CN103764835A - 通过生物技术方法获取低聚糖 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过生物技术手段获取低聚物，改进生物技术方法来生产在母乳中特定存在的低聚糖，具体地是从乳糖-N-丙糖生产低聚糖乳糖-N-新四糖和乳糖-N-四糖，其中乳糖-N-丙糖来源于富含适于用其前体：乳糖和N-乙酰-葡萄糖胺生产乳糖-N-丙糖的酶的培养上清液。

Description

通过生物技术方法获取低聚糖
技术领域
本发明涉及通过生物技术手段获取存在于母乳中的特定低聚糖，尤其是乳糖-N-新四糖（lacto-N-neotetraose）和乳糖-N-四糖（lacto-N-tetraose）。
背景技术
低聚糖为天然存在于水果、蔬菜、人乳以及蜂蜜中的短链碳氢化合物（聚合度为2-7）。由于其生物及生理特性，它们作为功能成分尤其是其益生元活性被认为是非常重要的。
存在于人乳中的低聚糖具有重要的生物作用，因为它们可能与新生儿的抗感染有关。它们通过阻止某些病原体（病毒和细菌）粘附在肠的上皮组织，引发局部免疫系统，充当益生元的作用。
母乳中包括130种以上不同的低聚糖，是第三丰富的组分。母乳哺育进行一年后其中的低聚糖含量低于初始数星期的一半。测量发现低聚糖在不同动物乳汁中的质量和数量有所不同。人乳低聚糖中最丰富的单体为D-葡萄糖、D-半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、L-海藻糖、N-乙酰甘露糖胺丙酮酸。所有的这些单体通过加成L-海藻糖和/或唾液酸基团而被修饰，分别生成所谓的中性或酸性低聚糖，其中的150-200已经被描述。随着母乳哺育进行，它们在乳汁中的含量下降，然而，似乎在头几个月具有相关生理作用。
乳糖通过糖基转移酶（GT）形成最重要的中性低聚糖，例如人乳中形成的最丰富的中性低聚糖是乳糖-N-丙糖（lacto-N-triose）和乳糖-N-四糖（lacto-N-tetraose）以及乳糖-N-岩藻五糖（lacto-N-fucopentaose）的不同异构体。母乳中未被消化的低聚糖部分刺激了结肠中双歧杆菌的生长，并且这些菌落对保护预防肠道感染有益。因此，低聚糖是先天免疫系统的主要成分，通过母乳哺育过程妈妈们保护她们的孩子远离病原体（肠道病原体或作用其他部分的病原体）。
值得注意的是，在山羊奶，绵羊奶以及牛奶中没有发现这些产品。并且，这些产品不存在与人造奶中，所以，向人造奶中添加它们具有明显的社会和经济效益。在此意义上，对于它们的生产和随后的应用有四种可能。
ⅰ）第一种可能是从人奶中纯化它们。这个选择是不可取的，因为缺乏原材料。
ⅱ）第二种可能是化学合成。虽然这是可能的，但它们的成本高且效率低。
ⅲ）第三种选择是以使用酶为基础通过乳糖生产不同的低聚糖。该计划是基于使用来自不同来源（微生物或哺乳动物）的不同的糖苷酶和糖基转移酶。优选使用具有更高效率的糖基转移酶，然而由于它们中许多来源于动物而太过昂贵。因此，在不同微生物（大肠杆菌，毕赤酵母和酿酒酵母）中表达基因编码这样的一种酶的工作已经实施，其目的是过度生成它们，虽然该途径从没达到半工业化规模。
ⅳ）最终，最后的计划包括通过遗传工程技术构建能够生产低聚糖的微生物。在此意义上，通过表达脑膜炎双球菌的三个基因取得了初步进展，在大肠杆菌菌株中编码N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖转移酶以及唾液酸转移酶，其中乳糖转移者的表达即编码基因可以通过甘油诱导。虽然该方法取得成功，将获得产品用于婴儿食品的销售是复杂的，因为致病的细菌是基因的供体和受体且获得的材料是产生于要求特殊标记的转基因生物体。当在发酵罐中生长且透性化，不同的转基因细菌能够生产不同的酶活性体，并且涉及合成感兴趣的低聚糖的细胞前体也已经成功构建。所述方法涉及四种不同的微生物使得其工业应用的可能困难。
关于该领域现状在本文件中进行描述，较早方法如JP11253191A，提供了一种酶促合成乳糖-N-四糖的方法，适合以任何剂量用于食品及药用产品中。该方法包括在β-1、3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的存在下UDP-葡萄糖酰胺（UDP-GlcNac）在乳糖上反应，合成乳糖-N-丙糖，随后在β-半乳糖苷酶存在下与半乳糖结合，因此得到乳糖-N-四糖。
文件US2007/0275881 A1涉及药剂组分及其在治疗传染性疾病中的用途。这些组分包括绑定在感兴趣的低聚糖（例如乳糖-N-四糖和乳糖-N-新四糖）上的多肽。该文件描述这些低聚糖是在相应糖基转移酶存在下在酵母菌中获取。
发明文件US7521212 B1涉及通过微生物方法生产低聚糖，例如在乳糖和葡萄糖酰胺以及酶β-1-3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和β-1-4-半乳糖基转移酶的存在下，得到乳糖-N-新四糖。其也描述了获取中间产物乳糖-N-丙糖。
