CN103597084A

CN103597084A - 增强的纤维糊精代谢

Info

Publication number: CN103597084A
Application number: CN201280017018.1A
Authority: CN
Inventors: 詹姆斯·H·多德纳-凯特; 陈勇秀; 乔纳森·M·加拉兹卡; 析辰河
Original assignee: University of California; University of Illinois
Current assignee: University of California; University of Illinois
Priority date: 2011-02-07
Filing date: 2012-02-07
Publication date: 2014-02-19
Also published as: JP2014506464A; US20140057323A1; AU2012214520A1; BR112013020133A2; CA2826570A1; WO2012109274A1; EP2673367A1

Abstract

本发明涉及一种宿主细胞，该宿主细胞含有重组纤维糊精转运蛋白、重组纤维糊精磷酸化酶、重组β-葡萄糖苷酶、重组葡萄糖磷酸变位酶或重组己糖激酶中的两种或更多种；以及用这些细胞降解纤维糊精，以从纤维糊精产生碳水化合物和碳水化合物衍生物和在葡萄糖利用期间降低ATP消耗的方法。

Description

增强的纤维糊精代谢

相关申请的交叉引用

该申请要求2011年2月7日提交的美国临时申请61/440,305和2011年12月2日提交的美国临时申请61/566,548的权益，两个申请的全部内容在此通过引用并入本文中。

作为ASCII文本文件提交的序列表

ASCII文本文件提交的内容在此通过引用并入本文中：计算机可读形式(CRF)序列表(文件名:677792001340SeqList.txt,记录日期:2012年2月6日,大小:1209KB)。

技术领域

本发明涉及用于降解纤维糊精和用于生产碳氢化合物和碳氢化合物衍生物的方法和成分。

背景技术

由于对能源安全、可持续性和全球气候变化(Lynd等人，Science,1991)的关注上升，生物燃料得到密集调查。植物来源的木质纤维素材料至生物燃料的生物转化被视为化工生产化石燃料的有吸引力的替换(Lynd等人，Nat Biotech,2008；Hahn-Hagerdal等人，Biotechnol Biofuels,2006)。将木质纤维素生物质有效地转化为乙醇的微生物工程依然是生物燃料领域的主要目标。大量的研究都集中在使单糖自然发酵成醇的微生物通过基因操作表达能降解木质纤维素生物质多聚体并在一个细胞内产生乙醇的纤维素酶和其它的酶，这一过程称为联合生物加工（consolidated bioprocessing,CBP）。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），又称为面包酵母，几千年来用于将单个己糖进行生物转化成为乙醇。使用微生物将D-葡萄糖发酵成乙醇是最广泛使用的大规模工业发酵。酿酒酵母是使木质纤维素生物质进行生物转化成为生物燃料的非常合适的候选者(van Maris等人，Antonie Van Leeuwenhoek,2006)。深入研究了遗传和生理学背景，充足的遗传工具，和对木质纤维素水解产物中存在的高浓度乙醇和抑制剂的高耐受性(Jeffries,Curr Opin Biotechnol,2006)。酿酒酵母在低PH发酵也可以在发酵期间防止细菌污染。

但是，酿酒酵母不能使更复杂的生物质聚合物，比如存在于植物细胞壁的纤维素，自然地降解和发酵。在使生物质自然降解的那些有机体，比如粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）和里氏木霉（Trichoderma reesei）中，用于降解生物质聚合物的酶广受欢迎。对粗糙脉孢菌降解植物细胞壁的最近的研究表明，除了表达各种纤维素酶，粗糙脉孢菌表达响应纤维素的纤维糊精转运蛋白和胞内β-葡萄糖苷酶(Tian等人，PNAS USA106,22157,2009;Galazka等人，Science330,84,2010)。纤维糊精为β(1→4)连接的葡萄糖低聚糖并且为通过真菌纤维素酶进行纤维素解聚的产物(Zhang and Lynd,Biotechnol Bioeng88,797,2004)。β-葡萄糖苷酶将纤维糊精水解为葡萄糖。

改造成表达纤维糊精转运蛋白和胞内β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母能以纤维糊精作为唯一碳源生长并且将纤维二糖有效地发酵成乙醇(Galazka等人，Science330,84,2010)。但是，使用β-葡萄糖苷酶使纤维糊精水解成葡萄糖需要在反应中将所有产生的葡萄糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸，该反应在发生进一步加工之前，每个葡萄糖消耗1ATP。当ATP供应不足时，这是个问题。

此外，纤维糊精转运之后进行胞内水解有利于使纤维素来源的葡萄糖和半纤维素来源的木糖共发酵，这是酿酒酵母通常无法做到的。但是，这些工程菌株可能不以最优的代谢发酵葡萄糖，因为，该菌株用于检测和响应葡萄糖的存在的内源系统取决于胞外的葡萄糖水平。在该工程菌株中，由于通过将纤维糊精转运到细胞中并且在胞内将纤维糊精降解为葡萄糖，从而在胞内产生葡萄糖，因此胞外的葡萄糖水平不再与细胞可用的葡萄糖水平联系在一起。

因此，需要改良工程酵母菌株，使该工程酵母菌株能进行联合生物加工，将生物质聚合物加工成生物燃料和其它有用的化学制品，并且当使从纤维糊精的裂解中产生的葡萄糖磷酸化时，消耗更少的ATP。

发明内容

为了满足上面的需求，本发明提供宿主细胞，该宿主细胞含有重组纤维糊精转运蛋白、重组纤维糊精磷酸化酶、重组β-葡萄糖苷酶、重组葡萄糖磷酸变位酶或重组己糖激酶的宿主细胞中的两种或更多种；以及用这些细胞降解纤维糊精、用于从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物和用于在纤维糊精利用期间降低ATP的消耗的方法。此外，本发明至少部分基于新发现：与表达β-葡萄糖苷酶的酵母菌株相比，改造成表达胞内纤维糊精磷酸化酶而不是β-葡萄糖苷酶的酵母菌株在利用纤维糊精时，消耗更少ATP并产生几乎等量的乙醇。因此，纤维糊精磷酸化酶利用无机磷酸盐裂解纤维糊精中的葡萄糖部分之间的β糖苷键。磷酸解反应在每个裂解反应中节约1ATP当量并引起葡萄糖-1-磷酸释放（图1）。接着得到的葡萄糖-1-磷酸通过葡萄糖磷酸变位酶转化成葡萄糖-6-磷酸（图1）。此外，该酵母可以直接将得到的葡萄糖-6-磷酸用于生长和发酵。

因此，本发明的一些方面涉及一种降解纤维糊精的方法，通过：a）提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有重组纤维糊精转运蛋白和重组多肽，所述重组多肽含有

Y-x(2)-G-x-[KR]-E-N-[AG]-[AG]-[IV]-F-x(2)-[ANST]-[NST]-x(2)-[AIV]-x(2)-[AGT]-x(4)-[AG]-x(4)-[ADNS](SEQ ID NO:233)，

Y-Q-[CN]-M-[IV]-T-F-[CN]-[FILMV]-[AS]-R-[ST]-[AS]-S-[FY]-[FY]-E-[STV]-G-x-[GS]-R-G-[IM]-G-F-R-D-S-[ACNS]-Q-D-[ILV]-[ILMV]-G-x-V-H-x-[IV]-P-[ADEST]-x-[AV]-[KR]-[AEQ]-x-[IL]-[FIL]-D(SEQ ID NO:14),或

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中，该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养该宿主细胞，藉此纤维糊精转运到细胞中，并被重组多肽降解。本发明的其它方面涉及一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，通过：a）提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有重组纤维糊精转运蛋白和重组多肽，该重组多肽含有

Y-x(2)-G-x-[KR]-E-N-[AG]-[AG]-[IV]-F-x(2)-[ANST]-[NST]-x(2)-[AIV]-x(2)-[AGT]-x(4)-[AG]-x(4)-[ADNS](SEQ ID NO:233),

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中，该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精转运到细胞中，并被重组多肽降解。并且藉此，该宿主细胞从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物。本发明的其它方面涉及一种在葡萄糖利用期间降解ATP的消耗的方法，通过：a）提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有重组纤维糊精转运蛋白和重组多肽，该重组多肽含有

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中，该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精转运到细胞中，并被重组多肽降解成葡萄糖-1-磷酸。其中，与缺乏重组多肽的相应的细胞相比，从纤维糊精产生葡萄糖-1-磷酸降低ATP的消耗。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽含有与CDP_Clent,

CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在可以与之前的任何实施例结合的一些实施例中，该重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。在一些实施例中，该重组多肽含有与选自SEQ ID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ IDNO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步包括重组葡萄糖磷酸变位酶。在一些实施例中，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，该保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步包括重组己糖激酶。在一些实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，该保守基序具有

