CN114829619A - 从发酵液中分离唾液酸化寡糖 - Google Patents

从发酵液中分离唾液酸化寡糖 Download PDF

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Abstract

本发明涉及从产生唾液酸化人乳寡糖(HMO)的反应混合物中分离和离析唾液酸化人乳寡糖(HMO)。

Description

从发酵液中分离唾液酸化寡糖
技术领域
本发明涉及从产生唾液酸化人乳寡糖(HMO)的反应混合物中分离和离析唾液酸化人乳寡糖(HMO)。
背景技术
在过去几十年期间，人们对人乳寡糖(HMO)的制备和商业化的兴趣一直在稳步增长。HMO的重要性与其独特的生物活性直接相关，因此HMO已成为用于营养和治疗用途的重要潜在产品。因此，人们一直在寻找低成本的工业化生产HMO的方式。
迄今为止，已经确定了140多种HMO的结构，并且相当多的HMO可能存在于人乳中(Urashima等人：《乳寡糖(Milkoligosaccharides)》，诺瓦生物医学图书，2011年；Chen《碳水化合物化学和生物化学进展(Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.)》72,113(2015))。HMO在还原端包括乳糖(Galβ1-4Glc)部分，并且可用N-乙酰氨基葡萄糖或一个或多个N-乙酰乳糖胺部分(Galβ1-4GlcNAc)和/或乳糖-N-二糖部分(Galβ1-3GlcNAc)延伸。乳糖和N-乙酰乳糖胺化或乳糖-N-二糖化乳糖衍生物可进一步被一个或多个岩藻糖和/或唾液酸残基取代，或者乳糖可被额外的半乳糖取代，以得到迄今为止已知的HMO。
唾液酸化人乳寡糖，例如二唾液酸化乳糖-N-四糖、3’-O-唾液酸化-3-O-岩藻糖基乳糖、6’-O-唾液酸乳糖、3’-O-唾液酸乳糖、6’-O-唾液酸化-乳糖-N-新四糖和3’-O-唾液酸化-乳糖-N-四糖，是人乳的主要组分。在这些唾液酸化人乳寡糖中，唾液酸残基始终通过α-糖苷键与末端D-半乳糖的3-O-和/或6-O-位相连，或与非末端GlcNAc残基的6-O-位相连。唾液酸化HMO被认为对新生儿的健康有重大益处，因为它们在提供对病原体的抗性、肠道成熟、免疫功能和认知发展方面发挥着重要作用(ten Bruggencate等人.《营养评论(Nutr.Rev.)》.72,377(2014))。
由于HMO在许多人类生物过程中的作用，开发合成HMO(包括唾液酸化HMO)的工艺的努力在过去十年中显著增加。在这方面，已经开发了通过微生物发酵、酶法、化学合成或这些技术的组合来生产它们的工艺。关于生产率，在实验室规模上生产3’-SL和6’-SL的发酵工艺已被证明是有前景的。
然而，从复杂基质(例如发酵液)中分离唾液酸化乳糖或唾液酸化寡糖是一项具有挑战性的任务。Antoine等人《德国应用化学(Angew.Chem.Int.Ed)》44,1350(2005)和US2007/0020736公开了通过遗传修饰E.coli生产3’-SL和伴随的二唾液酸化和三唾液酸化乳糖；对含有约0.8mM 3’-SL的液体培养基进行如下处理：将离心上清液中的产物吸附在炭/硅藻土上，用蒸馏水冲洗掉水溶性盐，用梯度含水乙醇洗脱化合物，在Biogel柱上分离唾液酸化产物并脱盐，从1升液体培养基中得到49mg 3’-SL。WO 01/04341和Priem等人在《糖生物学(Glycobiology)》12,235(2002)中公开了通过遗传修饰E.coli产生3’-SL；通过以下操作顺序分离3’-SL：生产细胞的热渗透，随后离心，将上清液中的产物吸附在炭/硅藻土上，用蒸馏水洗去水溶性盐，用梯度含水乙醇洗脱化合物，将化合物与HCO3 --形式的强阴离子交换剂结合，用线性梯度NaHCO3溶液洗脱化合物，然后用阳离子交换剂(H+-形式)去除碳酸氢钠，得到49％纯化产率的分离的3’-SL。WO 2007/101862和Fierfort等人的《生物技术杂志(J.Biotechnol.)》134,261(2008)公开了3’-SL发酵液的替代加工程序，该程序包括以下步骤：生产细胞的热渗透、离心、通过添加酸性强阳离子交换树脂将胞外pH调节至3.0，通过离心去除沉淀的蛋白质，通过添加碱形式的弱阴离子交换剂将上清液的pH调节至6.0，将唾液酸乳糖与HCO3 --形式的阴离子交换剂结合，用蒸馏水洗涤后，用连续梯度NaHCO3溶液洗脱化合物，用阳离子交换剂(H+-形式)消除碳酸氢钠，直到pH达到3.0，然后用NaOH将pH调节至6.0。上述纯化允许从含有25.5g 3’-SL的1升液体培养基中分离出15g 3’-SL。Drouillard等人的《碳水化合物研究(Carbohydr.Res.)》345,1394(2010)将上述Fierfort的程序应用于含有6’-SL(11g/l)和一些6,6’-二唾液酸乳糖(DSL)的发酵液，并且因此以155/86的比率分离出3.34g 6’-SL+DSL。
WO 2006/034225描述了从生产发酵液中提纯3’-SL的两种替代方法。根据第一个程序，用蒸馏水稀释来自培养物的裂解物，并且用活性炭/硅藻土搅拌。用水冲洗浆液，然后用含水乙醇从炭/硅藻土中洗脱产物。根据第二种方法，对培养细胞进行热处理，并且通过离心分离出上清液中的沉淀固体。所得上清液通过微滤器处理，渗透物通过10kDa膜，然后进行纳米过滤。然后对所得滞留物进行渗滤以收集最终样品。两种纯化方法均从1升发酵液中提供90-100mg 3’-SL。
Gilbert等人的《自然生物技术(Nature Biotechnol.)》16,769(1998)和WO 99/31224两者公开了使用CMP-Neu5Ac合成酶/α-2,3-唾液酸转移酶融合蛋白提取物从乳糖、唾液酸、磷酸烯醇式丙酮酸、ATP和CMP开始的3’-SL的酶促生产。产物通过一系列超滤(3000MWCO)、C18反相层析、在pH＝3和pH＝7下的纳米过滤/渗滤、用强阳离子交换(H+)树脂酸化、用NaOH溶液中和和活性炭脱色来纯化。
WO 2009/113861公开了一种从脱脂无蛋白乳流中分离唾液酸乳糖的方法，包括将所述乳流与游离碱形式且含水量为30-48％的第一阴离子交换树脂接触，使得带负电荷的矿物与树脂结合，而唾液酸乳糖不与树脂结合，随后用游离碱形式的第二种阴离子交换树脂进行处理使得唾液酸乳糖与树脂结合，所述第二阴离子交换树脂为大孔或凝胶型树脂且含水量在50％到70％之间。在该工艺中，含有唾液酸乳糖的流被相当地稀释(数百ppm的浓度)，并且来自第一树脂的唾液酸乳糖回收率适中。
WO 2017/152918公开了一种从发酵液中获得唾液酸化寡糖的方法，其中所述唾液酸化寡糖通过培养能够从内化碳水化合物前体产生所述唾液酸化寡糖的遗传修饰微生物来产生，所述方法包括以下步骤：
i)超滤(UF)，
ii)纳米过滤(NF)，
iii)任选活性炭处理，以及
iv)用强阴离子交换树脂和/或阳离子交换树脂处理所述液体培养基。
EP-A-3456836公开了一种从水性介质中分离唾液酸化寡糖的方法，所述方法包括用至少两种类型的离子交换树脂处理含有所述唾液酸化寡糖的水溶液，一种是Cl--形式的强阴离子交换树脂，另一种是强阳离子交换树脂。
WO 2019/043029公开了一种纯化通过微生物发酵或体外生物催化产生的唾液酸化寡糖的方法，所述方法包括以下步骤
i)从发酵液中分离生物质，
ii)从发酵液或反应混合物中去除阳离子，
iii)从发酵液或反应混合物中去除阴离子杂质，以及
iv)从发酵液或反应混合物中去除分子量低于待纯化唾液酸化寡糖分子量的化合物。
WO 2019/229118公开了一种从其他碳水化合物中纯化唾液酸乳糖的方法，所述唾液酸乳糖通过发酵产生，所述方法包括：
a)用超滤分离细胞团，
b)强阳离子交换剂处理，随后是强阴离子交换剂(Cl--形式)处理滤液，
c)第一次纳米过滤，
d)第二次纳米过滤，
e)电渗析，
f)反渗透，
g)活性炭处理，
h)无菌过滤，以及
i)喷雾干燥。
然而，为了提高HMO的回收率和/或简化现有技术方法，同时至少维持HMO的纯度，优选提高HMO的纯度，需要从生产唾液酸化HMO的发酵液的非碳水化合物组分中分离和纯化唾液酸化HMO的替代程序，特别是那些适合于工业规模的程序。
发明内容
本发明涉及一种从产生唾液酸化人乳寡糖(HMO)的反应环境中，优选从发酵液中，获得或分离或纯化唾液酸化人乳寡糖(HMO)，优选3’-SL或6’-SL的方法，其中所述HMO通过培养能够从内化的碳水化合物前体产生所述HMO的遗传修饰微生物产生，所述方法包括以下步骤：
-经由pH调节、稀释和/或热处理预处理所述反应环境，以及
-将预处理后的反应环境离心或将预处理后的反应环境与截留分子量(MWCO)约为5-1000kDa的超滤(UF)膜接触，其中所述膜优选由非聚合物材料组成。
在一个实施方式中，所述方法包括
-将所述反应环境的pH设定为酸性，例如从约3至约6，优选不高于约5，和/或将所述反应环境升温至高于室温(或环境)的温度，优选约30-90℃，更优选约35-85℃，以及
-将前一步骤中获得的反应环境与截留分子量(MWCO)约为5-1000kDa(例如10-1000kDa)的超滤(UF)膜接触，其中所述膜优选由非聚合物材料组成。
在一个实施方式中，所述方法包括
a)任选地，离心或微滤所述反应环境，或在压滤机或鼓式过滤器上过滤所述反应环境，
b)作为预处理，将来自步骤a)的滤液或上清液或反应环境的pH直接设定为3-6和/或将来自步骤a)的滤液或上清液或反应环境的pH直接升温至35-65℃，以及
c)将步骤b)中获得的反应环境与截留分子量(MWCO)为5-1000kDa(例如10-1000kDa)的超滤(UF)膜接触并收集渗透物，
前提是当未执行步骤a)时，所述UF膜为非聚合物膜。
在一个实施方式中，未执行步骤a)，并且所述非聚合物膜为陶瓷膜。
在一个实施方式中，上文所公开的方法还包括纳米过滤步骤。
在其他实施方式中，上文所公开的方法还包括使用一种或多种离子交换树脂进行处理。
在其他实施方式中，上文所公开的方法还包括使用活性炭处理或在活性炭上层析。
所述方法的一个实施方式涉及从产生唾液酸化HMO的反应环境中获得、分离或纯化唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL，包括以下步骤：
i)将所述反应环境的pH设定为酸性，例如从约3至约6，优选不高于约5，和/或将所述反应环境升温至高于室温(或环境)的温度，优选约30-90℃，更优选约35-85℃，
ii)将步骤i)中获得的反应环境与截留分子量(MWCO)约为5-1000kDa(例如10-1000kDa)的超滤(UF)膜接触，其中所述膜优选由非聚合物材料组成，以及
iii)将步骤ii)中获得的渗透物与纳米过滤膜接触。
所述方法的一个实施方式涉及从产生唾液酸化HMO的反应环境中获得、分离或纯化唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL，包括以下步骤：
i)经由pH调节、稀释和/或热处理预处理所述反应环境，
ii)将预处理后的反应环境离心或将预处理后的反应环境与截留分子量(MWCO)约为5-1000kDa(例如10-1000kDa)的超滤(UF)膜接触，其中所述膜优选由非聚合物材料组成，以及
iii)将步骤ii)中获得的澄清上清液或UF渗透物与纳米过滤膜接触。
所述方法的一个实施方式涉及从产生唾液酸化HMO的反应环境中获得、分离或纯化唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL，包括以下步骤：
i)将所述反应环境的pH设定为酸性，例如从约3至约6，优选不高于约5，和/或将所述反应环境升温至高于室温(或环境)的温度，优选约30-90℃，更优选约35-85℃，
ii)将步骤i)中获得的反应环境与截留分子量(MWCO)约为5-1000kDa(例如10-1000kDa)的超滤(UF)膜接触，其中所述膜优选由非聚合物材料组成，
iii)将步骤ii)中获得的渗透物与纳米过滤(NF)膜接触，以及
iv)用离子交换树脂，例如强阳离子离子交换树脂和弱碱性离子交换树脂处理步骤iii)中获得的NF滞留物，以使滞留物脱矿质。
所述方法的一个实施方式涉及从产生唾液酸化HMO的反应环境中获得、分离或纯化唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL，包括以下步骤：
i)经由pH调节、稀释和/或热处理预处理所述反应环境，
ii)将预处理后的反应环境离心或将预处理后的反应环境与截留分子量(MWCO)约为5-1000kDa(例如10-1000kDa)的超滤(UF)膜接触，其中所述膜优选由非聚合物材料组成，
iii)将步骤ii)中获得的澄清上清液或UF渗透物与纳米过滤膜接触，以及
