JP2023528657A - 発酵ブロスの改善された脱塩及び例えばオリゴ糖のファインケミカルの精製 - Google Patents

発酵ブロスの改善された脱塩及び例えばオリゴ糖のファインケミカルの精製 Download PDF

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Abstract

本発明は、発酵ブロスの改善された脱塩の方法であって、1種以上のオリゴ糖を含む溶液を用意するステップ、好ましくは精密ろ過又は限外ろ過である第1の膜ろ過を実施するステップ、第1の膜ろ過の透過液の第2の膜ろ過ステップ、並びに濃縮のサブステップ及び/又はダイアフィルトレーションのサブステップを含む第1のナノろ過ステップを含む、方法に関する。さらに、本発明は、発酵ブロスからのファインケミカルの改善された精製を対象とする。【選択図】なし

Description

本発明は、バイオマス及び少なくとも1種のオリゴ糖を含む溶液からバイオマスを分離する方法に関する。
ヒト母乳オリゴ糖(HMO)は、ラクトース及び脂質に次いで3番目に豊富なヒト母乳の固形成分である。ヒト母乳中の異なるHMOの濃度及びそれらの合計量は、授乳期内及び個人間で異なり、それは遺伝的背景に部分的に基づいていると考えられている。重要なことは、しかしながら、HMOは、ウシ、ヒツジ、又はヤギ乳のような他の天然資源において匹敵する量では見られない。ビフィズス菌の増殖の選択的な強化、病原体に対する抗接着効果及び腸上皮細胞に対するグライコーム改変効果を含む、乳児に対するHMOのいくつかの有益な効果が、示され、又は示唆されている。三糖2'-フコシルラクトース(2'-FL)は、ヒト母乳に見られる最も豊富なオリゴ糖の1つである。そのプレバイオティック及び抗感染特性のため、2'-FLは、乳児用調合乳の栄養添加物として論じられる。その上、2'-FLを含有する乳児の栄養は、より低い下痢の比率と関連しており、それを十分な量及び適正価格で入手できた場合、2'-FLを潜在的な栄養補給剤及び治療薬にする。
以前、2'-FLは、ヒト母乳からの抽出又は化学合成によって得られていたが、ヒト母乳の限られた入手可能性又は化学合成における側基保護及び脱保護の必要性は、それぞれ、供給及びコスト効率に制限を設定する。したがって、2'-FLの代替供給源が注目されるようになった。化学合成及びヒト母乳からの抽出に加えて、2'-FLは酵素的にインビトロ及びインビボで生成することができる。大規模な2'-FLの形成のための最も有望な手法は、GDP-L-フコースの細胞内合成及びそれに続く適切なα1,2-フコシルトランスフェラーゼによるラクトースのフコシル化による大腸菌(Escherichia coli)における全細胞生合成である。
したがって、HMOは、発酵を用いてバイオマス及び少なくとも1種のオリゴ糖、好ましくは2'-FLを含む溶液を生成することができる。このような溶液は、発酵ブロスと呼ぶこともできる。
HMOプロセスからの発酵ブロスからのバイオマス分離は、HMOの生成における最初の下流処理ステップである。このステップの現況技術の技術は、遠心分離及び又はフィルタープレスであり、凝集剤を用いる場合もある。しかしながら、精密ろ過も使用することができ、他の分離技術と比較していくつかの利点がある。遺伝子操作生物を含まない生成物溶液を可能にするためには、精密ろ過が、遺伝子改変された細胞、例えば微生物を含む全ての非溶解固体を完全に保留できるので、最良の選択肢である。
ナノろ過は、HMO三糖及びオリゴ糖をラクトースから分離する精製における方法として記載されている(WO 2019/003133として公開された国際特許出願参照)。
本発明は、1種以上のファインケミカル、例えばオリゴ糖及びバイオマスを含む発酵ブロスを、精製されたファインケミカル溶液又は固体ファインケミカルまで処理する新規な方法を開示する。この方法は、バイオマスが除去される前に特定の一連のステップ、バイオマスの除去及びその後の所望のファインケミカル(複数可)を含む溶液の脱塩を用いる。さらに、本発明はまた、ナノろ過による1種以上のオリゴ糖を含む溶液の脱塩の方法及びそのような溶液の迅速な精製方法である。
膜ろ過は、溶液中のより小さい分子をより大きいものから分離するのにしばしば使用される。オリゴ糖含有溶液の一例は、CN 100 549 019及びCN 101 003 823として公開されている中国特許出願に開示されており、この特許出願は、酵素及び膜技術を使用することによってわらから高純度キシロオリゴ糖を調製する方法を開示している。WO 2017/205705として公開された国際出願は、ヘミセルロース加水分解溶液のための膜ろ過の使用を開示している。別の例は、EP 2 896 628に開示されており、この特許出願は、オリゴ糖含有発酵ブロスの膜ろ過を開示し、続いてろ液への活性炭の添加を含むさらなるプロセスステップを実施している。
HMOの発酵生産後のバイオマスの分離は、通常pH値7で、最初の遠心分離又はフィルタープレス及びさらなる遠心分離を用いて行われる。高分子膜が代わりに使用されることもある。
しかしながら、膜を使用する場合、膜性能はかなり低く、透過液は多量のタンパク質及び色成分を含有し、それらは次のステップで除去する必要があり、複雑な下流プロセス、高い生成物収量の損失及び何らかの品質問題をもたらす。
通常、発酵ブロスからのバイオマス分離のこれらの最初のステップの後、実施される次のステップは、通常10kDaポリエーテルスルホン膜によって完了する限外ろ過であるが、これによって全てのタンパク質及び多糖類が分離できるわけではない。限外ろ過透過液はしたがって、活性炭カラムに配置されて、溶液を脱色され、1000未満のAPHA値が達成される。活性炭カラムにおける脱色は、かなり時間のかかるプロセスであり、発酵ブロスの初期量に関して約14%重量/重量の活性炭を使用する必要がしばしばある。このステップは、高い生成物損失をもたらし、巨大な活性炭カラムを必要とする。
限外ろ過及び脱色の後、ファインケミカル、例えばHMOを含む溶液は、荷電側の成分を減らすためにしばしばイオン交換処理を施される。大量の溶液は、大きなイオン交換装置及び大量のイオン交換樹脂を必要とすることがある。したがって濃縮ステップを使用して、イオン交換の前に体積を減少させてもよい。
WO2015106943として公開された国際出願は、イオン交換ステップが最初の膜ろ過後のナノろ過ステップに続くことがある手順を開示している。しかしながら、脱色の繰り返しが必要であり、イオン交換ステップは塩の除去ではない。陽イオンは除去されてNaOHに置き換えられ、陰イオンは塩化物イオンに交換される。次に追加の電気透析ステップによって塩の除去が達成される。
本発明は、発酵後のファインケミカル、例えばHMOを含む溶液の脱色と、バイオマス分離プロセス及び例えばイオン交換に限らないが脱塩前のナノろ過又は任意のその後の脱塩、例えばイオン交換ステップ(複数可)を含まないナノろ過の特定の一連の精製ステップとを有利に組み合わせる方法に関する。
本発明の方法の第1の部分は、資源に頼っているバイオマス分離及び脱色を可能にし、方法の第2の部分、任意のさらなる調製又はイオンの添加なしで所望のファインケミカルの有利な精製を可能にする。
本発明の方法では、生成物の濃縮に加えて、ナノろ過を使用して塩、好ましくは一価イオン及び低分子量の副成分を除去する。そうすることにより、イオン交換体は、より高濃度の生成物で操作でき、より少ない副成分を除去する必要があり、操作の規模を大幅に縮小することができる。その上、ナノろ過を含む全体的な精製プロセスの驚くべき有効性により、ナノろ過によるイオン交換ステップの置き換えが可能になる。
本発明の好ましい実施形態では、バイオマス及び1種以上のファインケミカルを含む溶液から1種以上のファインケミカル、好ましくはオリゴ糖及び又はアロマ化合物を精製する方法は:
i. バイオマス及び1種以上のファインケミカルを含む溶液を用意するステップ、
ii. バイオマス及び少なくとも1種のオリゴ糖を含む溶液に少なくとも1種の酸を加えることにより、溶液のpH値を7未満、好ましくはpH5.5未満又はそれ以下に設定するステップ、
iii. バイオマス及びファインケミカルを含む溶液に吸着剤を加えるステップ、
iv. 任意選択で、インキュベーションステップ、
v. 本明細書で第1の膜ろ過とも呼ばれ、通常は精密ろ過又は限外ろ過である膜ろ過を実施して、少なくとも1種のファインケミカルを含む溶液からバイオマスを分離するステップ;
vi. 任意選択で、第1の膜ろ過、好ましくは少なくとも1回の限外ろ過の透過液を用いて、少なくとも1回の第2の膜ろ過又はさらなる膜ろ過を実施するステップ;
vii. 任意選択で、脱色ステップを実施するステップ;
viii. このステップS22に先行する膜ろ過の透過液を用いて、第1の膜ろ過又は第2の膜ろ過又は任意のさらなる膜ろ過の透過液のいずれかを用いて、ナノろ過(ステップS22、図1参照)を実施するステップ;
ix. 任意選択で、脱色ステップ;
x. 任意選択で、前のナノろ過ステップiのナノろ過の保持液を用いた第2のナノろ過ステップS24であり、使用するナノろ過膜は、前のナノろ過ステップS22におけるものと異なるものである、第2のナノろ過ステップS24;
xi. 任意選択で、前のナノろ過ステップのものと異なる膜を用いた第3のナノろ過又はさらなるナノろ過ステップ;
xii. 以下のステップのいずれかによる前のナノろ過ステップの保持液のさらなる処理ステップ:
a. 任意選択で、脱色ステップを実施するステップ
b. 任意選択で、脱塩ステップ、より好ましくは陽イオン交換及び/又は陰イオン交換を実施するステップ、又は
c. 任意選択で、電気透析及び/又は逆浸透及び/又は濃縮ステップ及び/又は脱色ステップを実施するステップ、
d. 任意選択で、擬似移動床クロマトグラフィー、及び/又は固体ファインケミカル生成物を作成する凝固ステップ、好ましくは結晶化ステップ及び/又はファインケミカルの噴霧乾燥とその後必要に応じて乾燥を実施するステップ
を含む方法である。
より簡単な貯蔵及び移送のために、多くの場合、ファインケミカル、例えばオリゴ糖は溶液よりも固形形態であることが望ましい。したがって、好ましい実施形態では、最終ステップとしての本発明の方法は、所望のファインケミカル(複数可)、例えば1種以上のHMOのようなオリゴ糖(複数可)の、溶液からの除去を有する。これは、例えば、1種以上の溶媒、例えばそれだけには限らないが、短鎖アルコール(例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール)及び/又は有機酸、好ましくは食品用有機酸、例えばそれだけには限らないが酢酸及び/又はプロピオン酸を利用した結晶化によって行うことができるが、結晶化に限定されない。或いは、溶液からの除去は、本発明の方法の前記最終ステップにおいて、所望のファインケミカルからファインケミカルの適当な乾燥度まで水若しくは溶媒を除去する噴霧乾燥又は任意の他の方法によって達成することができる。また、溶液からファインケミカルを除去するこのようなステップは、前記最終ステップの前に使用することができる。例えば本発明の方法は、結晶化又は噴霧乾燥、続いてファインケミカルを再溶解して新しい溶液を作成するステップ、任意選択の他の精製ステップ又は溶液からの除去とファインケミカルの再溶解を繰り返して新しい溶液を形成し、その後最終ステップとして再度溶液からの除去を含む。
ステップS22のナノろ過は、洗浄とも呼ばれる濃縮及びダイアフィルトレーションのサブステップを、任意の順序で開始して交互に含んでいてもよい。しかしながら、最初にダイアフィルトレーションモードで使用する場合、大量のダイアフィルトレーション媒体、通常脱イオン水が必要である。したがって、好ましい実施形態では、サブステップを含むナノろ過ステップS22は、最初に濃縮サブステップ、次にダイアフィルトレーションサブステップ、次に任意選択で再度濃縮サブステップが行われる。
好ましい実施形態では、ナノろ過S22後又は第2のナノろ過後、結晶化のための短鎖有機酸を除いて、後続の任意のステップで陰イオン及び/又は陽イオン、例えばNaOHを添加しない。特に、本発明の方法は、電気透析を使用せずに塩の除去を可能にし、好ましい実施形態ではイオン交換せずに固体生成物が得られる。
本発明の方法によれば、驚くべきことに、第1の膜ろ過を実施する前に溶液のpH値を7未満に低下させた場合、第1の膜ろ過における膜性能を大幅に向上させることができ、タンパク質の除去を大幅に改善することができることが判明した。さらに、任意の膜ろ過の前に吸着剤を溶液に加えた場合、膜性能はさらに向上し、透過液の色は要求仕様より低い値に大幅に低下させることができることが判明した。また有利には、pH値が所望の目標値pH7未満に設定された後及び少なくとも1種の吸着剤が加えられた後に膜ろ過が行われた場合、活性炭のような吸着剤の必要量は既知の方法と比較してはるかに少なく、また脱色に要する時間は既知の方法よりもはるかに短い。
好ましくは、吸着剤は活性炭である。活性炭(active carbon)は、活性炭(activated carbon)又は活性炭(activated charcoal)としても知られており、低コスト、大量に入手可能、取り扱いが簡単及び食料品と共に使用するのに安全であるため、好ましい吸着剤である。
第1の膜ろ過が行われる場合、より好ましくは吸着剤が加えられる場合に、バイオマス及び1種以上のオリゴ糖、1種以上の二糖及び/又は1種以上の単糖を含む溶液のpH値がpH7.0未満であることが、本発明の方法に有益である。したがって、発酵ブロスのpH値は通常pH7.0以上であるので、目標pH値を達成するために必要に応じて少なくとも1種の酸の添加によってpH値を低下させる。バイオマス及び1種以上のオリゴ糖、1種以上の二糖及び/又は1種以上の単糖を含む溶液のpH値が開始時に既にpH7.0未満である場合、必要に応じてpH値を安定してpH7.0未満に設定するために少なくとも1種の酸を使用してもよい。また好ましくは、溶液のpH値は、任意の膜ろ過を開始する前に、pH値5.5以下に設定される。好ましくはpH値は、3.0～5.5の範囲、より好ましくは3.5～5の範囲の目標pH値に低下させる(ここで、所与の範囲には所与の数値が含まれる)。さらにより好ましい実施形態では、溶液のpH値はpH3.5以上、ただしpH4.5以下に設定されており、最も好ましくはpH値は4.0以上4.5以下の範囲内の値に設定されている。このために、少なくとも1種の酸を溶液に加える。前記少なくとも1種の酸は、より好ましくは、H2SO4、H3PO4、HCl、HNO3及びCH3CO2Hからなる群から選択される酸である。基本的に、任意の酸を使用してもよい。それにもかかわらず、これらの酸は通常取り扱いが簡単である。