[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQID NO:20)的氨基酸序列。在一些实施例中，该重组己糖激酶为HXK1。

本发明的一些方面涉及一种降解纤维糊精的方法，通过：a）提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有重组纤维糊精转运蛋白和重组葡萄糖磷酸变位酶；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养该宿主细胞，藉此纤维糊精转运到细胞中，并被降解。本发明的其它方面涉及一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，通过：a）提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有重组纤维糊精转运蛋白和重组葡萄糖磷酸变位酶；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精转运到细胞中，并且藉此该宿主细胞从转运的纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，其中保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组己糖激酶。在一些实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，该保守基序具有

[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQID NO:20)氨基酸序列。在一些实施例中，该重组己糖激酶为HXK1。

本发明的一些方面涉及一种降解纤维糊精的方法，通过：a）提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有重组纤维糊精转运蛋白和重组己糖激酶；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养该宿主细胞，藉此纤维糊精转运到细胞中，并被降解。本发明的其它方面涉及一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，通过：a）提供含有重组纤维糊精转运蛋白和重组己糖激酶的宿主细胞；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精转运到细胞中，并且藉此该宿主细胞从转运的纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，其中保守基序具有

[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQID NO:20)氨基酸序列。在一些实施例中，该重组己糖激酶为HXK1。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组葡萄糖磷酸变位酶。在一些实施例中，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，该保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。

在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组多肽，该重组多肽含有

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中，该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性。在一些实施例中，该重组多肽含有与CDP_Clent,

CDP_Ctherm,或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，该重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。在一些实施例中，该重组多肽含有与选自SEQ ID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置的含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ IDNO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，与缺乏该重组多肽的相应的细胞相比，该重组多肽降低ATP消耗。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有第二重组多肽，该第二重组多肽含有选自F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:18),

[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:19)和[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)的一个或多个序列。其中该第二重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。在一些实施例中，该第二重组多肽含有选自

F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:16),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:17)和

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:18)的两个或两个以上序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该第二重组多肽含有与NCU00130氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

本发明的一些方面涉及一种降解纤维糊精的方法，通过：a）提供含有重组纤维糊精转运蛋白和重组多肽的宿主细胞，该重组多肽含有选自

F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:18),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:19)和

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中，该重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精转运到细胞中，并被重组多肽降解。本发明的其它方面涉及一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，通过：a）提供含有重组纤维糊精转运蛋白和重组多肽的宿主细胞，该重组多肽含有选自F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:18),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:19)和

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中，该重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精转运到细胞中，并被重组多肽降解。并且藉此，该宿主细胞从纤维糊精产生碳水化合物或碳水化合物衍生物。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽含有选自

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:18)的两个或两个以上序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽含有与NCU00130氨基酸序列至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步包括重组葡萄糖磷酸变位酶。在一些实施例中，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，该保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步包括重组己糖激酶。在一些实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，该保守基序具有

[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQID NO:20)氨基酸序列。在一些实施例中，该重组己糖激酶为HXK1。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有第二重组多肽，该第二重组多肽含有

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中该第二重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该第二重组多肽含有与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，该第二重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。在一些实施例中，该第二重组多肽含有与选自SEQ ID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该第二重组多肽含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该第二重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ IDNO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。

在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白含有多肽，该多肽选自如下多肽：含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋1含有SEQ ID NO:1；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋2含有SEQ ID NO:2；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且连接跨膜α-螺旋2和跨膜α-螺旋3的环含有SEQ ID NO:3；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋5含有SEQ ID NO:4；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6含有SEQ ID NO:5；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6和跨膜α-螺旋7之间的序列含有SEQ ID NO:6；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋7含有SEQ ID NO:7；以及含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋10和跨膜α-螺旋11及它们之间的序列含有SEQ ID NO:8。在一些实施例中，重组纤维糊精转运蛋白为纤维二糖转运蛋白。在一些实施例中，该纤维二糖转运蛋白与SEQ ID NO:9(CDT-1)或SEQ ID NO:10(CDT-2)具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白在与SEQ IDNO:9(CDT-1)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中该一个或更多个位置为选自如下位置：与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸170对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸174对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸194对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，及其组合。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白在与SEQ ID NO:9(CDT-1)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，甘氨酸(G)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，谷氨酰胺(Q)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸170对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ IDNO:9的氨基酸174对应的位置，精氨酸(R)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸194对应的位置，谷氨酸(E)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为赖氨酸(L)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)，及其组合。

本发明的一些方面涉及一种降解纤维糊精的方法，通过：a）提供含有重组葡萄糖磷酸变位酶和重组多肽的宿主细胞，该重组多肽含有

Y-Q-[CN]-M-[IV]-T-F-[CN]-[FILMV]-[AS]-R-[ST]-[AS]-S-[FY]-[FY]-E-[STV]-G-x-[GS]-R-G-[IM]-G-F-R-D-S-[ACNS]-Q-D-[ILV]-[ILMV]-G-x-V-H-x-[IV]-P-[ADEST]-x-[AV]-[KR]-[AEQ]-x-[IL]-[FIL]-D(SEQ ID NO:14)，或

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精被重组多肽降解。本发明的其它方面涉及一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，通过：a）提供含有重组葡萄糖磷酸变位酶和重组多肽的宿主细胞，该重组多肽含有

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中，该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精被重组多肽降解，并且藉此，该宿主细胞从纤维糊精产生碳水化合物或碳水化合物衍生物。本发明的其它方面涉及一种在葡萄糖利用期间降解ATP消耗的方法，通过：a）提供含有重组葡萄糖磷酸变位酶和重组多肽的宿主细胞，该重组多肽含有

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中，该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精被重组多肽降解成葡萄糖-1-磷酸。其中，与缺乏该重组多肽的相应的细胞相比，从纤维糊精产生葡萄糖-1-磷酸降低ATP的消耗。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，该保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组己糖激酶。在一些实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，该保守基序具有

本发明的一些方面涉及一种降解纤维糊精的方法，通过：a）提供含有重组己糖激酶和重组多肽的宿主细胞，该重组多肽含有

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精被重组多肽降解。本发明的其它方面涉及一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，通过：a）提供含有重组己糖激酶和重组多肽的宿主细胞，该重组多肽含有

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中，该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精被重组多肽降解，并且藉此，该宿主细胞从纤维糊精产生碳水化合物或碳水化合物衍生物。本发明的其它方面涉及一种在葡萄糖利用期间降解ATP消耗的方法，通过：a）提供含有重组己糖激酶和重组多肽的宿主细胞，该重组多肽含有Y-x(2)-G-x-[KR]-E-N-[AG]-[AG]-[IV]-F-x(2)-[ANST]-[NST]-x(2)-[AIV]-x(2)-[AGT]-x(4)-[AG]-x(4)-[ADNS](SEQ ID NO:233),

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中，该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精被重组多肽降解成葡萄糖-1-磷酸。其中，与缺乏该重组多肽的相应的细胞相比，从纤维糊精产生葡萄糖-1-磷酸降低ATP的消耗。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，该保守基序具有[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQID NO:20)氨基酸序列。在一些实施例中，该重组己糖激酶为HXK1。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组葡萄糖磷酸变位酶，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，该保守基序具有

[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽含有与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在可以与之前的任何实施例结合的一些实施例中，该重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。在一些实施例中，该重组多肽含有与选自SEQ ID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ IDNO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。

本发明的一些方面涉及一种降解纤维糊精的方法，通过：a）提供含有重组葡萄糖磷酸变位酶和重组己糖激酶的宿主细胞；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精被降解。本发明的其它方面涉及一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，通过：a）提供含有重组葡萄糖磷酸变位酶和重组己糖激酶的宿主细胞；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精被降解，并且藉此该宿主细胞从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，该保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，该保守基序具有

[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQID NO:20)氨基酸序列。在一些实施例中，该重组己糖激酶为HXK1。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组多肽，该重组多肽含有

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽含有与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在可以与之前的任何实施例结合的一些实施例中，该重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。在一些实施例中，该重组多肽含有与选自SEQ ID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，与缺乏该重组多肽的相应的细胞相比，该重组多肽降低ATP的消耗。

在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有第二重组多肽，该第二重组多肽含有选自

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中该第二重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。在一些实施例中，该第二重组多肽含有选自

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:18)中的两个或两个以上序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该第二重组多肽含有与NCU00130的氨基酸序列至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致的氨基酸序列。

本发明的一些方面涉及一种降解纤维糊精的方法，通过：a）提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有：第一重组多肽，该第一重组多肽含有

