CN109414447A - 包括hmo的组合物、其制备和用于预防和/或治疗病毒和/或细菌感染的用途 - Google Patents
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Abstract
人乳寡糖混合物包含以下组分或者基本上由其组成：a)LNTri II、LNT、pLNH II和任选的乳糖，或者b)LNTri II、LNnT、pLNnH和任选的乳糖，其可用于预防或治疗病毒或细菌性的肠道和呼吸道感染，并用于调节人胃肠道微生物群，以增加双歧杆菌丰度。还描述了混合物的制备方法和使LNnT和LNT结晶的方法。
Description
发明领域
本发明涉及人乳寡糖(HMO)的三元混合物，具体地，涉及a)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(即，乳糖-N-丙糖II或LNTri II)；b)组分A，其为Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(即，乳糖-N-新四糖或LNnT)或Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(即，乳糖-N-四糖或LNT)；和c)组分B，当组分A是LNnT时组分B是Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(即，对-乳糖-N-新六糖或pLNnH)，或者组分B是Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(即，对-乳糖-N-六糖II或pLNH II)；和任选的Galβ1-4Glc(乳糖)的混合物。本发明还涉及三元混合物的制造方法以及三元混合物在人健康中的应用。
背景技术
HMO由于其在人有机体中发生的许多种生物过程中的作用，近年来成为极大受关注的对象。哺乳动物的奶含有至少130种这些复杂寡糖(Urashima等人:MilkOligosaccharides,Nova Biomedical Books,New York,2011,ISBN:978-1-61122-831-1)。
之前，HMO的唯一来源是哺乳动物的奶，其主要含有水，连同55-70g/l乳糖、24-59g/l脂类、大约13g/l蛋白质、5-15g/l HMO和大约1.5g/l矿物质。
但是，最近十年来，由于HMO在许多种人生物过程中的作用，开发HMO合成方法的努力显著增加。在这一方面，已经开发了通过生物发酵、酶方法、化学合成或这些技术的组合制造HMO的方法。例如，通过化学方法，可以制造LNnT，如WO 2011/100980和WO 2013/044928中所述，可以合成LNT，如WO 2012/155916和WO 2013/044928中所述，可以制造LNT和LNnT的混合物，如WO 2013/091660中所述，可以制造2'-FL，如WO 2010/115934和WO 2010/115935中所述，可以制造3-FL，如WO 2013/139344中所述，可以制造6'-SL及其盐，如WO 2010/100979中所述。作为生物技术方法的例子，WO 01/04341和WO 2007/101862描述了如何使用基因修饰的大肠杆菌(E.coli)制造任选地用岩藻糖或唾液酸取代的核心人乳寡糖。作为酶方法的例子，可以如EP-A-577580中所述制造唾液酸化寡糖。
另外已经努力开发在无需合成混合物所有组分HMO的情况下酶法合成HMO混合物的方法，如WO 2012/156897和WO 2012/156898中所述。这些方法提供了含有多种不同HMO的反应混合物。
另外已经寻求非酶促方法用于合成HMO混合物。在这一方面，WO 01/04341描述了用于制造HMO混合物的微生物方法。该方法涉及：i)将大肠杆菌用编码β1,3-Ν-乙酰基葡糖胺基转移酶和β1,4-半乳糖基转移酶的外源基因转化；ii)将大肠杆菌细胞在含水培养基或含有甘油和乳糖的发酵培养基中培养或发酵；和然后iii)通过热处理将细胞透化，以释放其HMO内容物。细胞内容物显然含有以下两种HMO：LNnT和p-LNnH，以及对-乳糖-N-新八糖(p-LNnO)和对-乳糖-N-新十糖(p-LNnD)，其通过生物凝胶色谱彼此分离。
WO 2015/049331描述了将具有离子交换树脂的连续模式模拟移动床色谱应用于将通过细菌发酵制造的中性HMO LNT与其他寡糖组分分离。
但是，已经寻求另外可选的用于制造包括LNT或LNnT的HMO混合物的微生物方法，其中大肠杆菌将会从细胞向外将HMO混合物分泌至培养基中，而无需对细胞进行透化。因此，随后可以容易地将HMO混合物与培养基分离，HMO混合物的污染最小，特别是来自细胞蛋白质和细胞DNA的污染。
而且，已经寻求另外可选的用于制造包括LNT或LNnT并且优选还有LNTri II的不同HMO混合物的微生物方法，上述混合物具体是相对于混合物中其他HMO的量含有主要量的LNT或LNnT的混合物。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种HMO的合成混合物，其包括，或者优选地基本上由以下组成：a)LNT、pLNH II、LNTri II和任选的乳糖；或者b)LNnT、pLNnH、LNTri II和任选的乳糖。有利地，无论哪种情况，HMO混合物含有相对于混合物中的其他HMO和乳糖为主要量的LNT或LNnT。更有利地，第一HMO混合物具有以下重量比：
a)乳糖、LNTri II和pLNH II相对于LNT为：
乳糖:LNT为不大于0.6，LNTri II:LNT为不大于0.2，pLNH II:LNT为不大于0.05；或者
b)乳糖、LNTri II和pLNnH相对于LNnT为：
乳糖:LNnT为不大于0.8，LNTri II:LNnT为不大于0.1，并且pLNnH:LNnT为不大于0.4。
本发明第二方面涉及制造本发明第一方面的合成HMO混合物的方法，其包括以下步骤：
a)提供基因改造的细胞，优选细菌细胞，更有利地为大肠杆菌(E.coli)细胞，其包括：
-第一重组基因，其编码β1,3-N-乙酰基-葡糖胺基转移酶，其能够在细胞中将来自UDP-GlcNAc的GlcNAc转移到乳糖，从而在细胞中形成LNTri II，和
-第二重组基因，其编码β1,3-或β1,4-半乳糖基转移酶，其能够将来自UDP-Gal的半乳糖基残基转移到LNTri II，以分别在细胞中形成LNT或LNnT，
b)将细胞在含有乳糖的培养基中培养，从而诱导：
-乳糖内化到细胞中，优选地经由主动转运机制，和
-在细胞中形成LNT、pLNH II和LNTri II，或者LNnT、pLNnH和LNTri II，然后
c)任选地，继续根据步骤b)培养，直至没有乳糖剩余，和
d)将LNT、pLNH II、LNTri II和任选的乳糖的混合物，或者LNnT、pLNnH、LNTri II和任选的乳糖的混合物从培养基中分离并隔绝。
有利地，基因改造的细胞具有LacY+基因型，优选LacZ-、LacY+基因型，特别是LacZ-、LacY+、LacI-基因型。另外有利地，步骤c)过程中细胞是完整的。在步骤c)的一实施方式中，无论哪种情况，通过延长发酵，直至步骤a)中提供的细胞将步骤b)中加入的所有乳糖均转化成LNT、pLNH II和LNTri II，或者LNnT、pLNnH和LNTri II，实现乳糖的全部消耗。在步骤c)的其他实施方式中，过量的乳糖通过外源加入的半乳糖苷酶，或者通过步骤a)中提供的细胞表达的半乳糖苷酶被酶水解。
本发明第三方面提供一种结晶方法，该方法：
a)使用一种或多种单羟基C1-C4醇作为抗溶剂使LNT结晶，其中结晶从包括LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖的混合物进行，其中乳糖、LNTri II和pLNH II相对于LNT的重量比为：
乳糖:LNT＝0-0.2，LNTri II:LNT不大于0.15，并且pLNH II:LNT不大于0.05；或者
b)使用一种或多种单羟基C1-C4醇和/或丙酮作为抗溶剂使LNnT结晶，其中结晶从包括LNnT、LNTri II、pLNnH和任选的乳糖的混合物进行，其中乳糖、LNTri II和pLNnH相对于LNnT的重量比为：
乳糖:LNnT＝0-0.2，LNTri II:LNnT不大于0.1，并且pLNnH:LNnT不大于0.03。
本发明第四方面涉及一种抗感染组合物，其用于预防和/或治疗人体内的病毒和/或细菌感染，其包括LNT、pLNH II和LNTri II，或者LNnT、pLNnH和LNTri II，有利地为根据本发明第一方面的合成HMO混合物。该组合物包含具有新的特性和生物活性组合的多种不同HMO。该组合物具体地可用于通过调节胃肠道微生物群、调节细菌和病毒的肠结合以及提高肠道屏障功能和免疫功能来针对病毒和细菌的肠道感染。在这一方面，组合物增加人体内胃肠道微生物群的双歧杆菌(Bifidobacterium)丰度。组合物也可通过抑制病原体定殖而特别有用于抗病毒和细菌的呼吸道感染，以保护宿主不受感染和/或调解免疫系统。
