및 >2 nm의 기공 크기 및/또는 >1000 Da 또는 10000 Da의 MWCO를 갖는 막을 사용할 수 있다. 기공 크기 또는 분획분자량은 생성물(시알릴화된 HMO)이 막의 기공을 통과하도록 충분히 커야한다. 선택적으로, 정용여과를 추가로 수행할 수 있으며, 여기에서는 시알릴화된 HMO가 투과액 스트림 중에 수집된다.
선택적인 후처리 단계에서, 한외여과는 원심분리후 바이오매스의 잔류 부분을 분리하기 위한 것이다. UF(또는 MF) 막은 중합체 또는 비-중합체 물질로 이루어질 수 있다. 바람직하게, UF 막은 비-중합체 물질, 보다 바람직하게는 세라믹 물질로 이루어진다. 상기 비-중합체 UF 막은 UF가 고온에서 수행되는 경우 상기 고온을 견딘다. 또한, 비-중합체 막, 유리하게는 세라믹 막의 적용가능한 플럭스는 통상적으로 동일하거나 유사한 MWCO를 갖는 중합체 UF 막보다 높다; 또한, 비-중합체 막, 유리하게는 세라믹 막은 오염되거나 막히는 경향이 적다. 산업적 용도에서, UF 막의 재생은 중요한 비용 및 기술 요인이다. 비-중합체 막, 유리하게는 세라믹 막은, 고온에서의 부식성/강한 산 처리(중합체 막에는 적용할 수 없음)를 포함한 거친 정치세척(CIP) 조건을 이용하게 하며, 이것은 높은 현탁 고체 함량을 갖는 발효 스트림을 한외여과시킬 때 필요할 수 있다. 더욱이, 비-중합체 막, 유리하게는 세라믹 막은 높은 교차흐름으로 순환하는 고체 입자에 대한 불활성 및 내마모성으로 인해 더 긴 수명을 갖는다.
약 1 내지 약 1000 kDa, 예를 들어, 약 1-10, 10-1000, 5-250, 5-500, 5-750, 50-250, 50-500, 50-750, 100-250, 100-500, 100-750, 250-500, 250-750, 500-750 kDa, 또는 임의의 다른 적합한 부분범위의 분획분자량(MWCO) 범위를 갖는 임의의 통상적인 비-중합체 한외여과 막, 유리하게는 세라믹 막을 사용할 수 있다.
UF는 저온에서(약 5℃ 내지 실온), 대략 실온에서, 또는 승온에서, 바람직하게는 승온에서 수행할 수 있다. 승온은 바람직하게는 약 80℃를 초과하지 않으며; 적합한 온도 범위는, 예를 들어, 약 35-50, 35-80, 45-65, 50-65, 55-65 또는 60-80℃일 수 있다. 승온에서 수행된 UF 단계는 실질적으로 반응 혼합물 중 생존 미생물의 총수(총 미생물 수)를 감소시키므로, 상기 방법의 나중 단계에서 멸균 여과 단계가 필요하지 않을 수 있다. 더욱이, 상기 단계는 보다 효과적인 변성 및 침전으로 인해 가용성 단백질의 양을 감소시키고, 이것은 이온 교환 처리 단계(나중의 선택적인 단계로서)에서 잔류 단백질 제거 효율을 증가시킨다.
한외여과 단계는 전량여과 또는 교차흐름 방식으로 적용할 수 있다. 또한 하나의 실시태양에서, 한외여과는 정용여과와 병행될 수 있다. 시알릴화된 HMO는 UF 투과액(UFP) 중에 수집된다.
2.2.5.2 나노여과
본 발명의 방법은 선택적인 단계로서 나노여과(NF) 단계를 포함한다. 바람직하게, NF 단계는 반응 혼합물(2.2.3) 또는 원심분리된 반응 혼합물(2.2.5.1)의 한외여과 바로 다음에 뒤따른다, 즉, NF 단계의 공급물은 관심 시알릴화된 HMO를 함유하는 UF 투과액이다. 또한 바람직하게, NF 단계는 원심분리 단계(2.2.4) 바로 다음에 이어진다. 선택적으로, UF 투과액 또는 청정화된 상등액은 NF 단계를 수행하기 전에 활성탄(하기 참조)을 사용하여 탈색시킬 수 있다. 상기 나노여과 단계는 UF 투과액 또는 청정화된 상등액을 농축시키고/시키거나, 이온, 주로 1가 이온, 및 모노사카라이드와 같은 시알릴화된 HMO보다 낮은 분자량을 갖는 유기 물질을 제거하기 위해 유리하게 이용될 수 있다. 나노여과 막은 선행 단계에서 사용된 한외여과 막(들)보다 낮은 MWCO를 가지며 관심 시알릴화된 HMO의 잔류를 보장한다.
나노여과의 첫 번째 태양에서, NF 막의 MWCO는 관심 시알릴화된 HMO의 분자량의 약 25 내지 50%, 전형적으로 약 150 내지 500 Da이다. 이와 관련하여, 관심 시알릴화된 HMO는 NF 잔류액(NFR)에 축적된다. 나노여과는 물을 사용한 정용여과와 병행되어 1가 이온과 같은 투과성 염을 보다 효과적으로 제거하거나 또는 그의 양을 감소시킬 수 있다.
상기 첫 번째 태양의 하나의 실시태양에서, NF는 UF 뒤에 이어져서 UF 투과액은 정용여과 없이 나노여과되고, 시알릴화된 HMO를 함유하는 NF 잔류액은 수거되어 상기 방법의 추가의 분리 단계(들)에 적용된다.
상기 첫 번째 태양의 다른 실시태양에서, NF는 UF 다음에 이어져서 UF 투과액은 나노여과된 후 정용여과되고, 시알릴화된 HMO를 함유하는 NF 잔류액은 수거되어 상기 방법의 추가의 분리 단계(들)에 적용된다.
나노여과의 상기 첫 번째 태양은, 락토스를 함유하지 않거나 또는 단지 미량의 락토스(관심 시알릴화된 HMO의 중량의 최대 약 1 내지 2%)를 함유하는 UF 투과액에 유리하게 적용할 수 있다.
보다 많은 락토스를 함유하는 UF 투과액에 유리하게 적용가능한 나노여과의 두 번째 태양에서, 막은 600 내지 3500 Da의 MWCO를 가져 트라이사카라이드 이상의 시알릴화된 HMO의 잔류를 보장하고 락토스의 적어도 일부가 막을 통과하도록 허용하며, 이때 막의 활성 (상부) 층은 폴리아미드로 이루어지고, 상기 막 상에서의 MgSO4 배제율은 약 20 내지 90%, 바람직하게는 50 내지 90%이다.