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中，该第一重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性；和第二重组多肽，该第二重组多肽含有选自F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:18),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:19),和

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中该第二重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精被重组多肽降解。本发明的其它方面涉及一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，通过：a）提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有：第一重组多肽，该第一重组多肽含有Y-x(2)-G-x-[KR]-E-N-[AG]-[AG]-[IV]-F-x(2)-[ANST]-[NST]-x(2)-[AIV]-x(2)-[AGT]-x(4)-[AG]-x(4)-[ADNS](SEQ ID NO:233),

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中该第二重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精被重组多肽降解，并且藉此，该宿主细胞从纤维糊精产生碳水化合物或碳水化合物衍生物。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该第一重组多肽含有与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该第一重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。在一些实施例中，该第一重组多肽含有与选自SEQ ID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该第一重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ IDNO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组葡萄糖磷酸变位酶。在一些实施例中，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，该保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组己糖激酶。在一些实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，该保守基序具有

本发明的一些方面涉及一种降解纤维糊精的方法，通过：a）提供含有重组葡萄糖磷酸变位酶和重组多肽的宿主细胞，该重组多肽含有选自

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中，该重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精被重组多肽降解。本发明的其它方面涉及一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，通过：a）提供含有重组葡萄糖磷酸变位酶和重组多肽的宿主细胞，该重组多肽含有选自F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:18),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:19)和

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中，该重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精被重组多肽降解。并且藉此，该宿主细胞从纤维糊精产生碳水化合物或碳水化合物衍生物。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，该保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组己糖激酶。在一些实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，该保守基序具有

本发明的一些方面涉及一种降解纤维糊精的方法，通过：a）提供含有重组己糖激酶和重组多肽的宿主细胞，该重组多肽含有选自

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中，该重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精被重组多肽降解。本发明的其它方面涉及一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，通过：a）提供含有重组己糖激酶和重组多肽的宿主细胞，该重组多肽含有选自

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中，该重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精被重组多肽降解。并且藉此，该宿主细胞从纤维糊精产生碳水化合物或碳水化合物衍生物。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，该保守基序具有[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQID NO:20)氨基酸序列。在一些实施例中，该重组己糖激酶为HXK1。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组葡萄糖磷酸变位酶。在一些实施例中，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，该保守基序具有

[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。

在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组纤维糊精转运蛋白，该重组纤维糊精转运蛋白含有多肽，该多肽选自如下多肽：含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋1含有SEQ ID NO:1；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋2含有SEQ ID NO:2；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且连接跨膜α-螺旋2和跨膜α-螺旋3的环含有SEQ ID NO:3；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋5含有SEQ ID NO:4；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6含有SEQ ID NO:5；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6和跨膜α-螺旋7之间的序列含有SEQ ID NO:6；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋7含有SEQ ID NO:7；以及含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋10和跨膜α-螺旋11及它们之间的序列含有SEQ ID NO:8。在一些实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白为纤维二糖转运蛋白。在一些实施例中，该纤维二糖转运蛋白与SEQ ID NO:9(CDT-1)或SEQ ID NO:10(CDT-2)具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白在与SEQ ID NO:9(CDT-1)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中该一个或更多个位置为选自如下位置：与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸170对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸174对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸194对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，及其组合。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白在与SEQ ID NO:9(CDT-1)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，甘氨酸(G)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，谷氨酰胺(Q)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸170对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸174对应的位置，精氨酸(R)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸194对应的位置，谷氨酸(E)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为赖氨酸(L)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)，及其组合。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，具有β-葡萄糖苷酶活性的重组多肽含有选自F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:16),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:17)，和

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:18)中的两个或两个以上序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，具有β-葡萄糖苷酶活性的重组多肽含有与NCU00130的氨基酸序列至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步包括一种或更多种葡萄糖应答基因，其中，与该蛋白质的野生型激活水平相比，由至少一种葡萄糖应答基因编码的蛋白质的激活水平是变化的。在一些实施例中，该一种或更多种葡萄糖应答基因选自Snf3、Rgt1、Rgt2、Yck1/2、Std1、Mth1、Snf1/4,Grr1、Gpr1、Gpa2、Ras2、Stb3、Hxk2、Pfk27、Pfk26、Sch9、Yak1、Mig1、Rim15、Kcs1和Tps1。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，与其野生型激活水平相比，由该一种或更多种葡萄糖应答基因编码的一种或更多种蛋白的激活水平是提高的。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，与其野生型激活水平相比，由该一种或更多种葡萄糖应答基因编码的一种或更多种蛋白的激活水平是下降的。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，纤维糊精的来源含有纤维素。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该纤维糊精选自纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖和纤维六糖中的一种或多种。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，碳水化合物或碳水化合物衍生物可用作燃料。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该碳水化合物或碳水化合物衍生物含有乙醇。在一些实施例中，乙醇以至少约0.10至至少20g/L-h的范围的速率产生。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该碳水化合物或碳水化合物衍生物含有丁醇。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞为真菌细胞。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞为酵母细胞。在一些实施例中，该酵母细胞为酿酒酵母。

本发明的其它方面涉及一种宿主细胞，该宿主细胞含有重组纤维糊精转运蛋白和重组多肽，该重组多肽含有

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:14)或Y-Q-[CN]-M-[IV]-T-F-[CN]-[FILMV]-[AS]-R-[ST]-[AS]-S-[FY]-[FY]-E-[STV]-G-x-[GS]-R-G-[IM]-G-F-R-D-S-[ACNS]-Q-D-[ILV]-[ILMV]-G-x-V-H-x-[IV]-P-[ADEST]-x-[AV]-[KR]-[AEQ]-x-[IL]-[FIL]-D(SEQ ID NO:15)。其中该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽含有与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，该重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。在一些实施例中，该重组多肽含有与选自SEQ ID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽在与SEQID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ IDNO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组葡萄糖磷酸变位酶。在一些实施例中，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，该保守基序具有

[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组己糖激酶。在一些实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，该保守基序具有

本发明的其它方面涉及一种宿主细胞，该宿主细胞含有重组纤维糊精转运蛋白和重组葡萄糖磷酸变位酶。在一些实施例中，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，该保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组己糖激酶。在一些实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，该保守基序具有

本发明的其它方面涉及一种宿主细胞，该宿主细胞含有重组纤维糊精转运蛋白和重组己糖激酶。在一些实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，该保守基序具有

[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQID NO:20)氨基酸序列。在一些实施例中，该重组己糖激酶为HXK1。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组葡萄糖磷酸变位酶。在一些实施例中，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，该保守基序具有

[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:14)或Y-Q-[CN]-M-[IV]-T-F-[CN]-[FILMV]-[AS]-R-[ST]-[AS]-S-[FY]-[FY]-E-[STV]-G-x-[GS]-R-G-[IM]-G-F-R-D-S-[ACNS]-Q-D-[ILV]-[ILMV]-G-x-V-H-x-[IV]-P-[ADEST]-x-[AV]-[KR]-[AEQ]-x-[IL]-[FIL]-D(SEQ ID NO:15)。其中该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽含有与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，该重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。在一些实施例中，该重组多肽含有与选自SEQ ID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽在与SEQID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ IDNO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有第二重组多肽，该第二重组多肽含有选自

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列。其中该第二重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。在一些实施例中，该第二重组多肽含有选自

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:18)中的两个或两个以上序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该第二重组多肽含有与NCU00130氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

本发明的其它方面涉及一种宿主细胞，该宿主细胞含有重组纤维糊精转运蛋白和重组多肽，该重组多肽含有选自

F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:18),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:19)，和

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列。其中该重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。在一些实施例中，该重组多肽含有选自

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:18)中的两个或两个以上序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽含有与NCU00130氨基酸序列至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组葡萄糖磷酸变位酶。在一些实施例中，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，该保守基序具有

[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组己糖激酶。在一些实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，该保守基序具有

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中该第二重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例

中，该第二重组多肽含有与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，该第二重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。在一些实施例中，该第二重组多肽含有与选自SEQ ID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该第二重组多肽含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该第二重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ IDNO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。