文件US 6204431 B1涉及制造非人类转基因动物能够在其乳汁中生产某些低聚糖。在所述文件中为了发明描述的目标，选择来自真核或原核生物的例如β-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因序列，并且插入到胚胎的前核中从而获得转基因动物。
文件ES2162619 T3描述了三步骤获得低聚糖组分的设备和方法，该方法使用人类葡萄糖基转移酶和半乳糖基转移酶，并且文件US 5879912描述了一种合成低聚糖、多糖、糖脂和糖蛋白的方法。它描述了在两个细胞培养物提供两种酶的条件下合成乳糖-N-新四糖，其中两种酶具有糖基转移酶活性使得在UPD-葡萄糖酰胺和乳糖的存在下形成β-半乳糖1-4葡萄糖和β-葡萄糖酰胺1-3键。
发明目标
本发明涉及改进生物技术生产方法来生产在母乳中特定存在的低聚糖，具体地是从乳糖-N-丙糖生产低聚糖乳糖-N-新四糖和乳糖-N-四糖，其中乳糖-N-丙糖来源于富含适于用其前体，乳糖和N-乙酰-葡萄糖胺，生产乳糖-N-丙糖的酶的培养上清液。
附图说明
图1表示低聚糖：乳糖-N-丙糖、乳糖-N-新四糖，乳糖-N-四糖的酶促形成。
图2表示平板检测N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶的活性（实施例3）。
图3表示温度和培养基对于黑曲霉nagA酶活性的影响，其中黑曲霉nagA酶从酿酒酵母(S.cerevisiae)重组菌的液体培养基中重新获得（实施例4）。
图4表示在酿酒酵母或毕赤酵母（P.pastoris）重组体用于嗜热链球菌（S.thermophilus）lacZ酶的液体培养基（A）或细胞上清液（B）中对β-半乳糖苷酶活性的测定（实施例5）。
图5表示在酿酒酵母中过度表达的嗜热链球菌lacZ的亚细胞定位（实施例6）。
图6表示在嗜热链球菌lacZ基因的E.大肠杆菌转化株中平板检测β-半乳糖苷酶的活性体（实施例7）。
图7表示在培养基中获取乳糖-N-丙糖的过程（实施例8）。
图8表示底物浓度对培养基中体内生产乳糖-N-丙糖的影响（实施例9）。
图9表示在两个连续步骤中获取乳糖-N-四糖和乳糖-N-新四糖的过程（实施例10）。
发明详述
本发明获得的低聚糖是四糖类乳糖-N-新四糖和乳糖-N-四糖。这些四糖存在于母乳中并且通过N-乙酰氨基葡萄糖（β-1-3键）加成在一个单元的乳糖上产生乳糖-N-丙糖。乳糖-N-新四糖（β-1-4键）和乳糖-N-四糖（β-1-3键）可以通过乳糖-N-丙糖在β-半乳糖基转移酶存在下获得。因此，该四糖依靠两个连续行为制得，即β-（1,3）-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶行为，然后是β-（1,3）-或β-（1,4）-半乳糖基转移酶行为。
所感兴趣的低聚物，即乳糖-N-新四糖和乳糖-N-四糖以及作为中间体的乳糖-N-丙糖，需要遵循酶促转糖基反应的简化方法（如图1所示）。
生产乳糖-N-丙糖、乳糖-N-新四糖和乳糖-N-四糖所需的酶是由S.酿酒酵母属转基因酵母菌产生并分泌到培养基中的。为了使用生产供人类消耗的酶的微生物，必须达到在所谓的“GRAS”（通常认为是安全的）列出的集中于这些微生物条件的一系列的法律要求，即，该微生物必须符合某些安全条例。有50种被认可的GRAS微生物用于食品工业。在本发明中，所有编码酶活性的基因源于GRAS微生物以防止被拒绝的问题。选择的基因是:黑曲霉（Aspergillus niger）nagA基因和嗜热链球菌lacZ基因。
在过程第一步所需酶活性已经被证明存在于牛血清、牛初乳中，并且该酶被米曲霉（Aspergillus oryzae）和构巢曲霉（Aspergillus nidulans）菌的nagA基因编码（两个酶具有N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性）。
由于与葡萄糖氨基转移酶-编码基因已识别的菌种（Matsuo2003）相似，公众可以得到其序列及其GRAS状态，黑曲霉被选为实现本发明目标的酶活性体的来源。必须表明的是，即使黑曲霉菌种中已经发现这种活性体，相应的基因的基因序列并未被识别。因此，为了本发明的目的，有必要首先识别黑曲霉中的基因，该基因与构巢曲菌的nagA基因同源。黑曲霉nagA基因的核苷酸序列如序列表编号1所示。
第二步通过半乳糖基转移酶实施的。该行为已经在一些细菌和真菌β-半乳糖苷酶（丝状真菌米曲霉,两歧双歧杆菌，环状芽孢杆菌）中证明。
这种情况下，编码β-半乳糖苷酶的基因（lacZ）的嗜热链球菌的酶被选为半乳糖转移酶活性体的来源用于实现本发明目的的方法，因为所述基因在其他乳酸菌中编码这些行为，并且已知嗜热链球菌能够通过作用于乳糖而催化转糖基反应（Smart1991,Reuter et al.1999）。lacZ基因在嗜热链球菌中被识别，并且如序列表编号2所示。