前記吸着剤、好ましくは活性炭は、通常0.25重量%～3重量%の範囲、好ましくは0.5重量%～2.5重量%の範囲、より好ましくは0.75重量%～2.2重量%の範囲、さらにより好ましくは1.0重量%～2.0重量%の範囲の量で加えられ、ここで、パーセント値は、溶液の重量当たりの吸着剤の重量に基づいている。したがって、好ましくは1000APHAである上限仕様以下に色数を低下させるのには、比較的少量の前記吸着剤、好ましくは活性炭で十分である。これにより、活性炭の消費量のかなりの削減、並びに活性炭カラムと比較して生成物の損失のかなりの削減が可能になる。一実施形態では、1種以上の吸着剤は、バイオマス及び/又は多糖及び/又はタンパク質及び/又は存在し得るDNA若しくはRNAのような核酸を含む出発溶液中の色成分及び/又はタンパク質の(好ましさが高まる順に)少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、92%、94%、95%又はそれ以上に結合するのに適した量で添加される。さらに、前記吸着剤、好ましくは活性炭は、通常2μm～25μmの範囲、好ましくは3μm～20μmの範囲、例えばd50が10～15μmのもの、より好ましくは3μm～7μmの範囲、さらにより好ましくは5μm～7μmの範囲直径d50の粒径分布をもつ粉末として加えられる。そのようなd50値が低い粉末は、より大きい粉末の湿式粉砕によって作製することができる。d50値は、標準手順によって決定される。この寸法範囲の粒径は、膜の摩耗のリスクを軽減する。その上、前記吸着剤、好ましくは活性炭は、さらに好ましくは水中の粉末の懸濁液として加えられる。これにより、粉末の懸濁液はバイオマス及びオリゴ糖を含む懸濁液とよりよく混合し得るので、吸着剤の取り扱いが容易になる。前記吸着剤、好ましくは活性炭を溶液に加えることは、通常、溶液に少なくとも1種の酸を加えた後に実施される。予想外に、最初にpH値を調整し、次に吸着剤又は少なくとも大部分の吸着剤を加える場合、色の低下及びタンパク質の減少ははるかに優れている。溶液に少なくとも1種の酸を加える前に、前記吸着剤、好ましくは活性炭を発酵ブロスに加えることが可能である。
別の変形形態では、溶液のpH値は、少なくとも1種の適当な酸を加えることによって5.5、より好ましくは5.0、さらにより好ましくは4.5に低下させ、次いで吸着剤、好ましくは活性炭、さらに所望の最終pH値が達成されるまで酸を加える。
また、pH値を低下させるために任意の酸を加える前に吸着剤の一部を加え、続いてpH値をpH7.0未満の目標値に設定した後に吸着剤を追加してもよい。
好ましくは、前記バイオマス及び少なくとも1種のファインケミカル、好ましくはオリゴ糖又はアロマ化合物を含む溶液は、通常、1種以上のタイプの細胞、好ましくは細菌又は酵母菌、より好ましくは細菌、さらにより好ましくは遺伝子改変された大腸菌(Escherichia coli)、アミコラトプシス属の種(Amycolatopsis sp.)又はロドバクタースフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)を、培養液、好ましくは少なくとも1種の炭素供給源、少なくとも1種の窒素供給源及び無機栄養素を含む培養液中で培養することによって得られる発酵ブロスである。したがって、費用効率のよい方法で十分な量の前記ファインケミカル(複数可)、好ましくはオリゴ糖(複数可)を生成することができる。
第1の膜ろ過ステップの前記精密ろ過又は限外ろ過は、通常クロスフロー精密ろ過又はクロスフロー限外ろ過として実施される。したがって、ろ過効率は、向上している可能性がある。セラミックモノ及びマルチチャンネルエレメントを使用している場合、前記クロスフロー精密ろ過又はクロスフロー限外ろ過は、0.2m/s超、好ましくは0.5m/s～6.0m/sの範囲、より好ましくは2.0m/s～5.5m/sの範囲、さらにより好ましくは2.8m/s～4.5m/sの範囲、最も好ましくは3.0m/s～4.0m/sの範囲のクロスフロー速度を含む。別の実施形態では、クロスフロー速度は、3.0m/s以下である。高分子膜を第1の膜ろ過に使用する場合、2m/s以下のクロスフロー速度を使用してもよく、0.5m/s～1.7m/の範囲のクロスフロー速度を好ましくは使用するが、0.5m/s以下のクロスフロー速度さえ使用してもよい。別の好ましい実施形態では、高分子膜を使用する場合、クロスフロー速度は、1.7m/s以下、1.6m/s以下、1.5m/s以下、1.4m/s以下、1.3m/s以下、1.2m/s以下、1.1m/s以下又は1.0m/s以下である。したがって、ろ過速度は、pH値調整及び吸着剤の添加を含まないろ過プロセスと比較した場合に最適化することができる。そうすることによって、以前に知られている方法と比較してより遅いクロスフロー速度で操作することにより、膜ろ過装置の摩滅及び/又はエネルギー消費を減らすと同時に良好な分離をもたらすことができる。
前記第1の膜ろ過、好ましくは精密ろ過又は限外ろ過は、通常、4℃～55℃の範囲、好ましくは10℃～50℃の範囲、より好ましくは30℃～40℃の範囲の溶液の温度で実施する。したがって、前記ろ過ステップ中の温度は、発酵中と同じである可能性があり、これは膜性能をさらに向上させ、バイオマス及びオリゴ糖を含む溶液の粘度を低下させる。さらに、第1の膜ろ過はまた、好ましくは、20nm～800nmの範囲、好ましくは40nm～500nmの範囲、より好ましくは50nm～200nmの範囲の孔径を有するセラミック精密ろ過膜又はセラミック限外ろ過膜を用いて実施する。耐摩耗性が向上するように設計された多層膜、例えば400nm及び200nm及び50nm孔径のAl2O3の層を使用することも可能である。したがって、所望の仕様に適合するために十分な量のタンパク質及び多糖を除去することができる。また通常、第1の膜ろ過は、カットオフが4kDa以上、好ましくは10kDa以上、より好ましくは50kDa以上、さらにより好ましくは100kDa以上の高分子限外ろ過膜を用いて実施する。また通常、第1の膜ろ過は、孔径が200nm以下、好ましくは100nm以下の高分子精密ろ過膜を用いて実施する。したがって、所望の仕様に適合するために十分な量のタンパク質及び多糖を除去することができる。
高分子精密ろ過膜又は高分子限外ろ過膜の高分子材料は、好ましくは:ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリアクリロニトリル、ポリフッ化ビニリデンからなる群から選択される少なくとも1種の高分子材料である。改変された高分子材料、例えば、親水化ポリエーテルスルホンも使用してもよい。
セラミック精密ろ過膜又はセラミック限外ろ過膜のセラミック材料は、好ましくは:TiO2、ZrO2、SiC及びAl2O3からなる群から選択される少なくとも1種のセラミック材料である。
第1の膜ろ過、好ましくは精密ろ過又は限外ろ過は、通常、吸着剤、好ましくは活性炭を溶液に加えてから所定時間後に実施する。これにより、色成分が吸着される吸着時間をもたらすことが可能になる。前記所定時間は、少なくとも2分、好ましくは少なくとも10分、より好ましくは少なくとも20分である。したがって、色成分の吸着は、比較的速い。
方法は、好ましくは、第2の又はさらなる膜ろ過、好ましくは限外ろ過を、第1の膜ろ過の精密ろ過又は限外ろ過によって得られたバイオマスを本質的に含まず、1種以上のオリゴ糖、1種以上の二糖及び/又は1種以上の単糖を含み、好ましくはバイオマスも含む出発溶液、例えば発酵ブロスからのこれらの糖の大部分を含む溶液を使用して実施することをさらに含んでいてもよい。好ましくは、第2の膜ろ過は、第1の膜ろ過の透過液と第1の膜よりもカットオフが低い膜で行われる。したがって、第1の膜ろ過によって得られた透過液の有利なさらなる処理が実現される。第2の膜ろ過は、通常、限外ろ過は、好ましくは、少なくとも部分的に高分子材料でできており、カットオフが1kDa～10kDaの範囲、好ましくは2kDa～10kDaの範囲、より好ましくは4kDa～5kDaの範囲の限外ろ過膜を用いて実施する。高分子膜は、通常、より頑丈で安価であるという、目の詰まったセラミック膜に勝る利点を提供する。
第2の膜ろ過は、カットオフが1～25kDa、好ましくは2～10kDa、より好ましくは2～5kDaのセラミック膜で行ってもよい。他の実施形態では、膜が少なくとも部分的に高分子材料でできていることが好ましい。前記高分子材料は、より好ましくは:ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、酢酸セルロースからなる群から選択される少なくとも1種の高分子材料である。前記第2の膜ろ過は、通常、溶液の温度を20未満の温度、好ましくは4℃～15℃の範囲、好ましくは8℃～13℃の範囲、より好ましくは8℃～12℃の範囲である溶液の温度に調整した後に実施する。
好ましい実施形態では、本発明の方法で使用される第1の膜ろ過は、以下でさらに詳細に説明されるように、2つ又は好ましくは3つのステップを含む。第1のステップは、ダイアフィルトレーション係数(DF)(ダイアフィルトレーション水の量=発酵ブロスの出発量×ダイアフィルトレーション係数)が0.5以下～3以上の第1のダイアフィルトレーションを含む。例えば、2'FLを含む溶液では、DFが0.5であることは有利だったが、他のHMO分子では、濃縮ステップが続く場合には3の値がより良いことが判明した。ダイアフィルトレーションの間、加えられた水又は適当な水溶液の量は、排出された透過液の量と同一である。バッチ式ダイアフィルトレーションでは、したがって供給容器内の体積は一定に保たれる。第2のステップは、ダイアフィルトレーション水の供給を停止することによって、好ましくは2以上の係数を用いて発酵ブロスを濃縮することを含み、レベルは目標値まで低下する(目標値=発酵ブロスの開始時の体積又は質量/濃縮係数)。任意選択で、後続の第3のステップは、第2のダイアフィルトレーションを含む。これらの3つのステップを用いて、透過液内での生成物のより低い希釈及び95%以上の増加した収率が実現される。第2のダイアフィルトレーションの係数を増加させることによって、収率はさらに増加し得る。しかしながら、生成物の希釈も増加することになる。
次いで透過液は、通常これらの3つのステップで膜を通過する全ての溶液の組合せである。バッチプロセスでは、各ステップは、時間分離された形で透過液画分を生成し、これは混合するために1つの容器に捕集し、又は別々に処理することができる。継続的なプロセスでは、3つのステップはそれぞれ、時間的に分離されていない透過液画分を生成し、これらの画分を組み合わせて、必要に応じて組み合わせた又は別々に処理した透過液を形成することができる。
任意選択で、第1の膜ろ過の第1のステップは、第2のステップの濃縮が終わる前に1回以上繰り返すことができる。任意選択で、第2のステップは、行ってもよく、又は溶液の濃縮が望ましくない場合は抜かしてもよい。これは、例えば、発酵ブロスが高粘度であり、及び又はバイオマス含有量が極めて高い場合、有用である。
任意選択で、第1のステップは抜かしてもよく、或いは第2のステップは第1のステップなしで行い、それにより最初に透過液を作成しながら発酵ブロスの濃縮が行われ、次に、最後のステップのダイアフィルトレーションは、バイオマス及び1種以上のオリゴ糖、二糖又は単糖を含む溶液に水又は水溶液を供給することによって行われる。
好ましくは、少なくとも1種のオリゴ糖は、ヒト母乳オリゴ糖、好ましくは中性又はシアリル化ヒト母乳オリゴ糖、より好ましくはラクト-N-テトラオース、ラクト-N-ネオテトラオース、3'-シアリルラクトース、6'-シアリルラクトース及び/又は2'-フコシルラクトース、さらにより好ましくは2'-フコシルラクトース、6'-シアリルラクトース及び/又はラクト-N-テトラオースを含む。
本発明の一実施形態では、本発明の方法は、単糖及び/又は二糖及びバイオマスを含有する溶液からのバイオマスから単糖及び/又は二糖を分離するため、例えばバイオマスからラクトース、フコース、マルトース又はサッカロースを分離するため、並びにそれに続く単糖及び/又は二糖を精製するための方法に適用される。
他の実施形態は、本発明の方法を行うのに適した本発明の装置である。
本発明のさらなる特徴及び実施形態は、特に従属請求項と併せて後続の説明でより詳細に開示される。その中で、それぞれの特徴は、当業者が理解しているように、独立した形並びに任意の実行可能な組合せで実現することができる。実施形態は、図に概略的に示す。その中で、これらの図中の同一の参照番号は、同一の要素又は機能的に同一の要素を意味する。