在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白含有多肽，该多肽选自如下多肽：含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋1含有SEQ ID NO:1；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋2含有SEQ ID NO:2；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且连接跨膜α-螺旋2和跨膜α-螺旋3的环含有SEQ ID NO:3；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋5含有SEQ ID NO:4；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6含有SEQ ID NO:5；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6和跨膜α-螺旋7之间的序列含有SEQ ID NO:6；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋7含有SEQ ID NO:7；以及含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋10和跨膜α-螺旋11及它们之间的序列含有SEQ ID NO:8。在一些实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白为纤维二糖转运蛋白。在一些实施例中，该纤维二糖转运蛋白与SEQ ID NO:9(CDT-1)或SEQ ID NO:10(CDT-2)具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白在与SEQ IDNO:9(CDT-1)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中该一个或更多个氨基酸替换是在选自如下位置：与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，与SEQID NO:9的氨基酸104对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸170对应的位置，与SEQ IDNO:9的氨基酸174对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸194对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，及其组合。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白在与SEQ ID NO:9(CDT-1)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，甘氨酸(G)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，谷氨酰胺(Q)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸170对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ IDNO:9的氨基酸174对应的位置，精氨酸(R)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸194对应的位置，谷氨酸(E)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为赖氨酸(L)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)，及其组合。

本发明的其它方面涉及一种宿主细胞，该宿主细胞含有重组葡萄糖磷酸变位酶和重组多肽，该重组多肽含有

[AG]-[IV]-F-x(2)-[ANST]-[NST]-x(2)-[AIV]-x(2)-[AGT]-x(4)-[AG]-x(4)-[ADNS](SEQ IDNO:233),

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性。在一些实施例中，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，该保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组己糖激酶。在一些实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，该保守基序具有

本发明的其它方面涉及一种宿主细胞，该宿主细胞含有重组己糖激酶和重组多肽，该重组多肽含有

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性。在一些实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，该保守基序具有[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQ ID NO:20)氨基酸序列。在一些实施例中，该重组己糖激酶为HXK1。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组葡萄糖磷酸变位酶。在一些实施例中，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，该保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽含有与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，该重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。在一些实施例中，该重组多肽含有与选自SEQ ID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽在与SEQID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ IDNO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。

本发明的其它方面涉及一种宿主细胞，该宿主细胞含有重组葡萄糖磷酸变位酶和重组己糖激酶。在一些实施例中，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，该保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，该保守基序具有[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQID NO:20)氨基酸序列。在一些实施例中，该重组己糖激酶为HXK1。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组多肽，该重组多肽含有G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:14)，或Y-Q-[CN]-M-[IV]-T-F-[CN]-[FILMV]-[AS]-R-[ST]-[AS]-S-[FY]-[FY]-E-[STV]-G-x-[GS]-R-G-[IM]-G-F-R-D-S-[ACNS]-Q-D-[ILV]-[ILMV]-G-x-V-H-x-[IV]-P-[ADEST]-x-[AV]-[KR]-[AEQ]-x-[IL]-[FIL]-D(SEQ ID NO:15)。其中该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性。在一些实施例中，该重组多肽含有与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，该重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。在一些实施例中，该重组多肽含有与选自SEQ ID NO:11(CgCBP)、SEQ IDNO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。

在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有第二重组多肽，该第二重组多肽含有选自F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:18),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:19)和

本发明的其它方面涉及一种宿主细胞，该宿主细胞含有：第一重组多肽，该第一重组多肽含有

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中该第二重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。在一些实施例中，该第一重组多肽含有与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，该第一重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。在一些实施例中，该第一重组多肽含有与选自SEQ ID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组多肽含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该第一重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ IDNO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组葡萄糖磷酸变位酶。在一些实施例中，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，该保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQID NO:19)氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组己糖激酶。在一些实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，该保守基序具有[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQ ID NO:20)氨基酸序列。在一些实施例中，该重组己糖激酶为HXK1。

本发明的其它方面涉及一种宿主细胞，该宿主细胞含有重组葡萄糖磷酸变位酶和重组多肽，该重组多肽含有选自

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中，该重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。在一些实施例中，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，该保守基序具有

本发明的其它方面涉及一种宿主细胞，该宿主细胞含有重组己糖激酶和重组多肽，该重组多肽含有选自F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:18),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:19)，和

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中，该重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。在一些实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，该保守基序具有

[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。

在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有第二重组多肽，该第二重组多肽含有

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中该第二重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性。在一些实施例中，该第二重组多肽含有与

CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，该第二重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。在一些实施例中，该第二重组多肽含有与选自SEQ ID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该第二重组多肽含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该第二重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ IDNO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。

在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步含有重组纤维糊精转运蛋白，该重组纤维糊精转运蛋白含有多肽，该多肽选自如下多肽：含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋1含有SEQ ID NO:1；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋2含有SEQ ID NO:2；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且连接跨膜α-螺旋2和跨膜α-螺旋3的环含有SEQ ID NO:3；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋5含有SEQ ID NO:4；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6含有SEQ ID NO:5；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6和跨膜α-螺旋7之间的序列含有SEQ ID NO:6；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋7含有SEQ ID NO:7；以及含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋10和跨膜α-螺旋11及它们之间的序列含有SEQ ID NO:8。在一些实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白为纤维二糖转运蛋白。在一些实施例中，该纤维二糖转运蛋白与SEQ ID NO:9(CDT-1)或SEQ ID NO:10(CDT-2)具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白在与SEQ ID NO:9(CDT-1)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中该一个或更多个氨基酸替换是在选自如下位置：与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，与SEQID NO:9的氨基酸170对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸174对应的位置，与SEQ IDNO:9的氨基酸194对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，及其组合。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白在与SEQ ID NO:9(CDT-1)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，甘氨酸(G)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，谷氨酰胺(Q)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸170对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸174对应的位置，精氨酸(R)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸194对应的位置，谷氨酸(E)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为赖氨酸(L)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)，及其组合。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，具有β-葡萄糖苷酶活性的重组多肽含有选自F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:16),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:17)，和

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:18)中的两个或两个以上序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，具有β-葡萄糖苷酶活性的重组多肽含有与NCU00130的氨基酸序列至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致的氨基酸序列。

在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步包括一种或更多种葡萄糖应答基因，其中，与该蛋白质的野生型激活水平相比，由至少一种葡萄糖应答基因编码的蛋白质的激活水平是变化的。在一些实施例中，该一种或更多种葡萄糖应答基因选自Snf3、Rgt1、Rgt2、Yck1/2、Std1、Mth1、Snf1/4,Grr1、Gpr1、Gpa2、Ras2、Stb3、Hxk2、Pfk27、Pfk26、Sch9、Yak1、Mig1、Rim15、Kcs1和Tps1。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，由至少一种葡萄糖应答基因编码的蛋白的激活水平与其野生型激活水平相比，提高了。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，由至少一种葡萄糖应答基因编码的蛋白的激活水平与其野生型激活水平相比，下降了。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞为真菌细胞。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞为酵母细胞。在一些实施例中，该酵母细胞为酿酒酵母。

本发明的一些方面涉及一种降解纤维糊精的方法，通过：a）提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有以下物质中的两种或更多种：重组纤维糊精转运蛋白、含有

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)的重组多肽，其中该重组多肽具有纤维磷酸化酶活性、含有选自

F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:18),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:19),和

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列的重组多肽，其中该重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性、重组葡萄糖磷酸变位酶和重组己糖激酶；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养该宿主细胞，藉此纤维糊精转运到细胞中，并降解。本发明的其它方面涉及一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，通过：a）提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有以下物质中的两种或更多种：重组纤维糊精转运蛋白、含有

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)的重组多肽，其中该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性、含有选自

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列的重组多肽，其中该重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性、重组葡萄糖磷酸变位酶和重组己糖激酶；以及b）在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养宿主细胞，藉此纤维糊精转运至该细胞中并降解。并且藉此，该宿主细胞从纤维糊精产生碳水化合物或碳水化合物衍生物。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞含有以下物质中的两种或更多种，三种或更多种，或四种：重组纤维糊精转运蛋白、含有

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列的多肽，其中该重组多肽具有β-葡萄糖苷酶、重组葡萄糖磷酸变位酶和重组己糖激酶。

在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，具有纤维糊精磷酸化酶活性的重组多肽含有与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，具有纤维糊精磷酸化酶活性的重组多肽为纤维二糖磷酸化酶。在一些实施例中，该纤维二糖磷酸化酶含有与选自SEQ ID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，具有纤维糊精磷酸化酶活性的重组多肽含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，具有纤维糊精磷酸化酶活性的重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，具有β-葡萄糖苷酶活性的重组多肽含有选自F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:16),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:17)，和

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:18)中的两个或两个以上序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，具有β-葡萄糖苷酶活性的重组多肽含有与NCU00130的氨基酸序列至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，与缺乏具有纤维糊精磷酸化酶活性的重组多肽的相应的细胞相比，具有纤维糊精磷酸化酶活性的重组多肽降低ATP消耗。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，该保守基序具有