另一方面，由于酿酒酵母分泌克隆酶到液体培养基中，有必要使用分泌信号肽来融合它们。对于酿酒酵母的三种最广泛研究的分泌物信号肽是α-因子分泌物信号肽（Brake et al.1989），序列表编号3，SUC2转化酶分泌物信号肽（Perlman et al.1982），序列表编号4，和PHO5酸性磷酸酶分泌物信号肽（Arima et al.1983）序列表编号5。
因此，编码酶nagA和lacZ的基因可以在酿酒酵母转化株中表达，酿酒酵母转化株可以通过插入本发明的DNA到两个载体，并将所述载体引入到寄主中获得。早期酿酒酵母转化方法涉及去除细胞壁来生产去壁细菌细胞，用钙和聚乙烯乙二醇处理去壁细菌细胞可以吸收DNA(Hinnen etal.1978)。该转化株被种植在等压选择性培养基上进行细胞壁再生。后来发展了很多实践方法使用经受锂离子的处理完整细胞(Ito et al.1983)。该方法迄今使用，虽然其比前述方法效率低；然而，使用二甲基亚砜的修饰使得转化频率增长高达25倍。第三种方法，近来使用电穿孔获得非常高的效率(Meilhoc et al.1990)。
为本发明目的而使用的载体可以是任何在合适的寄主中能够表达编码酶基因的那些。所述载体例如可以包括：质体、噬菌体、黏质体载体。所述载体通常包括调节因子例如启动子；它们必须在离启动子短距离内具有一个区域来提供基于核糖体转录的入口；并且最后它们必须包含一个复制来源允许其在寄主中增殖。此外，选择的载体对于每个蛋白质具有不同的筛选标记基因用于解救不同的营养缺陷体，其可以一步内同时引入一个载体并在该寄主中筛选。最广泛用于筛选标记酿酒酵母的是LEU2、TRP1、URA3和HIS3，它们分别用于同亮氨酸、色氨酸、尿嘧啶和组氨酸营养缺陷体相应的突变菌株中（Beggs1978;Rose et al.1984;Struhl et al.1980;Tschumper et al.1980）。这些营养缺陷体菌株是可以得到的，并且它们的筛选要求使用不包含相关的营养物的最小生长媒介。以下类型培养基的集散地可以作为获取所述菌株的来源被提及：美国典型培养物保藏中心的酵母基因保藏中心（Yeast Genetics Stock Culture Centerof the American Type Culture Collection）(http://www.atcc.org/SearchCatalogs/YeastGeneticStock.cfm.),EUROSCARF(http://www.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/esuoscarf/col_index.html),基因研究所（Research Genetics）(http://www.resgen/products/YEASTD.php3),酵母菌培养物国家中心（National Collection of Yeast Cultures）(http://www.ncyc.co.uk/Sacchgen.html.),Centraalbureau voorSchimmelcultures(http://www.cbs.knaw.nl/yeast/WebC.ASP)以及酵母属酿酒酵母培养物中心（Culture Collection of Saccharomyces cerevisiae）(http://www.natur.cuni.cz/fccm/federacs.htm#dgub)。
在以下提及的寄主可以用于引入包含本发明的DNA的表达载体：酵母菌、细菌、昆虫的培养细胞、哺乳动物等。优选使用酿酒酵母属酵母菌，但是裂殖酵母、毕赤酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热链球菌也同样理想。
为了检测nagA基因在寄主中的表达，可以使用合成基质甲基伞基（MU）-N-乙酰氨基葡萄糖或p-硝基苯基（PNP）-N-乙酰氨基葡萄糖，通过平板检测，或在液态介质中，来检测在所获取的转化株中表达的酶的水解N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性(Borooah et al.1961)。在平板检测中，作为水解N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的结果，甲基伞型酮的形成通过紫外灯下荧光分析进行定性检测。甲基伞型酮是荧光化合物，在366nm紫外灯的照射下发出荧光。液态分析可以通过分析在405nm处的吸收度来定量活性，这是由于作为水解的N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶活性的结果，所释放的有色化合物p-硝基酚在碱性溶液中吸收405nm波长。