本发明第五方面涉及一种调节人的胃肠道微生物群以增加双歧杆菌丰度的方法。该方法包括对人施用LNT、pLNH II和LNTri II，或者LNnT、pLNnH和LNTri II，有利地为本发明第一方面的合成HMO混合物。
本发明第六方面涉及一种预防和/或治疗人体内病毒和/或细菌感染、特别是肠道感染和呼吸道感染的方法。该方法包括对人施用LNT、pLNH II和LNTri II，或者LNnT、pLNnH和LNTri II，有利地为本发明第一方面的合成HMO混合物。
具体实施方式
根据本发明，已经出人意料地发现，LNT、pLNH II和LNTri II或者LNnT、pLNnH和LNTri II以及任选的乳糖的合成混合物可以提供用于治疗和/或预防人肠道和呼吸道的病毒和/或细菌感染的抗感染组合物。该组合物通过特异性地调节肠道中的微生物群发挥作用。在这一方面，混合物增加了微生物群的双歧杆菌丰度，还可以降低厚壁菌门(Firmicutes)特别是梭状芽胞杆菌(Clostridia)丰度。该混合物还通过刺激宿主防御包括调节免疫系统来抑制一系列呼吸道病原体的定殖。
此外，已经出人意料地发现，LNT、pLNH II和LNTri II或者LNnT、pLNnH和LNTri II以及任选的乳糖的混合物可以有利地用于LNT或LNnT从相应混合物中的选择性结晶。通过排除昂贵、繁琐的分离技术例如现有技术中提出的适合于将碳水化合物组分彼此分离的生物凝胶色谱和模拟流动床色谱，可以有利于并简化从培养肉汤中分离出LNT或LNnT的过程。相反地，足以分离出LNT、pLNH II和LNTri II或者LNnT、pLNnH和LNTri II以及任选的乳糖的混合物，通过选择性结晶可以很容易由其分别获得LNT或LNnT。
术语“合成混合物”或“合成组合物”是指人工制备的混合物或组合物，其优选地是指含有至少一种以化学和/或生物方式例如通过化学反应、酶反应或重组地离体制造的化合物的混合物或组合物。在这一方面，“合成的”与“天然的”相反，是指本发明的合成混合物或组合物与天然组合物或混合物例如人乳不相同，或者混合物或组合物的至少一种HMO并非来源于天然来源例如人乳。
本发明第一方面
本发明的混合物是一种HMO混合物，其包括，优选地基本上由以下组成：
-GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(LNTri II)，
-组分A，其为Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(LNT)或Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(LNnT)，
-组分B，其为：
当组分A是LNT时，Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(pLNH II)，或者
当组分A是LNnT时，Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(pLNnH)，
-和任选的乳糖。
在本发明背景中，术语“任选地”是指乳糖存在于或不存在于混合物中。在这一方面，在一实施方式中，本发明的混合物可以是包括LNT、pLNH II、LNTri II和乳糖、优选地基本上由其组成的混合物，在另一实施方式中，可以是包括LNnT、pLNnH、LNTri II和乳糖、优选地基本上由其组成的混合物。而且，本发明的混合物可以是包括LNT、pLNH II和LNTriII、优选地基本上由其组成的混合物，或者是包括LNnT、pLNnH和LNTri II、优选地基本上由其组成的混合物。无论在哪种情况下，本发明的各个混合物优选地含有主要量的LNT或LNnT，其分别相对于混合物中的pLNH II和LNTri II或者pLNnH和LNTri II以及任意的乳糖中每一种，更优选地是分别相对于混合物中pLNH II、LNTri II和任意的乳糖或者pLNnH、LNTri II和任意的乳糖的总量。在包括LNnT的混合物的情形中，另外优选地，混合物基本上不含有p-LNnO或p-LNnD。无论在哪种情形中，术语“主要”是指本发明的混合物中LNT或LNnT按重量计的量分别大于pLNH II和LNTri II或者pLNnH和LNTri II中每一种和任意的乳糖的量，使得比起混合物中pLNH II和LNTri II和任意的乳糖中的每一种的量，或者混合物中pLNH II和LNTri II和任意的乳糖中的每一种的合并的量，LNT的量要大至少约2.5倍，或者大至少约5倍，或者大至少约10倍，或者，比起混合物中pLNnH和LNTri II和任意的乳糖中的每一种的量，或者混合物中pLNnH和LNTri II和任意的乳糖中的每一种的合并的量，LNnT的量要大至少约2.5倍，或者大至少约5倍，或者大至少约10倍。
在HMO混合物中，乳糖、LNTri II和pLNH II相对于LNT的重量比优选为：
乳糖:LNT为0至不大于0.6，LNTri II:LNT不大于0.2，并且pLNH II:LNT不大于0.05。
在HMO混合物中，乳糖、LNTri II和pLNnH相对于LNnT的重量比优选为：
乳糖:LNnT为0至不大于0.8，LNTri II:LNnT不大于0.1，并且pLNnH:LNnT不大于0.4。
根据第一方面的HMO混合物的上述定义，乳糖是任选的成分，这意味着比例乳糖:LNT为0-0.6，比例乳糖:LNnT为0-0.8。当比例为0时，本发明的HMO混合物不含乳糖，或者至少基本上不含乳糖(即，基本上无乳糖)。当本发明的HMO混合物含有乳糖时，其与LNT的重量比大于0，但不大于0.6，或者其与LNnT的重量比大于0，但不大于0.8。另一方面，在含有LNT的混合物中，LNTri II:LNT和pLNH II:LNT这两个比例均大于0，或者在含有LNnT的混合物中，LNTri II:LNnT和pLNnH:LNnT这两个比例均大于0(换言之，不能是0)，因为无论在哪种情形中，LNTri II和pLNH II二者，或者LNTri II和pLNnH二者都是要求保护的HMO混合物的必要组分。
在第一方面的某些实施方式中，乳糖、LNTri II和pLNH II相对于LNT的重量比为：
乳糖:LNT不大于0.4，LNTri II:LNT不大于0.2，并且pLNH II:LNT不大于0.05，或者
乳糖:LNT为0，LNTri II:LNT不大于0.2，并且pLNH II:LNT不大于0.05，或者
乳糖:LNT不大于0.4，LNTri II:LNT不大于0.15，并且pLNH II:LNT不大于0.03，或者
乳糖:LNT为0，LNTri II:LNT不大于0.15，并且pLNH II:LNT不大于0.03，或者
乳糖:LNT＝0.15-0.20，LNTri II:LNT＝0.05-0.12，并且pLNH II:LNT＝0.005-0.03，或者
乳糖:LNT＝0，LNTri II:LNT＝0.05-0.12，并且pLNH II:LNT＝0.005-0.03，或者
乳糖:LNT＝0.10-0.15，LNTri II:LNT＝0.04-0.1，并且pLNH II:LNT＝0.005-0.03，或者
乳糖:LNT＝0，LNTri II:LNT＝0.04-0.1，并且pLNH II:LNT＝0.005-0.03。
在第一方面的其他某些实施方式中，乳糖、LNTri II和pLNnH相对于LNnT的重量比为：
乳糖:LNnT不大于0.4，LNTri II:LNnT不大于0.1，并且pLNnH:LNnT不大于0.4，或者
乳糖:LNnT为0，LNTri II:LNnT不大于0.1，并且pLNnH:LNnT不大于0.4，或者
乳糖:LNnT不大于0.4，LNTri II:LNnT不大于0.05，并且pLNnH:LNnT不大于0.2，或者
乳糖:LNnT为0，LNTri II:LNnT不大于0.05，并且pLNnH:LNnT不大于0.2，或者
乳糖:LNnT＝0.37-0.72，LNTri II:LNnT＝0.01-0.05，并且pLNnH:LNnT＝0.15-0.25，或者
乳糖:LNnT＝0，LNTri II:LNnT＝0.01-0.05，并且pLNnH:LNnT＝0.15-0.25，或者
乳糖:LNnT＝0.43-0.72，LNTri II:LNnT＝0.02-0.04，并且pLNnH:LNnT＝0.15-0.20，或者
乳糖:LNnT＝0，LNTri II:LNnT＝0.02-0.04，并且pLNnH:LNnT＝0.15-0.20，或者
乳糖:LNnT＝0.43-0.72，LNTri II:LNnT＝0.03-0.05，并且pLNnH:LNnT＝0.18-0.19，或者
乳糖:LNnT＝0，LNTri II:LNnT＝0.03-0.05，并且pLNnH:LNnT＝0.18-0.19。