[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，该保守基序具有[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQID NO:20)氨基酸序列。在一些实施例中，该重组己糖激酶为HXK1。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白含有多肽，该多肽选自如下多肽：含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋1含有SEQ ID NO:1；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋2含有SEQID NO:2；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且连接跨膜α-螺旋2和跨膜α-螺旋3的环含有SEQ ID NO:3；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋5含有SEQ ID NO:4；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6含有SEQ ID NO:5；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6和跨膜α-螺旋7之间的序列含有SEQ ID NO:6；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋7含有SEQID NO:7；以及含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋10和跨膜α-螺旋11及它们之间的序列含有SEQ ID NO:8。在一些实施例中，重组纤维糊精转运蛋白为纤维二糖转运蛋白。在一些实施例中，该纤维二糖转运蛋白与SEQ ID NO:9(CDT-1)或SEQ ID NO:10(CDT-2)具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白在与SEQ ID NO:9(CDT-1)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中该一个或更多个位置为选自如下位置：与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，与SEQID NO:9的氨基酸170对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸174对应的位置，与SEQ IDNO:9的氨基酸194对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，及其组合。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白在与SEQ ID NO:9(CDT-1)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，甘氨酸(G)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，谷氨酰胺(Q)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸170对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸174对应的位置，精氨酸(R)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸194对应的位置，谷氨酸(E)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为赖氨酸(L)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)，及其组合。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步包括一种或更多种葡萄糖应答基因，其中，与该蛋白质的野生型激活水平相比，由至少一种葡萄糖应答基因编码的蛋白质的激活水平是变化的。在一些实施例中，该一种或更多种葡萄糖应答基因选自Snf3、Rgt1、Rgt2、Yck1/2、Std1、Mth1、Snf1/4,Grr1、Gpr1、Gpa2、Ras2、Stb3、Hxk2、Pfk27、Pfk26、Sch9、Yak1、Mig1、Rim15、Kcs1和Tps1。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，与其野生型激活水平相比，由该一种或更多种葡萄糖应答基因编码的一种或更多种蛋白的激活水平是提高的。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，与其野生型激活水平相比，由该一种或更多种葡萄糖应答基因编码的一种或更多种蛋白的激活水平是下降的。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，纤维糊精的来源含有纤维素。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该纤维糊精选自纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖和纤维六糖。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，碳水化合物或碳水化合物衍生物可用作燃料。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该碳水化合物或碳水化合物衍生物含有乙醇。在一些实施例中，乙醇以至少约0.10至至少20g/L-h的范围的速率产生。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该碳水化合物或碳水化合物衍生物含有丁醇。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞为真菌细胞。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞为酵母细胞。在一些实施例中，该酵母细胞为酿酒酵母。

本发明的其它方面涉及一种宿主细胞，该宿主细胞含有以下物质中的两种或更多种：重组纤维糊精转运蛋白、含有

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列的重组多肽，其中该重组多肽具有β-葡萄糖苷酶、重组葡萄糖磷酸变位酶、和重组己糖激酶。在一些实施例中，该宿主细胞含有以下物质中的两种或更多种、三种或更多种、或四种：重组纤维糊精转运蛋白、含有

Y-Q-[CN]-M-[IV]-T-F-[CN]-[FILMV]-[AS]-R-[ST]-[AS]-S-[FY]-[FY]-E-[STV]-G-x-[GS]-R-G-[IM]-G-F-R-D-S-[ACNS]-Q-D-[ILV]-[ILMV]-G-x-V-H-x-[IV]-P-[ADEST]-x-[AV]-[KR]-[AEQ]-x-[IL]-[FIL]-D(SEQ ID NO:14),or

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列的重组多肽，其中该重组多肽具有β-葡萄糖苷酶、重组葡萄糖磷酸变位酶、和重组己糖激酶。

在一些实施例中，具有纤维糊精磷酸化酶活性的重组多肽含有与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，具有纤维糊精磷酸化酶活性的重组多肽为纤维二糖磷酸化酶。在一些实施例中，该纤维二糖磷酸化酶含有与选自SEQ ID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，具有纤维糊精磷酸化酶活性的重组多肽含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，具有纤维糊精磷酸化酶活性的重组多肽在与SEQID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，具有β-葡萄糖苷酶活性的重组多肽含有选自

F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:16),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:17)，和

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:18)中的两个或两个以上序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，具有β-葡萄糖苷酶活性的重组多肽含有与NCU00130的氨基酸序列至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致的氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组葡萄糖磷酸变位酶含有保守基序，该保守基序具有

[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组己糖激酶含有保守基序，该保守基序具有[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQID NO:20)氨基酸序列。在一些实施例中，该重组己糖激酶为HXK1。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白含有多肽，该多肽选自如下多肽：含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋1含有SEQ ID NO:1；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋2含有SEQID NO:2；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且连接跨膜α-螺旋2和跨膜α-螺旋3的环含有SEQ ID NO:3；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋5含有SEQ ID NO:4；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6含有SEQ ID NO:5；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6和跨膜α-螺旋7之间的序列含有SEQ ID NO:6；含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋7含有SEQID NO:7；以及含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋10和跨膜α-螺旋11及它们之间的序列含有SEQ ID NO:8。在一些实施例中，重组纤维糊精转运蛋白为纤维二糖转运蛋白。在一些实施例中，该纤维二糖转运蛋白与SEQ ID NO:9(CDT-1)或SEQ ID NO:10(CDT-2)具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白含有一个或更多个突变。在一些实施例中，该一个或更多个突变为氨基酸替换。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白在与SEQ ID NO:9(CDT-1)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中该一个或更多个氨基酸替换是在选自如下位置：与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸170对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸174对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸194对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，及其组合。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白在与SEQ ID NO:9(CDT-1)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中该一个或更多个氨基酸替换是在选自如下位置：在与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，甘氨酸(G)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，谷氨酰胺(Q)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ IDNO:9的氨基酸170对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸174对应的位置，精氨酸(R)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸194对应的位置，谷氨酸(E)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为赖氨酸(L)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)，及其组合。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞进一步包括一种或更多种葡萄糖应答基因，其中，与该蛋白质的野生型激活水平相比，由至少一种葡萄糖应答基因编码的蛋白质的激活水平是变化的。在一些实施例中，该一种或更多种葡萄糖应答基因选自Snf3、Rgt1、Rgt2、Yck1/2、Std1、Mth1、Snf1/4,Grr1、Gpr1、Gpa2、Ras2、Stb3、Hxk2、Pfk27、Pfk26、Sch9、Yak1、Mig1、Rim15、Kcs1和Tps1。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，与其野生型激活水平相比，由该一种或更多种葡萄糖应答基因编码的一种或更多种蛋白的激活水平是提高的。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，与其野生型激活水平相比，由该一种或更多种葡萄糖应答基因编码的一种或更多种蛋白的激活水平是下降的。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞为真菌细胞。在一些可以与之前的任何实施例结合的实施例中，该宿主细胞为酵母细胞。在一些实施例中，该酵母细胞为酿酒酵母。

附图说明

图1展示了目前酵母中的代谢途径和本发明的新代谢途径之间的比较。酵母的标准代谢途径如虚线左边所示。在此，葡萄糖经由己糖转运蛋白进入细胞中，接着被己糖激酶磷酸化，形成葡萄糖-6-磷酸。本发明的新代谢途径如虚线的右边所示。在此，纤维糊精经由纤维糊精转运蛋白进入细胞中。接着，由纤维糊精磷酸化酶裂解出一个葡萄糖部分，产生葡萄糖-1-磷酸和变短的纤维糊精。葡萄糖-1-磷酸由葡萄糖磷酸变位酶转化成葡萄糖-6-磷酸。图1展示了当纤维三糖用作碳源时的方案。

图2示意性展示了两条可能的纤维三糖发酵途径。由纤维糊精转运蛋白（CDT）转运穿过质膜之后，经由β-葡萄糖苷酶(例如,GH1)通过水解（图2A）或经由纤维二糖磷酸化酶（例如，CBP）通过磷酸解（图2B）裂解纤维二糖。胞内葡萄糖在水解途径中形成并被己糖激酶(HXK)转化成葡萄糖-6-磷酸(Glc6P)。胞内葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸在磷酸解途径中形成。在此，葡萄糖-1-磷酸被葡萄糖磷酸变位酶(PGM)转化成Glc6P，而葡萄糖被HXK转化成Glc6P。在两条途径中，Glc6P由内源性酵母酶发酵成乙醇和CO2。斜体为改造成进入酵母内的酶。