相似地，为了鉴定在寄主中lacZ基因的表达，分别使用合成基质甲基伞型基（MU）-半乳糖或p-硝基苯基（PNP）-半乳糖皮蒽，通过平板检测或在液体培养基中，合理分析获取转化株中表达的酶的水解β-半乳糖苷酶活性(Maruhn1976)。在平板检测中，作为水解N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的结果，甲基伞型酮的形成通过紫外灯下荧光分析进行定性检测。甲基伞型酮是荧光化合物，在366nm紫外灯的照射下发出荧光。液态分析可以通过分析在405nm处的吸收度来定量活性，这是由于作为水解的N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶活性的结果，所释放的有色化合物p-硝基酚在碱性溶液中吸收405nm波长。
平板检测可以快速筛选具有更高基因表达的克隆体。另一方面，液体分析可以定量活性和分泌物，因为在培养基中的和在单独细胞中的活性是各自被分析的。
一旦鉴定了筛选的重组酶的活性，有可能同时在相同的菌株中使用解救不同营养缺陷体的质体来表达它们。使用的质体可以是属于Mumberg等人描述的那些收集的(1995)，它们由一些表达载体与四个启动子、两个复制来源以及四个不同的标记物结合形成。通过使用这些载体，能够控制不同程度的基因表达，控制转录水平以及重组基因的复制数量。
一旦筛选了每个酶具有更大活性的转化株或在相同菌株具有同步活性的转化株，能够使它们生长到较高浓度获取具有高的酶促活性的培养基或大量具有细胞内活性的细胞，前提是该酶不是被分泌出的。这些培养基或细胞提取物可以直接作为体内反应床使用，来通过它们的前体细胞乳糖和N-乙酰-氨基葡萄糖获取感兴趣的低聚糖，而无需纯化相应的蛋白质。或者，酶可以被纯化以用来获得感兴趣的低聚糖。
因此，最终获得感兴趣的低聚糖包括两个阶段，第一阶段在43-47℃下持续70-74个小时，优选在45℃持续72小时，在该阶段使用培养基或者细胞提取物（前提是该蛋白质分别是分泌的或者不是分泌的）或者纯化蛋白的nagA活性，通过其前体乳糖和N-乙酰-氨基葡萄糖生成乳糖-N-丙糖。当这个阶段结束，纯化乳糖-N-丙糖或者继续进行第二阶段生成乳糖-N-四糖和乳糖-N-新四糖。第二个阶段在45℃下持续36小时，使用液反应培养基或细胞提取物的lacZ活性，取决于是否有重组酶被分泌，或有适当的纯化蛋白质，在第二阶段中由第一阶段得到的液体反应基中的乳糖-N-丙糖和半乳糖生成的乳糖-N-四糖和乳糖-N-新四糖。
在本发明优选的实施例中，获取乳糖-N-四糖和乳糖-N-新四糖的微生物的方法被实施，使得从由富含nagA活性的培养基和具有lacZ活性的细胞提取物，源自表达且分泌nagA和表达且不分泌lacZ的单一菌株，经两连续步骤，在体内所得的乳糖-N-四糖和乳糖-N-新四糖为1-100g/l反应基。
为达到本发明的目的，也计划可能通过使用同时存在于相同培养基或相同具有lagZ活性的细胞提取物的两种酶的活性来实施该反应，该细胞培养基或细胞提取物源自表达且分泌nagA和lacZ的单一菌株。
最后，根据本发明获取的低聚物通过本领域现今知悉的普通技术从反应介质中提取和纯化。在木炭上色谱分离(Whistler et al.1950)是优选使用的低聚物纯化技术。
一旦纯化，这些低聚物作为食品材料组成食品产品用于消费。
实施例
实施例1：黑曲霉nagA基因的核苷酸序列（图2）
在黑曲霉中编码N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性的基因通过与构巢菌nagA基因同源而被识别。所述参照基因的序列可获得自，并被注释，数据库(http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/aspergillus_group)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer/fcgi?db=protein&id=10039359)。它们表达得到的蛋白质与序列表编号6一致。
比较前述氨基酸序列与数据库(http://genome.igi-psi.org/Asoni1/Asoni1.home.html)中得到的黑曲霉基因组，至少有两个可能的基因与构巢菌nagA基因直系同源。这两个基因中，序列表编号1的基因序列是由它的更大同源性而被克隆的，并且在数据库中作为编码假定的N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性来描述的。通过两个基因编码的氨基酸序列校准显示71.3%同源。按照Mullis等(1986)描述的方法和材料，通过来自黑曲霉的DNA基因组的聚合酶链反应（PCR）来进行克隆。