iv)用离子交换树脂，例如强阳离子离子交换树脂和弱碱性离子交换树脂处理步骤iii)中获得的NF滞留物，以使滞留物脱矿质。
所述方法的一个实施方式涉及从产生唾液酸化HMO的反应环境中获得、分离或纯化唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL，包括以下步骤：
i)将所述反应环境的pH设定为酸性，例如从约3至约6，优选不高于约5，和/或将所述反应环境升温至高于室温(或环境)的温度，优选约30-90℃，更优选约35-85℃，
ii)将步骤i)中获得的反应环境与截留分子量(MWCO)约为5-1000kDa(例如10-1000kDa)的超滤(UF)膜接触，其中所述膜优选由非聚合物材料组成，
iii)将步骤ii)中获得的渗透物与纳米过滤(NF)膜接触，
iv)用离子交换树脂，例如强阳离子离子交换树脂和弱碱性离子交换树脂处理步骤iii)中获得的滞留物，以使所述滞留物脱矿质，以及
v)将步骤iv)中获得的溶液与活性炭(AC)接触。
所述方法的一个实施方式涉及从产生唾液酸化HMO的反应环境中获得、分离或纯化唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL，包括以下步骤：
i)经由pH调节、稀释和/或热处理预处理所述反应环境，
ii)将预处理后的反应环境离心或将预处理后的反应环境与截留分子量(MWCO)约为5-1000kDa(例如10-1000kDa)的超滤(UF)膜接触，其中所述膜优选由非聚合物材料组成，
iii)将步骤ii)中获得的澄清上清液或UF渗透物与纳米过滤膜接触，
iv)用离子交换树脂，例如强阳离子离子交换树脂和弱碱性离子交换树脂处理步骤iii)中获得的NF滞留物，以使所述滞留物脱矿质，以及
v)将步骤iv)中获得的溶液与活性炭(AC)接触。
优选地，其中产生唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL的反应环境是发酵液。除了作为被适当设计的遗传修饰的微生物，例如E.coli，生产的主要化合物的感兴趣的唾液酸化HMO外，发酵液典型地还含有：碳水化合物副产物或污染物，例如由乳糖(优选外源添加的乳糖)作为前体的感兴趣的唾液酸化HMO的生物合成途径中的碳水化合物中间体，和/或在生物合成途径中由于糖基化不足、缺陷或受损而产生的碳水化合物副产物或污染物，和/或在培养条件下或发酵后操作中由于重排或降解而产生的碳水化合物副产物或污染物，和/或在发酵期间过量添加的作为未消耗的离析物的乳糖。此外，发酵液可含有细胞、蛋白质、蛋白质片段、DNA、焦糖化副产物、矿物质、盐、有机酸、内毒素和/或其他带电分子。
优选地，当发酵液在UF之前未进行离心、微滤或在压滤机或鼓式过滤器上过滤时，所述UF膜由非聚合物材料组成(例如，所述UF膜是陶瓷膜)。
本发明的某些实施方式包括一个或多个另外的任选步骤。优选地，另外的任选步骤不是电渗析。
在一个实施方式中，优选当所述UF渗透物缺乏乳糖或基本上缺乏乳糖时，根据步骤iii)的NF步骤包括使用具有确保滞留感兴趣的唾液酸化人乳寡糖的MWCO的纳米过滤膜，即其MWCO约为唾液酸化人乳寡糖分子量的约25-50％，典型地约150-500Da。在这方面，唾液酸化人乳寡糖积聚在NF滞留物(NFR)中，而例如单价离子或单糖等盐则积聚在渗透物中。
在其他实施方式中，优选当所述UF渗透物含有大量乳糖时，根据步骤iii)的NF步骤包括使用MWCO约为600-3500Da、优选约为1000Da的纳米过滤膜，确保唾液酸化HMO的滞留，并且允许单价和二价盐以及至少一部分乳糖通过所述膜，其中所述NF膜的活性(顶)层由聚酰胺组成，其中所述NF膜上的MgSO4截留率约为50-90％。
在另一方面，本发明涉及从来自发酵或酶法的水性介质中溶解的无机和有机盐、酸和碱中分离唾液酸化HMO，包括将水性介质经历步骤i)、ii)、iii)、iv)和任选步骤v)的步骤。
在第三方面，本发明涉及从水性介质中分离唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL，所述方法包括使用至少两种类型的离子交换树脂处理含有所述唾液酸化HMO的水溶液，一种是碱形式的弱阴离子交换树脂，另一种是H+-形式的强阳离子交换树脂。
优选地，所述水性介质是含有所述唾液酸化HMO的发酵液或酶促反应混合物。
优选地，分离的唾液酸化HMO以其碱金属盐，优选钠盐的形式获得。
优选地，弱阴离子交换树脂处理在强阳离子交换树脂处理之后，优选直接在强阳离子交换树脂处理之后。
在本发明第三方面的一个实施方式中，离子交换处理之前是含有唾液酸化寡糖的水性介质或水溶液的预处理步骤，其中所述预处理步骤包括超滤、纳米过滤和任选活性炭处理，优选按以下顺序：超滤，纳米过滤和任选活性炭处理。
具体实施方式
1.术语和定义
术语“唾液酸化人乳寡糖”意指人乳中发现的唾液酸化复合碳水化合物(Urashima等人：《乳寡糖(Milkoligosaccharides)》，诺瓦生物医学图书(Nova Biomedical Books)，2011年；Chen《碳水化合物化学和生物化学进展(adv.Carbohydr.Chem.Biochem.)》72,113(2015))，其包括核心结构，该核心结构为还原端的乳糖单元，可被一个或多个β-N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个或多个β-乳糖-N-二糖基单元延长，并且其核心结构被α-N-乙酰基神经氨酰(唾液酸)部分取代，并且可任选地被αL-岩藻吡喃基部分取代。在这方面，酸性HMO在其结构中具有至少一个唾液酸残基。酸性HMO的示例包括3’-唾液酸乳糖(3’-SL)、6’-唾液酸乳糖(6’-SL)、3-岩藻糖基-3’-唾液酸乳糖(FSL)、LST a、岩藻糖基-LST a(FLST a)、LST b、岩藻糖基-LST b(FLST b)、LST c、岩藻糖基-LST c(FLST c)、唾液酸-LNH(SLNH)、唾液酸-乳糖-N-六糖(SLNH)、唾液酸-乳糖-N-新六糖I(SLNH-I)、唾液酸-乳糖-N-新六糖II(SLNH-II)和二唾液酸-乳糖-N-四糖(DS-LNT)。
术语“遗传修饰细胞”或“遗传修饰微生物”优选意指微生物的细胞，例如细菌或真菌细胞，例如E.coli细胞，其已被遗传操纵以包括其DNA序列中的至少一种改变。术语“至少一种遗传改变”意指可导致野生型细胞原始特征改变的遗传改变，例如，由于所引入的编码野生型细胞中不存在的酶的表达的新遗传物质，经修饰的细胞能够进行附加的化学转化，或者由于(一个或多个)基因的去除(敲除)而不能进行类似降解的转化。遗传修饰细胞可通过本领域技术人员熟知的遗传工程技术以常规方式产生。
术语“能够从内化的碳水化合物前体产生唾液酸化寡糖的遗传修饰细胞或微生物”优选意指这样的细胞或微生物，其经遗传操纵(参见上文)以包含编码合成所述唾液酸化寡糖所必需的唾液酸转移酶的重组基因、产生适于被所述糖基转移酶转移到碳水化合物前体(受体)的唾液酸核苷酸供体的生物合成途径和/或碳水化合物前体(受体)从培养基内化到细胞中的机制，在细胞中其被唾液酸化以产生感兴趣的唾液酸化寡糖。
术语“生物质”在发酵的上下文中指来自发酵细胞的悬浮、沉淀或不溶性物质，例如完整细胞、破碎细胞、细胞碎片、蛋白质、蛋白质碎片、多糖。术语“生物质”在酶促反应的上下文中指源自所用酶的(主要是变性和/或沉淀的)蛋白质或蛋白质片段。生物质可通过离心、微滤、超滤或压滤机过滤或鼓式过滤器过滤等方式从上述反应混合物(悬浮液)中分离出来。
术语“Brix”意指Brix度，即水溶液的糖含量(100g溶液中的糖的克数)。就此而言，本申请的唾液酸化寡糖溶液的Brix是指包括唾液酸化寡糖及其伴随的碳水化合物的溶液的总碳水化合物含量。Brix是用经校准的折射仪测量的。
盐的截留率(百分比)计算为(1-κp/κr)·100，其中κp是盐在渗透物中的电导率，κr是盐在滞留物中的电导率。滞留物浓度实际上等于盐的进料浓度。下面的工作示例中公开了测量盐截留率的程序。
碳水化合物的截留率(百分比)计算为(1-Cp/Cr)·100，其中Cp是渗透物中碳水化合物的浓度，Cr是滞留物中碳水化合物的浓度。滞留物浓度实际上等于碳水化合物的进料浓度。下面的工作示例中公开了一种测量碳水化合物截留率的示例性程序。
关于两种碳水化合物的分离因子计算为(Cp1/Cr1)/(Cp2/Cr2)，其中Cp1和Cp2分别是渗透物中第一种和第二种碳水化合物的浓度，Cr1和Cr2分别是滞留物中第一种和第二种碳水化合物的浓度。
“纯水通量”被定义为在规定条件下(约23-25℃，10bar，300b l/h恒定错流条件下)，每单位时间、每单位面积和每单位跨膜压力通过膜的纯化水(例如蒸馏水、RO水)的体积。
“脱矿质”优选意指从液体中去除矿物质或矿物盐的过程。在本发明的上下文中，脱矿质优选指离子交换处理的步骤，尤其是随后应用阳离子和阴离子交换树脂，使得来自第二离子交换剂的洗脱液不含或含极少量的矿物质或矿物盐。此外，脱矿质可发生在纳米过滤步骤中，尤其是当其与渗滤相结合时。
“微滤”优选意指预处理分离过程，以通过具有约0.1至10μm孔径的膜过滤发酵液或酶促反应混合物。就近似分子量而言，这些膜可分离分子量一般小于100000g/mol的大分子。
在本发明的整个说明书中使用的与数值相关的术语“约”或“大约”意指所述数值可偏离指示值的10％。
2.从产生唾液酸化HMO的反应环境中获得或分离唾液酸化HMO的方法
本发明涉及一种从水性介质中获得、分离或纯化唾液酸化HMO的方法，所述水性介质为其中已产生所述唾液酸化HMO的发酵液或酶促反应混合物。所述反应环境是一种复杂的基质，其中唾液酸化HMO伴随或被若干种物质污染，如合成所述唾液酸化HMO所需的副产物和残余材料。因此，借助于在若干个连续步骤，通过从副产物和残余材料中分离唾液酸化HMO，从反应环境中获得、分离或纯化唾液酸化HMO，使得唾液酸化HMO以比在反应环境中更纯的形式获得或分离。因此，本发明提供了一种纯化方法，通过所述方法，可按与现有技术相比更有益的方式获得或分离感兴趣的唾液酸化HMO。下面就对应的方法步骤公开了此类益处。
使用生物技术方法，无论唾液酸化HMO以何种方式(发酵或体外酶促)产生，反应环境均含有生物质。因此，本发明的方法强制包括从反应环境中分离生物质以提供包括感兴趣的唾液酸化HMO的水溶液的步骤。将生物质从反应环境中分离包括超滤(UF，详见下文)，任选在此之前进行预过滤(即离心、微滤或在压滤机或鼓式过滤器上过滤)或离心。UF或离心后通常会进行纳米过滤步骤(NF，详见下文)。此外，本发明的方法可任选包括使用离子交换树脂进行处理，有利地使用阳离子和阴离子交换树脂进行处理。此外，本发明的方法可任选包括用于脱色的活性炭处理。在UF和NF之后，可按任何顺序执行任选步骤中的任一个。此外，本发明的方法可任选包括至少一个以上NF步骤，特别是用于浓缩和/或脱盐/脱矿质唾液酸化HMO的水溶液。另选地，如果脱矿质不是必需的(例如，由于进料含盐量低)，可由蒸发替代任选的附加NF。
UF、NF、“用离子交换树脂处理”和“活性炭处理”的步骤将在下面对应的子章节中详细论述。
因此，所述方法包括以下任意顺序的分离/纯化步骤：
aa)离心(CF)或超滤(UF)，
bb)纳米过滤(NF)，以及
cc)用离子交换树脂处理。
有利的是，步骤aa)在步骤bb)之前执行。更有利的是，步骤aa)在步骤bb)和cc)中的任一个之前执行。优选地，所述方法按照步骤bb)在步骤aa)之后且步骤cc)在步骤bb)之后的顺序执行。
在一个实施方式中，所述方法包括：
-反应环境或离心反应环境的超滤(UF)并收集超滤渗透物(UFP)，
-UFP的纳米过滤(NF)并收集纳米过滤滞留物(NFR)，以及
-用离子交换树脂处理NFR并收集树脂洗脱液(RE)。
在一个实施方式中，所述方法包括：
-离心(CF)反应环境并收集澄清上清液，
-澄清上清液的纳米过滤(NF)并收集纳米过滤滞留物(NFR)，以及
-用离子交换树脂处理NFR并收集树脂洗脱液(RE)。
本发明的方法可包括UF、NF或离子交换树脂处理后的活性炭处理。
在一个实施方式中，所述方法包括：
-反应环境或离心反应环境的超滤(UF)并收集超滤渗透物(UFP)，
-UFP的纳米过滤(NF)并收集纳米过滤滞留物(NFR)，
-活性炭处理NFR并收集炭洗脱液(CCE)，以及
-用离子交换树脂处理CCE。
在一个实施方式中，所述方法包括：
-离心(CF)反应环境并收集澄清上清液，
-澄清上清液的纳米过滤(NF)并收集纳米过滤滞留物(NFR)，
-活性炭处理NFR并收集炭洗脱液(CCE)，以及
-用离子交换树脂处理CCE。
优选地，所述方法包括：
-反应环境或离心反应环境的超滤(UF)并收集超滤渗透物(UFP)，
-UFP的纳米过滤(NF)并收集纳米过滤滞留物(NFR)，
-活性炭处理NFR并收集炭洗脱液(CCE)，以及
-用H+-形式的强阳离子交换树脂和游离碱形式的弱阴离子交换树脂处理CCE。