图3描述了三种工程酵母菌株的纤维二糖发酵图谱，每种菌株表达纤维糊精转运蛋白基因cdt-1和三个纤维二糖磷酸化酶基因中的一个。在限氧条件下，确定菌株将纤维二糖(三角形)发酵成乙醇（菱形）的速率。也监测产生的生物质的量（圆）。每个图谱独立重复进行，并且在复制品之间的差异小于5%。所示的为代表性图谱。图3A描述了用cdt-1和来自C.gilvus的密码子优化的纤维二糖磷酸化酶基因转化的、酿酒酵母的D452-2菌株。图3B描述了用cdt-1和来自S.degradan的密码子优化的纤维二糖磷酸化酶基因转化的酿酒酵母D452-2菌株。图3C描述了用cdt-1和来自热纤梭菌（C.thermocellum）的密码子优化的纤维二糖磷酸化酶基因转化的酿酒酵母D452-2菌株。

图4描述了三种工程酵母菌株的纤维二糖发酵图谱，每种菌株表达PGM的酿酒酵母基因以及纤维糊精转运蛋白基因cdt-1和纤维二糖磷酸化酶基因。在限氧条件下，确定菌株将纤维二糖(三角形)发酵成乙醇（菱形）的速率。也监测产生的生物质的量（圆）。每个图谱独立重复进行，并且在复制品之间的差异小于5%。

图5描述了工程酵母菌株的发酵图谱，该工程酵母菌株具有纤维糊精转运蛋白基因cdt-1自然衍生的突变型。在限氧调节下，确定该菌株将纤维二糖（三角形）发酵为乙醇（菱形）的速率。也监测产生的生物质的量（圆）。所有的值为两个独立的发酵结果的平均值，并且误差条代表两个发酵之间的结果的标准偏差。图5A描述了用WT cdt-1和来自于S.degradans的、密码子优化的纤维二糖磷酸化酶基因转化的酿酒酵母D452-2菌株。图5B描述了用突变型cdt-1(F213L)和来自于S.degradans的、密码子优化的纤维二糖磷酸化酶基因转化的酿酒酵母D452-2菌株。图5C描述了用WT cdt-1和β-葡萄糖苷酶基因gh1-1转化的酿酒酵母D452-2菌株。图5D描述了用突变型cdt-1(F213L)和β-葡萄糖苷酶基因gh1-1转化的酿酒酵母D452-2菌株。

图6A描述了以各种突变型CDT-1经由水解途径进行纤维二糖发酵的时间图谱。图6B描述了以各种突变型CDT-1经由磷酸解途径进行纤维二糖发酵的时间图谱。

图7描述了具有各种纤维糊精转运蛋白基因(cdt-1)突变型(G91A、Q104A、F170A、R174A、E194A、F213L，和F335A)的工程酵母菌株的纤维二糖的消耗和乙醇的生产。用WT cdt-1或cdt-1突变型和来自于S.degradans的密码子优化的纤维二糖磷酸化酶基因或β-葡萄糖苷酶基因gh1-1转化酿酒酵母的D452-2菌株。沿Y轴展示了具有各种cdt-1突变型和纤维二糖磷酸化酶的生产率，沿x轴展示了具有各种cdt-1突变型和β-葡萄糖苷酶的生产率。所有的值为两个独立的发酵结果的平均值，并且误差条代表两个发酵之间的结果的标准偏差。图7A描述了纤维二糖的消耗速率。图7B描述了乙醇的生产速率。

图8描述了WT cdt-1和三个cdt-1突变型的转运动力学。用各种浓度的纤维二糖确定表达WT cdt-1、cdt-1(G91A)、cdt-1(F335A)，或cdt-1(F213L)的工程酵母菌株摄取的[3H]纤维二糖的线性速率。误差条代表在每个浓度的三个重复测量值的标准偏差。图8A描述了WT cdt-1的转运动力学。图8B描述了cdt-1(G91A)的转运动力学。图8C描述了cdt-1(F335A)的转运动力学。图8D描述了cdt-1(F213L)的转运动力学。

图9描述了CDT-1突变型的表达水平和发酵性能之间的相关性。通过具有一个GFP标记的CDT-1变体和β-葡萄糖苷酶GH1-1或纤维二糖磷酸化酶SdCBP的工程酵母菌株使纤维二糖发酵成乙醇。在这些发酵的指数期，收集细胞并且测量GFP荧光并且在校正培养物OD之后绘图。所示的值为两个发酵的平均值并且误差条代表两个发酵之间的标准偏差。图9A描述了具有一个GFP标记的CDT-1变体和β-葡萄糖苷酶GH1-1的工程酵母菌株。图9B描述了具有一个GFP标记的CDT-1变体和纤维二糖磷酸化酶SdCBP的工程酵母菌株。

图10描述了细胞提取物中纯化的β-葡萄糖苷酶GH1-1、S.degradans纤维二糖磷酸化酶SdCBP和酿酒酵母己糖激酶的活性。从富含葡萄糖的培养基(YPD80)上生长的D452-2酵母，和从富含纤维二糖的培养基(YPC80)上生长的、表达纤维糊精转运蛋白CDT-1和β-葡萄糖苷酶GH1-1或S.degradans纤维二糖磷酸化酶SdCBP的工程D452-2酵母中收集细胞提取物。确定10μg提取物中己糖激酶活性或纤维二糖酶活性的量，（定义为无论任何机制，释放葡萄糖的速率）。此外，通过测量GFP荧光估计存在于每种菌株中存在的转运蛋白的量。结果为三种培养物的平均值+/-标准偏差。图10A描述了转运蛋白的丰度。图10B描述了纤维二糖活性。图10C描述了己糖激酶活性。

图11描述了β-葡萄糖苷酶GH1-1的转糖苷活性。200pkat的每种纯化的GH1-1用20%(w/v)纤维二糖在50mM磷酸盐缓冲液,pH6.0中以30℃培养24小时。在没有添加酶的对照中进行相同的培养。接着，通过HPLC分析产物。

图12描述了纯化的GH-1和SdCBP酶的特征。从研究的酵母菌株中直接纯化β-葡萄糖苷酶GH1-1和S.degradans纤维二糖磷酸化酶SdCBP。在一式三份的各种纤维二糖浓度中确定催化的线性速率，并且通过非线性回归确定动力学参数。图12A描述了GH-1的动力学。图12B描述了SdCBP的动力学。

图13描述了纤维二糖对纯化的己糖激酶活性的影响，在大肠杆菌中（E.coli）表达并纯化三种酿酒酵母己糖激酶Hxk1、Hxk2，和Glk1。为了确定纤维二糖对己糖激酶活性的影响，在存在（灰条）或缺乏（黑条）184mM纤维二糖的情况下，确定使葡萄糖磷酸化的活性的线性速率。结果为一式三份的测量值的平均值+/-标准偏差，

图14描述了己糖激酶HXK1、HXK2，和GLK1的过表达与突变型纤维糊精转运蛋白CDT-1(F213L)经由磷酸解途径提高纤维二糖发酵能力的比较。图14A描述了酵母细胞的密度。图14B描述了纤维二糖的消耗。图14C描述了乙醇的产量。

图15描述了当在四种不同细胞起始OD值中培养时，过表达己糖激酶HXK1和纤维糊精转运蛋白突变型CDT-1(F213L)的工程酵母菌株经由磷酸解途径的纤维二糖发酵的图谱。测量纤维二糖消耗（正方形），乙醇产量（菱形）和酵母细胞密度（圆）。图15A描述了起始OD为1.6。图15B描述了起始OD为7.5。图15C描述了起始OD为13.6。图15D描述了起始OD为23.1。

图16描述了当用突变型纤维糊精CDT-1(F213L)使己糖激酶HXK1过表达时，经由磷酸解途径的细胞起始OD和乙醇生产率之间的线性关系。

图17描述了纤维弧菌(Cellvibrio gilvus)纤维二糖磷酸化酶(PDB2CQS)的晶体结构。深灰色的是鉴定的基序。

图18描述了纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖上生长的工程酿酒酵母菌株的生长曲线。符号：酿酒酵母D452-2(●)、D452-SdCBP-CDT-1(▽)、D452-CDP_Acell-CDT-1(■)、D452-CDP_Clent-CDT-1(◇)，和D452-CDP_Ctherm-CDT-1(▲)。图18A描述了在纤维二糖上的生长。图18B描述了在纤维三糖上的生长。图18C描述了在纤维四糖上的生长。

图19描述了在纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖上生长的工程酿酒酵母菌株的生长曲线。符号：酿酒酵母D452-2(●)、D452-SdCBP-CDT-1_F213L(▽)、D452-CDP_Acell-CDT-1_F213L(■)、D452-CDP_Clent-CDT-1_F213L(◇)，和D452-CDP_Ctherm-CDT-1_F213L(▲)。图19A描述了在纤维二糖上的生长。图19B描述了在纤维三糖上的生长。图19C描述了在纤维四糖上的生长。