"트라이사카라이드 이상의 시알릴화된 HMO의 잔류를 보장하는"이란 용어는 바람직하게는 나노여과 단계동안 트라이사카라이드 이상의 시알릴화된 HMO는 막을 통과하지 않거나 또는 적어도 상당히 통과하지 않으며 따라서 그의 대부분이 잔류액에 존재할 것임을 의미한다. "락토스의 적어도 일부가 막을 통과하도록 허용하는"이란 용어는 바람직하게는 락토스가 적어도 부분적으로 막을 관통하여 투과액에 수거될 수 있음을 의미한다. 락토스의 높은 배제율(약 90%)의 경우, 락토스의 전부 또는 적어도 대부분을 투과액에 유입시키기 위해 순수를 사용한 후속 정용여과가 필요할 수 있다. 락토스 배제율이 높을 수록 효과적인 분리를 위해 더 많은 정용여과수가 필요하다.
NF의 두 번째 태양에 따라 적용된 나노여과 막은 트라이사카라이드 이상의 시알릴화된 HMO가 효과적으로 보유되기 위해 상기 트라이사카라이드 이상의 시알릴화된 HMO에 치밀해야 한다. 바람직하게, 상기 트라이사카라이드 이상의 시알릴화된 HMO의 배제율은 95%보다 높고, 보다 바람직하게는 97%, 훨씬 더 바람직하게는 99%이다. 3500 Da보다 큰 MWCO를 갖는 막은 더 많거나 상당한 양의 트라이사카라이드 이상의 시알릴화된 HMO가 막을 통과하도록 허용하며 따라서 트라이사카라이드 이상의 시알릴화된 HMO의 감소된 잔류를 나타낼 것으로 예상되므로, 본 발명의 목적에 적합하지 않고, 배제될 수 있다. 락토스의 배제율은 80 내지 90% 이하인 것이 바람직하다. 락토스 배제율이 90 ± 1-2%가 되는 경우, 트라이- 또는 테트라사카라이드 시알릴화된 HMO 배제율은 바람직하게는 실질적으로 만족스러운 분리를 달성하기 위해 약 99% 이상이어야 한다.
상기 요건들은, 막이 MgSO4에 대해 비교적 느슨한 경우, 즉 그의 배제율이 약 50 내지 90%인 경우, 동시에 충족된다. 이와 관련하여, 상기 명시된 막은 트라이사카라이드 이상 시알릴화된 HMO에 대해 치밀하고, 모노사카라이드 및 락토스뿐 아니라 MgSO4에 대해서는 느슨하다. 그러므로, 모유 올리고사카라이드를 효소적으로 또는 발효에 의해 제조하는데 전구체인 락토스를 시알릴화된 모유 올리고사카라이드 생성물로부터 나노여과에 의해 우수한 효율로 분리하는 것이 가능하며, 추가로 2가 이온의 실질적인 부분이 또한 투과액으로 이동한다. 일부 실시태양에서, MgSO4 배제율은 30-90%, 20-80%, 40-90%, 40-80%, 60-90%, 70-90%, 50-80%, 50-70%, 60-70% 또는 70-80%이다. 바람직하게, 상기 막 상에서의 MgSO4 배제율은 80 내지 90%이다. 또한 바람직하게, 상기 막은 MgSO4에 대한 것보다 낮은 NaCl에 대한 배제율을 갖는다. 하나의 실시태양에서, NaCl에 대한 배제율은 약 50% 이하이다. 다른 실시태양에서, NaCl에 대한 배제율은 약 40% 이하이다. 다른 실시태양에서, NaCl에 대한 배제율은 약 30% 이하이다. 다른 실시태양에서, NaCl에 대한 배제율은 약 20% 이하이다. 약 20 내지 30%의 NaCl 배제율에서, 잔류액 중 모든 1가 염들의 실질적인 감소가 또한 달성될 수 있다.
또한 바람직하게, 일부 실시태양에서, 막의 순수 플럭스는 적어도 50 l/m2h이다(23 내지 25℃, 10 바 및 300 l/h의 일정 교차흐름에서 측정시). 바람직하게, 막의 순수 플럭스는 적어도 60 l/m2h, 적어도 70 l/m2h, 적어도 80 l/m2h 또는 적어도 90 l/m2h이다.
NF 단계의 두 번째 태양에 적합한 나노여과 막의 활성 층 또는 상부 층은 바람직하게는 폴리아미드로 제조된다. 상이한 유형의 막, 예를 들어, 락토스 및 3'-SL을 분리하기 위한 활성 층으로 설폰화 PES를 갖는 NTR-7450(문헌[Luo et al. (Biores. Technol. 166, 9 (2014)]; 문헌[Nordvang et al. (Separ. Purif. Technol. 138, 77 (2014)])은 유망한 분리 효율을 갖는 것으로 보이지만, 본 발명에 사용된 상기 명시된 막은 항상 시알릴화된 HMO로부터 락토스의 더 우수한 분리를 보여준다. 또한, 상기 언급된 NTR-7450 막은 오염되면, 전형적으로 플럭스의 감소, 락토스 배제율의 증가 및 따라서 감소된 분리율을 야기한다. 또한 바람직하게, 폴리아미드 막은 아민으로 페닐렌 다이아민 또는 피페라진 구성요소, 보다 바람직하게는 피페라진을 갖는 폴리아미드(피페라진-기반 폴리아미드로도 지칭됨)이다.
또한 바람직하게, 본 발명의 목적에 적합한 막은 박막 복합체(TFC) 막이다.
적합한 피페라진-기반 폴리아미드 TFC 막의 예는 트라이셉(TriSep)® UA60이다.
NF 단계의 두 번째 태양에 적합한 나노여과 막은 상기 특징들 중 일부 또는 전부를 특징으로 하며, 따라서 하기의 이점들 중 하나 이상이 제공된다: 트라이사카라이드 이상의 시알릴화된 HMO로부터 선택적으로 및 효과적으로 락토스를 제거하여 농축된 트라이사카라이드 이상의 시알릴화된 HMO 분획을 수득하고; 1가 뿐 아니라 2가 염을 효과적으로 제거하므로 이온 교환 단계가 필요하지 않을 수 있거나, 또는 염분제거가 여전히 필요한 경우 이온 교환 처리가 실질적으로 수지를 덜 필요로 하고; 선행 기술에서 동일하거나 유사한 목적으로 사용된 다른 막들에 비해 나노여과시 더 높은 플럭스가 유지될 수 있어 작업 시간을 단축시키고; 상기 개시된 막이 선행 기술의 용액에 비해 막힐 가능성이 적고; 상기 개시된 막은 세척되고 완전히 재생될 수 있으므로 그 성능의 실질적인 감소없이 재활용될 수 있다.