优选地，所述方法包括：
-离心(CF)反应环境并收集澄清上清液，
-澄清上清液的纳米过滤(NF)并收集纳米过滤滞留物(NFR)，
-活性炭处理NFR并收集炭洗脱液(CCE)，以及
-用H+-形式的强阳离子交换树脂和游离碱形式的弱阴离子交换树脂处理CCE。
在另一实施方式中，所述方法包括：
-反应环境或离心反应环境的超滤(UF)并收集超滤渗透物(UFP)，
-UFP的纳米过滤(NF)并收集纳米过滤滞留物(NFR)，
-用离子交换树脂处理NFR并收集树脂洗脱液(RE)，以及
-RE的活性炭处理。
在另一实施方式中，所述方法包括：
-离心(CF)反应环境并收集澄清上清液，
-澄清上清液的纳米过滤(NF)并收集纳米过滤滞留物(NFR)，
-用离子交换树脂处理NFR并收集树脂洗脱液(RE)，以及
-RE的活性炭处理。
优选地，所述方法包括：
-反应环境或离心反应环境的超滤(UF)并收集超滤渗透物(UFP)，
-UFP的纳米过滤(NF)并收集纳米过滤滞留物(NFR)，
-用H+-形式的强阳离子交换树脂和游离碱形式的弱阴离子交换树脂处理NFR并收集树脂洗脱液(RE)，以及
-RE的活性炭处理。
优选地，所述方法包括：
-离心(CF)反应环境并收集澄清上清液，
-澄清上清液的纳米过滤(NF)并收集纳米过滤滞留物(NFR)，
-用H+-形式的强阳离子交换树脂和游离碱形式的弱阴离子交换树脂处理NFR并收集树脂洗脱液(RE)，以及
-RE的活性炭处理。
在一个优选实施方式中，所述方法包括由步骤A)、B)、C)和D)组成的以下步骤顺序：
A)-将反应环境(发酵液)的pH设定为约3至5，
B)-离心(CF)步骤A)的pH调节后的液体培养基，以得到澄清上清液，或
-步骤A)的pH调节后的液体培养基的超滤(UF)，以得到超滤渗透物(UFP)，
C)-用粒状活性炭处理澄清上清液或UFP，以得到炭洗脱液(CCE)，以及
D)-CCE的纳米过滤(NF)并收集纳米过滤滞留物(NFR)，
其中所述方法不包括离子交换处理、模拟移动床层析、凝胶过滤/层析和电渗析。
本发明的方法提供了一种高度富集感兴趣的唾液酸化HMO的溶液，从中可按高收率获得HMO，并且优选具有令人满意的纯度，例如满足食品应用的严格监管要求。
2.1.唾液酸化HMO的产生
2.1.1通过遗传修饰微生物产生唾液酸化HMO
通过培养遗传修饰细胞生产唾液酸化HMO优选如下进行。
包括遗传修饰细胞的发酵生产优选以以下方式发生。外源添加的受体从培养基内化到细胞中，在细胞中，它在包括由合适的唾液酸转移酶介导的酶促唾液酸化的反应中被转化为感兴趣的唾液酸化寡糖。在一个实施方式中，内化可通过被动转运机制发生，在此期间外源受体被动扩散穿过细胞质膜。相对于待内化的受体分子，该流动由细胞外和细胞内空间的浓度差来引导，该受体应该从较高浓度的位置流向较低浓度的区域，趋于平衡。在另一实施方式中，外源受体可借助于主动转运机制内化到细胞中，在此期间，外源受体在转运蛋白或细胞通透酶的影响下扩散穿过细胞的质膜。乳糖通透酶(LacY)对选自半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖基单糖(例如乳糖)、N-乙酰氨基葡萄糖基单糖及其糖苷衍生物的单糖或双糖具有特异性。所有这些碳水化合物衍生物均可通过主动转运的方式容易地被具有LacY通透酶的细胞吸收，并且在糖基化之前在细胞中积累(WO 01/04341，Fort等人的《化学学会杂志，化学通讯(J.Chem.Soc.,Chem.Comm.)》2558(2005)、EP-A-1911850、WO 2013/182206、WO 2014/048439)。这是因为细胞能够利用其LacY通透酶将这些碳水化合物受体转运到细胞中，并且细胞缺乏任何能够降解这些受体的酶，尤其是LacZ。借助于已知的重组DNA技术，通过突变可改变对待内化底物糖部分的特异性。在优选实施方式中，外源添加的受体为乳糖，其内化通过由细胞的乳糖通透酶(更优选LacY)介导的主动转运机制发生。在内化到细胞中后，受体通过由异源基因或核酸序列表达的唾液酸转移酶被唾液酸化，该异源基因或核酸序列通过已知技术引入细胞，例如通过将其整合到细胞染色体或使用表达载体。所述遗传修饰细胞包括产生适于通过对应的唾液酸转移酶转移的唾液酸单糖核苷酸供体(典型地为CMP-唾液酸)的生物合成途径。所述遗传修饰细胞可通过两种方式产生CMP-唾液酸。在一种方式中，外源添加的唾液酸被主动或被动内化，优选主动地被唾液酸通透酶内化，更优选地被nanT编码的唾液酸通透酶内化，并且随后由CMP-NeuAc合成酶(例如，由异源neuA编码)转化为CMP-唾液酸。在另一种方式中，通过表达异源neuC、neuB和neuA，利用内部可用的UDP-GlcNAc，经由作为中间体的ManNAc和唾液酸将其转化为CMP-唾液酸。同时，细胞对唾液酸及其前体的分解代谢活性被醛缩酶基因(nanA)和/或ManNAc激酶基因(nanK)的失活/缺失所抑制。内化的碳水化合物前体可为除唾液酸化以外的糖基化的对象，例如在如上所述唾液酸化之前的N-乙酰氨基葡萄糖基化、半乳糖基化和/或岩藻糖基化。
在通过遗传修饰微生物产生唾液酸化HMO的优选实施方式中，能够产生唾液酸化HMO的微生物是E.coli，优选为携带neuBCA的LacY+LacZ-基因型的E.coli。微生物中的异源唾液酸转移酶基因优选为α-2,3-或α-2,6-唾液酸转移酶，借助于该酶，例如从作为碳水化合物受体的外源添加的乳糖，分别产生3’-SL或6’-SL。此类微生物公开于例如WO 2007/101862，Fierfort等人,《生物技术杂志》134,261(2008)、Drouillard等人,《碳水化合物研究》345,1394(2010)和WO 2017/101958中。
在优选实施方式中，所述遗传修饰微生物为E.coli。
因此，在优选实施方式中，生产过程包括以下步骤：
-提供LacY+表型或LacZ-、LacY+表型的遗传修饰E.coli细胞，其中所述细胞包含：
-编码合成唾液酸化HMO所需的唾液酸转移酶的重组基因，以及
-编码唾液酸转移酶CMP-唾液酸生物合成途径的一个或多个基因，以及
-在外源乳糖和适当碳源存在下，培养LacY+表型或LacZ-、LacY+表型的遗传修饰E.coli细胞，从而产生包含唾液酸化HMO的发酵液。
如此产生的发酵液在生产细胞和培养基中均包括唾液酸化HMO。为了收获细胞内唾液酸化HMO并由此提高产物的滴度，上文所描述的方法可进一步包括例如通过加热破碎或渗透细胞的任选步骤。
包含唾液酸化HMO的发酵液可伴随其他碳水化合物类化合物。典型地，另一种碳水化合物类化合物是乳糖，其在发酵过程中用作受体以制备唾液酸化HMO，并且未被转化。此外，另一伴随的碳水化合物类化合物可为所需唾液酸化HMO的生物合成途径期间的中间碳水化合物，例如乳糖-N-三糖II、LNT或在生成LST的情况下的LNnT。尽管在对发酵液进行下面所公开的分离/纯化步骤(例如，如WO 2012/112777或WO 2015/036138中所公开的)之前，它们在发酵液中的含量可大幅减少，但没有必要这样做。在一个实施方式中，所要求保护的方法适用于从非碳水化合物污染物中分离伴随碳水化合物类化合物的唾液酸化HMO，而碳水化合物类化合物的相对比例在所要求保护的方法过程中没有实质性变化。因此，在一方面，所要求保护的方法的目的是在从来自发酵液或酶促反应环境的水性介质中非碳水化合物类污染物中分离被碳水化合物类化合物伴随的唾液酸化HMO，而不是从包括伴随的碳水化合物类化合物的任何污染物中纯化唾液酸化HMO。唾液酸化人乳寡糖旨在用于营养目的，因此在最终营养组合物中除了主要唾液酸化HMO以外，还存在伴随的碳水化合物，这不是不利的，甚至可能是有利的。然而，所要求保护的方法的另一个实施方式适于通过将唾液酸化HMO从碳水化合物和非碳水化合物污染物中分离来纯化唾液酸化HMO，从而提供基本上纯的形式的唾液酸化HMO。
此外，发酵液中还可存在非HMO碳水化合物类污染物。这些通常是乳果糖及其糖基化衍生物。当乳糖在添加到发酵液之前和/或在发酵期间经过热灭菌时，乳果糖可通过重排由乳糖形成。由于乳果糖也被细胞内化，它可在并行的生物转化反应中被糖基化，类似于乳糖。然而，乳果糖及其糖基化衍生物的量不超过生物质分离后液体培养基总干固体物质重量％的十分之二。
根据本发明，发酵液进一步经受从其他非碳水化合物类化合物和任选地从液体培养基的碳水化合物类化合物中分离/纯化唾液酸化HMO的过程，如下所述。
2.1.2通过离体酶促反应的方法产生唾液酸化HMO
有关通过使用转唾液酸酶的唾液酸化乳糖的离体酶促合成，参见例如Maru等人的《生物科学、生物技术和生物化学(Biosci.Biotech.Biochem.)》56,1557(1992)、Masuda等人的《生物科学与生物工程杂志(J.Biosci.Bioeng.)》89,119(2000)、WO 2012/007588、WO2012/156897或WO 2012/156898。有关通过使用唾液酸转移酶进行的3’-SL的体外酶促合成，参见例如WO96/32492，Gilbert等人，《自然生物技术》16,769(1998)、WO 99/31224或Mine等人的《碳水化合物化学杂志(J.Carbohydr.Chem.)》29,51(2010)。
根据本发明，酶促反应混合物进一步经受从其他非碳水化合物类化合物和任选地从碳水化合物类化合物分离/纯化唾液酸化HMO的程序，如下所述。
2.2从产生唾液酸化HMO的反应环境中获得唾液酸化HMO
2.2.1.超滤前反应环境的任选预处理
除了产生的唾液酸化HMO外，发酵液典型地还含有所用微生物细胞的生物质以及蛋白质、蛋白质片段、DNA、DNA片段、内毒素、生物胺、无机盐、未反应的碳水化合物受体，如乳糖、类糖副产物、单糖、着色体等。任选地，为了使发酵液或酶促反应混合物的大分子更容易过滤，将反应环境的pH调节至约2.5-7.5和/或在30-75℃之间进行热处理和/或通过絮凝/凝聚进行澄清。还任选地，将如上所述处理或未处理的反应环境离心、微滤或在压滤机或鼓式过滤器上过滤，从而去除至少一部分生物质或沉淀/絮凝/变性的酶(一种或多种)。
因此，本发明上下文中使用的术语“预处理反应环境”包括上述步骤中的至少一个。
2.2.2离心前预处理
这些方法可包括离心以从悬浮液中分离生物质。此外，可在任何离心之前对悬浮液进行预处理。有利的是，与未经预处理的离心相比，本公开的实施方式可将非溶解颗粒的沉降速率不仅增加几倍，而且实质上可增加几个数量级，例如1000-10000倍。此外，可产生含有溶解的唾液酸化HMO的透明上清液(例如溶液)。
在某些实施方式中，可通过pH调节对悬浮液进行预处理。在某些实施方式中，可通过稀释对悬浮液进行预处理。在某些实施方式中，可通过加热对悬浮液进行预处理。在某些变型中，可执行所公开的预处理中的两种或三种。下面所公开的所有预处理均可在离心之前进行。
具体而言，本公开的实施方式可用于从悬浮液(例如发酵液)中分离含有唾液酸化HMO的液体，优选水相。
有利的是，预处理可在不添加絮凝剂的情况下执行(例如，加速该过程如沉降速率的试剂，例如无机多价金属盐或带电聚合物(例如聚乙烯亚胺(PEI)或壳聚糖))。因此，本公开的任何或所有实施方式中均不得使用絮凝剂。
在没有所公开的预处理的实施方式的情况下，溶液的典型离心在实验室规模的试验中需要在高重力下长时间离心(停留)，具有不确定的产率和不确定的蛋白质和其他生物分子的去除效果以及不确定的澄清度，例如通过OD600测量。因此，由于只能进行实验室规模的操作，因此无法使用已知工艺有效地将制造商业化。
然而，通过使用所公开的预处理方法的实施方式，已经产生了许多优点，例如1)实现了实质上更高的吞吐量；2)由于稀释和热处理，实现了溶解的唾液酸化HMO的更好的产率，这两者均最小化了生物质/上清液的比例，并且促进了从生物质中提取产物；3)如OD600所量化的，预处理后的细颗粒去除更加有效；4)生物分子去除也更有效(例如，由于在较低pH和热处理下变性和沉淀的蛋白质)；5)更高的吞吐量，即在后续任选膜过滤步骤如微滤或超滤中可获得更高的通量。
此外，本公开的实施方式具有更短的步骤持续时间、更小和更不复杂的设备、更少的清洁化学品，并且需要更短和更不频繁的清洁。
如下文将进一步详细论述的，悬浮液的预处理可包括pH调节、和/或稀释和/或热处理。在某些实施方式中，可进行pH调节、稀释和热处理中的所有三种。在替代实施方式中，可进行pH调节和稀释。在替代实施方式中，可执行pH调节和热处理。在替代实施方式中，可进行热处理和稀释。
有利的是，多种预处理方法的组合可提供在单个预处理中未发现的改进的协同效应。
所有预处理均可在离心或分离预处理悬浮液的唾液酸化HMO之前进行。在某些实施方式中，在离心期间可发生一个或多个预处理步骤。例如，在多步骤离心的步骤之间。另选地，离心容器可在离心期间加热悬浮液。