图20描述了利用纤维二糖的、单只缺失参与感受胞外的糖的基因的单基因缺失酿酒酵母菌株的生长。图20描述了利用纤维二糖的野生型酿酒酵母菌株(WT)、利用纤维二糖的缺失Snf3的酿酒酵母菌株(ΔSnf3)、利用纤维二糖的缺失Rgt2的酿酒酵母菌株(ΔRgt2)，和利用纤维二糖的缺失Gpr1的酿酒酵母菌株(ΔGpr1)在纤维二糖和葡萄糖上的生长。

图21描述了利用纤维二糖的、单只缺失参与胞内信号途径的基因的单基因缺失酿酒酵母菌株的生长。图21A描述了利用纤维二糖的野生型酿酒酵母菌株(WT)、利用纤维二糖的缺失Gpa2的酿酒酵母菌株(ΔGpa2)、和利用纤维二糖的缺失Ras2的酿酒酵母菌株(ΔRas2)在纤维二糖和葡萄糖上的生长。Gpa2和Ras2与激活cAMP依赖性蛋白激酶A(PKA)途径并行作用。图21B描述了利用纤维二糖的野生型酿酒酵母菌株(WT)、利用纤维二糖的缺失Ras2的酿酒酵母菌株(ΔRas2)和利用纤维二糖的缺失Sch9的酿酒酵母菌株(ΔSch9)在纤维二糖和葡萄糖上的生长。Sch9与Ras/PKA途径并行作用。图21C描述了利用纤维二糖的野生型酿酒酵母菌株(WT)、利用纤维二糖的缺失Yak1的酿酒酵母菌株(ΔYak1)在纤维二糖和葡萄糖上的生长。Yak1为与Ras/PKA途径并行作用的蛋白激酶，但该蛋白激酶抑制细胞生长而不是刺激细胞生长。

图22描述了利用纤维二糖的野生型酿酒酵母菌株(WT)、利用纤维二糖的缺失Gpa2的酿酒酵母菌株(ΔGpa2)、和利用纤维二糖的含有Gpa2G132V突变型的酿酒酵母菌株[Gpa2(G132V)]在纤维二糖和葡萄糖上的生长。

图23A描述了利用纤维二糖的野生型酿酒酵母菌株(WT)和利用纤维二糖的缺失Hxk2的酿酒酵母菌株(ΔKxk2)在纤维二糖和葡萄糖上的生长。图23B描述了利用纤维二糖的野生型酿酒酵母菌株(WT)和利用纤维二糖的含有Hxk2wrf突变型的酿酒酵母菌株在纤维二糖和葡萄糖上的生长。

图24描述了利用纤维二糖的野生型酿酒酵母菌株(WT)、利用纤维二糖的缺失Rim15的酿酒酵母菌株(ΔRim15)、利用纤维二糖的缺失Stb3的酿酒酵母菌株(ΔStb3)、和利用纤维二糖的缺失Kcs1的酿酒酵母菌株(ΔKcs1)在纤维二糖和葡萄糖上的生长。

具体实施方式

本发明涉及宿主细胞，该宿主细胞含有重组纤维糊精转运蛋白、重组纤维糊精磷酸化酶、重组β-葡萄糖苷酶、重组葡萄糖磷酸变位酶或重组己糖激酶中的两种或更多种。本发明的其它方面涉及降解纤维糊精的方法，通过：提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有重组纤维糊精转运蛋白、重组纤维糊精磷酸化酶、重组β-葡萄糖苷酶、重组葡萄糖磷酸变位酶或重组己糖激酶中的两种或更多种；以及在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养该宿主细胞，藉此降解纤维糊精。本发明的其它方面涉及从纤维糊精生产碳水化合物和碳水化合物衍生物的方法，通过：提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有重组纤维糊精转运蛋白、重组纤维糊精磷酸化酶、重组β-葡萄糖苷酶、重组葡萄糖磷酸变位酶或重组己糖激酶中的两种或更多种；以及在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养该宿主细胞，藉此该宿主细胞从该纤维糊精生产碳水化合物和碳水化合物衍生物。本发明的另一方面涉及在利用葡萄糖期间降低ATP消耗的方法，通过提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有重组纤维糊精磷酸化酶和重组纤维糊精转运蛋白、重组葡萄糖磷酸变位酶或重组己糖激酶中的一种或更多种；以及在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养该宿主细胞，藉此纤维糊精被重组纤维糊精磷酸化酶降解成葡萄糖-1-磷酸，其中与缺乏重组多肽的相应的细胞相比，从纤维糊精生产葡萄糖-1-磷酸降低了ATP消耗。

此外，本发明至少部分是基于降解纤维糊精以利用酿酒酵母菌株使葡萄糖磷酸化的新策略，其中酿酒酵母菌株改造成表达粗糙脉孢菌转运蛋白基因cdt-1以将纤维糊精运输至细胞中；来自纤维弧菌、Sacharophagus degradans，或热纤梭菌的纤维二糖磷酸化酶基因以将运输的纤维糊精降解成葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖；重组葡萄糖磷酸变位酶以将葡萄糖-1-磷酸转化成葡萄糖-6-磷酸；和重组己糖激酶以将纤维糊精降解产生的葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸（图1）。

定义

除非另外限定，所有的科技术语理解为具有如其所属的领域中通用的含义。为了本发明的目的，限定如下术语。

在此使用的“纤维糊精”指的是各种长度的β(1→4)葡萄糖聚合体，并且包括，但不限于：纤维二糖（2个葡萄糖单体）、纤维三糖（3个葡萄糖单体）、纤维四糖（4个葡萄糖单体）、纤维五糖（5个葡萄糖单体）、和纤维六糖（6个葡萄糖单体）。

在此使用的“纤维糊精磷酸化酶”指的是通过利用无机磷酸盐裂解纤维糊精中的葡萄糖部分之间的一个或更多个β-糖苷键来催化纤维糊精的降解的酶。

在此使用的“纤维糊精转运蛋白”指的是任何能跨过细胞的细胞膜运输纤维糊精的糖转运蛋白。

在此使用的“糖”指的是单糖（例如，葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖），二糖（例如，纤维二糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖），和低聚糖（通常含3到10个组分的单糖）。

在此使用的使用“多肽”、“核酸序列”、“核酸的序列”及其各种变体普遍指的是多聚脱氧核糖核苷酸（含有2-脱氧-D-核糖）、多聚核糖核苷酸（含有D-核糖）、作为嘌呤或嘧啶碱基的N糖苷的任何其它类型的多聚核苷酸以及含有非核苷类骨架的其它聚合物，只要该聚合物含有结构上能进行碱基配对和碱基堆积的碱基，如DNA和RNA上所发现的那样。因此，这些术语包括已知类型的核酸序列修饰，例如，用类似物取代一个或更多个自然生产的核苷酸、内部核苷酸修饰，比如，例如，带有不带电的键（例如，甲基膦酸、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等等）、带有负电的的键（例如，硫代硫酸酯、二硫代磷酸酯等等）和带有正电的键（例如，氨基烷基磷酸胺（aminoalkylphosphoramidate），氨基烷基磷酸三酯（aminoalkylphosphotriester））的核苷酸修饰；和含有螯合剂（例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等等）。在此使用的用于核苷酸和多聚核苷酸的符号为生化命名IUPAC-IUB委员会所推荐的符号(Biochem.9:4022,1970)。

在此使用的“多肽”为多个连续聚合氨基酸残基（例如，至少约15个连续聚合氨基酸残基），优选地至少约30个连续聚合氨基酸残基，至少约50个连续聚合氨基酸残基，的氨基酸。在许多例子中，多肽含有聚合氨基酸残基序列，该聚合氨基酸残基序列为转运蛋白、酶、未知功能的预测蛋白，或其结构域或部分或片度。转运蛋白涉及离子、小分子、或高分子，比如碳水化合物，跨越生物膜的运动。酶可以催化化学反应，比如在宿主细胞中将碳水化合物还原为乙醇。多肽可选地含有修饰的氨基酸残基，不是有密码子编码的自然生成的氨基酸残基，和非自然生成的氨基酸残基。