NF 단계의 두 번째 태양의 하나의 실시태양에서, 상기 단계는 다음을 포함한다:
- UF 투과액을 600 내지 3500 Da, 바람직하게는 약 1000 Da의 분획분자량(MWCO)을 갖는 나노여과 막과 접촉시켜 트라이사카라이드 이상의 시알릴화된 HMO의 잔류를 보장하고 락토스의 적어도 일부가 막을 통과하도록 허용하되, 이때 상기 막의 활성 (상부) 층은 폴리아미드로 이루어지고, 상기 막 상에서의 MgSO4 배제율은 약 50 내지 90%이고,
- 이어서 선택적으로 상기 막을 사용하여 정용여과시키고,
- 트라이사카라이드 이상의 시알릴화된 HMO가 농축된 잔류액을 수거한다.
다른 실시태양에서, NF 단계는 다음을 포함한다:
- UF 투과액을 약 1000 Da의 분획분자량(MWCO)을 갖는 피페라진-기반 폴리아미드 나노여과 막과 접촉시켜 트라이사카라이드 이상의 시알릴화된 HMO의 잔류를 보장하고 락토스의 적어도 일부가 막을 통과하도록 허용하되, 이때 상기 막 상에서의 MgSO4 배제율은 약 80 내지 90%이고,
- 상기 막 상에서의 NaCl 배제율은 MgSO4에 대한 배제율보다 낮고/낮거나,
- 상기 막의 순수 플럭스 값은 적어도 약 50 l/m2h이고,
- 이어서 선택적으로 상기 막을 사용하여 정용여과시키고,
- 트라이사카라이드 이상의 시알릴화된 HMO가 농축된 잔류액을 수거한다.
바람직하게, 상기 막의 NaCl 배제율은 MgSO4 배제율의 최대 절반이다.
상기 언급된 모든 이점들을 달성하기 위해, NF 단계의 두 번째 태양에 적용될 나노여과 막은 바람직하게는:
- 약 1000 Da의 MWCO를 갖는 피페라진-기반 폴리아미드 막이고,
- 약 50 내지 90%, 바람직하게는 80 내지 90%의 MgSO4 배제율을 가지고,
- 약 30% 이하의 NaCl 배제율을 가지고,
- 적어도 약 50 l/m2h, 바람직하게는 약 90 l/m2h의 순수 플럭스 값을 갖는다.
또한, 바람직한 실시태양에서, 시알릴화된 모유 올리고사카라이드에 대한 락토스의 분리율은 약 10보다 크고, 바람직하게는 25보다 크고, 보다 바람직하게는 50보다 크고, 훨씬 더 바람직하게는 100보다 크다.
또한 바람직하게, 3'-SL 또는 6'-SL에 대한 락토스의 분리율은 20보다 크고, 바람직하게는 50보다 크다.
또한 바람직하게, 시알릴 모이어티를 함유하는 테트라- 또는 펜타사카라이드에 비해 락토스의 분리율은 25보다 크고, 바람직하게는 50보다 크고, 보다 바람직하게는 100보다 크다.
NF 단계의 두 번째 태양은 투과액 측면과 비교해 양압 하에 접선 흐름 또는 교차흐름 여과를 사용한 통상적인 나노여과에 사용되는 조건하에서 수행된 후 정용여과가 수행될 수 있는데, 이때 상기 두 작업 모두 회분식 또는 바람직하게는 연속 방식으로 수행할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 선택적인 정용여과는 상기 개시된 나노여과 단계 후에 잔류액에 순수를 첨가하고 나노여과와 동일하거나 유사한 조건하에서 투과액을 일정하게 제거하면서 여과 과정을 지속함으로써 수행한다. 바람직한 물 첨가 방식은 연속적이다, 즉, 첨가 유량이 대략적으로 투과액 유량과 일치한다. NF는, 잔류액 스트림이 공급 탱크로 다시 재순환되고 공급 탱크에 정제수 또는 탈이온수를 연속적으로 첨가함으로써 정용여과(DF)를 수행하는 회분식으로 수행될 수 있다. 가장 바람직하게, DF수는 특정한 양의 투과액을 제거함으로써 적어도 일부의 사전-농축 후에 첨가된다. DF 시작 전에 농축율이 높을 수록 더 우수한 DF 효율이 달성된다. DF 종료 후, 과량의 투과액을 제거함으로써 추가의 농축을 달성할 수 있다. 대안으로, NF를, 바람직하게는 각각의 루프로부터의 잔류액을 다음 루프로 전달시키는 다중-루프 시스템에서 연속 방식으로 수행할 수 있다. 이 경우, DF수는 각각의 루프에서 투과액 흐름과 일치하는 유량하에 또는 더 낮은 유량으로 각각의 루프에서 따로따로 첨가될 수 있다. 회분식 DF와 유사하게, DF의 효율을 개선하기 위해, 예를 들어, 더 높은 농축율을 달성하기 위해 첫 번째 루프에서 물을 더 적게 첨가하거나 첨가하지 않아야 한다. 다중-루프 시스템에서 물의 분배 뿐 아니라, 막-통과 압력, 온도 및 교차흐름과 같은 다른 공정 파라미터는 통상적인 최적화에 적용된다. 다른 실시태양에서, 선택적인 정용여과는, WO 2019/003135 호에 따라서, 무기 전해질의 수용액을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 무기 전해질은, 물에 적어도 부분적으로 가용성이고, 바람직하게는 잘 용해되는 무기 염을 의미한다. 본 발명의 방법에 사용된 막 상에서의 무기 염의 배제율은 MgSO4의 배제율보다 높지 않아야 한다. 하나의 실시태양에서, 무기 전해질(염)의 수용액은 중성이다, 즉, 강한 무기산 및 강한 무기 염기의 염이다. 강한 무기산의 예시적인 실시태양은 HCl, HBr, 황산, 질산, 인산 및 과염소산이고, 강한 무기 염기의 예시적인 실시태양은 NaOH, KOH, LiOH, Mg(OH)2 및 Ca(OH)2이며; 상기 산 및 염기로부터 생성된 염은 본 발명의 목적에 적용가능한 중성 무기 전해질 군에 포함된다. 다른 실시태양에서, 무기 전해질의 수용액은 약간 염기성이며, 이것은 강한 무기 염기(상기 참조)가 약한 무기 산, 예를 들어, 탄산(탄산염 제조) 또는 아세트산(아세트산염 제조)과 염을 형성하는 경우이다. 무기 전해질은 통상적으로 1가 또는 2가 음이온 전해질이다. 1가 음이온 전해질은, 예를 들어, HCl, HBr, 질산 또는 과염소산의 염, 특히, LiCl, NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2와 같은 염화물, 또는 NaHCO3와 같은 중탄산염이다. 2가 음이온 전해질은, 예를 들어, Na2SO4, K2SO4, MgSO4, Na2SO4와 같은 황산의 염, 또는 Na2CO3, K2CO3와 같은 탄산염이다. 특히 바람직한 무기 전해질은 NaCl이다. 바람직하게, 정용여과에 사용되는 무기 전해질의 수용액은 단일 전해질이다, 즉, 상기 수용액은 1개의 유일한 전해질(염)을 함유한다.