有利的是，预处理可将悬浮液(液体培养基)中固体颗粒(生物质)的沉降速度提高100-20000倍，使得通过离心分离生物质的效率更高，因此可应用于工业规模。除沉降速度外，由于预处理，至少有3个其他参数得到了显著改善：
1)单次离心后，液相(上清液)中溶解的唾液酸化HMO的产率可提高到90％以上，而未经预处理的仅为约50-70％；
2)上清液中蛋白质和DNA含量可降低约10倍；
3)通过在低RCF＝约3000g下离心3分钟，残余悬浮固体含量也大幅降低至OD600<0.1，例如OD600<0.05，例如降低至OD600约0.024，相比之下，未经处理的液体培养基在10000g/10min时OD600>1。
2.2.2.1经由pH调节的预处理
在一种或多种示例性方法中，可在离心之前/期间调节悬浮液的pH(例如，液体培养基、发酵液、反应环境)。
在许多使用发酵液的情况下，悬浮液的pH在6-7范围内。例如，pH可为6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8或6.9。然而，其他悬浮液可具有不同的起始pH，例如低于6和高于7。悬浮液的特定起始pH没有限制。
有利的是，在离心之前降低悬浮液的pH，从而使其呈酸性，可提高沉降速率，从而提高过程的速度和产率。此外，可避免使用絮凝剂，因为pH调节可作为内源性絮凝过程。
可通过多种方法调节悬浮液的pH。例如，可将酸加入到悬浮液中以降低悬浮液的pH。所述酸可为有机酸。在其他实施方式中，所述酸可为无机酸。
可使用的一种示例酸是硫酸，例如具有式H2SO4。例如，酸可为20％的H2SO4溶液。然而，也可使用其他酸，并且使用的特定酸没有限制。例如，所述酸可选自H2SO4、HCl、H3PO4、甲酸、乙酸和柠檬酸中的一种或多种。这些酸中的每一种均可单独使用或与任何其他酸结合使用。
通过pH调节，悬浮液的pH可降至2至5之间，特别是3至4之间。例如，在pH调节预处理后，悬浮液的pH可为2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。在某些实施方式中，在pH调节预处理后，悬浮液的pH可大于2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8或4.9。在一些实施方式中，在pH调节预处理后，悬浮液的pH可小于2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。
在一个实施方式中，在调节酸性悬浮液的pH后，将预处理的悬浮液冷却，例如冷却至5-15℃，并且在离心前储存1-15天。
有利的是，悬浮液的pH调节可减少颗粒的表面电荷(例如，生物质的表面电荷)。因此，pH调节可促进生物质的自絮凝，例如在离心期间。
在一种或多种示例性方法中，pH调节可单独进行，与稀释一起进行，与热处理一起进行，或者与热处理和稀释一起进行。
2.2.2.2经由稀释的预处理
在所公开方法的一种或多种示例性方法中，悬浮液(例如，液体培养基、发酵液、反应环境)可在离心之前/期间稀释。
在某些实施方式中，可稀释悬浮液，使得稀释悬浮液的质量在悬浮液原始质量的1.1至10倍之间，优选在1.5至10倍之间，更优选在2至4倍之间，更优选在2.5至3.5倍之间。例如，可将悬浮液稀释为悬浮液原始质量的1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0倍。在一些实施方式中，可将悬浮液稀释至悬浮液原始质量的2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0倍以下。在一些实施方式中，可将悬浮液稀释至悬浮液原始质量的1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0或9.5倍以上。
稀释可优选用水进行。水可为自来水、去离子水或蒸馏水。
在某些实施方式中，稀释可降低上清液的密度并降低粘度。稀释的另一个优点是增加上清液中可获得的HMO产物的产率。例如，在没有稀释的情况下，发酵产生的HMO只有约50-70％进入上清液。
在某些实施方式中，稀释后，悬浮液可具有约2至10、优选2至8、更优选2至4、更优选2.5至3.5之间的稀释率。稀释率是悬浮液最终体积(即稀释后)与悬浮液初始体积(即稀释前)之间的比率。例如，可将悬浮液稀释为悬浮液原始体积的2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0倍。
优选地，可稀释悬浮液以获得特定的生物湿质量(BWM)。BWM是离心后分离的湿固体颗粒与初始液体培养基质量之间的比率。为了测定BWM，从搅拌过的悬浮液中提取样品，并且以约10000g的相对离心力(RCF)进行离心，直到获得澄清上清液(约10分钟)。倾析上清液并称量固体湿颗粒的质量。BWM是固体湿颗粒与取自悬浮液的样品重量的百分比。根据上述条件确定，典型悬浮液的BWM为25-35％，或者一直高至50％。因此，在一些实施方式中，可稀释悬浮液，使其BWM小于20、15、10或5％，优选约10-15％(稀释后的BWM在与稀释前相同的条件下测定)。更优选地，这是通过稀释率约为2.5-3.5的稀释实现的，或者稀释悬浮液的质量在悬浮液原始质量的2.5至3.5倍之间。在一些实施方式中，可稀释悬浮液，使得原始悬浮液的BWM减少30-90％，例如BWM减少至稀释前测量的原始BMW的2/3、1/2、1/3、1/5或1/10。
在一些实施方式中，可在多阶段离心期间执行稀释，例如两阶段离心。例如，水可在第一次离心后但在第二次离心前添加。
在一种或多种示例性方法中，稀释可单独进行，与pH调节一起进行，与热处理一起进行，或者与热处理和pH调节一起进行。
2.2.2.3经由热处理的预处理
在一种或多种示例性方法中，可在离心前/离心期间对悬浮液进行热处理(例如，热调节、温度处理、温度变化)。
在本公开的某些实施方式中，可通过将悬浮液加热至20至120℃之间的温度，例如30-90、30-85或35-65℃，优选45至120℃，优选60至90℃，更优选60至80℃来预处理悬浮液。例如，可将悬浮液加热至20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120℃的温度。在一些实施方式中，可将悬浮液加热至大于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120℃的温度。在一些实施方式中，可将悬浮液加热至低于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120℃的温度。
热处理可通过已知的方法进行，例如使用烤箱、燃烧器、水浴、油浴、加热罩或其他加热系统。优选地，热处理通过使用以下传热方法中的一种或组合的工业加热器来执行：传导、对流、辐射。此类加热器可为循环加热器、管式加热器、浸入式加热器、用蒸汽加热或通过加热罩加热。
在一些实施方式中，悬浮液可在热处理温度下保持特定时间。例如，悬浮液可在任一上述加热温度下保持1、2、3、4、5、10、15、20、25或30分钟。在一些实施方式中，悬浮液可在任一上述加热温度下保持大于1、2、3、4、5、10、15、20、25或30分钟。在一些实施方式中，悬浮液可在任一上述加热温度下保持小于2、3、4、5、10、15、20、25或30分钟。
在某些实施方式中，悬浮液通过直接加热至任一上述温度进行预处理。在其他实施方式中，悬浮液可包括逐步加热，其中悬浮液可被加热至第一温度持续第一时间量。然后可将悬浮液加热至第二温度持续第二时间量。第一温度可低于第二温度。第一温度可高于第二温度(例如，冷却而不是加热)。第一时间量可大于第二时间量。第一时间量可小于第二时间量。第一温度可为上述温度中的任一温度。第二温度可为上述温度中的任一温度。第一时间量可为上述时间中的任一时间。第二时间量可为上述时间中的任一时间。
有利的是，热处理可使部分生物质变性，例如蛋白质和DNA。此外，热处理可沉淀生物分子，例如蛋白质和DNA。这有助于降低高初始液体培养基粘度。
在一种或多种示例性方法中，热处理可单独进行，与稀释一起进行，与pH调节一起进行，或者与pH调节和稀释一起进行。
2.2.2.4经由pH调节和稀释的预处理
在一种或多种示例性方法中，可执行pH调节和悬浮液稀释两者。这两种方法的结合可提供协同效应，使得上清液更清澈且易于离心。例如，pH调节可减少表面电荷，并且当与稀释结合时，应能提供更好的HMO产率。
在一种或多种示例性方法中，可首先执行悬浮液的pH调节，如上文详细论述的。一旦根据需要调节pH，就可将悬浮液稀释至所需水平，如上文详细论述的。如果稀释影响pH，可重新平衡pH，以维持适当的pH。
在一种或多种示例性方法中，可首先进行悬浮液的稀释，如上文详细论述的。一旦悬浮液稀释至所需水平，则可对悬浮液进行pH调节。因此，最终稀释的悬浮液可进行pH调节，由于悬浮液体积较大，与单独进行pH调节相比，这可能需要使用更多的酸。
在一种或多种示例性方法中，稀释和pH调节可在同一时间发生(例如，一般同一时间、同时发生、同步)。例如，可向悬浮液中添加水，同时也可添加酸。另选地，可先添加酸，然后约同一时间添加水。在一种或多种示例性方法中，pH调节和稀释可在重复步骤中发生。例如，可添加一些酸，然后添加一些水，这可重复进行，直到达到所需的pH和稀释度。
pH调节和稀释两者均可在离心前或离心期间发生。
2.2.2.5经由pH调节和加热的预处理
在一种或多种示例性方法中，可对悬浮液进行pH调节和加热两者。这两种方法的结合可提供协同效应，使得上清液更清澈且易于离心。例如，pH调节可减少表面电荷，并且当结合加热变性时，可获得更好的HMO产率。
在一种或多种示例性方法中，可首先执行悬浮液的pH调节，如上文详细论述的。一旦根据需要调节pH，就可将悬浮液加热至所需温度，如上文详细论述的。如果加热影响pH，可重新平衡pH，以维持适当的稀释。
在一种或多种示例性方法中，可首先执行悬浮液的加热，如上文详细论述的。一旦悬浮液加热至所需温度，就可对悬浮液进行pH调节。与热处理结合所需的酸的量可仅基于pH调节而变化。
在一种或多种示例性方法中，加热和pH调节可在同一时间发生(例如，一般同一时间、同时发生、同步)。例如，可采用上述一种或多种上述方法对含有悬浮液的容器进行加热。当容器加热时，可向悬浮液中添加酸，以调节悬浮液的pH。
pH调节和稀释两者均可在离心前或离心期间发生。
2.2.2.6经由稀释和加热的预处理
在一种或多种示例性方法中，可对悬浮液进行稀释和加热两者。这两种方法的结合可提供协同效应，使得上清液更清澈且易于离心。例如，通过加热实现的蛋白质变性可更容易地从稀释中分离，这可导致更好的HMO产率。
在一种或多种示例性方法中，可首先进行悬浮液的稀释，如上文详细论述的。一旦稀释悬浮液，就可将悬浮液加热至所需温度，如上文详细论述的。如果加热影响稀释，例如通过蒸发损失材料，可添加更多的水以维持适当的稀释。
在一种或多种示例性方法中，可首先进行悬浮液的加热，如上文详细论述的。一旦悬浮液被加热至所需的温度，就可向悬浮液中添加水。水可与加热后的悬浮液处于相同的温度，也可处于更低或更高的温度。
在一种或多种示例性方法中，加热和稀释可在同一时间发生(例如，一般同一时间、同时发生、同步)。例如，可采用上述一种或多种上述方法对含有悬浮液的容器进行加热。当容器加热时，可向悬浮液中加水，以调节悬浮液的稀释度。另选地，在添加冷悬浮液后，稀释和加热可通过在添加冷悬浮液后添加预热到高于稀释悬浮液目标温度的热水而同时进行。
加热和稀释两者可发生在离心之前或离心期间。
2.2.2.7经由加热、pH调节和稀释的预处理
在一种或多种示例性方法中，可对悬浮液进行稀释、加热和pH调节的所有三种预处理。这三种方法的结合可提供协同效应，使得上清液更清澈且易于离心。因此，可在更快的时间获得更高的产率。三种预处理的组合比单独添加所有预处理的影响更大。
在一种或多种示例性方法中，可首先进行悬浮液的pH调节，如上文详细论述的。一旦根据需要调节pH，就可将悬浮液稀释至所需水平，如上文详细论述的。如果稀释影响pH，可重新平衡pH，以维持适当的pH。一旦进行了稀释，就可将悬浮液加热至所需的温度，如上文详细论述的。如果加热影响pH和/或稀释度，可重新平衡pH和/或稀释度，以维持适当的pH和/或稀释度。
在一种或多种示例性方法中，可首先进行悬浮液的pH调节，如上文详细论述的。一旦进行了pH调节，就可将悬浮液加热至所需温度。如果加热影响pH，可重新平衡pH，以维持适当的pH水平。一旦进行了加热，就可将悬浮液稀释至所需水平。如果稀释影响pH，可重新平衡pH，以维持适当的pH。水(例如，用于稀释)的温度可与加热后的悬浮液处于相同的温度，也可处于较低的温度或较高的温度。