例えば本発明に基づくバイオマス及び少なくとも1種のファインケミカルを含む溶液から1種以上のファインケミカルを精製する方法のブロック図を示す。破線枠は任意選択の部分を示すが、点線枠は請求項1に記載の脱塩の場合には任意であるが、それ以外の場合は任意ではない部分を示す。S10は、ファインケミカル、好ましくはHMO又はアロマ化合物を含む溶液の用意を表し;S12は、pH値を所望のpH、好ましくはpH7未満に調整し;S14は脱色ステップであり;S15は吸着剤を用いた任意選択のインキュベーションステップであり;S16は第1の膜ろ過(MF)ステップであり;S18は第2の膜ろ過ステップであり;S20は脱色ステップであり;S22は第1のナノろ過(NF)ステップであり;S24は第2のナノろ過ステップであり;S26は通常イオン交換ステップ(IEX)として示される任意選択の脱塩ステップであり;Decol.;Conc.;ED;ROは、任意選択の脱色、濃縮、電気透析及び/又は逆浸透ステップを任意の順序で示し;SMBは擬似移動床クロマトグラフィーの省略形であり;凝固は必要に応じてファインケミカルの固体粒子を生成するステップを示し、一部の用途では、ファインケミカル生成物がむしろ精製溶液に含まれていることを好む場合がある。 Perm.は透過液の略であり;Ret.は保持液の略であり;Reg.はイオン交換体の再生の略であり;FTは所望のファインケミカル(複数可)を主として含むイオン交換体のフロースルー(flow-through)の略である オリゴ糖又は他のファインケミカルを精製する、より好ましい方法のブロック図を示す。略語、描写及びステップは図1に示すとおりであり、以下の変更がある:S10はファインケミカル、好ましくはオリゴ糖、及び発酵ブロスの形態のバイオマスを含む溶液の用意である。第1の膜ろ過S16は、第1の膜ろ過の3つのサブステップ(S16/1からS16/3)で示され、第1のダイアフィルトレーションDF、濃縮C.、次いで任意選択で第2のダイアフィルトレーションである。第2の膜ろ過S18は好ましくは限外ろ過(UF)であり;ステップ22は、ナノろ過の第1の濃縮サブステップ(S22/1)とそれに続くダイアフィルトレーションモードの第2のサブステップ(S22/2)としてより詳細に示されている。イオン交換による脱塩ステップは2つのサブステップに示され、最初(S26/1)陽イオン交換体樹脂(CIEX)、好ましくは強いものが使用され、陰イオン交換樹脂(AIEX)、好ましくは弱いものを用いたサブステップS26/2が続き;好ましい方法のステップS26に続いて、さらなる脱色は必要ない。 渦巻形膜エレメントを使用したナノろ過を試験するためのユニットの設定の概略図を示す。ユニットは2つのポンプを備え、1つは圧力供給用及び1つは所望のクロスフローを生成するためである。 発酵ブロスからファインケミカルを精製する別の好ましい方法のブロック図を示す。発酵ブロスS10を用意した後、図1と同じように継続するが、イオンを除去するためのバイオマス分離とナノろ過の組合せにより、使用又は図4に示された任意選択のさらなる処理ステップに適した精製溶液が既に得られているため、脱塩ステップS26はもはや含まれていない。 ファインケミカルを含む溶液から前記ファインケミカル、例えばオリゴ糖を迅速に精製する別の好ましい方法のブロック図を示し、この方法はpHを所望の値の7未満に調整する任意選択のステップから始まり、その後本明細書でそれぞれS22及びS24と記載された第1及び任意選択の第2の膜ろ過ステップ、任意選択のさらなる精製溶液の処理ステップが続く。
以下で使用するように、用語「有する(have)」、「含む(comprise)」若しくは「含む(include)」又はその任意の文法上の変化は、非排他的な方法で使用されている。したがって、これらの用語は、これらの用語によって導入される特徴以外に、このような文脈において記載されている実体にはさらなる特徴が存在しない状況も、1つ以上のさらなる特徴が存在している状況も表し得る。一例として、「AはBを有する」、「AはBを含む(comprises)」及び「AはBを含む(includes)」という表現は、B以外に、Aには他の構成要素は存在しない状況(すなわちAがもっぱらBだけで構成されている状況)も、B以外に、実体Aには1つ以上のさらなる構成要素、例えば構成要素C、構成要素C及びD又はさらに他の構成要素が存在する状況も表し得る。
さらに、用語「少なくとも1つ(at least one)」、「1つ以上(one or more)」或いは特徴又は構成要素が1回又は1回よりも多く提示され得ることを示す同様の表現は、通常それぞれの特徴又は構成要素を導入する場合に1回だけ使用されることは留意されたい。以下において、ほとんどの場合、それぞれの特徴又は構成要素に言及する場合には、それぞれの特徴又は構成要素が1回又は1回よりも多く提示され得るという事実にもかかわらず、表現「少なくとも1つ」又は「1つ以上」は繰り返されない。
さらに、以下で使用されるように、用語「特に(particularly)」、「より詳細には(more particularly)」、「具体的には(specifically)」、「より具体的には(more specifically)」、「通常(typically)」、「より一般的には(more typically)」、「好ましくは(preferably)」、「より好ましくは(more preferably)」又は同様の用語は、追加/代替の特徴と併用され、代替の可能性を限定することはない。したがって、これらの用語によって導入される特徴は、追加/代替の特徴であり、請求項の範囲を限定することは全く意図していない。本発明は、当業者に認識されるように、代替の特徴を使用することによって行ってもよい。同様に、「本発明の実施形態では」又は同様の表現によって導入される特徴は、追加/代替の特徴であることを意図しており、本発明の代替実施形態に関して全く限定されず、本発明の範囲に関して全く限定されず、このようにして導入される特徴を、本発明の他の追加/代替又は非追加/代替の特徴と組み合わせる可能性に関して全く限定されない。
本明細書では、用語「バイオマス」は、1種以上のファインケミカルの溶液中に含まれる生物学的物質の質量を意味する。通常、本発明による前記生物学的物質は、1種類以上の原核生物若しくは真核生物、又は高分子質量のその一部、例えば細胞壁、タンパク質、リン脂質、細胞膜、ポリヌクレオチド及び生物によって生成される他の大きな有機化合物である。
バイオマスは、懸濁液及び/又は溶液であってもよい。
好ましくはバイオマスは、複雑でないバイオマス、通常細胞の特異な又は複雑な構造への組織化が低いかないことを理解されたい。非限定的な例は、個々の細胞、細胞対、細胞塊、オリゴ細胞又は多細胞構造、細胞層、バイオフィルムである。複雑でないバイオマスは、複雑でないバイオマスへの人間介入によって提供されるマトリックス、例えばそれだけには限らないが、層を形成するペトリ皿内の細胞又は生物学的リアクター内のバイオフィルム内層を形成する細胞、人が作ったバイオセンサーの表面又は内部に付着した細胞又はタンパク質などにより、三次元構造である可能性がある。複雑でないバイオマスは、非天然な三次元構造である可能性があるが、天然に存在する構造を模倣することもあり、しかし人間介入によってのみ達成される。
これとは対照的に、複雑なバイオマスは、本来複雑な構造であり、多くの場合複雑な三次元構造であり、数百、数千、数万、しかしより典型的に数十万又は数百万以上の複雑な組織内の細胞構造、多くの場合異なる分化をもつ種々の細胞型を含むことを理解されたい。非限定的な例は、肉眼で体が見える高等植物又は動物、骨及び肉を含む器官及び組織、又は果実、野菜、わら、サトウキビバガス、干し草、木、材木のような植物の一部である。複雑なバイオマスは複雑でないバイオマスの供給源であってもよく、例えば細胞株は通常組織又は器官由来であるが、培養において複雑な構造を維持しない。
より好ましい実施形態では、バイオマスは、1種以上の生物学的有機体の1種以上の細胞を意味し、より好ましくは1種以上の生物は、細菌又は菌類(酵母菌を含む)生物又は植物又は非ヒト動物、及びそれらの細胞部分、例えばそれだけには限らないが、細胞壁、細胞オルガネラ、タンパク質、リン脂質、細胞膜、ポリヌクレオチド又は多糖類である。より好ましい実施形態では、1種以上の生物は、a)グラム陰性菌、例えばロドバクター(Rhodobacter)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、パラコッカス(Paracoccus)、又はエシェリキア(Escherichia)の群;b)グラム陽性菌、例えばバチルス(Bacillus)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)、アミコラトプシス(Amycolatopsis)の群から選択される細菌細胞;c)コウジカビ(Aspergillus)(例えば黒色麹菌クロカビ(Aspergillus niger)、ブラケスレア(Blakeslea)、アオカビ(Penicillium)、ファフィア(Phaffia)(キサントフィロマイセス(Xanthophyllomyces))、ピキア(Pichia)、酵母菌(Saccharomyces)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、ヤロウィア(Yarrowia)、及びハンゼヌラ(Hansenula)の群から選択される菌類細胞;又はd)遺伝子導入植物若しくは遺伝子導入植物細胞を含む培養物であって、細胞がタバコ属の種(Nicotiana spp)、チコリ(Cichorum intybus)、レタス(lactuca sativa)、ハッカ属の種(Mentha spp)、クソニンジン(Artemisia annua)、塊茎形成植物(tuber forming plant)、油糧作物及び樹木から選択される遺伝子導入植物のもの;e)又は遺伝子導入キノコ(transgenic mushroom)若しくは遺伝子導入キノコ細胞を含む培養物であって、微生物がスエヒロタケ(Schizophyllum)、ハラタケ(Agaricus)及びプレウロティシ(Pleurotisi)から選択されるものから選択される細胞である。より好ましい生物は、エシェリキア属、サッカロミセス属、ピキア属、アミコラトプシス属、ロドバクター属に属する微生物であり、さらにより好ましくは大腸菌種、酵母(S.cerevisae)種、ロドバクタースフェロイデス種又はアミコラトプシス属の種のもの、例えばそれだけには限らないがアミコラトプシスメジテラネイ(Amycolatopsis mediterranei)、例えば株NCIM 5008、ストレプトマイセスセトニイ(Streptomyces setonii)、ストレプトマイセスサモチカス(Streptomyces psammoticus)、及び例えばそれだけには限らないがアミコラトプシス属の種株IMI390106、Zyl 926、ATCC39116、DSM 9991、9992又はZhp06である。
より好ましくは、前記バイオマスは、生物又はその細胞及びそれらの細胞部分、さらにより好ましくは遺伝子操作生物又は細胞を含み、それらは培養液、好ましく少なくとも1種の炭素供給源、少なくとも1種の窒素供給源及び無機栄養素を含む培養液で培養されている。
バイオマス及びファインケミカル、好ましくはオリゴ糖(複数可)、二糖(複数可)及び/又は単糖(複数可)の分離の成功を評価するのに最も簡単な方法は、第1の膜ろ過の透過液が光学的に透明であることをモニターすることである。分離が失敗すると、透過液の光学的検査でバイオマスが検出されることになり、透過液中の黒色活性炭などの吸着剤の存在も光学的検査で簡単に検出され、膜ろ過装置の漏れ又は故障を示すことになる。
本明細書では、用語「ファインケミカル」は、オリゴ糖、二糖、単糖、アロマ化合物、ポリマー、モノマー、ビタミン、アミン酸、ペプチド、グルコシド、核酸、ヌクレオチドを意味する。好ましい実施形態では、ファインケミカルは、オリゴ糖又は二糖又は単糖、より好ましくはオリゴ糖、さらにより好ましくはヒト母乳オリゴ糖を意味する。
本明細書では、用語「オリゴ糖」は、少数の通常3～10個の単糖(単純糖)を含有する糖ポリマーを意味する。好ましくは、前記オリゴ糖は、ヒト母乳オリゴ糖、好ましくは中性、酸性非フコシル化及び/又は酸性フコシル化されたもの、より好ましくは2'-フコシルラクトース、ジフコシルラクトース、ラクト-N-テトラオース、ラクト-N-ネオテトラオース、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、LNDFH I、LNDFH II及び/又はそれだけには限らないが3'-シアリルラクトース及び/又は6'-シアリルラクトースなどのヒト母乳オリゴ糖を含有するシアル酸、さらにより好ましくは2'-フコシルラクトースを含む。
本明細書では、用語「二糖」は、2個の単糖からなる糖、例えばグルコースとガラクトース部分からなるラクトース、又は1個のグルコースと1個のフルクトース分子からできているサッカロースを意味する。
本明細書では、用語「単糖」は、単純糖、好ましくは5又は6個の炭素原子を含む糖分子、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトース又はフコースを意味する。
本明細書では、用語「アロマ化合物」は、臭気剤、アロマ、香水、又はフレーバーである任意の物質を意味し、好ましくは匂い又は臭気がある化合物である。好ましくは、アロマ化合物は、通常分子量として分子質量が最大1000Da、好ましくは最大800Da、より好ましくは最大600Da、さらにより好ましくは最大400Daの有機化合物である。好ましくはアロマ化合物は、極性アロマ化合物であり、さらにより好ましくはフラネオール、安息香酸、フェニルエタノール、ラズベリーケトン、ピラジン、バニリン、バニリルアルコール及びバニラグリコシドのリストから選択され、さらに一層好ましくはそれはバニリン、バニリルアルコール及びバニラグリコシドから選択される。
用語「吸着剤」は、本明細書では気体、液体、又は溶解固形物から表面への原子、イオン、又は分子の付着をもたらすように構成されたエレメントを意味する。用語「付着」は、異なる粒子又は表面が互いにくっつく傾向を意味する。好ましくは、吸着剤は、色成分の付着をもたらすように構成されている。好ましくは、吸着は活性炭である。
本明細書では、用語「精密ろ過」は、望ましくない粒子を含む流体、例えば汚染された流体が特別な孔径の膜を通過して、細胞、例えば微生物と懸濁粒子を処理液、特により大きい細菌、酵母菌、及び任意の固体粒子から分離する物理的ろ過プロセスの一種を意味する。精密ろ過膜は0.1μm～10μmの孔径を有する。それによって、このような膜は、250kDaを超える分子量でカットオフを有する。
本明細書では、用語「限外ろ過」は、望ましくない粒子を含む流体、例えば汚染された流体が特別な孔径の膜を通過して、細胞、例えば微生物と懸濁粒子を処理液、特に細菌、巨大分子、タンパク質、より大きいウィルスから分離する物理的ろ過プロセスの一種を意味する。限外ろ過膜は通常2nm～100nmの孔径を有し、2kDa～250kDaの分子量でカットオフを有する。限外ろ過の基礎となる原理は、精密ろ過の基礎となるものと根本的に変わらない。これらの方法の両方とも、サイズ排除又は粒子保持に基づいて分離するが、粒子の大きさによってそれらの分離能力が異なる。