NF 단계의 두 번째 태양에 적용되는 공급 용액의 pH는 바람직하게는 약 7 이하, 보다 바람직하게는 약 3 내지 7, 훨씬 더 바람직하게는 약 4 및 5, 또는 약 5 및 6이다. 3보다 낮은 pH는 막 및 용질의 성질에 불리하게 영향을 미칠 수 있다.
NF 단계의 두 번째 태양에 적용되는 편리한 온도 범위는 약 10 내지 약 60℃이다. 더 높은 온도는 더 높은 플럭스를 제공하며 따라서 공정을 가속화시킨다. 막은 더 높은 온도에서 관류에 더 개방될 것으로 예상되지만, 이것은 분리율을 별로 변화시키지 않는다. 본 발명에 따른 나노여과 분리를 수행하기에 바람직한 온도 범위는 약 20 내지 45℃이다.
나노여과 분리에 바람직한 인가 압력은 약 2 내지 50 바, 예를 들면, 약 10 내지 40 바이다. 일반적으로, 압력이 높을 수록 플럭스가 더 높다.
특정한 실시태양에서, 본 발명의 방법은, 바람직하게는 활성탄 처리(하기 참조) 및/또는 이온 교환 처리(하기 참조) 후에, 추가의(하나 이상의) NF 단계를 포함할 수 있으며, 이때 주 목적은 관심 시알릴화된 HMO를 함유하는 수용액을 농축시키는 것이다.
2.2.5.3 이온 교환 수지에 의한 처리
상기에 개시된 바와 같은 청정화된 상등액(2.2.4.1), 상기에 개시된 UF 투과액(2.2.3 또는 2.2.5.1) 또는 상기에 개시된 NF 잔류액(2.2.5.2)으로 수득된 시알릴화된 HMO의 수용액은 선택적으로 이온 교환 수지에 의해 더 정제할 수 있다. 임의의 UF 투과액 및 NF 잔류액은 선택적으로, 이온 교환 수지에 의한 처리 전에 활성탄(하기 참조)을 사용하여 탈색할 수 있다. 잔류 염, 착색 물체, 이온화가능한 기를 함유하는 생체분자(예를 들어, 단백질, 펩티드, DNA 및 내독소), 이온화가능한 작용기를 함유하는 중성 또는 양쪽성-이온 화합물(예를 들면, 생체 아민, 아미노산을 포함하는 대사물 중 아미노기), 산-함유 기를 갖는 화합물(예를 들면, 유기산, 아미노산)을 수지에 의한 처리로 더 제거할 수 있다. 특히, 양이온 및 음이온 교환 수지가 "이온 교환 수지에 의한 처리"에서 적용되는 경우 수지 용출액의 낮은 염 함량(탈염)을 달성할 수 있다.
하나의 실시태양에 따르면, 이온 교환 수지는 양이온 교환 수지, 바람직하게는 양성자화된 형태의, 바람직하게는 강산성 양이온 교환 수지이다. 이 단계에서, 양으로 하전된 물질은 이들이 수지에 결합할 때 공급 용액으로부터 제거될 수 있다. 시알릴화된 HMO의 용액은, 양으로 하전된 물질이 양이온 교환 수지 상에 흡착되고 시알릴화된 HMO가 통과하도록 허용하는 임의의 적합한 방식으로 양이온 교환 수지와 접촉시킨다. 양이온 교환 수지와 접촉 후, 생성된 액체는, 상응하는 산 형태의 음이온 이외에 시알릴화된 HMO, 및 락토스와 같은 중성 탄수화물(하나 이상의 이전 정제 단계들 후에도 여전히 남아있는 경우)을 함유한다. 상기 산은 통상적으로 중화시킬 수 있다.
하나의 실시태양에서, 양이온 및 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 임의의 순서로 둘 다 적용할 수 있다. 양이온 및 음이온 수지 처리를 둘 다 적용하는 경우, 양이온 교환 수지는 강산성 수지이고 음이온 교환 수지는 유리 염기 형태의 약 음이온 수지이다. 양이온 교환 수지는 H+-형태 또는 염 형태, 바람직하게는 H+-형태이다. 잔류하는 배양 배지로부터 염 및 하전된 분자들을 제거하는 것 이외에, 상기 특별한 방식은 배양 배지에 남아있는 단백질, DNA 및 착색/카라멜 물체를 물리적으로 흡착시킬 수 있다.
유리 염기 형태의 약염기성 음이온 교환체(즉, 이때 수지의 작용기는 1급, 2급 또는 3급 아민이다)의 적용은 OH--형태의 강염기성 음이온 교환체에 비해 유리하다. 강염기성 교환체는, 그의 강염기성으로 인해, 시알릴화된 HMO의 아노머 OH-기를 탈양성자화시키는 능력을 갖는다. 이것은 시알릴화된 HMO의 구조에 재배열 반응을 개시하며 따라서 부산물을 생성하고/하거나 상당한 양의 시알릴화된 HMO가 수지에 결합한다. 결과적으로, 두 사건 모두 시알릴화된 HMO의 회수 수율의 감소에 기여한다.
하나의 실시태양에서, 청구된 방법의 선택적인 이온 교환 수지 처리 단계는 H+-형태의 강 양이온 교환 수지에 의한 시알릴화된 HMO의 수용액(상기 수용액은 활성탄으로 선택적으로 탈색될 수 있는 상기에 개시된 바와 같은 UF 투과액, 또는 활성탄으로 선택적으로 탈색될 수 있는 상기에 개시된 바와 같은 NF 잔류액, 또는 활성탄으로 선택적으로 탈색될 수 있는 상기에 개시된 바와 같은 청정화된 원심분리 상등액이다)의 처리 바로 다음에 유리 염기 형태의 약 음이온 교환 수지에 의한 처리로 이루어진다.
다른 실시태양에서, 시알릴화된 HMO를 이들이 생성된 반응 혼합물로부터 수득하거나 단리하기 위한 청구된 방법은 H+-형태의 강 양이온 교환 수지에 의한 단일 이온 교환 수지 처리 단계만을 포함한다.
이온 교환 수지를 사용하는 경우, 그의 가교결합 정도는 이온 교환 컬럼의 작업 조건에 따라 선택할 수 있다. 고도로 가교결합된 수지는 내구성 및 고도의 기계적 무결성의 이점을 제공하지만, 감소된 다공성 및 물질-전달의 감소가 따른다. 저-가교결합 수지는 보다 취약하고 이동상의 흡수에 의해 팽창하는 경향이 있다. 이온 교환 수지의 입자 크기는, 하전된 물질이 여전히 효과적으로 제거되면서 용출제의 효과적인 흐름을 허용하도록 선택된다. 컬럼의 용출 말단에 음압을 인가하거나 컬럼의 부하 말단에 양압을 인가하고, 용출제를 수거함으로써 적절한 유량을 또한 수득할 수 있다. 양압과 음압 둘 다의 병행도 또한 이용할 수 있다. 이온 교환 처리는 통상적인 방식으로, 예를 들어, 회분식으로 또는 연속적으로 수행할 수 있다.