在一种或多种示例性方法中，可首先进行悬浮液的加热，如上文详细论述的。一旦悬浮液加热至所需温度，就可对悬浮液进行pH调节。结合热处理所需的酸量可仅基于pH调节而变化。一旦进行了加热和pH调节，就可进一步稀释悬浮液。水可与加热后的悬浮液处于相同的温度，也可处于较低的温度或较高的温度。如果需要，在稀释后，则可将pH进一步调节至所需水平。
在一种或多种示例性方法中，可首先执行悬浮液的加热，如上文详细论述的。一旦悬浮液加热至所需温度，悬浮液就可进行稀释。水可与加热悬浮液处于相同的温度，也可处于较低的温度或较高的温度。一旦进行了加热和稀释，就可对悬浮液进行pH调节。结合热处理和稀释所需的酸量可仅基于pH调节而变化。
在一种或多种示例性方法中，可首先进行悬浮液的稀释，如上文详细论述的。一旦稀释悬浮液，就可将悬浮液加热至所需温度。如果加热影响稀释，例如通过蒸发损失材料，可添加更多的水以维持适当的稀释。加热后，可对悬浮液进行pH调节。结合热处理和稀释所需的酸量可仅基于pH调节而变化。
在一种或多种示例性方法中，可首先进行悬浮液的稀释，如上文详细论述的。一旦稀释，悬浮液就可进行pH调节。结合热稀释所需的酸量可仅基于pH调节而变化。pH调节后，可加热悬浮液。可在加热过程中对悬浮液进行调节，以维持pH和稀释水平。
在一种或多种示例性方法中，加热和稀释可在同一时间发生(例如，一般同一时间、同时发生、同步)。例如，含有悬浮液的容器可用上述方法中的一种或多种加热。当容器加热时，可向悬浮液中加水，以调节悬浮液的稀释度。加热和稀释后，可调节悬浮液的pH。另选地，可在同时加热和稀释之前调节悬浮液的pH。
在一种或多种示例性方法中，加热和pH调节可在同一时间发生(例如，一般同一时间、同时发生、同步)。例如，含有悬浮液的容器可用上述方法中的一种或多种加热。当容器加热时，可向悬浮液中添加酸，以调节悬浮液的pH。加热和pH调节后，可稀释悬浮液。另选地，可在同时加热和pH调节之前稀释悬浮液。
在一种或多种示例性方法中，稀释和pH调节可在同一时间发生(例如，一般同一时间、同时发生、同步)。例如，可向悬浮液中添加水，同时也可添加酸。另选地，可先添加酸，然后约同时添加水。在一种或多种示例性方法中，pH调节和稀释可在重复步骤中发生。例如，可添加一些酸，然后添加一些水，这可重复进行，直到达到所需的pH和稀释度。稀释和pH调节后，可加热悬浮液。另选地，可在同时稀释和pH调节之前加热悬浮液。
在一种或多种示例性方法中，稀释、pH调节和加热可在同一时间发生(例如，一般同一时间、同时发生、同步)。因此，所有三种预处理可在同一时间发生。
加热、pH调节和稀释可在离心前或离心期间发生。
2.2.3.反应环境或预处理反应环境的超滤(UF)
所要求保护的方法的UF步骤包括：
i)将所述反应环境的pH设定为酸性，例如从约3至约6，优选不高于约5，和/或将所述反应环境升温至高于室温(或环境温度)的温度，优选约30-90℃，更优选约35-65℃，以及
ii)将步骤i)中获得的反应环境与截留分子量(MWCO)约为5-1000kDa(例如10-1000kDa)的超滤(UF)膜接触，其中所述膜优选由非聚合物材料组成。
所述超滤步骤是从液体培养基的可溶性组分中分离生物质(或预处理反应环境中剩余的部分生物质)，优选地，还分离高分子量悬浮固体，其中可溶性成分在渗透物中通过超滤膜。这种UF渗透物(UFP)是含有生成的唾液酸化HMO的水溶液。
在优选实施方式中，如果反应环境被离心、微滤或在压滤机或鼓式过滤器上过滤，则UF膜由非聚合物材料组成，更优选由陶瓷材料组成。
在一个实施方式中，将反应环境或离心反应环境的pH设定为酸性，例如从约3到约6，优选设定为不高于约5的值，更优选设定为约3-5的值。如上所述设定pH是特别有利的，因为由于更有效的变性和沉淀，它致使溶解的生物分子(例如可溶性蛋白质和DNA)的量大幅减少。较少量的溶解生物分子允许在后续步骤中使用较高MWCO的UF膜，从而提供更好的通量，这是更高生产率的促成因素。
在其他实施方式中，将反应环境或离心反应环境加热至高于环境温度的温度，即室温或反应环境温度，例如加热至约30至约90℃的范围内，优选加热至约35-85℃，例如加热至约35-75℃，更优选加热至约50-75℃，例如约60-65℃。UF前的这种热处理大大减少了反应环境中活微生物的总数(总微生物计数)，因此在所述方法的后期阶段无菌过滤步骤可能是不必需的。此外，由于更有效的变性和沉淀，它减少了可溶性蛋白质的量，这增加了离子交换处理步骤(作为后续任选步骤)中残余蛋白质去除的功效。
优选地，上述步骤i)包括将所述反应环境的pH设定为不高于5，并且将所述反应环境升温至约30-90℃，这特别降低了蛋白质的溶解度，从而降低了蛋白质在后续UF步骤中向UF渗透物中的渗漏。
在所要求保护的方法的步骤ii)中，使用由非聚合物材料组成的UF膜，优选陶瓷膜。非聚合物UF膜可耐受高温如果在该温度下进行UF。此外，非聚合物膜(有利地为陶瓷膜)的适用通量通常高于具有相同或相似MWCO的聚合物UF膜的通量；此外，非聚合物膜，有利地为陶瓷膜，不易受到污染或堵塞。在工业应用中，UF膜的再生是一个重要的成本和技术因素。非聚合物膜，有利地为陶瓷膜，允许使用苛刻的原位清洗(CIP)条件，包括高温下的苛性碱/强酸处理(不适用于聚合物膜)，当对具有高悬浮固体含量的发酵流进行超滤时，可能需要这种条件。此外，非聚合物膜，有利地为陶瓷膜，由于对在高错流下循环的固体颗粒的惰性和耐磨性而具有更长的寿命。
可使用截留分子量(MWCO)范围在约5至约1000kDa之间，例如约5-250、5-500、5-750、50-250、50-500、50-750、100-250、100-500、100-750、250-500、250-750、500-750kDa或任何其他合适的子范围的任何常规非聚合物超滤膜，有利地为陶瓷膜。
所述方法的步骤ii)可在低温(约5℃至室温)、室温或高温下进行，优选在高温下进行。高温优选不超过约65℃；合适的温度范围可为例如约35-50、35-65、45-65、50-65、55-65或60-65℃。在高温下进行的UF步骤大大减少了反应环境中的活微生物总数(总微生物计数)，因此在所述方法的后期阶段无菌过滤步骤可能不是必需的。此外，由于更有效的变性和沉淀，它减少了可溶性蛋白质的量，从而提高了离子交换处理步骤(稍后作为任选步骤)中残余蛋白质去除的功效。
优选地，如果在高温下执行步骤ii)，则在前一步骤i)中将反应环境的pH设定为不高于约5是有利的，因为这特别降低了蛋白质的溶解度，从而降低了蛋白质向UF渗透物中的渗漏。
超滤步骤可按死端或错流模式应用。
在一个实施方式中，在本发明的方法中仅进行单个UF步骤。
在其他实施方式中，本发明的方法可包括使用具有不同MWCO的膜的多个超滤步骤，例如使用两个超滤分离，其中第一个膜的MWCO高于第二个膜的MWCO，前提是至少一个UF膜是非聚合物膜，优选陶瓷膜。这种布置可提供液体培养基的高分子量组分的更好分离效果。
然而，在一个实施方式中，超滤可与渗滤相结合。
在进行包括上述步骤i)和ii)的超滤后，UF渗透物含有分子量低于所用膜的MWCO的材料，当使用一系列膜时，任选地低于最后一个膜的MWCO，包括感兴趣的唾液酸化HMO。
2.2.4.离心
在上述预处理中的任何或所有之后，通过离心从悬浮液中分离生物质。它可比超滤等需要大量时间的其他工艺具有优势。离心可为实验室规模，或者有利地优于以前的离心方法，是商业规模的(例如工业规模、全生产规模)。
在一些实施方式中，可使用多步骤离心。例如，可进行一系列2、3、4、5、6、7、8、9或10次离心步骤。在其他实施方式中，离心可为单个步骤。
与具有冗长的原位清洗(CIP)程序、需要昂贵的陶瓷膜和高尺寸/高占地面积的实验室和全生产规模的冗长超滤相比，离心提供了快速的生物质去除。
与超滤相比，生物质分离通过更有效和更经济的方式实现。目前通过工业连续超滤去除生物质的渗透流速较低，这需要较长的停留时间(>1小时)、与设备高占地面积相关的高膜面积、由大功率错流泵产生的高能耗，具有依赖于液体培养基且有时不可预测的属性，需要每24小时或更短时间的长CIP(5小时)操作，具有对于UF单元和陶瓷膜均非常高的CapEx，并且具有高尺寸/占地面积。
在某些实施方式中，可使用由Flottweg设计和制造的
Figure BDA0003695554120000291
离心机。
离心机的具体类型没有限制，可使用多种类型的离心机。离心可为连续的过程。在一些实施方式中，离心可添加进料。例如，离心可连续添加进料。在某些实施方式中，离心可包括固体去除，例如湿固体去除。湿固体去除在某些实施方式中可为连续的，而在其他实施方式中可为周期性的。
例如，可使用锥形平板离心机(例如，盘碗离心机或碟片式分离机)。锥形平板离心机可用于从液体中去除固体(通常为杂质)，或通过高离心力将两个液相彼此分离。受到这些力作用的密度较大的固体或液体向外朝着旋转的转鼓壁移动，而密度较小的液体则向中心移动。这种特殊板(称为碟片组)增加了表面沉降面积，从而加快了分离过程。不同的片组设计、布置和形状用于不同的工艺，这取决于存在的进料类型。然后，取决于锥形平板离心机的设计，可连续、手动或间歇地去除浓缩的密度较高的固体或液体。这种离心机非常适合于澄清含有少量悬浮固体的液体。
离心机利用斜板设置器原理进行工作。安装一组相对于水平面倾斜角度θ的平行板，以减少颗粒沉降的距离。倾斜角度的原因是允许板上的沉降固体在离心力的作用下向下滑动，这样它们就不会积聚和堵塞相邻板之间形成的通道。
这种类型的离心机可有不同的设计，例如喷嘴类型、手动清洁、自清洁和密封。特定离心机不受限制。
影响离心机的因素包括圆盘角度、重力效应、盘间距、进料固体、排放锥角、排放频率和液体排放。
另选地，可使转鼓离心机(例如，沉降式离心机)。这是一种使用沉降原理的离心机。离心机是利用连续旋转产生的离心力来分离由两种不同密度的物质组成的混合物。它通常用于分离固-液、液-液和固-固混合物。与其他类型的离心机相比，工业用转鼓离心机的一个优点是安装简单。转鼓离心机有三种设计类型，即圆锥形、圆柱形和圆锥形-圆柱形。
转鼓离心机可有许多不同的设计，其中任何一种均可用于所公开的方法。例如，可使用锥形转鼓离心机、圆柱形转鼓离心机和圆锥形-圆柱形转鼓离心机。
在螺旋输送机的帮助下，转鼓离心机通过快速旋转下形成的离心力来分离两种不同密度的物质。进料浆进入输送机，并且通过卸料口输送到旋转的转鼓中。输送机和转鼓之间的旋转速度略有差异，致使固体从废水进入转鼓壁的固定区域输送。在离心力的作用下，收集的固体沿转鼓壁移动，离开池，并且向上移动至转鼓锥形端处的脱水滩。最后，分离出的固体进入固体排放口，而液体进入液体排放口。澄清液体通过可调节的溢流部件以相反方向流过输送机。
离心可在多种速度和停留时间下进行。例如，离心可在20000g、15000g、10000g或5000g的相对离心力(RCF)下进行。在一些实施方式中，离心可在小于20000g、15000g、10000g或5000g的相对离心力(RCF)下进行。在一些实施方式中，离心可在大于20000g、15000g、10000g或5000g的相对离心力(RCF)下进行。
在一些实施方式中，离心可通过工作体积来表征。在一些实施方式中，工作体积可为1、5、10、15、20、50、100、300或500升(l)。在一些实施方式中，工作体积可小于1、5、10、15、20、50、100、300或500l。在一些实施方式中，工作体积可大于1、5、10、15、20、50、100、300或500l。
在一些实施方式中，离心可通过进料流速来表征。在一些实施方式中，进料流速可为100、500、1000、1500、2000、5000、10000、20000、40000或100000升/小时。在一些实施方式中，进料流速可大于100、500、1000、1500、2000、5000、10000、20000、40000或100000升/小时。在一些实施方式中，进料流速可小于100、500、1000、1500、2000、5000、10000、20000、40000或100000升/小时。
离心所花费的时间(例如停留时间)也可有所不同。例如，停留时间可为0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟。在一些实施方式中，停留时间可大于0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟。在一些实施方式中，停留时间可小于0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟。
2.2.4.1上清液
上述离心过程可允许形成改良的上清液。例如，上清液可含有唾液酸化HMO，而剩余的物质可分离出来。因此，上清液可为透明的(例如澄清的、一般透明的、基本上透明的)上清液。剩余材料(可导致上清液缺乏澄清度)可为例如生物质，即细胞、细胞碎片、小颗粒和生物分子中的一种或多种。例如，生物分子可为蛋白质、RNA和DNA。因此，上清液可为含有纯化唾液酸化HMO的澄清上清液。