在其他实施方式中，合成HMO混合物有利地适合于LNT的选择性结晶，上述混合物的乳糖、LNTri II和pLNH II相对于LNT的重量比为：
乳糖:LNT＝0-0.2，LNTri II:LNT不大于0.15，并且pLNH II:LNT不大于0.05，例如
乳糖:LNT＝0-0.2，LNTri II:LNT不大于0.12，并且pLNH II:LNT不大于0.03，或者
乳糖:LNT＝0-0.2，LNTri II:LNT不大于0.1，并且pLNH II:LNT不大于0.02，或者
乳糖:LNT＝0-0.2，LNTri II:LNT不大于0.075，并且pLNH II:LNT不大于0.01。
在其他实施方式中，合成HMO混合物有利地适合于LNnT的选择性结晶，上述混合物的乳糖、LNTri II和pLNnH相对于LNnT的重量比为：
乳糖:LNnT＝0-0.2，LNTri II:LNnT不大于0.1，并且pLNnH:LNnT不大于0.03，例如
乳糖:LNnT＝0-0.2，LNTri II:LNnT＝0.005-0.1，并且pLNnH:LNnT＝0.005-0.03，或者
乳糖:LNnT＝0-0.2，LNTri II:LNnT＝0.005-0.05，并且pLNnH:LNnT＝0.005-0.025，或者
乳糖:LNnT＝0-0.2，LNTri II:LNnT＝0.01-0.03，并且pLNnH:LNnT＝0.01-0.025。
本发明第二方面
本发明的HMO混合物通过以下方法可以容易地得到：其涉及将基因改造的细胞在含有乳糖和一种或多种碳基底物的含水培养基或发酵培养基中培养或发酵，然后将其与培养基分离。术语“培养基”是指在基因改造的细胞外部的发酵器中的发酵过程的含水环境。
术语“基因改造的细胞”是指在细胞基因组中加入、删除或改变至少一段DNA序列、使得细胞具有改变的表型的细胞。这种表型的变化改变了基因改造的细胞相较于野生型细胞的特性。因此，当培养或发酵时，由于增加或改变的DNA编码至少一种野生型细胞中未发现的酶的表达，基因改造的细胞可以进行至少一种额外的化学转化，或者由于删除、增加或改变的DNA编码野生型细胞中发现的酶的表达，基因改造的细胞不能进行化学转化。基因改造的细胞可以通过常规的基因改造技术产生。基因改造的细胞可以是细菌或酵母，但优选为细菌。优选的细菌包括大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)(例如，枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、幽门弯曲菌(Campylobacterpylori)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、水生栖热菌(Thermophilus aquaticus)、固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、豆科根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、淋球奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(N.meningitis)、乳酸杆菌属(Lactobacillusspp.)、乳球菌属(Lactococcus spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus spp.)、Micromomosporaspp.、微球菌属(Micrococcus spp.)、红球菌属(Rhodococcus spp.)、假单胞菌(Pseudomonas)，特别是大肠杆菌。
具体地，本发明的基因改造的细胞含有：
-第一重组基因，其编码β1,3-N-乙酰基-葡糖胺基转移酶，其能够在细胞中将来自UDP-GlcNAc的GlcNAc转移到乳糖，从而形成LNTri II，
-第二重组基因，其编码
β1,3-半乳糖基转移酶，其能够在细胞中将来自UDP-Gal的半乳糖基残基转移到LNTri II，从而形成LNT，
或者β1,4-半乳糖基转移酶，其能够在细胞中将来自UDP-Gal的半乳糖基残基转移到LNTri II，从而形成LNnT。
优选的基因改造的细胞具有LacZ-基因型，特别是LacZ-、LacY+基因型，更特别地LacZ-、LacY+、LacI-基因型。
本发明的基因改造的细胞在含有乳糖的含水培养基中培养时，可以将乳糖内化，然后将细胞中活化糖核苷酸的GlcNAc残基转移至内化的乳糖，在细胞中形成LNTri II。无论在哪种情形中，细胞还可以将细胞中的活化糖核苷酸的半乳糖基残基转移至细胞中之前形成的LNTri II，以在细胞中形成LNT或LNnT。可以使用常规的表达载体，以公知的方式，将负责这些转移的重组基因或者等同DNA序列引入到细胞中。这些异源性核酸序列的来源可以是，例如，任何细菌，例如，脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)或幽门螺杆菌(H.pylori)。
在该方法的进行中，将基因改造的细胞在碳基底物例如甘油、葡萄糖、蔗糖、糖原、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素、果胶、壳多糖等的存在下培养。优选地，细胞与甘油、葡萄糖、蔗糖和/或果糖一起培养。
该方法还涉及初始将外源性乳糖从培养基中转运至基因改造的细胞中。乳糖可以用常规的方式外源性地加入到随后由其转运至细胞中的培养基中。当然，乳糖的内化不应当影响基本、重要的功能或者破坏细胞的完整性。内化可以经由被动转运机制发生，在该过程中乳糖被动地跨过细胞的质膜扩散。流动通过细胞外和细胞内空间相对于要内化的乳糖的浓度差异导向，使得乳糖从浓度较高的地方传至浓度较低的地方。但是，乳糖优选地在主动转运机制的辅助下内化到细胞中，通过该机制乳糖在细胞的转运蛋白或乳糖透过酶(LacY)的影响下跨过细胞的质膜而扩散。
在一些实施方式中，该方法中使用的基因改造的细胞缺少显著降解以下物质的酶活性：乳糖、LNT、LNnT、LNTri II、pLNH II、pLNnH和在细胞中产生LNT、LNnT、LNTri II和pLNH II和pLNnH需要的代谢中间产物。在这一方面，培养细胞的将乳糖水解成半乳糖和葡萄糖的天然β-半乳糖苷酶(在大肠杆菌中由LacZ编码)优选地被删除或失活(LacZ-基因型)。在本发明第二方面的一实施方式中，步骤b)中加入的过量乳糖在发酵之后没有被除去或降解，不论在哪种情形中，根据步骤d)将乳糖、LNT、LNTri II和pLNH II的混合物或者乳糖、LNnT、LNTri II和pLNnH的混合物与培养基分离并隔绝，分别产生基本上由乳糖、LNT、LNTri II和pLNH II组成的HMO混合物或者基本上由乳糖、LNnT、LNTri II和pLNnH组成的HMO混合物。在其他实施方式中，如上所述通过发酵产生乳糖、LNT、LNTri II和pLNH II的混合物或者乳糖、LNnT、LNTri II和pLNnH的混合物，不论在哪种情形中，将LNT、LNTri II和pLNH II的混合物或者LNnT、LNTri II和pLNnH的混合物与培养基以及过量的乳糖分离并隔绝，分别产生基本上由LNT、LNTri II和pLNH II组成的HMO混合物或者基本上由LNnT、LNTriII和pLNnH组成的HMO混合物。在再其他的实施方式中，如上所述通过发酵产生乳糖、LNT、LNTri II和pLNH II的混合物或者乳糖、LNnT、LNTri II和pLNnH的混合物，然后，在步骤c)中，
i)外源性地加入将乳糖水解成单糖的乳糖降解酶，例如半乳糖苷酶，或者
ii)使发酵继续进行，直至步骤b)中加入的所有乳糖均转化成所需的HMO，
提供基本上不含乳糖的肉汤。在这一方面，在选项ii)中，上文公开的LacZ-基因型基因改造细胞还可以包括功能性重组β-半乳糖苷酶。该功能性半乳糖苷酶可以由热诱导型的外源性LacZ基因编码(参见，例如，WO 2015/036138)。在发酵温度下，细胞不表达该功能性β-半乳糖苷酶，因此，在产生HMO的期间内化的乳糖在细胞中不降解。当肉汤中达到所需的HMO浓度或量时，培养在升高的温度下继续，通过其表达功能性β-半乳糖苷酶，将过量的乳糖降解。另外可选地，上文公开的LacZ-基因型基因改造细胞可以包括活性低、但水平可检测的重组β-半乳糖苷酶(参见，例如，WO 2012/112777)，以在发酵结束时除去任选地残余乳糖。两种选择由此均提供基本上不含乳糖的含有LNT、LNTri II和pLNH II的肉汤，或者基本上不含乳糖的含有LNnT、LNTri II和pLNnH的肉汤，由其分别可以容易地分离并隔绝出基本上由LNT、LNTri II和pLNH II组成的HMO混合物或者基本上由LNnT、LNTri II和pLNnH组成的HMO混合物。