적합한 산성 양이온 교환 수지의 비-제한 예는, 예를 들어, 앰버라이트(Amberlite) IR100, 앰버라이트 IR120, 앰버라이트 FPC22, 다우엑스(Dowex) 50WX, 피넥스(Finex) CS16GC, 피넥스 CS13GC, 피넥스 CS12GC, 피넥스 CS11GC, 레바티트(Lewatit) S, 다이아이온(Diaion) SK, 다이아이온 UBK, 앰버제트(Amberjet) 1000, 앰버제트 1200, 다우엑스 88일 수 있다.
적합한 염기성 음이온 교환 수지의 비-제한 예는, 예를 들어, 앰버라이트 IRA67, 앰버라이트 IRA 96, 앰버라이트 IRA743, 앰버라이트 FPA53, 다이아이온 CRB03, 다이아이온 WA10, 다우엑스 66, 다우엑스 마라톤(Dowex Marathon), 레바티트 MP64일 수 있다.
2.2.5.4 활성탄 처리
특정한 실시태양에 따르면, 본 발명의 방법은 활성탄 처리의 선택적인 단계를 포함한다. 상기 선택적인 활성탄 처리는, 모두 상기에 개시된 원심분리(2.2.4), UF 단계(2.2.3 또는 2.2.5.1), NF 단계(2.2.5.2) 또는 이온 교환 처리 단계(2.2.5.3) 중 임의 단계 후에 이어질 수 있다. 활성탄 처리는 착색제를 제거하고/하거나, 필요한 경우, 염과 같은 다른 수용성 오염물의 양을 감소시키는 것을 돕는다. 더욱이, 활성탄 처리는, 이전 단계 후에 부수적으로 남을 수 있는 잔류 또는 미량 단백질, DNA 또는 내독소를 제거한다.
관심 시알릴화된 HMO와 같은 탄수화물 물질은 그의 수용액, 예를 들어, UF 단계, NF 단계 또는 이온 교환 처리 단계 후에 수득된 수용액으로부터 활성탄 입자 표면에 결합하는 경향이 있다. 유사하게, 착색제도 또한 활성탄을 흡착할 수 있다. 탄수화물 및 착색 물질이 흡착되는 반면, 활성탄에 결합되지 않거나 더 약하게 결합되는 수용성 물질은 물과 함께 용출될 수 있다. 물에서 수성 알콜, 예를 들어, 에탄올로 용출제를 교체함으로써, 흡착된 시알릴화된 HMO는 용이하게 용출되고 별개의 분획으로 수거될 수 있다. 흡착된 착색 물질은 여전히 활성탄 상에 흡착되어 남아있으므로, 탈색 및 부분적 염분제거 둘 다 상기 선택적 단계에서 동시에 달성될 수 있다. 그러나, 용출 용매 중 유기 용매(에탄올)의 존재로 인해, 탈색 효율은 순수를 사용하여 용출을 수행하는 경우에 비해 더 낮다(하기 참조).
특정한 조건하에서, 시알릴화된 HMO는 활성탄 입자에 흡착되지 않거나 적어도 실질적으로 흡착되지 않고, 물을 사용한 용출은, 착색 물질은 여전히 흡착된 채, 그 양의 상당한 손실 없이 시알릴화된 HMO의 수용액을 제공한다. 이 경우, 용출을 위해 에탄올과 같은 유기 용매를 사용할 필요가 없다. 시알릴화된 HMO가 그 수용액으로부터 활성탄에 결합하는 조건을 결정하는 것은 퉁상적인 기술의 문제이다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서, 시알릴화된 HMO의 더 희석된 용액 또는 시알릴화된 HMO의 양에 비해 더 많은 양의 활성탄을 사용하며, 또 다른 실시태양에서는, 시알릴화된 HMO의 더 농축된 용액 및 시알릴화된 HMO의 양에 비해 더 낮은 양의 활성탄을 적용한다.
활성탄 처리는, 활성탄 분말을 시알릴화된 HMO의 수용액에 교반하에 첨가하고, 활성탄을 여과시키고, 교반하에 수성 에탄올에 재현탁하고 활성탄을 여과에 의해 분리함으로써 수행될 수 있다. 보다 큰 규모의 정제에서, 시알릴화된 HMO의 수용액은 바람직하게는, 선택적으로 셀라이트와 혼합될 수 있는 활성탄으로 충전된 컬럼에 부하된 다음, 상기 컬럼을 필요한 용출제로 세척한다. 시알릴화된 HMO를 함유하는 분획을 수거한다. 잔류 알콜은, 용출에 사용되는 경우, 예를 들어, 증발에 의해 상기 분획들로부터 제거하여 시알릴화된 HMO의 수용액을 수득할 수 있다.
바람직하게, 사용되는 활성탄은 과립화된다. 이것은 고압을 인가하지 않고 편리한 유량을 보장한다.
또한 바람직하게, UF 단계, NF 단계 또는 이온 교환 처리 단계로부터의 관심 시알릴화된 HMO를 함유하는 수용액의 활성탄 처리, 보다 바람직하게 활성탄 크로마토그래피는 승온에서 수행한다. 승온에서, 염, 착색 물체, 잔류 단백질 등이 활성탄 입자에 결합하는 것은 더 짧은 접촉 시간 내에 일어나므로, 유량이 편리하게 상승될 수 있다. 더욱이, 승온에서 수행된 활성탄 처리는 시알릴화된 HMO의 수용액 중 생존 미생물의 총 수(총 미생물 수)를 실질적으로 감소시키며, 따라서 상기 방법의 나중 단계에서 멸균 여과 단계가 필요하지 않을 수 있다. 승온은 적어도 30 내지 35℃, 예를 들면, 적어도 40℃, 적어도 50℃, 약 40 내지 50℃ 또는 약 60℃이다.
또한 바람직하게, 적용된 활성탄의 양은 부하물 중에 함유된 시알릴화된 HMO의 약 10 중량% 이하, 보다 바람직하게는 약 2 내지 6 중량%이다. 이것은, 상기 개시된 모든 이점들이 매우 소량의 활성탄을 사용하여 편리하게 달성될 수 있기 때문에 경제적이다.
활성탄 처리, 바람직하게 크로마토그래피는 수용액 중 관심 시알릴화된 HMO의 양에 비해 약 10 중량% 이하, 바람직하게는 약 2 내지 6 중량%의 활성탄을 사용하여 승온에서 수행하는 것이 특히 바람직하다.