实施例2：嗜热链球菌的lacZ基因的核苷酸序列
编码嗜热链球菌β-半乳糖苷酶的lacZ基因的序列被识别，并且可在数据库中得到，且其与序列表编号2一致。蛋白质描述为大约124kDa的四聚物。lacZ基因按照Mullis等(1986)描述的方法和材料，通过来嗜热链球菌的DNA基因组的聚合酶链反应（PCR）来进行克隆。
实施例3:平板检测在酿酒酵母中过度表达的黑曲霉nagA基因的N- 乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性体
由质体p415GPD-nagA-LEU2在单倍体菌株BY4741(MATa HIS3D1LEU2D0MET15D0URA3D0)中生产的转化株，在富含YPD的介质中生长，介质由10g/l的酵母提取物(Scharlau Chemie S.A.),20g/l的细菌蛋白胨(Pronadisa)和20g/l的葡萄糖(Panreac Química S.A.U.)作为碳源，使用2%琼脂(Pronadisa)凝固配制而成。
含有浓度为1mM的甲基伞型（MU）N-乙酰-氨基葡萄糖基质的在45mM的柠檬酸缓冲液中的液化溶液，pH值为4.8，1%琼脂糖，被倾倒到平板上，在50℃下遮光培育30分钟后在紫外灯下观察。N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性产生荧光物质甲基伞型酮，当其被366nm紫外灯照射发出荧光。
如图2所示，相对于不表达nagA（B）的对照组菌株，在那些能够分泌nagA酶（A）的克隆体周围发现荧光光晕。
实施例4：温度和培养基对于黑曲霉nagA酶活性的影响，其中黑曲 霉nagA酶从酿酒酵母(S.cerevisiae)重组菌株的培养基中重新获得
为了优化在酿酒酵母中nagA基因的表达，进行了介质组分和/或生长温度是否能够影响酶表达和/或分泌的研究。
为了该目的，使用质体p415GPD-nagA-LEU2，通过转化单倍体菌株BY4741(MATa HIS3D1LEU2D0MET15D0URA3D0)生产重组菌株。转化株在合成的SD介质中筛选，SD介质基于6.7g/l的没有氨基酸的酵母氮基(Difco)并补充20g/l的葡萄糖(Panreac Química S.A.U.)作为碳源和200mg/l的组氨酸(Merck),尿嘧啶(Calbiochem)以及蛋氨酸(Fluka)作为所需营养。
首先，细胞在最小筛选介质和肥沃介质中平行培养。基于6.7g/l的没有氨基酸的酵母氮基(Difco)并补充20g/l的葡萄糖(PanreacQuímica S.A.U.)作为碳源和200mg/l的组氨酸(Merck),尿嘧啶(Calbiochem)以及蛋氨酸(Fluka)作为所需营养合成SD介质作为最小介质；使用10g/l的酵母提取物(Scharlau Chemie S.A.),20g/l的细菌蛋白胨(Pronadisa)和20g/l的葡萄糖(Panreac Química S.A.U.)作为碳源配制YPD作为肥沃介质。
在两种介质中生长的菌株产生的培养基用于N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性的检测，该检测在液体介质中使用P-硝基苯基（PNP）-N-乙酰-氨基葡萄糖作为反应基质。为了该目的，使用小份的每个液体培养基并且用存在基质的pH值为4.8的浓度为0.09M柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液稀释，在30℃下培育30分钟。水解N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性由于其释放p-硝基酚，通过测定在405nm处的吸光度进行定量，p-硝基酚为颜色化合物，在碱性溶液中在波长405nm处有吸收，作为相同结果。
如图3中观察的，在肥沃介质中生长的菌株的培养基上清液中活性是在最小筛选介质中生长的菌株的培养基上清液中活性的几乎三倍，清楚的表明培养介质对于nagA酶表达和/或分泌的影响。
对于生长温度，筛选的转化株分别在三个不同温度28,30和32℃下在YPD介质中平行生长，YPD介质使用10g/l的酵母提取物(ScharlauChemie S.A.),20g/l的细菌蛋白胨(Pronadisa)和20g/l的葡萄糖(Panreac Química S.A.U.)作为碳源配制。该液体培养基以其在液体介质中的水解N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性进行分析。为了该目的，使用小份的每个液体培养基并且用存在基质P-硝基苯基（PNP）-N-乙酰-氨基葡萄糖的pH值为4.8的浓度为0.09M的柠檬酸盐/磷酸盐缓冲溶液稀释，在30℃下培育30分钟。水解N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性由于其释放p-硝基酚，通过测定在405nm处的吸光度进行定量，p-硝基酚为颜色化合物，在碱性溶液中在波长405nm处有吸收，作为相同结果。