作为上清液澄清度的一个示例，典型的发酵液在600nm(OD600)处可具有非常高的光密度，相对于纯水超过10。OD600通常用分光光度计测量；如果OD600因大量悬浮颗粒而超过1，则可能需要稀释样品(因此OD600值是根据稀释度计算的)。然而，在上述过程之后，OD600可移至1.0、0.7、0.5、0.3、0.2、0.1或0.05以下，这是在没有稀释的情况下测量的，但是相对于所得上清液的微滤样品。在一些实施方式中，OD600可移至1.0、0.7、0.5、0.3、0.2、0.1或0.05以上。在一些实施方式中，OD600可移至1.0、0.7、0.5、0.3、0.2、0.1或0.05。当OD600小于0.1时，无法目视检测到悬浮颗粒，上清液看起来像透明溶液。
此外，上清液中的蛋白质也可减少，从而提供进一步的澄清。离心后上清液中的蛋白质可小于3000、2500、2000、1500、1000、500、400、300、200、100或50mg/l。在一些实施方式中，离心后上清液中的蛋白质可大于3000、2500、2000、1500、1000、500、400、300、200、100或50mg/l。在一些实施方式中，离心后上清液中的蛋白质可为3000、2500、2000、1500、1000、500、400、300、200、100或50mg/l。
此外，与先前方法相比，所公开方法的有利实施方式可提供更高的产品产率。澄清上清液的产品产率为50、55、60、65、70、75、80、85、90或95％。澄清上清液的产品产率可大于50、55、60、65、70、75、80、85、90或95％。澄清上清液的产品产率可小于50、55、60、65、70、75、80、85、90或95％。
上述任何上清液性质均可通过单次离心产生。另选地，它可通过多次离心来产生。
2.2.5纯化的后处理
在产生上述UF渗透物(2.2.3)或CF上清液(2.2.4.1)后，可采取进一步的后处理步骤。这可用来例如从UF渗透物或上清液中分离(例如获得)唾液酸化HMO。下文论述了许多不同的方法。应当理解，所述方法可包括所公开的后处理步骤中的任一个。在替代实施方式中，所述方法可在步骤的任何配置中含有所公开的后处理步骤中的一个以上。
2.2.5.1离心后的UF
在一些实施方式中，后处理方法可包括离心后获得的澄清上清液的超滤(UF)或微滤(MF)。例如，过滤可使用孔径<2μm和>2nm和/或MWCO>1000Da或10000Da或以上的膜。孔径或截留值应足够大，以允许产品(唾液酸化HMO)通过膜的孔。任选地，还可进行渗滤，其中唾液酸化HMO收集在渗透流中。
在任选的后处理步骤中，超滤是为了在离心后分离生物质的剩余部分。UF(或MF)膜可由聚合物或非聚合物材料组成。优选地，UF膜由非聚合物材料、更优选陶瓷材料组成。非聚合物UF膜可耐受高温如果在该温度下进行UF。此外，非聚合物膜，有利地为陶瓷膜的适用通量通常高于具有相同或类似MWCO的聚合物UF膜的适用通量；此外，非聚合物膜，有利地为陶瓷膜，不易受到污染或堵塞。在工业应用中，UF膜的再生是一个重要的成本和技术因素。非聚合物膜，有利的为陶瓷膜，允许使用苛刻的原位清洗(CIP)条件，包括高温下的苛性碱/强酸处理(不适用于聚合物膜)，当对具有高悬浮固体含量的发酵流进行超滤时，可能需要这种条件。此外，非聚合物膜，有利地为陶瓷膜，由于对在高错流下循环的固体颗粒的惰性和耐磨性而具有更长的寿命。
可使用截留分子量(MWCO)范围在约1至约1000kDa之间，例如约1-10、10-1000、5-250、5-500、5-750、50-250、50-500、50-750、100-250、100-500、100-750、250-500、250-750、500-750kDa或任何其他合适的子范围的任何常规超滤膜，有利地为陶瓷膜。
UF可在低温(约5℃至室温)、室温或高温下进行，优选在高温下进行。高温优选不超过约80℃，合适的温度范围可为例如约35-50、35-80、45-65、50-65、55-65或60-80℃。在高温下进行的UF步骤大大减少了反应环境中活微生物的总数(总微生物计数)，因此在所述方法的后期阶段无菌过滤步骤可能不是必需的。此外，由于更有效的变性和沉淀，它减少了可溶性蛋白质的量，从而提高了离子交换处理步骤(稍后作为任选步骤)中残余蛋白质去除的效果。
超滤步骤可按死端或错流模式应用。然而，在一个实施方式中，超滤可与渗滤相结合。唾液酸化HMO收集在UF渗透物(UFP)中。
2.2.5.2纳米过滤
本发明的方法包括作为任选步骤的纳米过滤(NF)步骤。优选地，NF步骤直接跟随在反应环境(2.2.3)或离心反应环境(2.2.5.1)的超滤之后，即NF步骤的进料是含有感兴趣的唾液酸化HMO的UF渗透物。同样优选地，NF步骤直接跟随在离心步骤(2.2.4)之后。任选地，在进行NF步骤之前，UF渗透物或澄清上清液可使用活性炭(见下文)脱色。该纳米过滤步骤可有利地用于浓缩UF渗透物或澄清上清液，和/或去除离子(主要是单价离子)和分子量低于唾液酸化HMO的有机材料，例如单糖。纳米过滤膜的MWCO比前一步骤中使用的超滤膜的MWCO低，并且确保感兴趣的唾液酸化HMO的滞留。
在纳米过滤的第一方面，NF膜的MWCO约为感兴趣的唾液酸化HMO分子量的25-50％，典型地约为150-500Da。在这方面，感兴趣的唾液酸化HMO累积在NF滞留物(NFR)中。纳米过滤可与水的渗滤相结合，以更有效地去除或减少可渗透的盐(例如单价离子)的量。
在第一方面的一个实施方式中，NF跟随在UF之后，使得UF渗透物在不进行渗滤的情况下进行纳米过滤，并且收集含有唾液酸化HMO的NF滞留物并进行所述方法的进一步分离步骤。
在第一方面的其他实施方式中，NF跟随在UF之后，使得UF渗透物被纳米过滤，随后渗滤，并且收集含有唾液酸化HMO的NF滞留物并进行所述方法的进一步分离步骤。
纳米过滤的第一方面有利地适用于不含乳糖或仅含少量乳糖(最多约为感兴趣的唾液酸化HMO重量的1-2％)的UF渗透物。
在纳米过滤的第二方面，其有利地适用于含有更多乳糖的UF渗透物，膜具有600-3500Da的MWCO，确保三唾液酸化HMO或更高唾液酸化HMO的滞留，并且允许至少一部分乳糖通过膜，其中膜的活性(顶)层由聚酰胺组成，其中所述膜上的MgSO4截留率约为20-90％，优选为50-90％。
术语“确保三唾液酸化HMO或更高唾液酸化HMO的滞留”优选意指，在纳米过滤步骤期间，三唾液酸化HMO或更高唾液酸化HMO不通过或至少显著不通过膜，因此它们的绝大多数将存在于滞留物中。术语“允许至少一部分乳糖通过膜”优选意指乳糖至少部分可穿透膜并收集在渗透物中。在高乳糖截留率(约90％)的情况下，则可能需要随后用纯水进行渗滤，以使全部或至少大部分乳糖进入渗透物中。乳糖截留率越高，有效分离所需的渗滤水就越多。
根据NF的第二方面，所应用的纳米过滤膜对于三唾液酸化HMO和更高唾液酸化HMO应是紧密的，以便它们被有效地滞留。优选地，对三唾液酸化HMO或更高唾液酸化HMO的截留率大于95％、更优选97％、甚至更优选99％。预期MWCO大于3500Da的膜允许更多或显著量的三唾液酸化或更高唾液酸化HMO通过膜，因此显示三唾液酸化HMO或更高唾液酸化HMO的滞留率降低，因此不适合本发明的目的，并且可被排除。乳糖的截留率优选不超过80-90％。如果乳糖截留率变为90±1-2％，则三糖或四糖唾液酸化HMO截留率优选为约99％或更高，以实现实际上令人满意的分离。
当膜对MgSO4相对松散时，即其截留率约为50-90％时，上述要求同时得到满足。在这方面，上述规定的膜对于三唾液酸化和更高唾液酸化HMO是紧密的，对于单糖和乳糖以及MgSO4是松散的。因此，可通过纳米过滤有效地从唾液酸化人乳寡糖产品中分离乳糖，乳糖是通过酶法或发酵制备人乳寡糖的前体，此外，大量二价离子也会进入渗透物。在一些实施方式中，MgSO4截留率为30-90％、20-80％、40-90％、40-80％、60-90％、70-90％、50-80％、50-70％、60-70％或70-80％。优选地，所述膜上的MgSO4截留率为80-90％。还优选地，所述膜对NaCl的截留率低于对MgSO4的截留率。在一个实施方式中，NaCl的截留率不超过约50％。在其他实施方式中，NaCl的截留率不超过约40％。在其他实施方式中，NaCl的截留率不超过约30％。在其他实施方式中，NaCl的截留率不超过约20％。在约20-30％的NaCl截留率下，滞留物中所有单价盐的显著减少也是可以实现的。
同样优选地，在一些实施方式中，膜的纯水通量至少为50l/m2h(当在23-25℃、10bar和300l/h恒定错流下测量时)。优选地，膜的纯水通量为至少60l/m2h、至少70l/m2h、至少80l/m2h或至少90l/m2h。
适用于NF步骤的第二方面的纳米过滤膜的活性层或顶层优选由聚酰胺制成。尽管不同类型的膜似乎具有有希望的分离效果，例如具有磺化PES作为活性层的NTR-7450用于分离乳糖和3’-SL(Luo等人(《生物资源技术(Biores.Technol.)》166,9(2014)；Nordvang等人(《分离与纯化技术(Separ.Purif.Technol.)》138,77(2014))，本发明中使用的上述指定膜始终能够更好地从唾液酸化HMO中分离乳糖。此外，上述NTR-7450膜容易受到污染，这典型地会导致通量下降，增加乳糖截留率，从而降低分离因子。更优选地，聚酰胺膜是具有苯二胺或哌嗪结构单元作为胺的聚酰胺，更优选哌嗪(也被称为哌嗪基聚酰胺)。
更优选地，适用于本发明目的的膜是薄膜复合(TFC)膜。
合适的哌嗪基聚酰胺TFC膜的一个示例是
Figure BDA0003695554120000351
UA60。
适用于NF步骤第二方面的纳米过滤膜的特征在于上述特征中的一些或所有，因此提供一个或多个以下益处：从三唾液酸化HMO或更高唾液酸化HMO中选择性且有效地去除乳糖，产生富集的三唾液酸化HMO或更高唾液酸化HMO级分；有效去除单价盐和二价盐，因此可能不需要离子交换步骤，或者如果仍然需要脱盐，则离子交换处理需要的树脂要少得多；与现有技术中用于相同或类似目的的其他膜相比，纳米过滤期间可维持更高的通量，这减少了操作时间；与现有技术的解决方案相比，上述公开的膜不易堵塞；上述公开的膜可被彻底清洁和再生，因此可在不大幅降低其性能的情况下回收利用。
在NF步骤的第二方面的一个实施方式中，该步骤包括：
-将UF渗透物与截留分子量(MWCO)为600-3500Da，优选约1000Da的纳米过滤膜接触，确保三唾液酸化HMO或更高唾液酸化HMO的滞留，并且允许至少一部分乳糖通过膜，其中膜的活性(顶)层由聚酰胺组成，其中所述膜上的MgSO4截留率约为50-90％，
-随后用所述膜进行任选的渗滤，
-以及收集富含三唾液酸化HMO或更高唾液酸化HMO的滞留物。
在其他实施方式中，NF步骤包括：
-将UF渗透物与截留分子量(MWCO)约为1000Da的哌嗪基聚酰胺纳米过滤膜接触，确保三唾液酸化HMO或更高唾液酸化HMO的滞留，并且允许至少一部分乳糖通过膜，其中所述膜上的MgSO4截留率约为80-90％，并且其中
-所述膜上的NaCl截留率低于MgSO4的截留率，和/或
-所述膜的纯水通量值至少约为50l/m2h，
-随后用所述膜进行任选的渗滤，
-以及收集富含三唾液酸HMO或更高唾液酸HMO的滞留物。
优选地，膜的NaCl截留率至多为MgSO4截留率的一半。
为了实现上述所有益处，在NF步骤的第二方面中应用的纳米过滤膜优选：
-是MWCO约为1000Da的哌嗪基聚酰胺膜，
-具有约50-90％，优选80-90％的MgSO4截留率，
-具有不超过约30％的NaCl截留率，以及
-具有至少约50l/m2h，优选约90l/m2h的纯水通量值。
同样在优选实施方式中，乳糖对唾液酸化人乳寡糖的分离因子大于10，优选大于25，更优选大于50，甚至更优选大于100。
更优选地，乳糖对3’-SL或6’-SL的分离因子大于20，优选大于50。
更优选地，乳糖对含有唾液酸部分的四糖或五糖的分离因子大于25，优选大于50，更优选大于100。