2.2.5.5 단리된 형태의 관심 시알릴화된 HMO의 제공
상기 2.2.3 내지 2.2.5.4 중 어느 하나에 개시된 분리/정제 단계 후에, 상기와 같이 수득된 관심 시알릴화된 HMO는 분무-건조 또는 동결-건조에 의해 그의 고체 형태로 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 관심 시알릴화된 HMO를 단리된 형태, 바람직하게는 건조된 형태로 제공하는 하나 이상의 추가의 단계, 예를 들면, 원심분리, UF 단계, NF 단계, 활성탄 처리 및/또는 이온 교환 처리 후에 수득된 시알릴화된 HMO의 수용액을 분무-건조시키는 단계; 또는 원심분리, UF 단계, NF 단계, 활성탄 처리 및/또는 이온 교환 처리 후에 수득된 시알릴화된 HMO의 수용액을 동결-건조시키는 단계를 포함할 수 있다. 대안으로, UF 단계, NF 단계, 활성탄 처리 및/또는 이온 교환 처리 후에 수득된 시알릴화된 HMO는, 예를 들어, 증류, 바람직하게는 진공 증류 또는 나노여과에 의해 물을 제거함으로써 농축 수용액 또는 시럽의 형태로 제공될 수 있다.
관심 시알릴화된 HMO가 분무-건조된 형태로 단리되는 경우, 상기 분무-건조는 바람직하게는, 예를 들어, WO 2013/185780 호에 개시된 바와 같이 수행되거나, 또는 분무-건조 과정은, 예를 들어, 110 내지 190℃의 노즐 온도 및 60 내지 110℃의 유출구 온도에서 관심 시알릴화된 HMO의 15 내지 65 w/v%의 수용액을 사용하여 수행되나, 단, 상기 노즐 온도는 상기 유출구 온도보다 적어도 10℃ 더 높아야 한다.
3. 본 발명의 바람직한 실시태양
상기 방법의 하나의 실시태양은, 하기의 단계를 포함하는, 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL을 그것이 생성된 발효액으로부터 수득하거나 단리하는 것에 관한 것이다:
a) 상기 반응액의 pH를 pH=3 내지 5로 설정하고,
b) 선택적으로, 단계 a)에서 수득된 pH-조정된 발효액을 5 내지 15℃로 냉각시키고, 1 내지 15일 동안 저장하고,
c) 단계 a) 또는 단계 b)의 발효액을 60 내지 65℃로 가열하고,
d) 단계 c)에서 수득된 발효액을, 선택적으로 40 내지 65℃에서, 약 10 내지 1000 kDa의 분획분자량(MWCO)을 갖는 한외여과(UF) 막(상기 막은 세라믹 막이다)과 접촉시키고,
e) 선택적으로, 단계 d)에서 수득된 투과액을 멸균 여과시키고,
f) 단계 d)에서 수득된 투과액 또는 단계 e)에서 수득된 멸균 여과된 투과액을 600 내지 3500 Da의 MWCO를 갖는 나노여과(NF) 막(이때, 상기 막의 활성 (상부) 층은 폴리아미드로 이루어지고, 상기 막 상에서의 MgSO4 배제율은 약 20 내지 90%, 바람직하게는 50 내지 90%이다)과 접촉시키고,
g) 단계 f)에서 수득된 잔류액을 H+-형태의 강 양이온성 이온 교환 수지로 처리한 후 염기 형태의 약 염기성 이온 교환 수지로 처리하여 잔류액을 탈염시키고,
h) 단계 g)에서 수득된 용액을 30 내지 60℃에서 활성탄 크로마토그래피하고(이때, 활성탄의 양은 부하물에 함유된 시알릴화된 HMO의 약 2 내지 10 중량%이다),
i) 단계 h)에서 수득된 용액을 150 내지 500 Da의 막으로 나노여과시켜 용액을 농축시키고,
j) 단계 i)의 용액을 분무-건조시켜 무정형 고체로서 시알릴화된 HMO를 수득한다.
상기 방법의 하나의 실시태양은, 하기의 단계를 포함하는, 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL을 그것이 생성된 발효액으로부터 수득하거나 단리하는 것에 관한 것이다:
a) 상기 반응액의 pH를 약 5.5의 pH로 설정하고,
b) 단계 a)에서 수득된 발효액을 원심분리하고,
c) 선택적으로, 단계 b)의 상등액을 60 내지 65℃로 가열하고,
d) 단계 b) 또는 단계 c)의 상등액을, 선택적으로 40 내지 65℃에서, 약 5 내지 1000 kDa의 분획분자량(MWCO)을 갖는 한외여과(UF) 막과 접촉시키고,
e) 단계 d)에서 수득된 투과액을,
- 600 내지 3500 Da의 MWCO를 가지거나(이때, 상기 막의 활성 (상부) 층은 폴리아미드로 이루어지고, 상기 막 상에서의 MgSO4 배제율은 약 20 내지 90%, 바람직하게는 50 내지 90%이다), 또는
- 150 내지 500 Da의 MWCO를 갖는
나노여과(NF) 막과 접촉시키고,
f) 단계 e)에서 수득된 잔류액을, 30 내지 60℃에서 활성탄 크로마토그래피하고(이때, 활성탄의 양은 부하물에 함유된 시알릴화된 HMO의 약 2 내지 10 중량%이다),
g) 단계 f)에서 수득된 용액을 H+-형태의 강 양이온성 이온 교환 수지로 처리한 후 염기 형태의 약 염기성 이온 교환 수지로 처리하여 용액을 탈염시키고,
h) 단계 g)에서 수득된 용액을 150 내지 500 Da의 막으로 나노여과시켜 용액을 농축시키고,
i) 단계 i)의 용액을 분무-건조시켜 무정형 고체로서 시알릴화된 HMO를 수득한다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 방법은 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL을 그것이 생성된 발효액으로부터 수득/단리/정제하는 것에 관한 것으로, 상기 방법은 단계 A), B), C) 및 D)로 이루어지는 하기 순서의 단계들을 포함한다:
A) - 발효액의 pH를 약 3 내지 5의 pH로 설정하고,
B) - 단계 A)의 pH-조정된 발효액을 원심분리(CF)하여 청정화된 상등액을 수득하거나, 또는
- 단계 A)의 pH-조정된 발효액을 한외여과(FU)시켜 한외여과 투과액(UFP)을 수득하고,
C) - 상기 청정화된 상등액 또는 UFP를 과립화된 활성 탄소로 처리하여 활성탄 용출액(CCE)을 수득하고,
D) - 상기 CCE를 나노여과(NF)시키고 나노여과 잔류액(NFR)을 수거하되,
이때, 상기 방법은 이온 교환 처리, 모사 이동층 크로마토그래피, 겔 여과/크로마토그래피 및 전기투석을 포함하지 않는다.