产生LNT的菌株的其他例子公开于以下文献中，例如，等人.ChemBioChem 15,1896(2014)和Enzyme Microb.Technol.75-76,37(2015)、WO 2014/153253、WO 2015/036138或WO2016/008602。产生LNnT的菌株的其他例子公开于以下文献中，例如，Priem等人.Glycobiology 12,235(2002)；Gebus等人.Carbohydr.Res.361,83(2012)；WO 01/04341、WO 2014/153253、WO 2015/197082或WO 2016/008602。
为了取得高收率，该方法优选地涉及在培养基中提供碳基底物和每升初始体积的培养基至少30、优选至少45、更优选50-70、直至大约100克乳糖。优选地，该方法还在28-35℃温度下、优选地在连续搅动和连续通气的情况下进行大于2又1/2天，更优选至少4天。进一步优选地，培养基的最终体积是向培养基中提供乳糖和碳基底物之前培养基初始体积的不大于3倍，更优选不大于2倍，更优选小于2倍。
根据一实施方式，在本发明方法的进行中，基因改造的LacZ-Y+大肠杆菌菌株通过以下方式培养：
(1)第一阶段指数细胞生长，其通过在培养基中提供的碳基底物、优选葡萄糖保证，并优选地持续直至葡萄糖已全部被消耗，其优选为至少12小时，更优选至少18小时，再更优选20-25小时，直至大约48小时；和
(2)第二阶段细胞生长，其受在第一阶段之后在培养基中优选地连续提供的碳基底物、优选甘油和乳糖的限制，其持续直至葡萄糖和优选大多数(例如，至少60％)乳糖已被消耗，其优选为至少35小时，更优选至少45小时，再更优选50-70小时，直至大约130小时。
通过上述方法在含水培养基中在细胞外产生的LNnT、LNTri II、pLNnH和任选的乳糖的混合物在每升最终体积培养基中包括至少20克、更优选至少30克、再更优选至少40克、再更特别优选至少50克LNnT。在培养基中的LNnT、LNTri II、pLNnH和乳糖混合物中，乳糖主要是没有从培养基转运至基因改造的细胞中的未反应的乳糖。
在培养基因改造细胞的过程中，LNT、LNnT、LNTri II、pLNH II和pLNnH在细胞的细胞内和细胞外基质中积累，优选主要在细胞外基质中积累。然后该混合物的主要部分以被动方式转运出细胞外部至含水介质，即，其跨过细胞膜扩散到细胞外部。这种转运可以通过在细胞中提供一种或多种糖外流转运蛋白即促进糖衍生物从细胞外流至培养基的蛋白质来提高(参见，例如，WO 2010/142305)。糖外流转运蛋白可以在发酵条件下过量表达，以提高细胞中产生的该混合物输出至培养基。
从细胞转运至含水培养基的LNT、LNTri II和pLNH II产物混合物优选地含有主要量的LNT。更优选地，在培养基中，LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖以下列比例存在：
乳糖:LNT不大于0.6，LNTri II:LNT不大于0.2，并且pLNH II:LNT不大于0.05，例如
乳糖:LNT不大于0.4，LNTri II:LNT不大于0.2，并且pLNH II:LNT不大于0.05，或者
乳糖:LNT不大于0.2，LNTri II:LNT不大于0.2，并且pLNH II:LNT不大于0.05，或者
乳糖:LNT不大于0.4，LNTri II:LNT不大于0.15，并且pLNH II:LNT不大于0.03，或者
乳糖:LNT不大于0.2，LNTri II:LNT不大于0.15，并且pLNH II:LNT不大于0.03，或者
乳糖:LNT＝0.15-0.20，LNTri II:LNT＝0.05-0.12，并且pLNH II:LNT＝0.005-0.03，或者
乳糖:LNT＝0.10-0.15，LNTri II:LNT＝0.04-0.1，并且pLNH II:LNT＝0.005-0.03。
然后可以将LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖以常规方式与培养基中的细胞和杂质分离，任选地，将LNT、LNTri II和pLNH II的混合物与培养基中的乳糖分离。
从细胞转运至含水培养基的LNnT、LNTri II和pLNnH产物混合物优选地含有主要量的LNnT。更优选地，在培养基中，LNnT、LNTri II、pLNnH和任选的乳糖以下列比例存在：
乳糖:LNnT不大于0.8，LNTri II:LNnT不大于0.05，并且pLNnH:LNnT不大于0.4，例如
乳糖:LNnT＝0.2-0.8，LNTri II:LNnT不大于0.05，并且pLNnH:LNnT不大于0.4，或者
乳糖:LNnT＝0.37-0.72，LNTri II:LNnT＝0.03-0.05，并且pLNnH:LNnT＝0.15-0.25，或者
乳糖:LNnT＝0.43-0.72，LNTri II:LNnT＝0.03-0.05，并且pLNnH:LNnT＝0.15-0.20，或者
乳糖:LNnT＝0.43-0.72，LNTri II:LNnT＝0.03-0.05，并且pLNnH:LNnT＝0.18-0.19，或者
乳糖:LNnT不大于0.2，LNTri II:LNnT＝0.03-0.05，并且pLNnH:LNnT＝0.15-0.25，或者
乳糖:LNnT不大于0.2，LNTri II:LNnT＝0.03-0.05，并且pLNnH:LNnT＝0.15-0.20，或者
乳糖:LNnT不大于0.2，LNTri II:LNnT＝0.03-0.05，并且pLNnH:LNnT＝0.18-0.19。
然后可以将LNnT、LNTri II、pLNnH和任选的乳糖以常规方式与培养基中的细胞和杂质分离，任选地，将LNnT、LNTri II和pLNnH的混合物与培养基中的乳糖分离。
本发明第二方面的步骤d)包括以下分离步骤中的至少一种：
-超滤
-纳米过滤，
-离子交换处理，或者
-活性炭处理，
但优选地以任意顺序进行其中的2个或3个，或者全部4种步骤。有利地，总是包括超滤步骤，优选作为第一分离步骤(其应用于发酵肉汤)，然后进行纳米过滤、离子交换处理和/或活性炭处理。
第一分离步骤涉及将含有LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖或者LNnT、LNTriII、pLNnH和任选的乳糖的含水培养基与细胞以及悬浮的颗粒物和污染物、不溶性材料和碎片分离。在该步骤中，可以将培养基用常规的方式澄清化，例如，通过对肉汤进行膜过滤或离心。根据一实施方式，膜过滤是超滤(UF)。在超滤步骤中，将生物质和优选另外的高分子量悬浮固体与肉汤的可溶性成分分离。将含有产生的LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖或者LNnT、LNTri II、pLNnH和任选的乳糖的水溶液在基本上不改变其相互间的相对重量比的情况下通过超滤膜，产生UF渗透物(UFP)。
可以使用分子量截留(MWCO)范围为大约1至大约500kDa，例如10-250、50-100、200-500、100-250、1-100、1-50、10-25、1-5kDa、任意其他合适的子范围的任意常规超滤膜。膜材料可以是陶瓷的，或者由合成或天然聚合物例如聚砜、聚丙烯、醋酸纤维素或聚乳酸制成。超滤步骤可以用全流(dead-end)或错流(cross-flow)模式应用。该分离步骤可以包括多于一个的使用具有不同MWCO的膜的超滤步骤，例如，使用两次超滤分离，其中第一膜的MWCO比第二膜高。这种设置可以提供对肉汤中较高分子量组分的更好的分离效率。该分离步骤之后，渗透物含有分子量低于第二膜的MWCO的材料，包括LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖或者LNnT、LNTri II、pLNnH和任选的乳糖的混合物，其范围基本上与应用UF步骤之前相同。
第二分离步骤包括纳米过滤(NF)。该纳米过滤步骤可以有利地用于将之前得到的UFP浓缩和/或除去离子，主要是单价离子，并除去分子量低于乳糖的有机材料例如单糖。纳米过滤膜的MWCO保证LNT、LNnT、LNTri II、pLNH II和pLNnH得以保留，即，其MWCO低于之前的步骤中使用的超滤膜，大约为LNTri II、LNT或LNnT的分子量的25-50％。在这一方面，LNT、LNTri II和pLNH II或者LNnT、LNTri II和pLNnH在NF保留物(NFR)中积累。令人感兴趣的是，大多数乳糖(如果存在的话)也保留在NFR中，因此，LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖或者LNnT、LNTri II、pLNnH和任选的乳糖的量的范围基本上与应用NF步骤之前相同。纳米过滤可以与用水渗滤结合，以更加有效地除去可渗透的分子，例如，直至渗透物的电导率表现出不存在或极少存在有盐。