如图3所示，随着生长温度的下降，在培养基上清液中的重新获得的活性逐渐增加，生长温度从32降到28℃活性体增大50%。因此，对于nagA的生长和分泌而言，26-30℃是优选的生长温度。
如图4所示，当nagA转化株在肥沃介质中生长时，在液体培养基中重新获得的N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性高达3倍，当生长温度进一步降低到28℃时，重新获得的活性多于4倍。
实施例5：测定在酿酒酵母和毕赤酵母中过度表达的嗜热链球菌lacZ 基因的β-半乳糖苷酶活性
分别使用质体p416GPD-lacZ-URA3来转化单倍体菌株BY4741(MATa HIS3D1LEU2D0MET15D0URA3D0)并且使用质体pPICzaB-lacZ来转化野生型单倍体菌株X-33来生产酿酒酵母和毕赤酵母的重组菌株。酿酒酵母转化株在合成的SD介质中筛选，SD介质的合成基于6.7g/l的没有氨基酸的酵母含氮基(Difco)并补充20g/l的葡萄糖(PanreacQuímica S.A.U.)作为碳源和200mg/l的组氨酸(Merck),亮氨酸(Merck)和蛋氨酸(Fluka)作为所需营养。毕赤酵母转化株在YPDS介质中筛选，YPDS介质的配方为10g/l的酵母提取物(Scharlau ChemieS.A.)，20g/l的细菌蛋白胨(Pronadisa)，20g/l的葡萄糖(Panreac QuímicaS.A.U.)作为碳源,1M的山梨醇(Applichem VWR)和100μg/ml的抗生素Zeocin(Invivogen)。
它们在指定的媒介中生长，并且决定了在培养基和在细胞上清液中的水解β-半乳糖苷酶活性。为了该目的，指定数量的培养基或细胞上清液用pH值为7的有基质P-硝基苯基（PNP）-半乳糖皮蒽存在下浓度为100mM的磷酸盐缓冲液稀释，在55℃下培育30分钟。水解β-半乳糖苷酶活性由于其释放p-硝基酚，通过测定在405nm处的吸光度进行定量，p-硝基酚有颜色在碱性溶液中在波长405nm处有吸收，作为相同结果。
如图4所示，在培养基上清液中没有检测到β-半乳糖苷酶活性。也没有检测到毕赤酵母的重组菌株或嗜热链球菌（A）。在细胞上清液中活性体的水平在两种生物体中是相近的（B）。
实施例6：嗜热链球菌lacZ重组体的lacZ在酿酒酵母中的亚细胞定 位
使用质体p416GPD-lacZ-URA3来转化单倍体菌株BY4741(MATaHIS3D1LEU2D0MET15D0URA3D0)生产酿酒酵母的重组菌株,并且酿酒酵母转化株在合成的SD介质中筛选，SD介质的合成基于6.7g/l的没有氨基酸的酵母含氮碱基(Difco)并补充20g/l的葡萄糖(PanreacQuímica S.A.U.)作为碳源和200mg/l的组氨酸(Merck),亮氨酸(Merck)和蛋氨酸(Fluka)作为所需营养。
重组体在肥沃YPD介质中生长，YPD介质由10g/l的酵母提取物(Scharlau Chemie S.A.)，20g/l的细菌蛋白胨(Pronadisa)，20g/l的葡萄糖(Panreac Química S.A.U.)作为碳源在28℃下配制。分开三个具有相同细胞数量的样本：准备完整细胞的悬浮液，其中一个用于分析细胞壁中的活性；样本中的另一个通过使用3mg/ml的裂解酶20T(Seikagaku)在37℃下处理15分钟制备原生质体，来评定细胞膜中的lacZ活性；最后，第三个样本机械细胞溶解并且制备细胞提取物评定细胞质中的lacZ活性。三个样本在相同的体积下准备的。
使用每个样品中的一份来实施测定液体介质中的水解β-半乳糖苷酶活性的实验，通过用pH值为7的有基质P-硝基苯基（PNP）半乳糖皮蒽存在下浓度为100mM的磷酸盐缓冲液稀释每个样品，并且在55℃下培育30分钟。水解β-半乳糖苷酶活性体由于其释放p-硝基酚,通过测定在405nm处的吸光度进行定量，p-硝基酚有颜色在碱性溶液中在波长405nm处有吸收，作为相同结果。
如图5中观察的，重新获得的活性在细胞溶液物中是细胞壁中的3倍多。来自制备的原生质体的细胞膜中极其少量的检测到活性。因此，在这种重组体中的lacZ活性大部分存在于细胞质中且小部分保留在细胞壁中。
实施例7：平板检测在大肠杆菌中过度表达的嗜热链球菌lacZ基因 的β-半乳糖苷酶活性体