상기 방법은 이전의 선행 기술 방법보다 적은 정제 단계를 포함하며, 놀랍게도 엄격한 규제 사양을 충족시키는 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL을 제공한다. 특히, 상기 방법은, 통상적으로 상기 물질의 정제의 일부인 이온 교환 처리를 포함하지 않는다. 그러므로, 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL을 인간의 섭취를 위해 보다 경제적인 방법으로 제공할 수 있다.
상기에 명시된 방법에서, 단계 A)의 pH-조정에 사용될 수 있는 산은 황산이다. 예를 들어, 상기 산은 20% H2SO4-용액일 수 있다. 그러나, 다른 산도 또한 사용할 수 있으며, 사용되는 특정 산은 제한되지 않는다. 예를 들어, 산은 H2SO4, HCl, H3PO4, 폼산, 아세트산 및 시트르산 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 이들 산은 각각 단독으로 또는 임의의 다른 산과 함께 사용될 수 있다.
단계 B)에서, 원심분리 또는 UF는 동일하게 적용할 수 있다. 상기 방법들은 상기에서 상세하게 교지되어 있다.
단계 C)에서, 과립화 활성탄의 양은, 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL이 활성탄 입자에 흡착되지 않거나 적어도 실질적으로 흡착되지 않고, 물을 사용한 용출이, 착색 물질은 여전히 흡착된 채, 그의 상당한 손실 없이 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL의 수용액을 제공하도록 선택된다. 이를 달성하기 위해, 탈색에 적용되는 활성탄의 양은 이전 단계에서 수득된 공급 용액의 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL 함량에 대해 질량 기준으로 약 12 내지 25%, 바람직하게는 공급 용액의 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL 함량에 대해 약 15 내지 20%이어야 한다. 상기 특정한 방식에 의해, 이전 단계에서 수득된 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL의 적어도 90%(질량 기준)가 탈색된 용액의 형태로 다시 수거될 수 있다. 더욱이, 상기에 개시된 조건하에서, 공급 용액의 단백질 함량의 상당한 감소가 달성가능하다, 예를 들면, 잔류 단백질의 적어도 90%가 제거가능하고, 바람직하게는 잔류 단백질의 약 98 내지 99%가 제거될 수 있다. 그러므로, 다음 NF 단계에 저-단백질 활성탄 용출액이 제공된다.
단계 D)에서, NF 단계는 바람직하게는 상기에 상세하게 개시된 두 번째 태양의 바람직한 실시태양 및 보다 바람직한 실시태양에 따라서 수행된다. 이 단계에서, 락토스, 시알산 및 다른 유사한 저분자량 유기 화합물이 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL로부터 분리될 수 있으며, 상당량의 1가 및 2가 이온, 바람직하게는 무기 이온도 또한 제거가능하다. 적합한 NF 막의 한 예는 피페라진 기반 폴리아미드 TFC 막 트라이셉® UA60이다.
상기 절차에 따라서, NF 잔류액 중에 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL이 규제 사양을 충족시키는 순도로 수득가능하다.
실시예
실시예 1
이종 neuBCA를 갖는 LacZ-, LacY+ 표현형의 유전자 변형 이. 콜라이 세포를 사용한 발효에 의해 6'-SL을 제조하였으며, 이때 상기 세포는 GMP-시알산의 시알산을 내재화된 락토스로 전달할 수 있는 α-2,6-시알릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 재조합 유전자를 포함하고, nanKETA가 결실되거나 불활성화되었다. 외인적으로 첨가된 락토스 및 적합한 탄소 공급원의 존재하에서 상기 세포를 배양하여 발효를 수행함으로써 6'-SL을 생성하였다. 6'-SL을 함유하는 수득된 발효액(pH는 약 6.3이다)을 황산을 사용하여 약 4.5로 산성화시켰다. 산성화된 발효액을 2개의 분획으로 나누고, 이들 각각을 20℃에서 8000 RCF에서 1 시간동안 별도로 원심분리하였다. 하기의 표는 상기 분획들로부터 수득된 상등액의 양 및 상응하는 성질을 나타낸 것이다.
Figure pct00001
분획 #1 및 분획 #2의 상등액을 혼합하고, 증류수를 사용하여 희석하여 약 300 mg/l의 단백질 농도를 생성하였다. 상기 희석된 상등액 혼합물을 충전 층 과립화 활성탄(GAC, 즉, CPGLF 12Х40, 175 g) 상에서의 공정에 공급물로 사용하였다. GAC 작업의 시작 전에 충전 층 GAC를 90℃에서 뜨거운 증류수를 사용하여 2 시간동안 다시 플러싱하였다(즉, 상향류 방식으로). 표 2는 GAC 공급물 성질 및 공정 조건을 요약한 것이다. 표 3은 벌크 및 용질 물질 균형 뿐 아니라 GAC 유출액 성질 면에서의 결과를 요약한 것이다. 더욱이, 처리 초기에 즉시 전체 GAC 유출액을 수거한(즉, 공극 부피 포함) 반면, 작업 마지막에는 단순히 공기를 층을 통해 펌핑함으로써 GAC 층 중의 액체를 밀어냈다. 그러므로, 표 3에서 볼 수 있듯이, GAC 유출액은 희석된 것으로(즉, 벌크 물질 균형이 100%보다 크다) 예상된다.
Figure pct00002
용출액을 65℃ 및 약 50 밀리바에서 회전증발기에서 농축시키고 NF/DF로 처리하였다. NF/DF 공정은 0.23 m2의 면적을 갖는 나권형 박막 복합체(TFC) 막 트라이셉 터보클린 1812-UA60을 사용하여 회분식으로 수행하였다. 작업 파라미터는 TMP 약 39 바 및 400 l/h의 교차흐름인 반면, 온도는 역동적이었으나 45℃ 미만으로 유지하였다. 하기의 표는 최종 균질화된 NF/DF 잔류액의 성질을 요약한 것이다.
Figure pct00003
다음의 최종 생성물 성질을 갖는 NF/DF 잔류액을 동결-건조시켰다:
Figure pct00004
데이터는 pH-조정, 원심분리, 활성탄 탈색 및 나노여과를 이용하여 발효액으로부터 6'-SL을 정제한 결과 규제 사양을 충족시키는 생성물을 제공함을, 특히 단백질 함량이 상당히 감소되었음을 보여준다.
탄수화물 화합물의 농도/양을 HPLC 이온 크로마토그래피로 측정하였다: 하전된 에어로졸 검출(CAD)을 이용하여 1.1 ml/분의 유량 및 25℃에서 70% 아세토니트릴, 15% 물 및 15% 10 mM 암모늄 포메이트 완충액을 사용한 TSKGel 아미드-80 (150 mm x 4.6 mm, 3 μm).