第三分离步骤优选地涉及将任何残余的矿物质、盐或其他带电分子以及氨基酸从残余的培养液中除去，优选地在第二分离步骤之后进行。该第三分离步骤可以用常规方式使用离子交换树脂通过使残余培养基通过H+-形式的阳离子交换树脂和/或游离碱形式的阴离子交换树脂进行。阳离子交换树脂优选为强交换剂，阴离子交换树脂为弱交换剂。除从残余培养基中除去盐和带电分子之外，离子交换树脂还可以在物理上吸附留在残余培养基中第二HMO混合物中的蛋白质、DNA和着色/焦糖体。
根据一实施方式，离子交换树脂是阴离子交换树脂，优选弱碱性阴离子交换树脂。在该步骤中，可以将带负电的物质从预处理过的溶液除去，因为它们与树脂结合。以任何适当的方式将LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖或者LNnT、LNTri II、pLNnH和任选的乳糖的水溶液与阴离子交换树脂接触，这将使得带负电的物质吸附在阴离子交换树脂上，并使中性的寡糖通过其中。与阴离子交换树脂接触之后产生的液体主要含有水、阳离子和LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖或者LNnT、LNTri II、pLNnH和任选的乳糖的混合物。
根据另一实施方式，离子交换树脂是阳离子交换树脂，优选强酸性阳离子交换树脂。在该步骤中，可以将带正电的物质从预处理过的溶液除去，因为它们与树脂结合。以任何适当的方式将LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖或者LNnT、LNTri II、pLNnH和任选的乳糖的溶液与阳离子交换树脂接触，这将使得带正电的物质吸附在阳离子交换树脂上，并使中性的寡糖通过其中。除阴离子以外，与阳离子交换树脂接触之后产生的液体主要还含有水和LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖或者LNnT、LNTri II、pLNnH和任选的乳糖。
上文公开的离子交换树脂处理中的一种可以足以得到所需纯度的LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖或者LNnT、LNTri II、pLNnH和任选的乳糖的混合物。如果必要，可以任意顺序应用阳离子和阴离子交换树脂色谱二者。离子交换树脂处理基本上不会改变混合物中LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖或者LNnT、LNTri II、pLNnH和任选的乳糖的相对重量比。
当使用离子交换树脂时，其交联程度可以取决于离子交换柱的操作条件而选择。高度交联的树脂提供耐久性和高度机械完整性的优势，但缺点在于孔隙度降低，传质下降。低交联树脂更加脆性，往往通过吸收流动相而溶胀。离子交换树脂的粒径选择成允许洗脱液的充分流动，而仍然有效地除去带电物质。通过对柱洗脱端施加负压，或者对柱装载端施加正压，并收集洗脱液，也可以得到适当的流速。也可以组合使用正压和负压。离子交换处理可以用常规的方式进行，例如，分批或连续进行。
合适的酸性阳离子交换树脂的非限定性例子可以是，例如，Amberlite IR100、Amberlite IR120、Amberlite FPC22、Dowex 50WX、Finex CS16GC、Finex CS13GC、FinexCS12GC、Finex CS11GC、Lewatit S、Diaion SK、Diaion UBK、Amberjet 1000、Amberjet1200。
合适的碱性阴离子交换树脂的非限定性例子可以是，例如，Amberlite IRA67、Amberlite IRA 96、Amberlite IRA743、Amberlite FPA53、Diaion CRB03、Diaion WA10、Dowex 66、Dowex Marathon、Lewatit MP64。
第四分离步骤优选地涉及将任何残余的着色/焦糖体和/或水溶性污染物例如盐从剩余培养基中除去。该第四步骤可以用常规方式使用活性炭进行，以对之前的步骤中得到的HMO混合物进行脱色。活性炭处理可以在上述任何超滤、纳米过滤或离子交换处理之后，优选地在离子交换处理之后。
碳水化合物物质例如LNT、LNnT、LNTri II、pLNH II、pLNnH和乳糖(如果存在的话)往往从其水溶液例如UF、NF或离子交换处理之后的水溶液中与炭颗粒的表面结合。类似地，着色剂也能够吸附在炭上。尽管碳水化合物和着色材料被吸附，但是与炭不结合或者结合较弱的水溶性材料可以用水洗脱。通过将洗脱液从水改变成含水乙醇，可以容易地将吸附的碳水化合物洗脱并收集，混合物关于LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖或者LNnT、LNTri II、pLNnH和任选的乳糖的相对重量比基本上相同。吸附的着色物质将保留吸附在炭上，从而可以在该步骤中同时实现脱色和脱盐。
在某些条件下，LNT、LNTri II、pLNH II和乳糖(如果存在的话)或者LNnT、LNTriII、pLNnH和乳糖(如果存在的话)不吸附在或者至少基本上不吸附在炭颗粒上，用水洗脱产生这些寡糖的水溶液而其量不显著损失，同时着色物质则保持吸附。确定寡糖将会从其水溶液中结合到炭的条件是本领域的常规操作。例如，在一实施方式中，使用更加稀释的LNT、LNTri II、pLNH II和乳糖(如果存在的话)或者LNnT、LNTri II、pLNnH和乳糖(如果存在的话)的溶液，在另一实施方式中，应用相对于寡糖的量其量较低的炭。在该实施方式中，LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖或者LNnT、LNTri II、pLNnH和任选的乳糖的重量比与应用该特定活性炭处理之前范围基本上相同。
而且，在活性炭处理的一实施方式中，当发酵过程中和/或任意上文公开的分离步骤之后得到的LNT、LNTri II、pLNH II和乳糖的混合物中乳糖:LNT比例高于0.2时，通过有利地应用活性炭处理，可以降低至0.2或更低，例如通过采用Whistler等人,J.Am.Chem.Soc.72,677(1950)或Morales等人.Chromatographia 64,233(2006)提出的方法。这些方法基于从高级寡糖LNTri II、LNT和pLNH II中洗脱/除去相当大量的二糖乳糖，从而可得到乳糖含量很低或没有的LNTri II、LNT和pLNH II的混合物(即，其中乳糖:LNT的重量比低于0.2)，同时LNT与LNTri II和pLNH II的重量比基本上不变化。因此，通过将上述活性炭处理应用于包括LNT、LNTri II、pLNH II和乳糖或者由其组成的HMO混合物，其中混合物中乳糖、LNTri II和pLNH II相对于LNT的重量比为：乳糖:LNT大于0.2且小于0.8，LNTri II:LNT不大于0.15，并且pLNH II:LNT不大于0.05，可以得到包括LNT、LNTri II、pLNHII和乳糖或者由其组成的HMO混合物，其中混合物中乳糖、LNTri II和pLNH II相对于LNT的重量比为：乳糖:LNT＝0-0.2，LNTri II:LNT不大于0.15，并且pLNH II:LNT不大于0.05，其中混合物可以有利地用于选择性地结晶出LNT。其中至少一个比例高于上述规定的混合物是不适合于LNT选择性结晶的混合物。
而且，在活性炭处理的一实施方式中，当发酵过程中和/或任意上文公开的分离步骤之后得到的LNnT、LNTri II、pLNnH和乳糖的混合物中乳糖:LNnT比例高于0.2时，通过有利地应用活性炭处理，可以降低至0.2或更低，例如通过采用Whistler等人,J.Am.Chem.Soc.72,677(1950)或Morales等人.Chromatographia 64,233(2006)提出的方法。这些方法基于从高级寡糖LNTri II、LNnT和pLNnH中洗脱/除去相当大量的二糖乳糖，从而可得到乳糖含量很低或没有的LNTri II、LNnT和pLNnH的混合物(即，其中乳糖:LNnT的重量比低于0.2)，同时LNnT与LNTri II和pLNnH的重量比基本上不变化。因此，通过将上述活性炭处理应用于包括LNnT、LNTri II、pLNnH和乳糖或者由其组成的HMO混合物，其中混合物中乳糖、LNTri II和pLNnH相对于LNnT的重量比为：乳糖:LNnT大于0.2且小于0.8，LNTriII:LNnT不大于0.1，并且pLNnH:LNnT不大于0.03，可以得到包括LNnT、LNTri II、pLNnH和乳糖或者由其组成的HMO混合物，其中混合物中乳糖、LNTri II和pLNnH相对于LNnT的重量比为：乳糖:LNnT＝0-0.2，LNTri II:LNnT不大于0.1，并且pLNnH:LNnT不大于0.03，其中混合物可以有利地用于选择性地结晶出LNnT。其中至少一个比例高于上述规定的混合物是不适合于LNnT选择性结晶的混合物。