使用质体p416GPD-lacZ URA3，通过转化菌株DH5α(fhuA2Δ(argF-lacZ)U169phoA glnV4√480Δ(lacZ)M15gyrA96recA1relA1endA1thi-1hsdR17)生产用于嗜热链球菌lacZ的大肠杆菌转化株，并且在LB介质中筛选，LB介质由5g/l的酵母提取物(Scharlau ChemieS.A.)，10g/l的胰化蛋白胨(Scharlau Chemie S.A.)，10g/l的氯化钠(NaCl)和浓度为100mg/l的氨苄西林(Calbiochem)配制而成.
pH值为6浓度为100mM的1%琼脂糖的磷酸盐缓冲液中含有浓度为1mM的甲基伞型（MU）-半乳糖皮蒽的液化溶液，其被倾倒到感光底片上，在50℃下遮光温育30分钟后在紫外灯下观察。β-半乳糖苷酶活性产生荧光物质甲基伞型酮，当其被366nm紫外灯照射发出荧光。
如图6所示，相对于不表达nagA（B）的对照组菌株，在那些能够分泌nagA酶（A）的克隆体周围发现荧光光晕。
实施例8：从富含nagA活性的培养基和其前体乳糖和N-乙酰-氨基 葡萄糖进行体内获取乳糖-N-丙糖
为了实施获得乳糖-N-丙糖的反应，使用质体p415GPD-nagA-LEU2通过转化单倍体菌株BY4741(MATa HIS3D1LEU2D0MET15D0URA3D0)生产重组菌株。转化株在合成的SD介质中筛选，SD介质的合成基于6.7g/l的没有氨基酸的酵母含氮基(Difco)并补充20g/l的葡萄糖(Panreac Química S.A.U.)作为碳源和200mg/l的组氨酸(Merck),尿嘧啶(Calbiochem)和蛋氨酸(Fluka)作为所需营养。
筛选的菌株分批的在4xYPD介质中长到OD40，4xYPD介质由40g/l的酵母菌提取物(Scharlau Chemie S.A.),80g/l的细菌蛋白胨(Pronadisa)和80g/l的葡萄糖(Panreac Química S.A.U.)作为碳源在28℃下配置直至饱和。
在培养基上清液中nag酶的存在通过测定小份液体培养基中水解N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性而验证，小份培养基用存在基质的pH值为4.8的浓度为0.09M柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液稀释，在30℃下培育30分钟。水解N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性由于其释放p-硝基酚,通过测定在405nm处的吸光度进行定量，p-硝基酚有颜色在碱性溶液中在波长405nm处有吸收，作为相同结果。
如图7中统计的，乳糖和N-乙酰-氨基葡萄糖以高浓度(分别是330g/l和100g/l)随后相继直接加入到培养介质中，并且在45℃下培育72小时。过滤上清液部分并且此处存在的乳糖-N-丙糖用HPLC测定。
实施例9：基础浓度对在培养基中体内乳糖-N-丙糖的生产的影响
为了优化体内乳糖-N-丙糖生产过程，使用递减数量的底物乳糖和N-乙酰-氨基葡萄糖实施上文描述的实验。使用416g/l的乳糖和125g/l的N-乙酰-氨基葡萄糖的反应作为参考，使用50%，33%，25%，10%和1%的底物浓度进行平行实验。
如图8所示，随着在介质中底物浓度的下降反应收率有所下降。然而，该趋势不成比例的，当底物浓度下降高达50%时只丢失7%的产物，下降高达99%时丢失33%。
实施例10：通过两个连续步骤从富含nagA活性和具有lacZ活性的 细胞提取物的培养基中，在体内获取乳糖-N-新四糖和乳糖-N-四糖，nagA 活性和具有lacZ活性细胞提取物源自表达且分泌nagA和表达且不分泌 lacZ的单一菌株
同时使用质体p415GPD-nagA-LEU2和p416GPD-lacZ-URA4转化单倍体菌株BY4741(MATa HIS3D1LEU2D0MET15D0URA3D0)。转化株在合成的SD介质中筛选，SD介质的合成基于6.7g/l的没有氨基酸的酵母含氮基(Difco)并补充20g/l的葡萄糖(Panreac Química S.A.U.)作为碳源和200mg/l的组氨酸(Merck)和蛋氨酸(Fluka)作为所需营养。获得的菌株为两种酶的重组体，只分泌nagA蛋白。这能够在相同的单一培养基中分离两种活性；nagA活性在培养基中富集而lacZ活性富集在细胞内。
如图9所示，菌株在4xYPD介质中生长到高浓度，4xYPD介质由40g/l的酵母提取物(Scharlau Chemie S.A.),80g/l的细菌蛋白胨(Pronadisa)和80g/l的葡萄糖(Panreac Química S.A.U.)作为碳源在28℃下配置直至饱和。然后该细胞从培养基上清液中分离。乳糖和N-乙酰-氨基葡萄糖以浓度分别是330g/l和100g/l加入到培养介质中，并且在45℃下培育72小时。然后细胞进行细胞溶解并且准备加入到反应中的细胞分泌物，在相同温度下再培育36小时。过滤一小部分反应液并且通过HPLC测定存在于其中的乳糖-N-四糖和乳糖-N-新四糖。乳糖-N-四糖和乳糖-N-新四糖测定在反应液中的量为3.5克每升。