실시예 2 - 막의 물질 배제율의 측정
막의 NaCl 및 MgSO4 배제율을 다음과 같이 측정하였다: 막 여과 시스템에서, 투과 스트림을 공급물 탱크로 다시 순환시키면서 (타미(Tami): 관형 모듈)를 사용하여 선택된 막 시트를 가로질러 NaCl(0.1%) 또는 MgSO4(0.2%) 용액을 순환시켰다. 투과액 및 잔류액으로부터 샘플을 취하기 전에 10분동안 상기 시스템을 10 바 및 25℃에서 평형화시켰다. 배제율은 샘플의 측정 전도도로부터 산출한다: (1-κp/κr)*100, 여기서, κp는 투과액 중 NaCl 또는 MgSO4의 전도도이고, κr은 잔류액 중 NaCl 또는 MgSO4의 전도도이다.
Figure pct00005
배제율을 샘플의 농도(HPLC로 측정)로부터 산출하는 차이하에 유사한 방식으로, 탄수화물, 예를 들어, 3'-SL 또는 6'-SL과 같은 시알릴화된 HMO의 배제율을 측정하였다: (1-Cp/Cr)*100, 여기서, Cp는 투과액 중 탄수화물의 농도이고, Cr은 잔류액 중 탄수화물의 농도이다.

Claims (19)

  1. 시알릴화된 모유 올리고사카라이드(HMO), 바람직하게는 3'-SL(시알릴락토스) 또는 6'-SL을, 이들이 생성된 반응 혼합물로부터, 바람직하게는 발효액으로부터 정제하는 방법으로서,
    - 상기 반응 혼합물을 pH-조정, 희석 및/또는 열 처리에 의해 전처리하는 단계, 및
    - 상기 전처리 후에 상기 반응 혼합물을 원심분리하거나, 또는 상기 전처리 후에 상기 반응 혼합물을, 약 5 내지 1000 kDa, 예를 들면, 10 내지 1000 kDa의 분획분자량(MWCO)을 갖고 바람직하게는 비-중합체 물질로 이루어진 한외여과(UF) 막과 접촉시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 전처리가 상기 반응 혼합물의 pH를 3 내지 5로 조정하는 것을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    - 원심분리로부터 수득된 청정화된 상등액, 또는
    - UF 투과액
    을 나노여과(NF) 막과 접촉시키는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    H+-형태의 강 양이온 교환 수지 처리 및 유리 염기 형태의 약 음이온 교환 수지 처리 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 반응 혼합물이, 시알릴화된 HMO, 바람직하게는 3'-SL 또는 6'-SL이 생성된 발효액이고,
    상기 원심분리로부터 수득된 청정화된 상등액 또는 UF 투과액이, 과립화된 활성 탄소로 처리되어 활성탄 용출액을 제공하고, 상기 활성탄 용출액이 나노여과되어 나노여과 잔류액이 수거되고,
    상기 방법이 이온 교환 처리, 모사(simulated) 이동층 크로마토그래피, 겔 여과/크로마토그래피 및 전기투석을 포함하지 않는, 방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NF 막이 600 내지 3500 Da의 분획분자량(MWCO)을 가지고, 상기 NF 막의 활성 (상부) 층이 폴리아미드로 이루어지고, 상기 막의 MgSO4 배제율이 약 50 내지 90%인, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 방법이,
    a) 선택적으로, 상기 반응 혼합물을 원심분리, 미세여과시키거나, 또는 상기 반응 혼합물을 필터 프레스 또는 드럼 필터 상에서 여과시키는 단계,
    b) 전처리로서, 단계 a)의 여액 또는 상등액, 또는 반응 혼합물의 pH를 바로 3 내지 6으로 설정하고/하거나 단계 a)의 여액 또는 상등액, 또는 반응 혼합물을 바로 35 내지 65℃로 가온시키고,
    c) 단계 b)에서 수득된 반응 혼합물을, 5 내지 1000 kDa, 예를 들면, 10 내지 1000 kDa의 분획분자량(MWCO)을 갖는 한외여과(UF) 막과 접촉시키고 투과액을 수거하는 단계
    를 포함하되, 단, 단계 a)가 수행되지 않는 경우, 상기 UF 막이 비-중합체 막인, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    단계 a)가 수행되지 않고, 상기 비-중합체 막이 세라믹 막인, 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    단계 c)가 45 내지 65℃에서 수행되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 UF 막이 세라믹 막이고,
    상기 방법이,
    단계 c)에서 수득된 투과액을 나노여과(NF) 막과 접촉시키고 잔류액을 수거하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 NF 막이 600 내지 3500 Da의 분획분자량(MWCO)을 가지고, 상기 NF 막의 활성 (상부) 층이 폴리아미드로 이루어지고, 상기 막의 MgSO4 배제율이 약 50 내지 90%인, 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 나노여과 잔류액이 이온 교환 수지로 처리되고,
    상기 이온 교환 수지에 의한 처리가, H+-형태의 강 양이온 교환 수지에 의한 NF 잔류액의 처리에 바로 뒤이어 유리 염기 형태의 약 음이온 교환 수지에 의한 처리로 이루어지는, 방법.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 나노여과 잔류액이 활성탄으로 처리되고,
    바람직하게는 상기 나노여과 잔류액이 30 내지 60℃에서 활성탄 상에서의 크로마토그래피에 적용되어 활성탄 용출액이 수득되고, 이때 상기 활성탄의 양은 상기 나노여과 잔류액에 함유된 시알릴화된 HMO의 약 2 내지 10 중량%인, 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 이온 교환 처리의 용출액이 활성탄으로 처리되고,
    바람직하게는 상기 용출액이 30 내지 60℃에서 활성탄 상에서의 크로마토그래피에 적용되어 활성탄 용출액이 수득되고, 이때 상기 활성탄의 양은 상기 용출액에 함유된 시알릴화된 HMO의 약 2 내지 10 중량%인, 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 활성탄 용출액이 이온 교환 수지로 처리되고,
    상기 이온 교환 수지에 의한 처리가, H+-형태의 강 양이온 교환 수지에 의한 활성탄 용출액의 처리에 바로 뒤이어 유리 염기 형태의 약 음이온 교환 수지에 의한 처리로 이루어지는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 반응 혼합물이, 내재화된(internalized) 탄수화물 전구체로부터 상기 시알릴화된 HMO를 생성할 수 있는 유전자 변형 세포, 바람직하게는 미생물을 배양함으로써 수득된 발효액인, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    유전자 변형 미생물이 LacZ- 유전자형의 이. 콜라이(E. coli)인, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 이. 콜라이가 재조합 α-2,3- 또는 α-2,6-시알릴 트랜스퍼라제를 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 이.콜라이가 neuBCA 유전자를 갖는, 방법.
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