NF步骤的第二方面可在用于常规纳米过滤的条件下进行，与渗透侧相比，常规纳米过滤具有正压力的切向流或错流过滤，随后是渗滤，其中两种操作均可按间歇模式或优选以连续模式进行。在一个实施方式中，任选的渗滤通过在上文公开的纳米过滤步骤后向滞留物中添加纯水，并且在与纳米过滤相同或类似的条件下持续去除渗透物的过滤过程来进行。水添加的优选模式是连续的，即添加流速与渗透流速大致匹配。NF可按间歇模式进行，其中滞留物流被循环回给进料罐，并且渗滤(DF)通过连续向进料罐中加入纯化的或去离子水来完成。最优选地，通过去除一定量的渗透物，在至少一些预浓缩后添加DF水。DF开始前浓度因子越高，DF效果越好。DF完成后，可通过去除多余的渗透物来实现进一步的浓缩。另选地，NF可优选在多回路系统中以连续模式执行，其中来自每个回路的滞留物被转移到下一个回路。在这种情况下，可在每个回路中单独添加DF水，其流速或者与每个回路中的渗透流速相匹配，也可在较低的流速下添加。与间歇模式DF一样，为了提高DF的效果，应在第一回路中添加少量水或不加水，以实现更高的浓缩系数。多回路系统中的水分配以及其他工艺参数，例如跨膜压力、温度和错流，均需进行常规优化。根据WO 2019/003135，在其他实施方式中，可使用无机电解质的水溶液进行任选的渗滤。无机电解质意指无机盐至少部分可溶于水，优选易溶于水。本发明方法中使用的膜对无机盐的截留率不得高于MgSO4的截留率。在一个实施方式中，无机电解质(盐)的水溶液为中性，即强无机酸和强无机碱的盐。强无机酸的示例性实施方式为HCl、HBr、硫酸、硝酸、磷酸和高氯酸，强无机碱的示例性实施方式为NaOH、KOH、LiOH、Mg(OH)2和Ca(OH)2；由这些酸和碱形成的盐包括在适用于本发明目的的中性无机电解质组中。在其他实施方式中，无机电解质的水溶液为微碱性，这是当强无机碱(见上文)与弱无机酸，例如碳酸(产生碳酸盐)或乙酸(产生醋酸盐)形成盐时的情况。无机电解质通常是单价或二价阴离子电解质。单价阴离子电解质是例如HCl、HBr、硝酸或高氯酸的盐，特别是氯化物，例如LiCl、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2或碳酸氢盐，例如NaHCO3。二价阴离子电解质为硫酸盐，例如Na2SO4、K2SO4、MgSO4、Na2SO4，或碳酸盐，例如Na2CO3、K2CO3。特别优选的无机电解质是NaCl。优选地，用于渗滤的无机电解质的水溶液是单一电解质，即水溶液含有一种且仅有一种电解质(盐)。
应用于NF步骤第二方面的进料溶液的pH优选不高于约7，更优选在约3和7，甚至更优选在约4和5，或约5和6之间。pH低于3可能会对膜和溶质性质产生不利影响。
应用于NF步骤的第二方面的适宜温度范围在约10℃至约60℃之间。较高的温度提供了较高的通量，从而加速该过程。预计在较高温度下，膜对流通更加开放，但是这不会显著改变分离因子。根据本发明进行纳米过滤分离的优选温度范围约为20-45℃。
纳米过滤分离中的优选施加压力约为2-50bar，例如约为10-40bar。一般而言，压力越高，流量越大。
在某些实施方式中，本发明的方法可包括附加的(一个或多个)NF步骤，优选在活性炭处理(见下文)和/或离子交换处理(见下文)之后，其中主要目的是浓缩含有感兴趣的唾液酸化HMO的水溶液。
2.2.5.3用离子交换树脂处理
作为如上所公开的澄清上清液(2.2.4.1)、如上所公开的UF渗透物(2.2.3或2.2.5.1)、如上所公开的NF滞留物(2.2.5.2)获得的唾液酸化HMO水溶液可任选通过离子交换树脂进一步纯化。在用离子交换树脂处理之前，任何UF渗透物和NF滞留物可任选用活性炭(见下文)脱色。残余盐、色素体、含有可电离基团的生物分子(例如蛋白质、肽、DNA和内毒素)、含有可电离官能团的唾液酸化或两性离子化合物(例如代谢物中的氨基，包括生物胺、氨基酸)、含有含酸基团的化合物(例如有机酸、氨基酸)可通过用树脂处理进一步去除。特别是，如果在“用离子交换树脂处理”中应用阳离子和阴离子交换树脂，则可实现树脂洗脱液的低盐含量(脱矿质)。
根据一个实施方式，离子交换树脂是阳离子交换树脂，优选强酸性阳离子交换树脂，优选质子化形式。在该步骤中，带正电的材料可从进料溶液中去除，因为它们与树脂结合。唾液酸化HMO的溶液以任何合适的方式与阳离子交换树脂接触，从而允许带正电的材料吸附到阳离子交换树脂上，并且唾液酸化HMO通过。所得液体在与阳离子交换树脂接触后，除了对应酸形式的阴离子和碳水化合物如乳糖(如果在一个或多个先前纯化步骤后仍保留)之外，还含有唾液酸化HMO。这些酸可按常规方法中和。
在一个实施方式中，可按任何顺序应用阳离子和阴离子交换树脂层析法。如果同时使用阳离子和阴离子树脂处理，则阳离子交换树脂为强酸性树脂，而阴离子交换树脂为游离碱形式的弱阴离子树脂。阳离子交换树脂可呈H+-形式或盐形式，优选呈H+-形式。这种特殊的排列方式，除了从剩余培养基中去除盐和带电分子外，还可有效地物理吸附留在培养基中的蛋白质、DNA和着色/焦糖体。
与OH--形式的强碱阴离子交换剂相比，应用游离碱形式的弱碱阴离子交换剂(即，其中树脂的官能团为伯胺、仲胺或叔胺)是有利的。强碱性交换剂由于其强碱性具有使唾液酸化HMO的异头OH-基团去质子化的能力。这在唾液酸化HMO的结构中引发重排反应，从而产生副产物，和/或大量唾液酸化HMO与树脂结合。因此，这两个事件均有助于降低唾液酸化HMO的回收率。
在一个实施方式中，所要求保护的方法的离子交换树脂处理步骤由用H+-形式的强阳离子交换树脂处理，随后直接用游离碱形式的弱阴离子交换树脂处理唾液酸化HMO的水溶液(该水溶液是如上所公开的UF渗透物，其可任选用活性炭脱色，或如上所公开的NF滞留物，其可任选用活性炭脱色，或如上所公开的澄清离心上清液，其可任选用活性炭脱色)。
在其他实施方式中，所要求保护的用于从产生唾液酸化HMO的反应环境中获得或分离唾液酸化HMO的方法仅包括使用H+-形式的强阳离子交换树脂的单一离子交换树脂处理步骤。
当使用离子交换树脂时，可根据离子交换柱的操作条件选择其交联度。高度交联的树脂具有耐久性和高度机械完整性的优点，但是具有孔隙率降低和传质下降的缺点。低交联树脂更脆弱，并且易于因吸收流动相而膨胀。选择离子交换树脂的粒度，以允许洗脱液有效流动，同时带电材料仍被有效去除。也可通过对柱的洗脱端施加负压或对柱的装载端施加正压并收集洗脱液来获得合适的流速。也可使用正压和负压两者的组合。离子交换处理可按常规方式，例如间歇式或连续进行。
合适的酸性阳离子交换树脂的非限制性示例可为例如Amberlite IR100、Amberlite IR120、Amberlite FPC22、Dowex 50WX、Finex CS16GC、Finex CS13GC、FinexCS12GC、Finex CS11GC、Lewatit S、Diaion SK、Diaion UBK、Amberjet 1000、Amberjet1200、Dowex 88。
合适的碱性阴离子交换树脂的非限制性示例可为例如Amberlite IRA67、Amberlite IRA 96、Amberlite IRA743、Amberlite FPA53、Diaion CRB03、Diaion WA10、Dowex 66、Dowex Marathon、Lewatit MP64。
2.2.5.4活性炭处理
根据某些实施方式，本发明的方法包括任选的活性炭处理步骤。任选活性炭处理可跟随在所有上文所公开的离心(2.2.4)、UF步骤(2.2.3或2.2.5.1)、NF步骤(2.2.5.2)或离子交换处理步骤(2.2.5.3)中的任一个之后。如果需要，活性炭处理有助于去除着色剂和/或减少水溶性污染物(例如盐)的量。此外，活性炭处理可去除在先前步骤后附带滞留的残留或微量蛋白质、DNA或内毒素。
碳水化合物物质(如感兴趣的唾液酸化HMO)倾向于从其水溶液(例如，在UF步骤、NF步骤或离子交换处理步骤后获得的水溶液)结合到炭颗粒的表面。类似地，着色剂也能够吸附到炭上。当碳水化合物和给色材料被吸附时，没有与炭结合或结合较弱的水溶性物质可用水洗脱。通过将洗脱液从水改为含水乙醇，例如乙醇，吸附的唾液酸化HMO可很容易地洗脱并收集在单独的级分中。被吸附的给色物质将仍然保持吸附在炭上，因此脱色和部分脱盐两者可在这个任选的步骤中同步实现。然而，由于洗脱溶剂中存在有机溶剂(乙醇)，与用纯水进行洗脱的情况相比，脱色效果较低(见下文)。
在某些条件下，唾液酸化HMO没有或至少基本上没有吸附到炭颗粒上，并且用水洗脱产生唾液酸化HMO的水溶液，其量没有显著损失，而给色物质保持被吸附。在这种情况下，无需使用例如乙醇等有机溶剂进行洗脱。确定唾液酸化HMO可从水溶液中结合至炭上的条件是一项常规技能。例如，在一个实施方式中，使用更稀的唾液酸化HMO溶液或相对于唾液酸化HMO量更大量的炭，在另一个实施方式中，应用更浓的唾液酸化HMO溶液和相对于唾液酸化HMO量更低的炭。
炭处理可通过在搅拌下向唾液酸化HMO的水溶液中添加炭粉，过滤出炭，在搅拌下重新悬浮在含水乙醇中，并且通过过滤分离炭来进行。在更大规模的纯化中，优选将唾液酸化HMO的水溶液装载到填充有炭的柱中，炭可任选与硅藻土混合，然后用所需的洗脱液清洁柱。收集含有唾液酸化HMO的级分。如果用于洗脱，残余醇可通过例如蒸发从这些级分中去除，得到唾液酸化HMO的水溶液。
优选地，所使用的活性炭是粒状的。这可确保在不施加压力的情况下获得方便的流速。
还优选地，来自UF步骤、NF步骤或离子交换处理步骤的含有感兴趣的唾液酸化HMO的水溶液的活性炭处理，更优选活性炭层析，在高温下进行。在高温下，盐、着色体、残余蛋白质等与炭颗粒的结合发生在较短的接触时间内，因此可方便地提高流速。此外，在高温下进行的活性炭处理大大减少了唾液酸化HMO水溶液中的活微生物总数(总微生物计数)，因此在所述方法的后期阶段无菌过滤步骤可能是不必需的。高温至少为30-35℃，例如至少40℃、至少50℃、约40-50℃或约60℃。
还优选地，所施加的炭量不超过装载物中所含唾液酸化HMO的约10wt.％，更优选约2-6wt.％。这是经济的，因为上文所公开的所有益处可用非常少量的炭方便地实现。
特别优选的是，当活性炭处理(优选层析法)在高温下进行时，相对于水溶液中感兴趣的唾液酸化HMO的量，使用不超过约10wt.％，优选约2-6wt.％的活性炭。
2.2.5.5提供分离形式的唾液酸化HMO
在上述2.2.3至2.2.5.4中所公开的分离/纯化步骤之后，如此获得的感兴趣的唾液酸化HMO可通过喷雾干燥或冷冻干燥的方式以固体形式提供。因此，本发明的方法可包括一个或多个进一步步骤，以分离的、优选的干燥形式提供感兴趣的唾液酸化HMO，例如对离心、UF步骤、NF步骤、活性炭处理和/或离子交换处理后获得的唾液酸化HMO水溶液进行喷雾干燥的步骤；或对离心、UF步骤、NF步骤、活性炭处理和/或离子交换处理后获得的唾液酸化HMO水溶液进行冷冻干燥的步骤。另选地，在UF步骤、NF步骤、活性炭处理和/或离子交换处理后获得的唾液酸化HMO可通过去除水，例如借助于蒸馏，优选真空蒸馏，或纳米过滤以浓缩水溶液或糖浆的形式提供。
当感兴趣的唾液酸化HMO以喷雾干燥的形式分离时，优选如例如WO2013/185780中公开的那样进行，或者喷雾干燥过程例如用感兴趣的唾液酸化HMO的15-65w/v％水溶液在110-190℃的喷嘴温度和60-110℃的出口温度下进行，前提是喷嘴温度比出口温度高至少10℃。
3.本发明的优选实施方式
所述方法的一个实施方式涉及从产生唾液酸化HMO的发酵液中获得或分离唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL，包括以下步骤：
a)将所述反应液体培养基的pH设定为pH＝3-5，
b)任选将步骤a)中获得的pH调节后的液体培养基冷却至5-15℃并储存1-15天，
c)将步骤a)或步骤b)的液体培养基加热至60-65℃，
d)将在步骤c)中获得的液体培养基与截留分子量(MWCO)约为10-1000kDa的超滤(UF)膜接触，其中所述膜为陶瓷膜，任选在40-65℃，
e)任选对步骤d)中获得的渗透物进行无菌过滤，
f)将步骤d)中获得的渗透物或步骤e)中获得的无菌过滤渗透物与MWCO为600-3500Da的纳米过滤(NF)膜接触，其中所述膜的活性(顶)层由聚酰胺组成，并且其中所述膜上的MgSO4截留率约为20-90％，优选50-90％，
g)用H+-形式的强阳离子离子交换树脂和随后的碱性形式的弱碱性离子交换树脂处理步骤f)中获得的滞留物，以使滞留物脱矿质，
h)在30-60℃下对步骤g)中获得的溶液进行活性炭层析，其中所述炭的量约为装载物中所含唾液酸化HMO的2-10wt.％，
i)用150-500Da的膜对步骤h)中获得的溶液进行纳米过滤，以浓缩所述溶液，
j)喷雾干燥步骤i)的溶液，以获得无定形固体形式的唾液酸化HMO。
所述方法的一个实施方式涉及从产生唾液酸化HMO的发酵液中获得或分离唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL，包括以下步骤：
a)将所述反应液体培养基的pH设定为约5.5，
b)离心步骤a)中获得的液体培养基，
c)任选将步骤b)的上清液加热至60-65℃，
d)将步骤b)或步骤c)的上清液与截留分子量(MWCO)约为5-1000kDa的超滤(UF)膜接触，任选在40-65℃，
e)将步骤d)中获得的渗透物与如下所述的纳米过滤(NF)膜接触
-MWCO为600-3500Da，其中所述膜的活性(顶)层由聚酰胺组成，并且其中所述膜上的MgSO4截留率约为20-90％，优选50-90％，或者
-MWCO为150-500Da，
f)在30-60℃下对步骤e)中获得的滞留物进行活性炭层析，其中所述炭的量约为装载物中所含唾液酸化HMO的2-10wt.％，