本明細書では、用語「ナノろ過」は、望ましくない粒子を含む流体、例えば汚染された流体が特別な孔径の膜を通過して、溶液中のより小さい化合物からより大きい化合物を分離する物理的ろ過プロセスの一種を意味する。それは、限外ろ過膜よりも小さい孔を有する膜を使用する。ナノろ過膜の例は、孔径が1～10nmのものである。ナノろ過膜は、それらの無機塩、例えばNaCl又はMgSO4の保持が少なくとも部分的だが完全ではないことを特徴とする。これらのより低分子種の保持のために、それらは通常限外ろ過膜よりも高圧で操作される。本明細書において、「ナノろ過」は、NaClの保持が5～90%の膜で行われるろ過と定義され、ここで保持は、塩濃度2,000ppm、温度25℃、供給圧力8バール、回収率15%で決定される。
膜ろ過が精密ろ過、限外ろ過、ナノろ過又は逆浸透と見なされる場合、ろ過膜の孔径は唯一の決定要素ではないことが当技術分野で理解されたい。当業者は、これらの方法が区別できるようであろう。
本明細書では、用語「凝固」は、化合物、例えばファインケミカルを、物質の非固体状態から固体状態に移行するプロセスを意味する。化合物は、懸濁液又は非懸濁固体として存在していてもよい。非限定的な例は、結晶化、噴霧乾燥、沸騰乾固、沈殿及びフロキュレーションである。固体粒子は、凝固プロセスの後又は凝固プロセスの一部として部分的又は完全に乾燥させ、水のような溶媒を依然として含有していても、或いはそのような溶媒に懸濁させていてもよい。用途によっては懸濁液又はスラリーが好ましく、多かれ少なかれ他の乾燥固体、例えば粉末又は結晶が好ましい。室温で固体状態ではない化合物の場合、又は室温で固体状態のものの凝固プロセスを支持するために、より低温で凝固を行ってもよい。非限定的な例は、溶液から固体を沈殿させるための冷却であるが、より強力な温度低下、例えばそれだけには限らないが凍結乾燥を含むプロセスもある。他方では、温度上昇による溶媒の除去も、例えば、化合物が室温で溶液又は懸濁液中である場合、凝固プロセスに使用することができる。
本明細書では、用語「脱塩」は、少なくとも部分的脱塩、好ましくは全塩の少なくとも90mol%、より好ましくは少なくとも95mol%の除去を表す。
本発明の方法によれば、第1の膜ろ過は、好ましくはカットオフが4kDa以上、好ましくは10kDa以上、より好ましくは50kDa以上の高分子限外ろ過膜、又は孔径が200nm以下、好ましくは100nm以下の高分子精密ろ過膜を用いて実施する。さらに、前記第2の膜ろ過は、好ましくはカットオフが1kDa～10kDaの範囲、好ましくは2kDa～10kDaの範囲、より好ましくは4kDa～5kDaの範囲の限外ろ過膜を用いて実施する。
ろ過膜のカットオフは、通常所与のサイズ又は分子量の溶質の90%の保持を意味し、例えばxkDaの球状タンパク質の90%は、カットオフがxkDaの膜によって保持される。これらのカットオフ値は、例えば当技術分野で一般的な条件及びパラメーター下での定義されたデキストラン又はポリエチレングリコールのろ過、並びに保持液、透過液及び供給物とも呼ばれる元の溶液を当技術分野で一般的な方法及びパラメーターを使用してGPCゲル透過クロマトグラフィー分析器で分析することによって測定することができる。
本明細書では、用語「クロスフローろ過」は、透過液側に対して正圧で、供給物流の大部分がフィルター内ではなくフィルターの表面を横切って接線方向に移動するろ過の一種を意味する。これの主な利点は、他の方法ではフィルターを目詰まりさせる可能性のあるろ過ケーキがろ過プロセス中に蓄積されず、ろ過ユニットが可動できる時間の長さが延びることである。これは、バッチ式のデッドエンドろ過とは違って、連続プロセスになり得る。大規模な用途には、連続プロセスが好ましい。デッドエンドろ過ではフィルター表面が固体材料にすぐに塞がれてしまう(目詰まりする)可能性があるので、透過液が最も重要とされる小さな粒径の固体を高い割合で含有する供給物の場合にこの種のろ過が通常選択される。本開示によれば、前記クロスフロー精密ろ過又はクロスフロー限外ろ過は、0.5m/s～6.0m/sの範囲、好ましくは2.0m/s～5.5m/sの範囲、より好ましくは3.0m/s～4.5m/sの範囲のクロスフロー速度を含む。セラミックでできた膜の場合、膜のそれぞれの形状に応じて、クロスフロー速度が高分子材料でできた膜の場合よりも高くすることができる。例えば、平坦な高分子膜、例えば平坦シートモジュールの高分子膜の場合、クロスフロー速度は0.5m/s～2.0m/s、好ましくは1.0m/s～1.7m/s、より好ましくは1.0～1.5m/sである。特定の設定及びバイオマスを含む特定溶液に応じて、場合によっては1.0m/s以下のクロスフロー速度さえも使用できるが、クロスフロー速度が低すぎる場合にろ過がデッドエンドろ過に変わるかもしれない。クロスフロー速度(cross-flow velocity)及びクロスフロー速度(cross-flow speed)は、本明細書では区別なく用いられている。
用語「カットオフ」は、本明細書では、通常ダルトン単位のMWCO、分子量カットオフの形式で指定される膜の排除限界を意味する。これは、溶質、例えば膜によって90%に保持される球状タンパク質の最小分子量として定義される。カットオフは、本方法に応じて、いわゆるD90に変換でき、それは次にメートル単位で表される。
本発明の方法の重要な部分は、S22と呼ばれる少なくとも1つのナノろ過ステップによる1種以上のファインケミカルを含む溶液の脱塩である。このナノろ過ステップS22は、好ましくは、ファインケミカル、好ましくはオリゴ糖を含む溶液を用いて行われ、ここで溶液のpHは、pH7未満、好ましくはpH5未満の値に設定されており、これによりリン酸塩又は硫酸塩のようなイオンの除去がより容易になる。
しかしながら、より好ましい実施形態では、方法は、ステップS22のナノろ過ステップが実施される前に有益なステップを含む。この改善された本発明の方法では、第1のステップ(図2、ステップS10)において、バイオマス及び少なくとも1種のオリゴ糖を含む溶液を供給している。前記少なくとも1種のオリゴ糖は、ヒト母乳オリゴ糖、好ましくは2'-フコシルラクトースを含む。好ましくは、バイオマス及びオリゴ糖を含む前記溶液は、培養液中での1種類以上の細胞の培養によって得られる。したがって、前記溶液はまた、好ましい実施形態では発酵ブロスと呼んでもよい。培養液は、好ましくは少なくとも1種の炭素供給源、少なくとも1種の窒素供給源及び無機栄養素を含む培養液である。より好ましくは、発酵ブロス又はバイオマス及び少なくとも1種のオリゴ糖を含む溶液は、微生物発酵、好ましくは好気性微生物発酵によって得られる。オリゴ糖を生成できる微生物は、例えばエシェリキア属(Escherichia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、ヘリコバクター属(Helicobacter)、バチルス属(Bacillus)、ラクトバシラス属(Lactobacillus)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、ピキア属(Pichia)、サッカロミセス属(Saccharomyces)及びクルイベロマイセス属(Kluyveromyces)からなる群からの、又はWO 2015/032412として公開された国際特許出願若しくはEP 2 379 708として公開された欧州特許出願に記載された酵母菌又は細菌、好ましくは遺伝子改変された大腸菌株、より好ましくはlacZ遺伝子(lacZ-)を欠損し、オリゴ糖の生合成に有利な制御された条件下で水性栄養培地で培養される、ヒトの栄養のための物質の生成に適した遺伝子改変された大腸菌株、例えばEP 2 379 708、EP 2 896 628又はUS 9 944 965に開示されているようなものであってもよい。水性栄養培地は、増殖及び/又はオリゴ糖の生合成ために微生物に使用される少なくとも1種の炭素供給源(例えばグリセリン又はグルコース)を含む。その上、栄養培地は、好ましくはアンモニウム塩、例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、クエン酸アンモニ
ウム、水酸化アンモニウムなどの形態で少なくとも1種の窒素供給源も含有し、これは細胞、例えば微生物の増殖に必要である。培地中の他の栄養素には、例えば1つ又は複数のリン供給源としてのリン酸塩、硫黄供給源としての硫酸塩、並びに例えばMg、Fe及び他の微量栄養素を細胞にもたらす他の無機又は有機塩がある。多くの場合、1種以上のビタミン、例えばチアミンは、最適な性能のために栄養培地に補充する必要がある。栄養培地は、任意選択で複雑な混合物、例えば酵母エキス又はペプトンを含有していてもよい。このような混合物は通常、高窒素含有化合物、例えばアミノ酸並びにビタミン及びいくつかの微量栄養素を含有する。
栄養素は、培養開始時に培地に加えることができ、及び/又はそれらはプロセスの過程の間に供給することもできる。ほとんどの場合、炭素供給源(複数可)は、培養開始時に定義された低濃度まで培地に加えられる。炭素供給源(複数可)は次いで、細胞の増殖速度、したがって、酸素要求量を制御するために連続的又は断続的に供給される。追加の窒素供給源は、通常アンモニアを用いたpH制御によって得られる(下記参照)。培養の過程中に上記の他の栄養素を加えることも可能である。
場合によっては、前駆体化合物を培地に加え、これはオリゴ糖の生合成に必要である。例えば、2'-フコシルラクトースの場合、ラクトースは通常前駆体化合物として加える。前駆体化合物は、培養開始時に培地に加えてもよく、又は培養中に連続的若しくは断続的に供給してもよく、又は最初の追加と供給の組合せによって加えてもよい。
細胞は、撹拌槽バイオリアクター中で増殖及びオリゴ糖の生合成を可能にする条件下で培養する。微生物細胞への50mmol O2/(l*h)～180mmol O2/(l*h)の範囲の十分な酸素供給は増殖及び生合成に必須であり、したがって液体培地への高速酸素移動を達成するために培養液を通気及び強烈に撹拌する。任意選択で、培地中の細胞への酸素移動の速度を増大させるために、培養液への空気流は、純粋な酸素ガスの流れによって濃縮してもよい。培養は、24℃～41℃、好ましくは32℃～39℃で実施し、pH値は、好ましくはNH3(ガス又はNH4OHの水溶液として)の自動追加によって6.2～7.2に設定する。
場合によっては、例えばEP 2 379 708として公開された欧州特許出願にあるように、オリゴ糖の生合成は、化合物、例えばイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)の追加によって誘発する必要がある。誘発化合物は、培養開始時に培地に加えてもよく、又は培養中に連続的若しくは断続的に供給してもよく、又は最初の追加と供給の組合せによって追加してもよい。
続いて、本発明の方法は、第2のステップ(図2、ステップS12)でpH値の調整に進む。前記ステップでは、通常溶液のpH値は、7以下に設定される。必要に応じて、それは、バイオマス及び少なくとも1種のオリゴ糖を含む溶液に少なくとも1種の酸を加えることによって低下させる。好ましくは、溶液のpH値を、好ましくは3.0～5.5の範囲、より好ましくは3.5～5の範囲、さらにより好ましくは4.0～4.5の範囲、例えば4.0又は4.1の目標pH値に低下させる。前記少なくとも1種の酸は、H2SO4、H3PO4、HCl、HNO3(好ましくは濃縮形態ではない)及びCH3CO2Hからなる群から選択される酸、又は食物若しくは飼料の生産において安全と考えられる任意の他の酸であり、好ましくは酸は、H2SO4、H3PO4、HCl及びCH3CO2Hからなる群から選択される。これらの酸単一の代わりに、これらの酸の混合物を一実施形態で使用することができる。
さらに、本発明の方法の別の実施形態では、バイオマス及び少なくとも1種のオリゴ糖、少なくとも1種の二糖又は少なくとも1種の単糖を含む溶液が、既に7未満のpH値、好ましくはpH5.5未満、より好ましくはpH5.0以下、さらにより好ましくはpH4.5以下を有している場合、これらの酸を少しも追加せず、ステップS12を抜かし、そのような溶液のための本発明の方法をステップS14で続ける。
次いで、方法は次のステップ(図2、S14)に進む。前記ステップでは、バイオマス及び少なくとも1種のオリゴ糖を含む溶液に1種以上の吸着剤を加える。好ましくは、吸着剤は活性炭である。前記吸着剤、好ましくは活性炭は、0.5重量%～3重量%の範囲、好ましくは0.6重量%～2.5重量%の範囲、より好ましくは0.7重量%～2.0重量%の範囲、例えば1.5重量%の量で加える。この点に関して、吸着剤の粒子が小さいほど、吸着特性が良くなることに留意されたい。前記吸着剤、好ましくは活性炭は、2μm～25μmの範囲、好ましくは3μm～20μmの範囲、例えば10～15μmのもの、より好ましくは3μm～7μmの範囲、例えば5μmの直径d50の粒径分布をもつ粉末として加える。より好ましくは、前記吸着剤、好ましくは活性炭は、水中の粉末の懸濁液として加える。好ましくは、前記吸着剤、好ましくは活性炭を溶液に加えることは、少なくとも1種の酸を溶液に加えてから実施する。或いは、前記吸着剤、好ましくは活性炭を溶液に加えることは、少なくとも1種の酸を溶液に加える前に実施してもよい。言い換えると、ステップS12及びS14の順序は変えてもよく、その順序は固定されていない。しかし、7未満のpHを所望のpH値に設定し、次に1種以上の吸着剤、好ましくは活性炭を加える順序の場合、タンパク質の除去及び脱色に関して最良の結果をもたらすはずである。好ましい実施形態では、少なくとも1種の酸の追加は、少なくとも1種の吸着剤、好ましくは活性炭の追加に先行する。
本発明の方法の好ましい実施形態では、ステップS12とS14の両方とも実施され、S12、続いてS14の順序で実施される。