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Claims (13)

1.一种生产乳糖-N-丙糖和/或乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖的方法，该方法包括使用至少一种微生物培养基进行反应，该培养基具有从乳糖生产乳糖-N-丙糖和/或乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖的酶的活性，该方法包括：
a)在β-（1,3）-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的存在下加入N-乙酰氨基葡萄糖以形成乳糖-N-丙糖，并且
b)在β-半乳糖转移酶的存在下加入半乳糖以形成乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖，
c)允许乳糖-N-丙糖和/或乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖的积累，并且
d)从所述反应混合物中恢复乳糖-N-丙糖和/或乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖。
2.根据权利要求1所述的微生物方法，其特征在于用于生产乳糖-N-丙糖和/或乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖所需的酶通过酿酒酵母属的转基因酵母菌产生。
3.根据权利要求2所述的微生物方法，其特征在于至少一种来自酿酒酵母属的酵母菌携带了包含有序列表编号1的黑曲霉nagA基因的重组载体，该基因表达的酶具有β-1-3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性。
4.根据权利要求2所述的微生物方法，其特征在于至少一种来自酿酒酵母属的酵母菌携带了包含有序列表编号2的嗜热链球菌lacZ基因的重组载体，该基因表达的酶具有β-半乳糖基转移酶活性。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于来自酿酒酵母属的单一的酵母菌携带了一种或多种载体包含有序列表编号1的黑曲霉nagA基因，该基因表达的酶具有β-1-3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性，和序列表编号2的嗜热链球菌lacZ基因，该基因表达的酶具有β-半乳糖基转移酶活性。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和/或β-半乳糖基转移酶的活性从液体培养基、细胞提取物或培养介质中纯化的酶中恢复。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于该方法的所述步骤（a）在43-47℃中持续大约70-74小时。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于该方法的所述步骤（b）在45℃中持续大约72小时。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于其另外包含萃取和纯化步骤（a）中得到的乳糖-N-丙糖的步骤。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于在步骤（b）中使用的β-半乳糖基转移酶是β-1-3-半乳糖基转移酶来形成乳糖-N-四糖和/或β-1-4-半乳糖基转移酶来形成乳糖-N-新四糖。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖从源自富含nagA活性的培养基和具有lacZ活性的细胞提取物体内获取，nagA活性和lacZ活性源自酿酒酵母属的单一的酵母菌表达且分泌序列表编号1的nagA基因且表达且不分泌序列表编号2的lacZ基因。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖从源自富含nagA活性的培养基和具有lacZ活性的细胞提取物体内获取，nagA活性和lacZ活性源自酿酒酵母属的单一的酵母菌表达且分泌序列表编号1的nagA基因并且表达且分泌序列表编号2的lacZ基因。
13.根据权利要求1-12的方法获取的乳糖-N-丙糖、乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖，在食品产品中作为食品成分的用途。
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