g)用H+-形式的强阳离子交换树脂随后用碱性形式的弱碱性离子交换树脂处理步骤f)中获得的溶液，以使所述溶液脱矿质，
h)用150-500Da的膜对步骤g)中获得的溶液进行纳米过滤，以浓缩所述溶液，
i)喷雾干燥步骤i)的溶液，以获得无定形固体形式的唾液酸化HMO。
在一个优选实施方式中，所述方法涉及从产生唾液酸化HMO的发酵液中获得/分离/纯化唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL，所述方法包括由步骤A)、B)、C)和D)组成的以下步骤顺序：
A)-将液体培养基的pH设定为约3至5，
B)-离心(CF)步骤A)的pH调节后的液体培养基，以得到澄清上清液，或
-步骤A)的pH调节后的液体培养基的超滤(UF)，以得到超滤渗透物(UFP)，
C)-用粒状活性炭处理澄清上清液或UFP，以得到炭洗脱液(CCE)，以及
D)-CCE的纳米过滤(NF)并收集纳米过滤滞留物(NFR)，
其中所述方法不包括离子交换处理、模拟移动床层析、凝胶过滤/层析和电渗析。
所述方法比以前的现有技术方法包括更少的纯化步骤，并且令人惊讶地提供了符合严格监管规范的唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL。特别地，所述方法不包括离子交换处理，离子交换处理通常是此类物质纯化的一部分。因此，唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL可按更经济的方式提供给人类消费。
在上述方法中，步骤A)中可用于pH调节的酸为硫酸。例如，所述酸可为20％的H2SO4溶液。然而，也可使用其他酸，并且所用的特定酸没有限制。例如，所述酸可选自H2SO4、HCl、H3PO4、甲酸、乙酸和柠檬酸中的一种或多种。这些酸中的每一种均可单独使用或与任何其他酸组合使用。
在步骤B)中，离心或UF同样适用。以上详细介绍了这些方法。
在步骤C)中，选择粒状活性炭的量，使得唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL不被或至少基本上不被吸附在炭颗粒上，并且用水洗脱产生唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL的水溶液，而不会发生显著损失，同时给色物质保持被吸附。为了实现这一点，用于脱色的活性炭的量应为相对于前一步骤中获得的进料溶液中唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL含量的约12-25％(按质量计)，优选相对于进料溶液中唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL含量的约15-20％(按质量计)。通过这种特殊的布置，上一步骤中获得的多达至少90％的唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL(按质量计)可按脱色溶液的形式收集。此外，在上述条件下，可实现进料溶液蛋白质含量的显著降低，例如至少90％的残余蛋白质可去除，优选约98-99％的残余蛋白质可去除。因此，为下一个NF步骤提供低蛋白质的炭洗脱液。
在步骤D)中，优选地根据上文详细公开的第二方面的优选和更优选实施方式执行NF步骤。在此步骤中，乳糖、唾液酸和其他类似的低分子量有机化合物可从唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL中分离，并且大量的单价和二价离子(优选无机离子)也可去除。合适的NF膜的一个示例是哌嗪基聚酰胺TFC膜
Figure BDA0003695554120000441
UA60。
根据上述程序，NF滞留物中的唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL，可按符合规定规格的纯度获得。
实施例
实施例1
6’-SL通过使用携带异源neuBCA的LacZ-、LacY+表型的遗传修饰E.coli发酵制备，其中所述细胞包含编码能够将GMP-唾液酸的唾液酸转移至内化的乳糖上的α-2,6-唾液酸转移酶的重组基因，并且缺失或失活nanKETA。通过在外源添加的乳糖和合适的碳源存在下培养所述细胞来进行发酵，从而产生6’-SL。用硫酸将所获得的含有6’-SL(pH约为6.3)的发酵液酸化至约4.5。将酸化的液体培养基分为两个级分，每个级分在20℃下以8000RCF分别离心1小时。下表显示了从这些级分获得的上清液量和对应的属性。
Figure BDA0003695554120000442
将级分#1和级分#2的上清液混合并用蒸馏水稀释，以生成约300mg/l的蛋白质浓度。将这种稀释上清液混合物用作填料床粒状活性炭(GAC，即CPGLF 12×40，175g)上的进料进行处理。在GAC操作开始之前，使用90℃的热蒸馏水对填充床GAC进行反冲洗(即在上流模式下)2小时。表2总结了GAC进料属性和工艺条件。表3总结了总物料量和溶质物料量(bulk and solute material balance)以及GAC流出物属性方面的结果。此外，在处理开始时立即收集全部GAC流出物(即包括空隙体积)，而在操作结束时，通过简单地将空气泵过GAC床将GAC床中的液体推出。因此，从表3中可看出，据推测GAC流出物被稀释(即，总物料量(bulk material balance)大于100％)。
Figure BDA0003695554120000443
将洗脱液在旋转蒸发仪中在65℃和约50mbar下浓缩，并且对其进行NF/DF处理。使用面积为0.23m2的螺旋缠绕薄膜复合材料(TFC)膜TRISEP TurboClean 1812-UA60，以间歇式模式进行NF/DF处理。操作参数为TMP ca.39bar且错流为400l/h，同时温度是动态的，但保持在45℃以下。下表总结了最终均质NF/DF滞留物的属性。
Figure BDA0003695554120000451
将NF/DF滞留物冷冻干燥，具有最终产品质量：
Figure BDA0003695554120000452
数据表明，使用pH调节、离心、活性炭脱色和纳米过滤从发酵液中纯化6’-SL，可提供符合监管规范的产品，尤其是蛋白质含量显著降低。
碳水化合物类化合物的浓度/量通过HPLC离子层析法测定：TSKGel Amide-80(150mm x 4.6mm，3μm)，含70％乙腈，15％水和15％10mM甲酸铵缓冲液，流速为1.1ml/min，温度为25℃，使用电雾式检测器(CAD)。
实施例2–膜上物质截留率的测定
NaCl和MgSO4在膜上的截留率测定如下：在膜过滤系统中，NaCl(0.1％)或MgSO4(0.2％)溶液在选定的膜片(对于Tami：管状组件)上循环，同时渗透物回流至进料罐。在从渗透物和滞留物中取样之前，系统在10bar和25℃下平衡10分钟。根据测量的样品电导率计算截留率：(1-κp/κr)·100，其中κp是渗透物中NaCl或MgSO4的电导率，κr是滞留物中NaCl或MgSO4的电导率。
Figure BDA0003695554120000453
碳水化合物(例如唾液酸化HMO，例如3’-SL或6’-SL)的截留率以类似的方式测定，不同之处在于截留率根据样品浓度(通过HPLC测定)计算得出：(1-Cp/Cr)·100，其中Cp是渗透物中碳水化合物的浓度，Cr是滞留物中碳水化合物的浓度。

Claims (19)

1.一种从产生唾液酸化人乳寡糖(HMO)的反应环境中，优选从发酵液中纯化唾液酸化人乳寡糖(HMO)，优选3’-SL或6’-SL的方法，其包括以下步骤：
-经由pH调节、稀释和/或热处理对所述反应环境进行预处理，以及
-将所述预处理后的反应环境离心或将所述预处理后的反应环境与截留分子量(MWCO)约为5-1000kDa，例如10-1000kDa的超滤(UF)膜接触，其中所述膜优选由非聚合物材料组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述预处理包括将所述反应环境的pH调节至3-5。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其还包括以下步骤：将
-从离心获得的澄清上清液或
-UF渗透物
与纳米过滤(NF)膜接触。
4.根据权利要求3所述的方法，其还包括H+-形式的强阳离子交换树脂处理和游离碱形式的弱阴离子交换树脂处理的步骤。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述反应环境是其中已产生唾液酸化HMO，优选3’-SL或6’-SL的发酵液，并且其中从离心获得的澄清上清液或所述UF渗透物用粒状活性炭处理以得到炭洗脱液，并且所述炭洗脱液被纳米过滤以收集纳米过滤滞留物，并且其中所述方法不包括离子交换处理、模拟移动床层析、凝胶过滤/层析和电渗析。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中所述NF膜具有600-3500Da的截留分子量(MWCO)，所述NF膜的活性(顶)层由聚酰胺组成，并且其中所述膜上的MgSO4截留率约为50-90％。
7.根据权利要求1所述的方法，其包括
a)任选地，离心、微滤所述反应环境，或在压滤机或鼓式过滤器上过滤所述反应环境，
b)作为预处理，将来自步骤a)的滤液或上清液或所述反应环境的pH直接设定为3-6和/或将来自步骤a)的滤液或上清液或所述反应环境直接升温至35-65℃，以及
c)将步骤b)中获得的所述反应环境与截留分子量(MWCO)为5-1000kDa，例如10-1000kDa的超滤(UF)膜接触并收集渗透物，
前提是当未执行步骤a)时，所述UF膜为非聚合物膜。
8.根据权利要求7所述的方法，其中未执行步骤a)，并且其中所述非聚合膜为陶瓷膜。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中步骤c)在45-65℃执行。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述UF膜是陶瓷膜，并且所述方法还包括将步骤c)中获得的所述渗透物与纳米过滤(NF)膜接触并收集滞留物的步骤。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述NF膜具有600-3500Da的截留分子量(MWCO)，所述NF膜的活性(顶)层由聚酰胺组成，并且其中所述膜上的MgSO4截留率约为50-90％。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述纳米过滤滞留物用离子交换树脂处理，所述用离子交换树脂处理由用H+-形式的强阳离子交换树脂处理，随后直接用游离碱形式的弱阴离子交换树脂处理所述NF滞留物组成。
13.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述纳米过滤滞留物用活性炭处理，优选所述纳米过滤滞留物在活性炭上30-60℃下进行层析，其中所述炭的量为所述纳米过滤滞留物中所含的唾液酸化HMO的约2-10wt.％，以得到活性炭洗脱液。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述离子交换处理的洗脱液用活性炭处理，优选所述洗脱液在活性炭上30-60℃下进行层析，其中所述炭的量为所述洗脱液中所含的唾液酸化HMO的约2-10wt.％，以得到活性炭洗脱液。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述活性炭洗脱液用离子交换树脂处理，所述用离子交换树脂处理由用H+-形式的强阳离子交换树脂处理，随后直接用游离碱形式的弱阴离子交换树脂处理所述活性炭洗脱液组成。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述反应环境是通过培养能够从内化的碳水化合物前体产生所述唾液酸化HMO的遗传修饰细胞，优选微生物，而获得的发酵液。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述遗传修饰微生物是LacZ-基因型的E.coli。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述E.coli包括重组α-2,3-或α-2,6-唾液酸转移酶。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述E.coli携带neuBCA基因。
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