例如，通过在搅拌条件下向碳水化合物水溶液中加入炭粉，滤去炭，在搅拌条件下再次悬浮在含水乙醇中，通过过滤分离出炭，可以进行炭处理。在更大规模的提纯中，优选地将UF、NF或离子交换处理之后的碳水化合物水溶液装载在填有炭的柱子上，上述炭可以是颗粒炭，或者可以任选地与硅藻土混合，然后将柱子用所需的洗脱液洗涤。收集含有LNT、LNTri II、pLNH II和乳糖(如果存在的话)或者LNnT、LNTri II、pLNnH和乳糖(如果存在的话)的部分。如果必要，通过例如蒸发将残余的乙醇从该部分中除去，得到LNT、LNTri II、pLNH II和乳糖(如果仍存在的话)或者LNnT、LNTri II、pLNnH和乳糖(如果存在的话)的水溶液。
第五(任选)分离步骤可以是中性固相上的色谱，有利地为反相色谱。发酵步骤中和/或任意上文公开的分离步骤之后得到的包括LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖或者LNnT、LNTri II、pLNnH和任选的乳糖的水溶液可以含有少量其他应当除去的可溶性疏水杂质。疏水性杂质由于与固定的中性固相的凝胶基质(树脂)的疏水性配体例如烷基或芳基侧链的疏水相互作用而得以吸附并因此保留，而亲水性更强的LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖或者LNnT、LNTri II、pLNnH和任选的乳糖的混合物则不会结合在该固体介质上，因此可以被用作流动相的含水介质、优选为水洗脱。在该第五分离步骤中，LNT与LNTri II、与pLNH II和与乳糖(如果存在的话)或者LNnT、LNTri II、pLNnH和乳糖(如果存在的话)的重量比基本上不变化。
反相色谱可以用常规的方式进行。优选地，使用选自以下的疏水性色谱介质：反相二氧化硅和有机聚合物，特别是苯乙烯或二乙烯基苯的共聚物和甲基丙烯酸酯聚合物。二氧化硅优选地用长度范围为C1-C18(最常见为C1、C4、C5、C8和C18)的直链烷基烃或其他疏水性配体(例如苯基或氰基)衍生化。
可以向在反相色谱中用作流动相的含水介质中加入有机溶剂，以改变其极性，从而提高寡糖与疏水性更强的物质的分离。出于该目的可以使用许多种有机溶剂，优选与水混溶的溶剂，例如低级烷醇例如甲醇、乙醇和异丙醇，或者乙腈，或者四氢呋喃，或者丙酮。
反相色谱可以另外用常规方式例如分批或者连续地进行。通过使用常规的实验室或工业级色谱柱或容器，其中疏水性色谱介质可以是装填或悬浮的(小珠)，可以容易地进行提纯。
在中性固相上的色谱的一实施方式中，当发酵步骤中和/或任意上文公开的分离步骤之后得到的LNT、LNTri II、pLNH II和乳糖的混合物中pLNH II:LNT比例高于0.05时，可以应用凝胶过滤色谱，以将其降低至0.05或更低。该方法是基于根据尺寸将己糖pLNH II与低级寡糖乳糖、LNTri II和LNT分离。LNTri II和乳糖与LNT的重量比基本上不变化。因此，通过将上述色谱应用于包括LNT、LNTri II、pLNH II和乳糖或者由其组成的HMO混合物，其中混合物中乳糖、LNTri II和pLNH II相对于LNT的重量比为：乳糖:LNT为0-0.2，LNTriII:LNT不大于0.15，并且pLNH II:LNT大于0.05，可以得到包括LNT、LNTri II、pLNH II和乳糖或者由其组成的HMO混合物，其中混合物中乳糖、LNTri II和pLNH II相对于LNT的重量比为：乳糖:LNT＝0-0.2，LNTri II:LNT不大于0.15，并且pLNH II:LNT不大于0.05，其中混合物可以有利地用于选择性地结晶出LNT。
在中性固相上的色谱的一实施方式中，当发酵步骤中和/或任意上文公开的分离步骤之后得到的LNnT、LNTri II、pLNnH和乳糖的混合物中pLNnH:LNnT比例高于0.03时，可以应用凝胶过滤色谱，以将其降低至0.03或更低。该方法是基于根据尺寸将己糖pLNnH与低级寡糖乳糖、LNTri II和LNnT分离。LNTri II和乳糖与LNnT的重量比基本上不变化。因此，通过将上述色谱应用于包括LNnT、LNTri II、pLNnH和乳糖或者由其组成的HMO混合物，其中混合物中乳糖、LNTri II和pLNnH相对于LNnT的重量比为：乳糖:LNnT为0-0.2，LNTri II:LNnT不大于0.1，并且pLNnH:LNnT大于0.03，可以得到包括LNnT、LNTri II、pLNnH和乳糖或者由其组成的HMO混合物，其中混合物中乳糖、LNTri II和pLNnH相对于LNnT的重量比为：乳糖:LNnT＝0-0.2，LNTri II:LNnT不大于0.1，并且pLNnH:LNnT不大于0.03，其中混合物可以有利地用于选择性地结晶出LNnT。
凝胶过滤色谱可以用常规方式进行。
如果发酵步骤中和/或任意上文公开的分离步骤之后得到的LNT、LNTri II、pLNHII和乳糖的混合物的乳糖:LNT比例大于0.2且小于0.8，pLNH II:LNT比例大于0.05，则应当应用上文所述的活性炭处理和凝胶过滤二者，以得到适合于LNT结晶的包括LNT、LNTri II、pLNH II和乳糖或者由其组成的HMO混合物。
如果发酵步骤中和/或任意上文公开的分离步骤之后得到的LNnT、LNTri II、pLNnH和乳糖的混合物的乳糖:LNnT比例大于0.2且小于0.8，pLNnH:LNnT比例大于0.03，则应当应用上文所述的活性炭处理和凝胶过滤二者，以得到适合于LNnT结晶的包括LNnT、LNTri II、pLNnH和乳糖或者由其组成的HMO混合物。
本发明第三方面
本发明第三方面涉及：
使用一种或多种单羟基C1-C4醇作为抗溶剂使以下结晶的方法：
a)LNT，其中结晶由包括LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖的混合物进行，其中乳糖、LNTri II和pLNH II相对于LNT的重量比为：
乳糖:LNT＝0-0.2，LNTri II:LNT不大于0.15，并且pLNH II:LNT不大于0.05；
或者
使用一种或多种单羟基C1-C4醇和/或丙酮作为抗溶剂使以下结晶的方法：
b)LNnT，其中结晶由包括LNnT、LNTri II、pLNnH和任选的乳糖的混合物进行，其中乳糖、LNTri II和pLNnH相对于LNnT的重量比为：
乳糖:LNnT＝0-0.2，LNTri II:LNnT不大于0.1，并且pLNnH:LNnT不大于0.03。
结晶典型地是溶剂-抗溶剂结晶，其中上述HMO混合物作为其水溶液。抗溶剂优选为甲醇。
如果LNnT的结晶以相反的加入顺序进行(即，向抗溶剂中加入寡糖水溶液)，抗溶剂优选为丙酮，这样结晶的LNnT优选是EP-A-1405856中公开的其多晶型物(polymorph)。如果结晶以正常加入顺序进行(即，向寡糖混合物水溶液中加入抗溶剂)，抗溶剂优选为单羟基C1-C4醇，有利地为甲醇，这样结晶的LNnT优选为WO2011/100980中公开的其多晶型物。
本发明第四方面
本发明的HMO混合物含有LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖或者LNnT、LNTriII、pLNnH和任选的乳糖，优选基本上由其组成，该混合物是抗感染组合物，其可以用于通过特异性调节胃肠道微生物群、调节病毒和致病菌的肠结合以及提高肠道屏障功能和免疫功能，来治疗和/或预防病毒和/或细菌性的肠道感染。具体地，混合物增加肠道微生物群中双歧杆菌的丰度，特别是青春(Bifidobacterium adolescentis)系统发育组的成员，特别是青春(Bifidobacterium adolescentis)和/或假链状双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)，在大约14天之后，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)和/或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)。混合物还可以降低厚壁菌门特别是梭状芽胞杆菌和致病菌的丰度。而且，各个混合物起到诱饵受体的作用，并与轮状病毒结合，以防止轮状病毒粘附在肠道细胞上。这些特性与肠道屏障功能和免疫功能的提高相结合，使得混合物适合于预防和治疗病毒和/或细菌感染。混合物还可以降低活泼瘤胃球菌(Ruminococcusgnavus)的丰度，其与例如炎症性肠病和肠易激综合症的肠道疾病有关。这与肠道屏障功能和免疫功能的提高相结合，使得混合物适合于预防和治疗例如炎症性肠病、肠易激综合征的病症和其他与验证和屏障功能受损有关的病症。