方法は、次いで、分離前に1種以上の吸着剤への色成分の付着に適した時間を含むさらなるステップ(図2、ステップS16)の第1の膜ろ過、好ましくは精密又は限外ろ過に進む。第1の膜ろ過は、少なくとも1種のオリゴ糖、少なくとも1種の二糖及び/又は少なくとも1種の単糖を含む溶液からバイオマス及び1種以上の吸着剤を分離するために実施し、これにより、バイオマスが除去され、オリゴ糖、二糖及び/又は単糖を含む透過液とも呼ばれる得られた溶液の色成分及びタンパク質が減少する。基本的に、ステップS16は精密ろ過又は限外ろ過を含む。しかしながら、精密ろ過と限外ろ過の間に円滑に移行されるので、両方とも当業者によって、片側にバイオマス、吸着剤及びタンパク質、反対側に所望の1種以上のオリゴ糖、1種以上の二糖及び/又は1種以上の単糖のバルクを含有する透過液を分離する目的で使用可能である。ステップS16のろ過はまた、精密ろ過に代わる方法としての限外ろ過であってもよい。前記精密ろ過又は限外ろ過は、好ましくはクロスフロー精密ろ過又はクロスフロー限外ろ過として実施して、膜性能を改善し、膜摩耗を減少させる。ステップS16のろ過の詳細を以下に説明する。前記クロスフロー精密ろ過又はクロスフロー限外ろ過は、0.5m/s～6.0m/sの範囲、好ましくは2.0m/s～5.5m/sの範囲、より好ましくは3.0m/s～4.5m/sの範囲、例えば4.0m/sのクロスフロー速度を含む。一実施形態では、クロスフロー速度は、3.0m/s以下であり、好ましくは1.0～2.0(両端含む)である。本発明の方法、使用及び装置の1つの有利な点は、より遅いクロスフロー速度を使用して、好ましくは任意のオリゴ糖、二糖又は単糖からの溶液のタンパク質成分の良好な分離を達成できることである。したがって、エネルギー及び機器のコストを削減でき、機器の摩滅及びろ過膜の摩耗も減少する。前記第1の膜ろ過、好ましくは精密ろ過又は限外ろ過は、8℃～55℃の範囲、好ましくは10℃～50℃の範囲、より好ましくは30℃～40℃の範囲、例えば38℃の溶液の温度で実施する。前記精密ろ過又は限外ろ過は、20nm～800nmの範囲、好ましくは40nm～500nmの範囲、より好ましくは50nm～200nmの範囲、例えば100nmの孔径を有するセラミック若しくは高分子精密ろ過膜又はセラミック限外ろ過膜を用いて実施する。前記セラミック材料は:二酸化チタン(TiO2)、二酸化ジルコニウム(ZrO2)、炭化ケイ素(SiC)及び酸化アルミニウム(Al2O3)からなる群から選択される少なくとも1種のセラミック材料の少なくとも1種の層であり、又はそれを有している。或いは、前記精密ろ過又は限外ろ過は、カットオフが10kDa以上、好ましくは50kDa以上の高分子限外ろ過膜、又は粒子サイズが100nm以下の高分子精密ろ過膜を用いて実施する。前記高分子材料は:ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリアクリロニトリル、ポリフッ化ビニリデンからなる群から選択される少なくとも1種の高分子材料である。前記第1の膜ろ過、好ましくは精密ろ過又は限外ろ過は、吸着剤、好ましくは活性炭を溶液に加えた後の所定時間後に実施し、したがって色成分の付着を確実にする。通常、溶液中の吸着剤、好ましくは活性炭の均一な分布が達成されるまで溶液と加えた吸着剤とを混合するのに必要な時間は、色成分の付着を可能にするのに十分であるが、これを最大にするためにより長いインキュベーション時間を使用することができる。一実施形態では、前記所定時間は、少なくとも2分、好ましくは少なくとも10分、より好ましくは少なくとも20分、例えば25分又は30分である。
好ましい実施形態では、以下でさらに詳細に説明するように、本発明の方法の第1の膜ろ過は3つのステップを含む。第1のステップは、0.5の係数(ダイアフィルトレーション水の量=発酵ブロスの出発量×ダイアフィルトレーション係数)を有する第1のダイアフィルトレーションを含む。ダイアフィルトレーションの間、加えられた水の量は、排出された透過液の量と同一である。第1のステップは継続的なステップであり、したがって供給容器内の体積は一定に保たれる。第2のステップは、ダイアフィルトレーション水の供給を停止することによって、係数2で発酵ブロスを濃縮することを含み、レベルは目標値まで低下する(目標値=発酵ブロスの開始時の体積又は質量/濃縮係数)。続いて、第3のステップは、第2のダイアフィルトレーションを含む。これら3つのステップの間に捕集した透過液は通常、組み合わせて、以下の表で参照されている透過液を形成する。これらの3つのステップを用いて、透過液内での生成物のより低い希釈及び95%以上の増加した収率が実現される。第2のダイアフィルトレーションの係数を増加させることによって、収率はさらに増加し得る。
本発明の方法は、次に第2の膜ろ過ステップ(図2、ステップS18)に進む。好ましくはステップS16の第1の膜ろ過によって得られたオリゴ糖、二糖及び/単糖を含む溶液の限外ろ過を実施する。言い換えれば、ステップS16の第1の膜ろ過から導出された透過液の限外ろ過を実施する。好ましくは、前記第2の膜ろ過、好ましくは限外ろ過は、カットオフが1kDa～10kDaの範囲、好ましくは2kDa～10kDaの範囲、より好ましくは4kDa～5kDaの範囲の限外ろ過膜を用いて実施する。特に好ましい実施形態では、カットオフが4kDa又は5kDaの膜が適している。前記限外ろ過膜は、少なくとも部分的に高分子材料でできている。前記高分子材料は:ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、酢酸セルロースからなる群から選択される少なくとも1種の高分子材料である。前記第2の膜ろ過、好ましくは限外ろ過は、溶液の温度が5℃～15℃の範囲、好ましくは8℃～13℃の範囲、より好ましくは8℃～12℃の範囲、例えば10℃で実施する。
図1は、任意選択の個別のステップ(ステップS15)として示された分離前の1種以上の吸着剤への色成分の付着に適した時間を含む本発明の方法の一連のステップを示す。このような個別のインキュベーションステップは、吸着剤への望ましくない化合物の十分な付着のために長時間が必要な場合に有利かもしれない。さらに、図2は、第1の膜ろ過を3つのサブステップとして描写しており、第1の膜ろ過の3つのサブステップは、第1のダイアフィルトレーション、濃縮、その後任意選択で第2のダイアフィルトレーションである。これらは図2でそれぞれS16/1、S16/2及びS16/3として示されている。
本発明の方法は、次いで、必要に応じて任意選択の脱色ステップ20、又は上記で説明したように直接第1のナノろ過ステップ(S22)に進む。
ナノろ過ステップは、濃縮作用及びダイアフィルトレーション作用を含んでいてもよく、それは時々洗浄と呼ばれる。装置の設定及びプロセスによってもたらされる制限に応じて、ダイアフィルトレーション又は洗浄作用が最初であってよく、濃縮作用が続き、任意選択でダイアフィルトレーション又は2つの作用の連続が1回又は数回繰り返されてもよい。
好ましくは濃縮作用及びダイアフィルトレーション作用は、同じ装置及び同じ膜を用いて行われるが、濃縮作用及びダイアフィルトレーション作用に異なる膜を用いる設定が可能である。
好ましい実施形態では、ナノろ過ステップは、濃縮作用とそれに続くダイアフィルトレーション作用を含む。好ましくは、CFは少なくとも3であり、より好ましくは少なくとも5であり、最も好ましくは少なくとも10である。
ダイアフィルトレーション係数は、通常10以下である。別の好ましい実施形態では、DFは少なくとも0.5以上であり、より好ましくは1.5(1.5を含む)～7(7を含む)であり、さらにより好ましくは2～4の範囲であり、さらに一層好ましくは2.5～3.5であり、最も好ましくは2.5、2.6、2.7、2.8、2.9又は3.0である。
請求項に記載の方法は、記載された形でナノろ過膜を適用し、以下の1つ以上の利点が提供される:効率的に一価並びに二価の塩を除去するため、イオン交換ステップが必要ではなく、又は脱塩が依然として必要な場合、イオン交換処理に必要とされるイオン交換樹脂が大幅に少なくなる;先行技術で同じ又は同様の目的に使用される他の膜と比較して、ナノろ過中により高い流量を維持でき、操作時間が短縮される;請求項に記載の方法で適用される膜は、先行技術の解決策と比較して目詰まりしにくい;請求項に適用された膜は、完全に洗浄及び再生することができるため、その性能を大幅に低下させずに再利用することができる;必要に応じてナノろ過は、三糖以上のオリゴ糖、好ましくはHMOから二糖、好ましくはラクトースを選択的及び効率的に除去して、濃縮された三糖以上のオリゴ糖、好ましくはHMO画分を得る方法で行うことができる。
好ましい実施形態では、第1及び任意選択の第2のナノろ過ステップは、継続的な設定で行われる。
別の実施形態では、ナノろ過による脱塩と他の脱塩方法を組み合わせることが可能である。例えば、図1のS22及びS26によって描写されているように、イオン交換ステップは第1のナノろ過の後に実施することができる。また、本発明の方法では、第1のナノろ過S22の後に異なる膜を用いて第2のナノろ過を行うことが可能である。これは、図1、4及び5の第1のナノろ過(S22及びS24によって描写されているように)に続いて直接行ってもよい。一実施形態は、第1のナノろ過において、ダイアフィルトレーションモードでより開いた膜を使用し、それに続く第2のナノろ過は、より目の詰まった膜及び濃縮モードで行われた。
第2のナノろ過は、例えば第1のナノろ過に続くイオン交換による別の脱塩ステップの後に行うことが可能である。イオン交換ステップの後に膜を使用して濃縮する場合はより目の詰まった膜を使用できるため、生成物の損失はわずかに少なくなる。
吸着剤による任意選択の脱色ステップは、必要に応じてステップ20、26の前又はステップ26の後に行ってもよい。
別の実施形態では、ステップS10～S26を行い、ここで、少なくとも1種のオリゴ糖ではなく、少なくとも1種の単糖、少なくとも1種の二糖或いは少なくとも1種の単糖、少なくとも1種の二糖及び/又は少なくとも1種のオリゴ糖の混合物が、少なくとも1種のオリゴ糖の代わりに存在する。
好ましい実施形態は、1種以上のファインケミカル、好ましくは1種以上のHMO又は1種以上のアロマ化合物を含む溶液を脱塩する改善された方法を対象とし、ここで方法は、ステップS22について記載された第1のナノろ過、続いて任意選択の第2のナノろ過、及び好ましくは本明細書においてステップS26について記載されたように、好ましくはイオン交換による、後続の脱塩ステップを含み、ここでファインケミカルの脱塩は、脱塩前にナノろ過ステップ(複数可)で処理されていない溶液又は本発明のナノろ過以外の手段によって脱塩された溶液と比較して、少なくとも50%、100%又は150%、より好ましくは少なくとも200%、さらにより好ましくは少なくとも300%改善される。
このような方法は、
a) 1種以上のファインケミカルを含む溶液を用意するステップ;
b) pHを所望の値の7未満に調整するステップ
c) 好ましくは吸着剤、好ましくは活性炭の添加による脱色ステップ、
d) 任意選択のインキュベーションステップ、
e) 第1の膜ろ過ステップ
f) 第1の膜ろ過の透過液の第2の膜ろ過ステップ、
g) 第2の膜ろ過の透過液を、任意選択の脱色ステップで、好ましくは吸着剤、好ましくは活性炭の添加によって使用し、続いて第1のナノろ過ステップを行うか又はそれに置き換えるステップ;
h) 第1のろ過の保持液を用いた任意選択の第2のナノろ過ステップ、
i) 図4に示すように保持液の任意選択のさらなる処理ステップ
を含む。
溶液中のファインケミカルを精製する方法であって、任意選択のpH7以下へのpH設定のステップ、任意選択の脱色ステップ、任意の手段によるバイオマス分離のステップを含み、それに続く一連の
第1のナノろ過S22、任意選択の第2のナノろ過S24、任意選択の脱色及び/又は濃縮ステップ、その後の任意選択の凝固ステップ
からなる1つ以上のステップを含む、方法がさらに開示される。
さらなる実施形態は、発酵若しくは酵素的若しくは化学的合成によって生成されるファインケミカル又はその混合物に適した方法に対する。溶液中のファインケミカルを精製する方法であって、任意の手段による任意選択のバイオマス分離ステップ及び任意選択のpHの所望の値へのpH設定のステップを含み、ここでこれら2つの任意選択のステップは任意の順序で行うことができ、それに続く一連の:
第1のナノろ過S22、任意選択の第2のナノろ過S24、任意選択の脱色及び/又は濃縮ステップ、その後の任意選択の凝固ステップ
からなる1つ以上のステップを含む、方法。
さらなる実施形態では、本発明は、発酵若しくは酵素的若しくは化学的合成によって生成されるファインケミカル又はその混合物に適した迅速な精製方法(図5)に関する。溶液中のファインケミカルを精製する本発明の方法であって、任意選択のpHの所望の値へのpH設定のステップと、一連の:
第1のナノろ過S22、任意選択の第2のナノろ過S24、任意選択の脱色及び/又は濃縮ステップ、その後の任意選択の凝固ステップ
からなる1つ以上のステップを含む、方法。
誤解を避けるために、溶液又は透過液又は保持液のタンパク質含有量へのいかなる言及も、溶液/透過液/保持液中の遊離タンパク質を指し、すなわちたとえあったとしてもバイオマスに含有されているタンパク質ではなく、細胞外で見つかったタンパク質である。発酵及びその後の取り扱い及び膜ろ過の間も、タンパク質は、バイオマスから遊離し、次いで遊離タンパク質と見なされることがある。
誤解を避けるために、溶液又は透過液又は保持液の少なくとも1種のオリゴ糖、少なくとも1種の二糖及び/又は少なくとも1種の単糖へのいかなる言及も、溶液/透過液/保持液中の遊離した少なくとも1種のオリゴ糖、少なくとも1種の二糖及び/又は少なくとも1種の単糖を指し、すなわちたとえあったとしてもバイオマスに含有されている少なくとも1種のオリゴ糖、少なくとも1種の二糖及び/又は少なくとも1種の単糖ではなく、細胞外で見つかったものである。発酵及びその後の取り扱い及び膜ろ過の間も、少なくとも1種のオリゴ糖、少なくとも1種の二糖及び/又は少なくとも1種の単糖は、バイオマスから遊離し、次いで溶液中の遊離した少なくとも1種のオリゴ糖、少なくとも1種の二糖及び/又は少なくとも1種の単糖と見なされることがある。
好ましい実施形態では、第1の膜ろ過、好ましくは精密ろ過又は限外ろ過を実施して、少なくとも1種のオリゴ糖、少なくとも1種の二糖及び/又は少なくとも1種の単糖を含む溶液からバイオマスを分離するするステップは、少なくとも1種のオリゴ糖、少なくとも1種の二糖及び/又は少なくとも1種の単糖からバイオマスを分離するステップとして理解されるべきであり、ここで、少なくとも1種のオリゴ糖、少なくとも1種の二糖及び/又は少なくとも1種の単糖の大部分は、バイオマスの分離後の第1の膜ろ過の透過液に見られる。
好ましい実施形態では、第1の膜ろ過の後に限外ろ過が続き、次いで任意選択でナノろ過又は逆浸透、好ましくはナノろ過が続き、イオン交換が続く。