本发明的HMO混合物含有LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖或者LNnT、LNTriII、pLNnH和任选的乳糖，优选基本上由其组成，还可以用于预防和/或治疗呼吸道的病毒和/或细菌感染。在这一方面，混合物影响宿主防御，包括调节免疫系统，从而引起对呼吸道病原定殖的抑制。
本发明的抗感染组合物可以是药物组合物。各药物组合物可以含有药学可接受的载体，例如，磷酸盐缓冲盐水溶液，乙醇在水中的混合物，水和乳液例如油/水或水/油乳液，以及各种润湿剂或赋形剂。药物组合物还可以含有当给予患者时不产生不利、过敏或其他有害反应的材料。载体和其他材料可以包括溶剂、分散剂、包衣、吸收促进剂、控释剂以及一种或多种惰性赋形剂，例如，淀粉、多元醇、造粒剂、微晶纤维素、稀释剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。如果要求，抗感染组合物的片剂可以通过标准的含水或非水技术技术进行包衣。
本发明的抗感染组合物可以口服给药，例如，作为含有预定量第一混合物的片剂、胶囊或小丸剂，或者作为含有预定浓度的第一混合物的粉末或颗粒剂，或者含有预定浓度第一混合物的含水或非水液体中的凝胶、糊剂、溶液、悬液、乳液、糖浆、丸药(bolus)、干药糖剂或浆料。口服给药的组合物可以包括粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、风味剂和润湿剂。口服给药的组合物例如片剂可以任选地进行包衣，并可以配制成提供其中的第一混合物的持续、延迟或受控的释放。
本发明的抗感染组合物也可以通过直肠栓剂、气溶胶管、鼻胃管或直接输注到GI道或胃内给药。
本发明的抗感染药物组合物还可以包括治疗剂，例如抗病毒剂、抗生素、益生菌、镇痛剂和抗炎剂。这些组合物对于患者来说适当的剂量可以用常规方式确定，其基于例如患者免疫状况、体重和年龄的多种因素。在一些情形中，剂量将会是类似于人母乳中混合物成分所发现浓度的浓度。要求的量通常范围为每天大约200mg至大约20g，在某些实施方式中，为每天大约300mg至大约15g，每天大约400mg至大约10g，在某些实施方式中，为每天大约500mg至大约10g，在某些实施方式中，为每天大约1g至大约10g。适当的剂量方案可以通过本领域技术人员已知的方法确定。
本发明的抗感染组合物还可以加入到营养组合物中。例如，可以将其加入到水分补给溶液或者用于老年人或免疫受损个体的饮食维持或补剂中。这些抗感染组合物中还可以包括常量营养素，例如可食用的油脂、碳水化合物和蛋白质。可食用的油脂包括椰子油、大豆油、单甘油酯和二甘油酯。碳水化合物包括，例如，葡萄糖、可食用乳糖和水解玉米淀粉。蛋白质包括，例如，大豆蛋白、乳清和脱脂牛奶。这些抗感染组合物中也可以包括维生素和矿物质(例如钙、磷、钾、钠、氯、镁、锰、铁、铜、锌、硒、碘和维生素A、E、D、C和复合维生素B)。
本发明第五方面
本发明第五方面涉及一种调节人胃肠道微生物群以增加双歧杆菌丰度的方法。该方法包括对人施用LNT、pLNH II和LNTri II的混合物或者LNnT、pLNnH和LNTri II的混合物，有利地为本发明第一方面的合成HMO混合物或者包括其的营养或药物组合物。
本发明第六方面
本发明第六方面涉及一种预防或治疗人体内病毒和/或细菌感染、特别是肠道感染和呼吸道感染的方法。该方法包括对人施用LNT、pLNH II和LNTri II的混合物或者LNnT、pLNnH和LNTri II的混合物，有利地为本发明第一方面的合成HMO混合物或者包括其的营养或药物组合物。
尽管本发明已结合优选实施方式得以说明，但应当认识到，可以在本发明范围内进行许多种修改。
在本说明书中，除非另外明确指出，措辞“或”以如下操作符的含义使用：当符合所述条件中的任一者或二者时，返回真值，这与操作符“异或”相反，异或要求仅满足一条件。措辞“包括”以“包括有”而不是“由其组成”的含义使用。上文确认的所有现有技术的教导均在此并入作为参考。任何在先公开的文件的确认均不应当视作是认可或表示其教导是在其日期下在澳大利亚或别处的公知常识。
实施例
实施例1–制造基本上由LNT、LNTriII、pLNHII和乳糖或者LNnT、LNTriII、pLNnH和
乳糖组成的混合物
菌株：
菌株由获自德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen)的大肠杆菌K12菌株DH1(参考DSM 5346)构建。通过插入Plac启动子，同时保持参与UDP-GlcNAc和UDP-Gal生物合成的基因，删除以下基因：lacZ、nanKETA、lacA、melA、wcaJ和mdoH。菌株含有包括β-1,3-N-乙酰基葡糖胺基转移酶(IgtA)和抗生素标记物的质粒(质粒1)，和包括β-1,3-半乳糖基转移酶和抗生素标记物的质粒(质粒2)[用于产生LNT]，或者携带β-1,3-N-乙酰基葡糖胺基转移酶的脑膜炎奈瑟菌IgtA基因和四环素抗性基因的pBBR3-IgtA-tet质粒，和携带β-1-4-半乳糖基转移酶的幽门螺杆菌galT基因和氨苄青霉素抗性基因的pBS-galT-amp质粒[用于产生LNnT]。
发酵步骤：
将葡萄糖、甘油和乳糖均在120℃下灭菌。将异丙基硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)过滤灭菌。
发酵在含有≈0.9l含水矿物培养基的3l发酵器中进行(Samain等人.J.Biotechnol.72,33(1999))。温度保持在33℃，pH用28％NH4OH调节成6.8。将菌株接种在补充有氨苄青霉素和四环素的LB培养基(20ml)中。指数生长阶段从接种开始，当最初加入到含水培养基中的葡萄糖碳源耗尽时停止。然后将乳糖溶液(70g乳糖/500ml水)加入到含水培养基中，之后用500g/l溶液、作为碳源的4.5g/h甘油开始饲喂。另外将1-2ml 50mg/ml异丙基硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)的溶液作为诱导物加入到含水培养基中。甘油饲喂发酵持续约90小时，产生最终的含水培养基，其含有：
a)[对于产生LNT的菌株]以下比例的LNT、LNTri II、pLNH II和乳糖：
乳糖:LNT＝0.15-0.20
LNTri II:LNT＝0.05-0.12
pLNH II:LNT＝0.005-0.03；或者
b)[对于产生LNnT的菌株]以下比例的LNnT、LNTri II、pLNnH和乳糖：
乳糖:LNnT＝0.43-0.72
LNTri II:LNnT＝0.03-0.05
pLNnH:LNnT＝0.19-0.20
其LNnT滴度为45g/l。
提纯方法：
通过以下连续步骤对来自每个批次的最终含水培养基进行提纯：
i)将培养基离心，以从残余培养基中分离出大肠杆菌细胞、悬浮颗粒和污染物、不溶性材料和碎片；
ii)将分离的细胞用温水洗涤，然后将洗涤水加入到残余培养基中；
iii)将残余培养基用孔径为50kDAMWCO的陶瓷膜超滤，然后将培养基用孔径为1kDAMWCO的陶瓷膜再次超滤，以除去细胞蛋白质、肽、氨基酸、RNA和DNA、内毒素和糖脂类；
iv)将培养基用强酸性阳离子交换DOWEX 50WX 12和弱碱性阴离子交换离子交换树脂DOWEX 66处理，以除去矿物质、盐和其他带电分子以及氨基酸、残余蛋白质、DNA和着色/焦糖体；然后
v)用活性炭对培养基进行脱色。
产生的培养基是本发明的含水第二HMO混合物，其基本上分别由以下组成：
a)乳糖、LNTri II、LNT和pLNH II，其中乳糖、LNTri II、LNT和pLNH II的比例如下：
乳糖:LNT＝0.15-0.20
LNTri II:LNT＝0.05-0.12
pLNH II:LNT＝0.005-0.03；或者
b)乳糖、LNTri II、LNnT和pLNnH，其中乳糖、LNTri II、LNnT和pLNnH的比例如下：
乳糖:LNnT＝0.43-0.72
LNTri II:LNnT＝0.03-0.05
pLNnH:LNnT＝0.18-0.20。
实施例2–制造基本上由LNT、LNTriII、pLNHII和乳糖或者LNnT、LNTriII、pLNnH和
乳糖组成的干混合物
将来自实施例1的LNT、LNTri II、pLNH II和乳糖的混合物或者LNnT、LNTri II、pLNnH和乳糖的含水混合物用200Da的膜进行纳米过滤，除去大多数残余的水。然后通过加热对所产生的本发明的LNTri II、LNT、pLNH II和乳糖的湿第二HMO混合物或者LNTri II、LNnT、pLNnH和乳糖的湿第二HMO混合物进行进一步干燥，以基本上除去所有残余的水；产生的干混合物中的重量比如下：
乳糖:LNT＝0.15-0.20
LNTri II:LNT＝0.05-0.12
pLNH II:LNT＝0.005-0.03；或者
乳糖:LNnT＝0.43-0.72
LNTri II:LNnT＝0.03-0.05
pLNnH:LNnT＝0.18-0.19.
实施例3
招募30名男性和女性患者参与该研究。经过1-2周的筛查访视及磨合期后，选择患者，并随机分成3组，每组10名患者。两组给予治疗产品，一组给予安慰剂产品，持续8周。治疗产品含有a)5克LNT、LNTri II和pLNH II的组合，或b)5克LNnT、LNTri II和pLNnH的组合，而安慰剂产品含有2克葡萄糖。所有产品均为单位剂量容器中的粉末形式。
如果患者年龄至少18岁，则有资格参加。所有招募的患者均能够并且愿意理解并依从研究方法。如果有以下情况则患者被排除在外：在筛查访视前一个月参加过临床研究；在与参与研究临床相关的筛选测试中结果异常；患有严重疾病，例如恶性肿瘤、糖尿病、严重冠心病、肾病、神经系统疾病或严重精神疾病或任何可能影响研究结果的病症；研究前2个月使用高剂量益生菌补剂(允许使用酸奶)；研究前3个月服用抗生素药物；在研究前2周定期服用任何可能干扰症状评价的药物；怀孕或哺乳期。
在筛查访视时，登记病史和伴随用药，并采集血液样本进行安全性分析。分发粪便样本试剂盒。指导患者将收集到的粪便样本保存在冰箱中，直至第二次访视。
在第二次访视时，检查合格标准，并将合格的受试者随机分成试验中的三个组。收集粪便样本，分发用于新样本的装置。使患者熟悉交互式互联网支持系统，该系统每天记录数据，并提供治疗或安慰剂产品。研究过程中提醒受试者不要改变其日常饮食。采集血样用于生物标志物研究。将粪便样本存储在-80℃下直至分析。对粪便样本进行16S rRNA测序分析。
研究持续8周，患者每天服用安慰剂或治疗产品。指导患者在早晨随早餐服用这些产品。通过交互式互联网支持系统监测依从性。患者另外使用该系统记录以下信息：
-Bristol粪便性状量表(Bristol Stool Form Scale，BSFS)信息，
-症状信息，例如腹痛、腹部不适、腹部绞痛、腹胀和饱腹感，
-额外的胃肠道症状评分量表(GSRS)信息。
该调查问卷包括15项，涵盖5个维度(腹痛、消化不良、反流、腹泻、便秘)，并使用7个等级的李克特量表(Likert scale)。
研究结束时，每位患者由医疗小组进行退出访视。收集粪便样品和血液样品，如前所述进行分析。
粪便分析表明，治疗组患者的双歧杆菌丰度增加。
实施例4
将30只5日龄的Sprague-Dawley大鼠单独饲养，以避免大鼠之间的污染，并提供辐照过的食物和水。将大鼠分成3组，每组10只，两个治疗组，一个对照组。
分别将LNT、LNTri II、pLNH II的混合物和LNnT、LNTri II、pLNnH的混合物以40mg/ml的总浓度加入到每个治疗组中的引用水中。对照组的水(第0天)不变。每天给予新鲜的水，所有大鼠均可自由饮水。大鼠用啮齿类动物食物喂养，并每天给予新鲜食物。
给予混合物之后2天(第2天)，所有组的大鼠均通过口服填喂用包封的肺炎链球菌(S.pneumoniae)菌株感染。
24小时之后，使用盐水溶液对大鼠进行鼻腔洗涤。回收溶液，并通过对琼脂板上的集落进行计数，得到活菌的数量。对大鼠进行1周的监测，然后实施安乐死(第10天)。安乐死之后，摘取肺部。将肺组织在10ml PBS中切碎，然后用Stomacher均化(2分钟/样本)。将组织匀浆连续稀释，并在选择性链球菌琼脂上培养48小时，测定集落形成单位(cfu)。
在经治疗的大鼠中，与对照大鼠相比较，肺部的肺炎链球菌定殖得以降低。类似地，与对照大鼠相比较，经治疗的大鼠鼻腔洗液中发现的活的肺炎链球菌数量得以降低。
Claims (17)
1.一种合成混合物，其包含，优选地基本上由以下组成：
-GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(LNTri II)，
-组分A，其为Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(LNT)或Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(LNnT)，
-组分B：
当组分A是LNT时，其为Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(pLNH II)，或者
当组分A是LNnT时，其为Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(pLNnH)，
-和任选的乳糖。
2.根据权利要求1所述的混合物，其含有相对于混合物中其他组分为主要量的LNT或LNnT。
3.根据权利要求1或2所述的混合物，其基本上由以下组成：
-LNTri II，
-组分A，其为LNT或LNnT，
-组分B：
当组分A是LNT时，其为pLNH II，或者
当组分A是LNnT时，其为pLNnH。
4.根据权利要求1或2所述的混合物，其基本上由以下组成：
-LNTri II，
-组分A，其为LNT或LNnT，
-组分B：
当组分A是LNT时，其为pLNH II，或者
当组分A是LNnT时，其为pLNnH，和
-乳糖。
5.根据权利要求1-3所述的混合物，其含有，或者基本上由以下组成：LNTri II、LNnT、pLNnH和任选的乳糖，并且其中LNTri II、pLNnH和任选的乳糖相对于LNnT的重量比为：
LNTri II:LNnT不大于0.1；
pLNnH:LNnT不大于0.4，优选地不大于0.03；并且
乳糖:LNnT为0至不大于0.8，优选地不大于0.2。
6.根据权利要求1-3所述的混合物，其含有，或者基本上由以下组成：LNTri II、LNT、pLNH II和任选的乳糖，并且其中LNTri II、pLNH II和任选的乳糖相对于LNT的重量比为：
LNTri II:LNT不大于0.2；
pLNH II:LNT不大于0.05；并且
乳糖:LNT为0至不大于0.6。
7.根据权利要求4所述的混合物，其基本上由LNTri II、LNnT、pLNnH和乳糖组成，并且其中乳糖、LNTri II和pLNnH相对于LNnT的重量比为：
乳糖:LNnT＝0.2-0.8，LNTri II:LNnT＝0.01-0.05，并且pLNnH:LNnT＝0.1-0.2。
8.根据权利要求4所述的混合物，其基本上由LNTri II、LNT、pLNH II和乳糖组成，并且其中乳糖、LNTri II和pLNH II相对于LNT的重量比为：
乳糖:LNT＝0.15-0.20，LNTri II:LNT＝0.05-0.12，并且pLNH II:LNT＝0.005-0.03。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的混合物，其包含在营养组合物或药物组合物中。
10.一种获得根据权利要求1-9中任一项所述的混合物的方法，其包括以下步骤：
a)提供基因改造的细胞，优选细菌细胞，更优选大肠杆菌(E.coli)细胞，其包含：
-第一重组基因，其编码N-乙酰基-葡糖胺基转移酶，所述N-乙酰基-葡糖胺基转移酶能够在所述细胞中将来自UDP-GlcNAc的GlcNAc转移到乳糖以形成LNTri II，
-第二重组基因，其编码半乳糖基转移酶，所述半乳糖基转移酶能够在所述细胞中将来自UDP-Gal的半乳糖基残基转移到LNTri II以形成组分A，所述组分A为LNT或LNnT，和
-编码所述细胞中指向所述UDP-GlcNAc和所述UDP-Gal的生物合成路径的基因，
b)将所述细胞在含有乳糖的培养基中培养，从而诱导：
-所述乳糖内化到所述细胞中，优选经由主动转运机制，和
-在所述细胞中形成LNTri II、组分A和组分B，当组分A是LNT时组分B是pLNH II，或者当组分A是LNnT时组分B是pLNnH，和
c)任选地，继续根据步骤b)培养，直至没有乳糖剩余，和
d)将LNnT、组分A、组分B和任选的乳糖的混合物从培养基中分离并隔绝。
11.根据权利要求10所述的方法，其中在步骤d)中，通过离心、超滤、离子交换然后脱色，对所述培养基进行处理。
12.根据权利要求11所述的方法，其中在步骤d)之后，通过纳米过滤对所述培养基进行处理，从所述培养基中除去水。
13.一种抗感染组合物，其用于预防和/或治疗人体内的细菌和/或病毒感染，特别是肠道和呼吸道感染，所述抗感染组合物包含含有LNTri II、组分A和组分B的混合物，优选为根据权利要求1-9中任一项所述的混合物，组分A是LNT或LNnT，当组分A是LNT时组分B是pLNHII，或者当组分A是LNnT时组分B是pLNnH。
14.一种调节人的微生物群以增加双歧杆菌(Bifidobacterium)丰度的方法，所述方法包括对人施用包含LNTri II、组分A和组分B的混合物，优选为根据权利要求1-9中任一项所述的混合物，组分A是LNT或LNnT，当组分A是LNT时组分B是pLNH II，或者当组分A是LNnT时组分B是pLNnH。
15.一种预防和/或治疗人体内病毒和/或细菌感染、特别是肠道和呼吸道感染的方法，所述方法包括对人施用包含LNTri II、组分A和组分B的混合物，优选为根据权利要求1-9中任一项所述的混合物，组分A是LNT或LNnT，当组分A是LNT时组分B是pLNH II，或者当组分A是LNnT时组分B是pLNnH。
16.一种使LNnT结晶的方法，其中使用一种或多种单羟基C1-C4醇和/或丙酮作为抗溶剂由包含LNnT、LNTri II、pLNnH和任选的乳糖的混合物进行结晶，其中乳糖、LNTri II和pLNnH相对于LNnT的重量比为：
乳糖:LNnT＝0-0.2，LNTri II:LNnT不大于0.1，并且pLNnH:LNnT不大于0.03。
17.一种使LNT结晶的方法，其中使用一种或多种单羟基C1-C4醇作为抗溶剂由包含LNT、LNTri II、pLNH II和任选的乳糖的混合物进行结晶，其中乳糖、LNTri II和pLNH II相对于LNT的重量比为：
乳糖:LNT＝0-0.2，LNTri II:LNT不大于0.15，并且pLNH II:LNT不大于0.05。
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