ステップS26又はS24に続いて逆浸透を行って、溶液の濃縮だけではなく、少なくともある程度の精製が達成される場合、一実施形態では、これは本出願の意味の範囲内ではナノろ過と考えられ、したがって本発明の方法は、ナノろ過ステップとして逆浸透にも使用できる膜及び設定を含むことになる。
また、ステップ22のナノろ過は、精製ではなく溶液の濃縮が望まれる場合は逆浸透に置き換えることができ、次いで好ましくは少なくとも1つの脱ろ過サブステップを含む第2のナノろ過ステップS.24と組み合わせることができる。
別の実施形態では、
i. バイオマス及び1種以上のファインケミカルを含む溶液を用意するステップ、
ii. バイオマス及び少なくとも1種のオリゴ糖を含む溶液に少なくとも1種の酸を加えることにより、溶液のpH値を7未満、好ましくはpH5.5未満又はそれ以下に設定するステップ、
iii. バイオマス及びファインケミカルを含む溶液に吸着剤を加えるステップ、
iv. 任意選択で、インキュベーションステップ、
v. 本明細書で第1の膜ろ過とも呼ばれ、通常は精密ろ過又は限外ろ過である膜ろ過を実施して、少なくとも1種のファインケミカルを含む溶液からバイオマスを分離するステップ;
vi. 任意選択で、第1の膜ろ過、好ましくは少なくとも1回の限外ろ過の透過液を用いて、少なくとも1回の第2の膜ろ過又はさらなる膜ろ過を実施するステップ;
vii. 1回以上のナノろ過による溶液の脱塩ステップ;
viii. イオン交換ステップのような任意のさらなる脱塩なしでHMOの精製を完了するステップ
を含む1種以上のHMOを精製する方法が開示される。
好ましい実施形態では、本発明の方法は、中性又は酸性ヒト母乳オリゴ糖の改善された精製、より好ましくは2'-フコシルラクトース、LNT及び6'SL単独又は組み合わせた精製の方法である。
別の好ましい実施形態では、本発明の方法を使用して、オリゴ糖、二糖若しくは単糖の代わりに、又はそれに加えて、1種以上のアロマ化合物を含む溶液を精製する。
好ましくは、本発明の方法のナノろ過ステップは、渦巻形膜を用いたクロスフローナノろ過として行われる。
一実施形態は、供給溶液、特に発酵又は酵素的プロセスからの水性媒体に溶解している塩からオリゴ糖及び/又は二糖を分離する方法であって、a)オリゴ糖及び二糖の保持を確実にし、塩の少なくとも一部を通過させる分子量カットオフを有するナノろ過膜を供給溶液と接触させるステップであり、膜は、その膜の活性(上)層が例えばポリアミドから構成されている薄膜複合膜であり、ここで膜のNaCl保持率は30%未満、好ましくは20%未満、より好ましくは15%未満、さらにより好ましくは10%未満である、ステップ、b)それに続く任意選択の、前記膜を用いたダイアフィルトレーション、並びにc)オリゴ糖及び/又は二糖を濃縮した保持液の捕集を含む、方法を対象とする。
要約すると、本発明は、以下の実施形態を含むものであって、それらはここで定義される各相互従属により示された実施形態の特定の組合せを含む。
さらなる実施形態
1. バイオマス及び1種以上のオリゴ糖を含む溶液から1種以上のオリゴ糖を精製する方法であって、
i. バイオマス及び1種以上のファインケミカル、好ましくはオリゴ糖又はアロマ化合物を含む溶液を用意するステップ、
ii. バイオマス及び少なくとも1種のオリゴ糖を含む溶液に少なくとも1種の酸を加えることにより、溶液のpH値を7未満、好ましくはpH5.5未満又はそれ以下に設定するステップ、
iii. バイオマス及びファインケミカル、好ましくはオリゴ糖又はアロマ化合物を含む溶液に吸着剤を加えることにより、溶液を少なくとも部分的に脱色するステップ、
iv. 任意選択で、インキュベーションステップ、
v. 本明細書で第1の膜ろ過とも呼ばれ、通常は精密ろ過又は限外ろ過である膜ろ過を実施して、少なくとも1種のファインケミカル、好ましくはオリゴ糖又はアロマ化合物を含む溶液からバイオマスを分離するステップ;
vi. 任意選択で、第1の膜ろ過、好ましくは少なくとも1回の限外ろ過の透過液を用いて、少なくとも1回の第2の膜ろ過又はさらなる膜ろ過を実施するステップ;
vii. 任意選択で、脱色ステップを実施するステップ
viii. このステップviiiに先行する膜ろ過の透過液を用いて、第1の膜ろ過又は第2の膜ろ過又は任意のさらなる膜ろ過の透過液のいずれかを用いて、ナノろ過を実施するステップ;
ix. 任意選択で、脱色ステップ;
x. 任意選択で、前のナノろ過ステップviiiのナノろ過の保持液を用いた第2のナノろ過ステップであり、使用するナノろ過膜は、前のナノろ過ステップにおけるものと異なるものである、第2のナノろ過ステップ;
xi. 任意選択で、前のナノろ過ステップのものと異なる膜を用いた第3のナノろ過又はさらなるナノろ過ステップ;
を含む方法。
2. ステップxiの後に、以下のステップ:
a. 脱色ステップを実施するステップ、並びに/又は
b. 脱塩ステップ、より好ましくは陽イオン交換及び/若しくは陰イオン交換を実施するステップ、並びに/又は
c. 電気透析及び/若しくは逆浸透及び/若しくは濃縮ステップ及び/若しくは脱色ステップを実施するステップ;並びに/又は
d. 擬似移動床クロマトグラフィー、及び/若しくは固体ファインケミカル、好ましくはオリゴ糖若しくはアロマ化合物生成物を作成する凝固ステップ、好ましくは結晶化ステップ及び/若しくはファインケミカル、好ましくはオリゴ糖若しくはアロマ化合物の噴霧乾燥とその後必要に応じて乾燥を実施するステップ
のいずれかによる、前のナノろ過ステップの保持液のさらなる処理が、好ましくはこの順序で行われる実施形態1の方法。
3. 脱塩ステップがステップviii、x及びxiの1回以上のナノろ過の最後の1回の後に実施され、ここで脱塩はイオン交換によって行われ、ここでさらに脱塩ステップのスループットは、ステップviii、x及びxiの1回以上のナノろ過を含まないイオン交換ステップのスループットと比較して、好ましくは少なくとも2倍、より好ましくは2.5、3.0、3.5、4.0、4.25又は4.5倍以上増加される、実施形態2に基づく方法。
4. 1種以上のオリゴ糖、好ましくは1種以上のHMOを含む溶液を脱塩する方法であって、
a. 1種以上のオリゴ糖を含む溶液を用意するステップ;
b. 好ましくは、少なくとも1種のオリゴ糖を含む溶液に少なくとも1種の酸を加えることにより、pHを所望の値の7未満、好ましくはpH5.5未満又はそれ以下に調整するステップ、
c. 好ましくは吸着剤、好ましくは活性炭の添加による好ましい脱色ステップ、
d. 任意選択のインキュベーションステップ、
e. 好ましくは精密ろ過又は限外ろ過である、第1の膜ろ過を実施するステップ
f. 第1の膜ろ過の透過液の第2の膜ろ過ステップ、
g. 好ましくは吸着剤の添加による、第2の膜ろ過の透過液の、任意選択の脱色ステップ、
h. 濃縮のサブステップ及び/又はダイアフィルトレーションのサブステップ、好ましくは濃縮のサブステップ及びダイアフィルトレーションのサブステップ、より好ましくは第1の濃縮のサブステップとそれに続く第2のダイアフィルトレーションのサブステップを含む、第1のナノろ過ステップ
を含む、方法。
5. ステップh)の濃縮サブステップが、濃縮係数が少なくとも3、好ましくは少なくとも3.5～10、より好ましくは10以上となるように行われる、実施形態4に基づく方法。
6. ステップh)のダイアフィルトレーションサブステップが、ダイアフィルトレーション係数が約3となるように行われる、実施形態4又は5に基づく方法。
7. 1種以上のオリゴ糖を含む溶液の脱塩が、脱塩前にナノろ過ステップ(複数可)で処理されなかった、又はステップe及び任意選択でfに基づくナノろ過以外の手段によって脱塩された溶液と比較して、少なくとも150%、より好ましくは少なくとも200%、さらにより好ましくは少なくとも300%改善されている、実施形態4から6のいずれかの方法。
8. ナノろ過膜が、膜のNaCl保持率が5～30%、好ましくは5～20%、より好ましくは5～15%、さらにより好ましくは5～10%である、前の実施形態のいずれかの方法。
9. 溶液のpH値を3.0～5.5の範囲、好ましくは3.5～5の範囲、より好ましくは4.0～4.5の範囲のpH値に低下させる、前述の実施形態のいずれか1つに基づく方法。
10. 前記少なくとも1種の酸が、H2SO4、H3PO4、HCl、HNO3及びCH3CO2Hからなる群から選択される酸である、前述の実施形態のいずれか1つに基づく方法。
11. 前記吸着剤、好ましくは活性炭が、0.5重量%～3重量%の範囲、好ましくは0.75重量%～2.5重量%の範囲、より好ましくは1.0重量%～2.0重量%の範囲の量で加えられる、前述の実施形態のいずれか1つに基づく方法。
12. 前記吸着剤、好ましくは活性炭が、2μm～25μmの範囲、好ましくは3μm～20μmの範囲、より好ましくは3μm～7μm又は10μm～15μmの範囲の直径d50の粒径分布をもつ粉末として加えられる、前述の実施形態のいずれか1つに基づく方法。
13. 前記第1の膜ろ過が、クロスフロー精密ろ過又はクロスフロー限外ろ過として実施される、前述の実施形態のいずれか1つに基づく方法。
14. 前記クロスフロー精密ろ過又はクロスフロー限外ろ過が、0.5m/s～6.0m/sの範囲、好ましくは2.0m/s～5.5m/sの範囲、より好ましくは3.0m/s～4.5m/sの範囲のクロスフロー速度を含む、実施形態13に基づく方法。
15. 前記クロスフロー速度が、3m/s以下であり、好ましくは高分子膜では1.7m/s以下である、実施形態14に基づく方法。
16. 前記第1の膜ろ過が、8℃～55℃の範囲、好ましくは10℃～50℃の範囲、より好ましくは30℃～40℃の範囲の溶液の温度で実施される、前述の実施形態のいずれか1つに基づく方法。
17. 前記第1の膜ろ過が、20nm～800nmの範囲、好ましくは40nm～500nmの範囲、より好ましくは50nm～200nmの範囲の孔径を有するセラミック精密ろ過若しくは限外ろ過膜を用いて実施され、又は前記第1の膜ろ過が、カットオフが10kDa以上、好ましくは50kDa以上の高分子限外ろ過膜、若しくは孔径が100nm以下の高分子精密ろ過膜を用いて実施される、前述の実施形態のいずれか1つに基づく方法。
18. 第1の膜ろ過によって得られたオリゴ糖を含む溶液を用いた第2の膜ろ過、好ましくは第1の膜ろ過の膜よりもカットオフが低い膜を用いた限外ろ過を実施するステップをさらに含む、前述の実施形態のいずれか1つに基づく方法。
19. 前記第2の膜ろ過が限外ろ過であり、カットオフが1kDa～10kDaの範囲、好ましくは2kDa～10kDaの範囲、より好ましくは4kDa～5kDaの範囲の限外ろ過膜を用いて実施される、実施形態18に基づく方法。
20. 前記第2の膜ろ過が、5℃～15℃の範囲、好ましくは8℃～13℃の範囲、より好ましくは8℃～12℃の範囲である溶液の温度で実施される、実施形態18又は19に基づく方法。
21.前記少なくとも1種のオリゴ糖が、ヒト母乳オリゴ糖、好ましくは2'-フコシルラクトース、6′-シアリルラクトース及び/又はラクト-N-テトラオース、より好ましくは2'-フコシルラクトースを含む、前述の実施形態のいずれか1つに基づく方法。
実施形態22:
供給溶液、特に発酵又は酵素的プロセスからの水性媒体に溶解している塩からオリゴ糖及び/又は二糖を分離する方法であって、
i. オリゴ糖及び/又は二糖の保持を確実にし、塩の少なくとも一部を通過させる分子量カットオフを有するナノろ過膜を供給溶液と接触させるステップであり、膜のNaCl保持率は30%未満、好ましくは20%未満である、ステップ、
ii. それに続く任意選択の前記膜を用いたダイアフィルトレーション、並びに
iii. オリゴ糖及び/又は二糖を濃縮した保持液の捕集
を含む、方法。
実施形態23:
膜の上層がポリアミドから構成されている、実施形態22のいずれかに基づく方法。
実施形態24:
ポリアミドナノろ過膜が、薄膜複合(TFC)膜である、実施形態23のいずれかに基づく方法。
実施形態25
膜の純水流量が少なくとも3L/(m2.h.bar)である、実施形態22から24のいずれかに基づく方法。
実施形態26:
ポリアミドナノろ過膜がピペラジン系ポリアミド膜である、実施形態22から25のいずれかに基づく方法。
実施形態27:
活性層が高分子電解質多層である、実施形態22のいずれかに基づく方法。
実施形態28:
前記三糖以上のオリゴ糖が、その構造中に前記二糖を含む、実施形態22から27のいずれかに基づく方法。
実施形態29:
前記二糖がラクトースである、実施形態22から28のいずれかに基づく方法。
実施形態30:
三糖以上のオリゴ糖がヒト母乳オリゴ糖(HMO)、好ましくは三糖から八糖HMOである、実施形態28に基づく方法。
実施形態31:
HMOが中性HMOである、実施形態30に基づく方法。
実施形態32:
中性HMOがフコシル化HMO、好ましくは2'-FL、3-FL、DFL又はLNFP-Iである、実施形態31に基づく方法。
実施形態33:
中性HMOが、非フコシル化HMO、好ましくはラクト-N-トリオースII、LNT、LNnT、pLNnH又はpLNH IIである、実施形態31に基づく方法。
実施形態34:
HMOがシアリル化HMO、好ましくは3'SL又は6'-SLである、実施形態30に基づく方法。
実施形態35:
HMOは、前駆体としてラクトースから発酵によって又は酵素的に生成される、実施形態30から34のいずれかに基づく方法。
[実施例]
本発明に基づく方法を以下にさらに詳細に示す。いずれにせよ、実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
分析方法:
以下の分析方法を実施した。
- 生成物、すなわちヒト母乳オリゴ糖、二糖、単糖、及び第2の成分を測定するためのHPLC
- 乾燥含有量を測定するための乾燥天秤
- 標準方法、例えばDIN EN ISO 6271を用いて色を測定するためのAPHA
- タンパク質の濃度を測定するためのブラッドフォードタンパク質アッセイ。
略語と記号:
以下、次の略語を使用する:
- AC=活性炭
- UF=限外ろ過
- NF=ナノろ過
- DP=モジュールに沿った圧力降下(p供給物-p保持液)
- クロスフロー速度=膜チャンネル内の懸濁液の線速度(m/s)
- 膜負荷=1m2の膜面積によって生成される透過液の量(m3/m2)
さらに、液体分離に関して、以下の記号及び説明を使用する。
Figure 2023528657000001
特定の化合物iの保持率は:
Figure 2023528657000002
 によって計算され、すなわち1から透過液中の成分iの濃度と保持液中の成分iの濃度との比を引いた値である。
混合物をダイアフィルトレーションする場合、成分iの濃度Cは以下の関係に基づいてダイアフィルトレーション係数DFと共に指数関数的に減少し:
Figure 2023528657000003
 Ci 0は、時間0での化合物Iの濃度である。
最初の精製ステップ-脱色、バイオマスの除去及び最初の膜ろ過:
バイオマス及び少なくとも1種のオリゴ糖を含む複合溶液としての発酵ブロスを、標準的な方法によって調製した。そのpH値は、10%硫酸を加えることによって4±0.1まで低下させた。その後、食品安全性がある、活性炭Carbopal Gn-P-F(Donau Carbon GmbH, Gwinnerstrasse 27-33, 60388 Frankfurt am Main, Germany)の30%懸濁液を複合溶液2.5kg当たり約100g以上加え、20分撹拌した。
このようにして調製した溶液は、プロセス装置、Sartorius AG, Otto-Brenner-Str. 20, 37079 Goettingen, Germany製の半自動MFラボユニットに供給し、目的のために改変し、透過液を密閉して37℃に循環加熱した。分離目的で、プロセス装置は、外径10mm、内径6mm、長さ1.2m及びAl2O3製の孔径50nmの膜を有するセラミックモノチャンネルエレメント(Atech Innovations GmbH, Gladbeck, Germany製)を含んでいた。溶液の循環を実施し、溶液が目標温度37℃を有するとすぐに、透過液の排出が開始され、膜間圧の制御を起動させた。
本発明の方法の終了後、プロセス装置を停止し、濃縮液を処理し、プロセス装置を洗浄した。洗浄は、50℃～80℃の温度で0.5%～1%NaOHを用いて実施し、ここでNaOHはその後パージによって除去した。
i) とりわけ2-フコシルラクトース(2-FL)を含有する発酵ブロスを用いて、DF=1の第1のダイアフィルトレーションステップ及びCF=2の濃縮ステップだけを、それぞれ50nm Al2O3膜(Atech Innovations GmbH、Germanyから入手可能)を用いて、温度40℃、膜間圧(TMP)1.2バール及びクロスフロー速度4m/sで行った。次いで第1の膜ろ過を停止し、得られた溶液及び出発溶液の残りを分析し、結果を比較した。
表Aは、pH値及び活性炭に応じて分析結果を示す。DCは、乾燥含量の略語である。ODは、光学密度である。
Figure 2023528657000004
以下の結果は、表Aから導き出すことができる:
発酵ブロスに1%活性炭を加えると、透過液の色値が低下する。pH値7で、1％の活性炭は色値を約65％低下させる。pH値4で、1％の活性炭は色値を約84％低下させる。したがって、色値は1000の上限を下回っており、さらなる脱色の必要はない。pH値7で活性炭を加えると、透過液内のタンパク質の濃度が約40％低下するが、この点に関して活性炭を加えることによる効果は、タンパク質濃度へのpHの効果に対してpH値4では得られない。それにもかかわらず、pH値4で1％活性炭を加えた場合の透過液内のタンパク質の濃度は、pH値7で1％活性炭を加えた場合の透過液内のタンパク質の濃度と比較して4分の1になる。活性炭を加えることは、両方のpH値で透過液内のオリゴ糖3.2-Di-フコシルラクトース(3.2-Di-Fl)、2’フコシルラクツロース(2F-ラクツロース)及び2’フコシルラクトース(2FL)の濃度への影響が極めて少ない。したがって、これらの成分は、かなりの量で活性炭に付着しないと推論することができる。この実験で二糖ラクトースは、活性炭を使用した場合に濃度が少し低下することを示すが、低下したｐＨ及び活性炭の有益な効果により、この二糖に本発明の方法の適用が可能になる。
ii) 標準方法で生成した、6′-シアリルラクトース又はラクト-N-テトラオースを含む発酵ブロスのいくつかのバッチに、本発明の方法を施した。pH値の低下及び吸着剤を用いた脱色が最初のステップであった。
最初に、ステップS10からS18を行った。ラクト-N-テトラオースを含む発酵ブロスは、高濃度の色成分から始まって発酵ブロス中のAPHA値が7000以上になり、50nm Al2O3膜(Atech Innovations GmbH、Germanyから入手可能)を用いて温度40℃、膜間圧(TMP)1.2バール及びクロスフロー速度4m/sで、第1の膜ろ過後にAPHA値が1000未満の透過液を生成したが、通常は300未満である。タンパク質濃度は、通常約3g/lから0.01g/l未満に低下させた。もとは発酵ブロスで見られた、大量の、通常95%超のラクト-N-テトラオースは、組み合わせた透過液中に存在していた。同様に、存在する他のオリゴ糖、また二糖ラクトースの場合、ほとんどが組み合わせた透過液に存在し、第1の膜ろ過の最後に保持液に少量しか見られなかった。適用したDF値は、3.5以下であった。6-SL及びLNTの場合、最初にダイアフィルトレーション係数3の設定、続いて濃縮係数2の設定が有用であることが判明した。
また、APHA値が約7000の6'-シアリルラクトースを含む発酵ブロスは、前記第1の膜ろ過後にAPHA値が300未満ほど低い透過液をもたらした。タンパク質濃度は、3未満のDF値で、発酵ブロスの開始値と比較して少なくとも10分の1以上、さらに100分の1以上に低下した。もとは発酵ブロスで見られた、大量の、通常90%超の6'-シアリルラクトースは、組み合わせた透過液中に存在していた。同様に、存在する他のオリゴ糖、また二糖ラクトースの場合、ほとんどが組み合わせた透過液に存在し、第1の膜ろ過の最後に保持液に少量しか見られなかった。
方法を5.5未満のpHで行うと、より高いpH値と比較して第1の膜ろ過で流量が改善されたことも判明した(クロスフロー速度3.5m/s、温度30℃;DF=3)。これは、バイオマス及び6’-シアリルラクトースを含む溶液のpH値がpH4.2の場合にさらにもっと改善された。pH6.3と比較して、流量は、pH5.2を使用した場合に2倍以上になり、pH値がpH4.2の場合に3倍になった。
組み合わせた第1の膜ろ過の透過液を第2の膜ろ過としての限外ろ過にかけた。
6'SL及びLNTの両方に関して、MICRODYN-NADIR GmbH、Kasteler Strasse 45、Gebaude D512、65203 Wiesbaden/Germanyの4kDa PES高分子膜(50nm)UH004は、高性能で膜汚れがほとんどない良好な性能を示した。6'SLの場合、発酵ブロスのpHを、10～20%硫酸又はリン酸でpH4に設定し、1.4%(w/w)活性炭を混合し、第1の膜ろ過を30～37℃、速度3.5m/s:DF1=3～3,5、続いてCF=2で行い、この第1の膜ろ過で収率≧95%であった。次いで第2の膜ろ過として限外ろ過を4kDa PES膜で8～12℃及び10バール、クロスフロー速度1.5m/s、CF1>10(最大20)、続いてDF≧3で行い;全収率は95%であった。
LNTの場合、発酵ブロスのpHを、10～20%硫酸又はリン酸でpH4に設定し、1.0%(w/w)活性炭を混合し、50分間撹拌し、第1の膜ろ過は、Al2O3膜(50nm)膜を用いて行い、30～37℃で3.5 m/s及びDFが3、続いてCFが2で実施し;収率は>97%であった。以下の第2の膜ろ過は、8～12℃及び10バールでの6'SLの場合と同様の限外ろ過であり、濃縮係数が最大80とそれに続いてDF=3であり;全収率は99%超であった。
得られた透過液は、第1のナノろ過で使用する前に冷蔵保存し、又は長期間保存する場合には第1のナノろ過の前に冷凍解凍及び撹拌した。
ナノろ過:
いくつかのナノろ過膜を異なるオリゴ糖を用いて試験した。
Figure 2023528657000005
試験した膜のほとんどは、オリゴ糖の非常に良好な保持を示し、多くの場合、ラクトースも同様であった。しかしながら、試験は、膜の一部が塩及びリン酸などの他のイオンを通過させるのにあまり適していないことも示した。UA60又はXN45又はAS3014など他のものは、リン酸などのイオンからのオリゴ糖の分離が達成できることを示す有望な結果を示した。オリゴ糖及び設定に応じて、8%未満、27%未満又は52%未満のリン酸が、それぞれ保持液中に見られた。
TS80膜はLNTの非常に高い保持率を示す。発酵ブロスの用意から開始して第2の膜ろ過としての限外ろ過の透過液を用いたナノろ過と同じ設定を使用する実験では、中性HMO 2'-フコシルラクトースを生成する細菌株からの発酵ブロスを使用するが、TS80膜は、より小さい2'-FL分子で保持値>99%を示した。しかしながら、TS80は、同様にリン酸の強い保持も示した。
中空繊維dNF 40(上の表に示さず)を6'SLのみで試験し、このHMOの保持率が99.1%であることを示したが、この試験ではリン酸の62.6%しか保持されなかった。
渦巻形エレメント:
ナノろ過膜の渦巻形エレメントは、例えば平坦シート膜を使用した実験よりも大規模なプロセスへの拡張性を向上させる。
実験は、渦巻形エレメントを用いたクロスフロー設定で実行した(表2参照)。002及び003と呼ばれる最初の2つの実験は、CFが10で濃縮するのにUA60膜を使用し、実験003の場合にDFが2.9でダイアフィルトレーションに使用した。洗浄は、透過液が除去されるのと同じ量の脱イオン水を保持液に連続的に加えたことを示す。実験006及び007は、実験002及び003と同様に行ったが、より低い濃縮係数における膜の性能を確認するためであった。
Figure 2023528657000006
表3は、ナノろ過ステップによる精製の概要を示す。これらのパラメーターは他の濃度又はダイアフィルトレーション係数のために調整することができるので、精製は、LNT、ラクトース及びリン酸の生成物保持に関して示されている(HPLC分析)。
Figure 2023528657000007
表3に見られるように、LNTに対するUA60膜の保持率は一般的に高い(透過液に基づいて、全てのデータで>98.5%が測定され、多くの場合>99%が測定された)。同時に、75～95%のラクトース保持率が記録され、洗浄によりラクトース保持率が低下した。正確な値は、この試験で適用した条件に応じて異なった。リン酸の場合、15～25%の範囲の非常に低い保持率が測定された。これらのデータは、同様の値が記録された試験セルでの測定値に対応する。
これらの実験の供給物と比較した実験の最終保持液の収率の概要は以下のとおりであった:
実験から、UA60膜を用いると保持液中のLNTの収率が良好であることがわかった。保持液中のラクトース収率は、ほぼ同じくらい高かったが、リン酸塩は、透過液で大部分が除去された。濃縮及びダイアフィルトレーションモードを使用した場合、LNTの全収率は同様に良好であったが、対照的にラクトース収率ははるかに低かった。したがって、ナノろ過の設定を選択することによって、LNT及びラクトースの両方が保持されるかどうか、又はHMOが好ましくは保持され、LNTと比較してラクトースが減少するかどうかを導くことができる。リン酸塩は、このタイプのナノろ過でさらによく除去され、保持液には非常に少量しか見られなかった。
実験002及び003を、ナノろ過ステップ後の脱塩に選択した。
平坦シート膜を使用した6'-SLの試験:
異なるpHのUF透過液を用いて3つの試験セル実験を行った。全ての実験は、DF=3でダイアフィルトレーションを実行し、続いてCF=10で濃縮ステップを実行した。この順序は完全には最適化されていないが、ナノろ過を使用して塩と潜在的に小さな分子を除去する可能性を示しているはずである。より高いダイアフィルトレーション係数を適用した場合により高い除去率に達する可能性がある。
表4は、結果の概要を示している。供給物のpHと無関係に、全ての実験で酢酸を検出限界未満まで除去することに成功した。保持液中の6SLに対するリン酸塩レベルは測定した全てのpH値で劇的に低下し、同様にpH5.56で重要な保持液中のリン酸塩の絶対的な減少があった。
下流の結晶化又はSMBステップを大幅に容易にできるため、最も興味深い除去のうちの1つは、ラクトースの除去であった。pHが4.4及び5.56の実験では、ラクトースの約半分が、プロセスを実行する現在の方法で除去された。より高いダイアフィルトレーション係数を使用すると、さらにいくらかのラクトースが除去できることを期待することができる。pHが6.25では、驚くほど大量のラクトースが除去された。ここで、ダイアフィルトレーション後のラクトースと6'-SLとの比は0.30であり、濃縮ステップ後にわずか0.16に変わり、ラクトースが強力に除去された。さらに、より高いダイアフィルトレーション係数を実装した場合、さらに少ない量のラクトースを得ることができる。したがって、必要に応じてS10からS22のプロセスを使用して、発酵におけるその役割のために存在するラクトースの量を減らしながら、HMOを精製する。
Figure 2023528657000008
6'SLを含む発酵ブロスと、そのステップS10からS18によって調製した溶液を使用し、TMP 28～30バールで最大12.6のCFを用いて、それに続いて2.25のDFで、再びTMP 28～30バールでナノろ過を使用するクロスフローナノろ過実験を行った。結果から、濃縮を伴うステップS22のナノろ過とそれに続くダイアフィルトレーションステップでは、濃度168g/lの6'SLが達成されたが、塩化物、硫酸塩、一価リン酸及びリン酸塩などのイオンは全て最終保持液中で0.002wt%未満であることが実証された。これは、もはや脱塩ステップを必要としない、6'SL及び他のシアリル化HMO及び他のHMOの精製と濃縮を可能にする改善されたプロセスとしての、ステップS10からS22を含む方法の可能性を実証している。ラクトースは、必要に応じてこのプロセスによって保持することもでき、最終保持液中のラクトースレベルは、g/lで6'Slレベルの約半分であった。
以下の表Bの実験AからDでは、とりわけ2-フコシルラクトース(2-FL)を含有する発酵ブロスを使用した。最初に、バイオマスをブロスから除去し、次いで、それを所与のpHに設定し、実験A及びDの場合には活性炭(AC)で処理した。続いて、カットオフが0.4kDaのナノろ過膜AMS AS-3014(AMS Technologies Ltd., Israelから入手可能)を使用してブロスを濃縮に施した。実験Cの場合には、実験Aで得られた濃縮物は、前記膜を使用してダイアフィルトレーションした。
Figure 2023528657000009
ナノろ過に使用される供給物及びナノろ過から得られる濃縮物において、以下の表Cに見られるように、いくつかの成分の濃度をHPLCによって分析した:
Figure 2023528657000010
2-FLとリン酸、ギ酸又は酢酸との比がそれぞれ増加していることから明らかなように、濃縮又はダイアフィルトレーションの後、ナノろ過により一致した脱プロトン化した酸が除去され、発酵ブロスの効果的な脱塩が確認された。
イオン交換実験:
実験用カラム(内径20mm)での脱塩実験
脱塩手順の初期検査では、2つの二重ジャケット付きガラスカラム(内径20mm、高さ1000mm)を設置し、それぞれにDowex Monosphere 88 H約0.28L及びDowex Monosphere 77 0.24Lを詰めた。
脱塩実験は、表5に示した条件を使用して実施し、陰イオン交換の前に陽イオン交換を行った。前すすぎ、充填、生成物置換及び後すすぎステップを実施し、カラムは直列で最初に陽イオン交換体、次いで陰イオン交換体を接続した。供給物及び流出溶液のためのカラム及び容器を約10℃に冷却した。再生及びその後すすぎを、カラム毎に個々に向流モードで実施した。最初に使用する前に樹脂を再生させて、それらが完全に再生された状態であることを確認した。
実験の間、画分を捕集し、分析して、プロセスをモニターした。
Figure 2023528657000011
LNT試料の脱塩:
Dowex Monosphere 88 H及びDowex Monosphere 77は、以前オリゴ糖に使用されていたので、これらを選択した。これらの特性を表6に示す。供給業者は最近これらの商品の名前を変更し、これらは現在それぞれAmberLite FPC88 UPS H及びAmberLite FPA77 UPSとして販売されている。
Figure 2023528657000012
UF透過液(すなわち第2の膜ろ過ステップS18の透過液)の試料及びUF透過液をナノろ過(ステップS22)の2つの異なる方法で処理することによって得られたNF保持液の試料を分析した。
実験002及び003(上記参照)からの最終保持液をイオン交換実験に使用した。
脱塩実験の結果を表7にまとめて示す。表に見られるように、生成物に対する塩の量はナノろ過でかなり減少し、追加の洗浄によりさらにもっと減少させることができた。
Figure 2023528657000013
対照試料(第2の膜ろ過としての限外ろ過後にナノろ過処理をしない)を供給物として使用した。流出液中の導電率が50μS/cmに達するまで、陽イオン交換体に対して0.8BV/hの流速でイオン交換カラムに供給物を充填した。これは約18BV後に起こったが、16BV後に既に色のブレークスルーが観察された。プロセスの間中の流出液の導電率は約15μS/cmであり、イオンの小さな漏れを示した。したがって、塩の漏れにより、少量の水酸化物イオンが陰イオン交換体から置換されるため、流出液のpHはわずかにアルカリ性であった。この漏れの理由は明らかになっていないが、混合物中の他の成分が一部のイオンと錯体を形成できる可能性がある。陰イオン交換体は充填中に約5%膨潤すること、陽イオン交換体は数パーセント収縮することが観察された。
それらの再生後に対照試料と同じカラムを使用して、洗浄したNF保持液(上の実験003から)を流速0.8BV/hで脱塩した。この実験では、実験003からの溶液の所定量の供給物をカラムに通した、10BV。
LNTの溶出は、対照試料よりも早く完了した。
対照試料に関しては、色のブレークスルーがやや早く、6.2BV後にもたらされ、以前の対照試料のように、ここでも実行中にイオンの小さな漏れが観察された。また、この場合、陰イオン交換体は、充填中に約5%膨潤すること、陽イオン交換体は数パーセント収縮することが観察された。
各脱塩実験の無色画分を実験毎に組み合わせた。対照試料の組み合わせた画分及び実験003からのナノろ過した試料の組み合わせた画分を次いで分析した。結果(表8参照)から、ナノろ過と洗浄による前処理によって、ファインケミカルLNTに比べてイオンの残留レベルが低くなったことがわかった。
Figure 2023528657000014
塩の量を減らしたNF保持液を脱塩ステップで使用した場合、スループットがはるかに高くなり、1サイクル当たりのLNTが167%増え、サイクル時間がほぼ60%短縮され、すなわち全体で約350%改善されたことが観察された。したがって、試料の洗浄を含むナノろ過のステップを使用した場合、第2の膜ろ過としての限外ろ過後にナノろ過を少しも受けていない対照試料の脱塩のスループットと比較して、脱塩ステップの所望のファインケミカルのスループットが約4.5倍改善された。実験に示すとおり、脱塩の効率も損なわれず、NF処理をしない対照試料と比較して、洗浄したNF保持液を脱塩した場合、ファインケミカルLNTに比べて少ない残留イオンが得られた。
濃縮ステップ単独(実験002)ではイオン濃度が大きく変わらず;しかしながら、LNT濃度が8.3倍に増加したため、LNTに対するイオンの相対濃度が大幅に減少したことが観察された(表7参照)。実験003の場合、追加のダイアフィルトレーションステップにより、イオン濃度、特に一価K+及びH2PO4 -の濃度が大幅に減少する。二価SO4 2-イオンは減少がより一層少なく、二価M2+は少ししか減少しない。
実証されているように、イオン交換前のナノろ過は、溶液からほぼ全てのリン酸とラクトースの一部を除去するのに使用でき、或いはイオンを好ましくは除去するがラクトース又はLNTは除去しない。さらに、濃縮ステップの終わりの流速から判断すると、ブロスは、少なくとも10倍、おそらくそれ以上に濃縮することができる。現在使用されている濃縮係数10とその後のダイアフィルトレーション係数3は、ラクトースの約65%とリン酸の>95%の除去を可能にする。より高いダイアフィルトレーション係数を使用すると、ラクトースのより高い除去率が当業者にとって達成可能である。
脱塩実験の結果のまとめ:
脱塩前にNFを実施することには、いくつかの利点があることがわかっている:
イオン交換中のスループットが著しく高くなり、最大350%高い
必要に応じて、ナノろ過中にラクトースを部分的に除去でき、それは生成物LNTの精製の改善も実証した
ナノろ過を使用した場合、生成物に比べて脱塩後の残留塩が少ないことがわかった
全体として、脱色、バイオマス除去、ナノろ過による精製及びイオン交換を組み合わせる本発明の方法は、いくつかのファインケミカル生成物、例えば異なるタイプのHMOの迅速な回収を果たしながら、資源と設備に関して非常に効率的であることが証明された。
引用文献
- WO 2015/032412
- EP 2 379 708
- CN 100 549 019 & CN 101 003 823
- WO 2017/205705
- EP 2 896 628
- US 9 944 965
- WO 2019/003133
- WO2015106943

Claims (17)

1種以上のファインケミカル、好ましくは1種以上のオリゴ糖、より好ましくは1種以上のHMOを含む溶液を脱塩する方法であって、
a. 1種以上のオリゴ糖を含む溶液を用意するステップ、
b. 任意選択で、少なくとも1種のオリゴ糖を含む溶液に少なくとも1種の酸を加えることにより、pHを所望の値の7未満、好ましくはpH5.5未満又はそれ以下に調整するステップ、
c. 好ましくは吸着剤、好ましくは活性炭の添加による、任意選択の脱色ステップ、
d. 任意選択のインキュベーションステップ、
e. 好ましくは精密ろ過又は限外ろ過である、第1の膜ろ過を実施するステップ
f. 第1の膜ろ過の透過液の第2の膜ろ過ステップ、
g. 好ましくは吸着剤の添加による、第2の膜ろ過の透過液の、任意選択の脱色ステップ、
h. 濃縮のサブステップ及び/又はダイアフィルトレーションのサブステップを含む、第1のナノろ過ステップ
を含む、方法。
ステップb)及びc)が行われる、請求項1に記載の方法。
陽イオン交換又は陰イオン交換が実施されない、請求項1又は2に記載の方法。
ステップh)において、濃縮のサブステップ及びダイアフィルトレーションのサブステップ、好ましくは第1の濃縮のサブステップとそれに続く第2のダイアフィルトレーションのサブステップが実施される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
濃縮係数が少なくとも3、好ましくは少なくとも3.5～10、より好ましくは10以上となるようにステップh)の濃縮サブステップが行われる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
ダイアフィルトレーション係数が2.5～3.5、好ましくは2.8～3.2となるようにステップh)のダイアフィルトレーションサブステップが行われる、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
ナノろ過膜のNaCl保持率が5～30%である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
バイオマス及び1種以上のオリゴ糖を含む溶液から1種以上のファインケミカル、好ましくは1種以上のオリゴ糖を精製する方法であって、
i. バイオマス及び1種以上のオリゴ糖を含む溶液を用意するステップ、
ii. バイオマス及び少なくとも1種のオリゴ糖を含む溶液に少なくとも1種の酸を加えることにより、溶液のpH値を7未満、好ましくはpH5.5未満又はそれ以下に設定するステップ、
iii. バイオマス及び1種以上のオリゴ糖を含む溶液に吸着剤を加えることにより、溶液を少なくとも部分的に脱色するステップ、
iv. 任意選択で、インキュベーションステップ、
v. 本明細書で第1の膜ろ過とも呼ばれ、通常は精密ろ過又は限外ろ過である膜ろ過を実施して、1種以上のオリゴ糖を含む溶液からバイオマスを分離するステップ;
vi. 任意選択で、第1の膜ろ過、好ましくは少なくとも1回の限外ろ過の透過液を用いて、少なくとも1回の第2の膜ろ過又はさらなる膜ろ過を実施するステップ;
vii. 任意選択で、脱色ステップを実施するステップ;
viii. このステップviiiに先行する膜ろ過の透過液を用いて、第1の膜ろ過又は第2の膜ろ過又は任意のさらなる膜ろ過の透過液のいずれかを用いて、ナノろ過を実施するステップ;
ix. 任意選択で、脱色ステップ;
x. 任意選択で、前のナノろ過ステップviiiのナノろ過の保持液を用いた第2のナノろ過ステップであり、使用するナノろ過膜は、前のナノろ過ステップにおけるものと異なるものである、第2のナノろ過ステップ;
xi. 任意選択で、前のナノろ過ステップのものと異なる膜を用いた第3のナノろ過又はさらなるナノろ過ステップ;
を含む方法。
ステップxiの後に、以下のステップ:
a. 脱色ステップを実施するステップ、並びに/又は
b. 脱塩ステップ、より好ましくは陽イオン交換及び/若しくは陰イオン交換を実施するステップ、並びに/又は
c. 電気透析及び/若しくは逆浸透及び/若しくは濃縮ステップ及び/若しくは脱色ステップを実施するステップ;並びに/又は
d. 擬似移動床クロマトグラフィー、及び/若しくは固体オリゴ糖生成物を作成する凝固ステップ、好ましくは結晶化ステップ及び/若しくはオリゴ糖の噴霧乾燥とその後必要に応じて乾燥を実施するステップ
のいずれかによる、前のナノろ過ステップの保持液のさらなる処理が、好ましくはこの順序で行われる、請求項8に記載の方法。
脱塩ステップが、ステップviii、x及びxiの1回以上のナノろ過の最後の1回の後に行われ、脱塩がイオン交換によって行われ、さらに脱塩ステップのスループットが、それに先行するステップviii、x及びxiの1回以上のナノろ過を含まない同一のイオン交換ステップのスループットと比較して、好ましくは少なくとも2倍、より好ましくは2.5、3.0、3.5、4.0、4.25又は4.5倍以上増加される、請求項9に記載の方法。
溶液のpH値を3.0～5.5の範囲、好ましくは3.5～5の範囲、より好ましくは4.0～4.5の範囲のpH値に低下させる、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
前記吸着剤、好ましくは活性炭が、0.5重量%～3重量%の範囲、好ましくは0.75重量%～2.5重量%の範囲、より好ましくは1.0重量%～2.0重量%の範囲の量で加えられる、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
前記第1の膜ろ過が、クロスフロー精密ろ過又はクロスフロー限外ろ過として実施される、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
前記第1の膜ろ過が8℃～55℃の範囲、好ましくは10℃～50℃の範囲、より好ましくは30℃～40℃の範囲の溶液の温度で実施される、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
第1の膜ろ過によって得られたオリゴ糖を含む溶液を用いた第2の膜ろ過、好ましくは第1の膜ろ過の膜よりもカットオフが低い膜を用いた限外ろ過を実施するステップをさらに含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
前記第2の膜ろ過が、5℃～15℃の範囲、好ましくは8℃～13℃の範囲、より好ましくは8℃～12℃の範囲である溶液の温度で実施される、請求項14又は15のいずれか一項に記載の方法。
前記少なくとも1種のオリゴ糖が、ヒト母乳オリゴ糖、好ましくは2'-フコシルラクトース、6'-シアリルラクトース及び/又はラクト-N-テトラオース、より好ましくは2'-フコシルラクトースを含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
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