在此使用的“蛋白”指的是自然生成或合成的氨基酸序列、寡肽、肽、多肽、或其一部分。

本发明中可以使用的基因和蛋白质包括编码保守修饰的变体的基因以及编码作为那些基因的保守修饰变体的蛋白质和本申请中描述的蛋白质。在此使用的“保守修饰的变体”包括多肽序列的单个取代，缺失，或插入，这导致氨基酸被化学相似的氨基酸所取代。保守取代表提供本领域周知的功能上相似的氨基酸。这种保守修饰变体增加至并且不排除多态性变体，种间同源物，和本发明的等位基因。以下八组中的氨基酸彼此是保守替换：1）丙氨酸（A）、甘氨酸（G）；2）天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）；3）天冬酰胺（N）、谷氨酰胺（Q）；4）精氨酸（R）、赖氨酸（K）；5）异亮氨酸（I）、亮氨酸（L）、蛋氨酸（M）、缬氨酸（V）；6）苯丙氨酸(F)、酪氨酸（Y）、色氨酸（W）；7）丝氨酸（S）、苏氨酸（T）；以及8）半胱氨酸（C）、甲硫氨酸（M）(参见，例如Creighton,Proteins(1984))。

在此描述的基因和蛋白质的同源物也可以用于本发明中。在此使用的“同源性”指的是参考序列与第二序列的至少一个片段之间的序列相似性。同源物可通过本领域任何已知方法鉴定，优选地，通过使用BLAST工具以使单条第二序列或序列的片段或序列的数据库与参考序列比较。如下文所述，BLAST将基于百分比一致性和相似性比较泄露。在此使用的“直系同源”指的是来源于共同祖先的基因的不同物种中的基因。

在两个或两个以上核酸或多肽序列的上下文中，术语“一致”或百分比“一致性”，指的是两个或两个以上序列或子序列相同。当在比较窗口对最大相符部分进行比较和比对或指定作为用下文的一个序列比较算法或通过手动比对和目测检测的区域时，如果两条序列具有相同的特定百分比的氨基酸残基或核苷酸，两条序列是“基本一致的”（即，在特定区域，或当不是特定时，在整条序列具有29%一致性,可选地30%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,99%或100%一致性）。可选地，一致性存在于长度为至少约50个核苷酸（或10个氨基酸）的区域，或更可选地，存在于长度为100至500或1000或更多的核苷酸（或20,50,200或更多个氨基酸）的区域。

对于序列比较，通常以一条序列作为参考序列，测试序列与该参考序列比较。当用序列比较算法时，测试和参考序列输入计算机中，必要时，指定子序列匹配，并且指定序列算法程序参数。使用缺省程序参数，或指定可选的参数。接着，序列比较算法基于程序参数计算测序序列相对于参考序列的序列百分比一致性。当比较两条序列的一致性时，序列不一定是连续的，而是带有一些空隙，该空隙作为罚分将降低整体的百分比一致性。对于blastn，缺省参数为空隙开口罚分（Gap opening penalty）=5和空隙延伸罚分（Gap extensionpenalty）=2。对于blastp，缺省参数为空隙开口罚分=11和空隙延伸罚分=1。

在此使用的“比较窗口”包括处于连续位置的任何编号的片段，包括但不限于从20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150，其中对两条序列进行最优比对之后，可将一个序列连续位置的相同编号的参考序列相比较。本领域周知用于比较的序列比对方法。例如，通过Smith和Waterman局部同源算法（the local homology algorithm of Smith andWaterman）(1981)，通过Needleman和Wunsch同源比较算法（the homology alignmentalgorithm of Needleman and Wunsch）(1970)J Mol Biol48(3):443-453，通过Pearson和Lipman寻找相似性方法（the search for similarity method of Pearson and Lipman）(1988)ProcNatl Acad Sci USA85(8):2444-2448,通过用计算机执行这些算法(在Wisconsin Genetics软件包中的GAP,BESTFIT,FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)或通过手动比对和可视检查[参见，例如Brent等人(2003)Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(Ringbou Ed)]对序列进行最优比对。

该算法涉及通过鉴定查询序列中的长度W的短字串首先鉴定高分片段对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字串比对时，长度W的短字符匹配或满足一些正值阈值分数T。T指的是附近的字串分数阈值(Altschul等人，同上)。这些临近的起始字串作为起始搜索的种子寻找包含在其中的更长的HSP。字串沿每条序列的两个方向延伸，只要能提高累积的比对分数。对于核苷酸序列，用参数M（匹配的残基对的奖励分数；总是大于0）和N（对不匹配的残基的罚分；总是小于0）计算累积分数。对于氨基酸序列，用分数矩阵计算累积分数。在如下情况时，字串在每个方向的延伸中止：累积比对分数从其获得的最大值以量X下滑、由于一个或更多个负分数的残基比对的累积使累积分数降到零或以下、或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W,T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序（对于核苷酸序列）使用缺省值：字长（W）11，期望阈值(E)10，M=5，N=-4和双链比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用缺省值：字长（W）3，和期望阈值(E)10，以及BLOSUM62打分矩阵[参见Henikoff and Henikoff,(1992)Proc Natl Acad Sci USA89(22):10915-10919]比对(B)50，期望阈值(E)10，M=5，N=-4和双链比较。对于氨基酸序列。

BLAST算法也在两条序列之间进行相似性的统计学分析（参见，例如Karlin andAltschul,(1993)Proc Natl Acad Sci USA90(12):5873-5877）。BLAST算法提供的一个相似性测量是最小总和可能性(P(N))，该最小总和可能性提供两条核苷酸或氨基酸序列之间的匹配偶然发生的可能性指示。例如，如果在测试核酸和参考核酸的比较中，最小总和可能性小于约0.2，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，那么该核酸被认为与参考序列相似。

除了上述序列百分比一致性，两条核酸序列或多肽基本一致的另一指示是第一核酸编码的多肽与第二核酸编码的多肽引起的抗体进行免疫交叉反应。因此，多肽典型地与第二多肽基本一致，例如，当该两条肽仅仅保守取代不同的时候。两条核酸序列基本一致的另一指示为两个分子或其补体在严格的条件下互相杂交。两条核酸序列基本一致的另一指示为可以用相同的引物扩增该序列。

本发明的宿主细胞

本发明的一些方面涉及宿主细胞，该宿主细胞含有重组纤维转运蛋白、重组纤维糊精磷酸化酶、重组β-葡萄糖苷酶、重组葡萄糖磷酸变位酶或重组己糖激酶中的一种或更多种。这些宿主细胞可以用于降解纤维糊精，以从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物，或在葡萄糖利用期间降低ATP消耗。

“宿主细胞”和“宿主微生物”在此可交换使用，指的是能通过插入重组DNA或RNA转化的活生物细胞。这种重组DNA或RNA可以在表达载体中。因此，在此描述的宿主生物或细胞可以为原核生物（例如，真细菌界生物）或真核生物。本领域普通技术人员应该理解，原核细胞缺少膜界定的核，而真核细胞具有膜界定的核。

只要在用核酸序列转化之后能存活，任何原核或真核宿主细胞可用于本发明中。优选地，必要的核酸序列的转导、蛋白质的后继表达或产生的中间物不会对该宿主细胞产生不利的影响。合适的真核细胞包括，但不限于，真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞。

在优选的实施例中，该宿主细胞为真菌细胞。在此使用的“真菌”包括子囊菌（phylaAscomycota），担子菌门（Basidiomycota），壶菌门（Chytridiomycota）和接合菌门（Zygomycota）（如Hawksworth等人，在英国剑桥大学出版社CAB International，1995年第8版的Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi中所定义）以及卵菌门（Oomycota）(如Hawksworth等人，1995,同上,第171页中所引证)和所有的有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995,同上)

在一些实施例中，真菌细胞为酵母细胞。在此使用的“酵母”包括产子囊孢子酵母（内孢霉目endomycetales）、产担孢子酵母（basidiosporogenous yeast）、和属于半知菌类（芽生菌）的酵母。由于酵母的分类在将来可能改变，为了本发明的目的，酵母的定义如酵母生物学和活性(Biology and Activities of Yeast,Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.,编辑,Soc.App.Bacteriol.专题系列号9,1980)中所述。

在一些实施例中，该酵母宿主为假丝酵母（Candida）、汉逊酵母属（Hansenula）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、毕赤酵母（Pichia）、接合酵母（Saccharomyces）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）、或罗维亚酵母（Yarrowia）菌株。在另一个实施例中，该酵母宿主为卡尔斯伯酵母（Saccharomyces carlsbergensis）(Todkar,2010),酿酒酵母(Duarte等人，2009),糖化酵母（Saccharomyces diastaticus）,道氏酵母（Saccharomycesdouglasii）,克鲁维酵母（Saccharomyces kluyveri）,奇异酵母（Saccharomyces norbensis）,摩纳酵母（Saccharomyces monacensis）(GB-Analysts Reports,2008),贝酵母（Saccharomycesbayanus）(Kristen Publicover,2010),巴氏酵母（Saccharomyces pastorianus）(Nakao等人，2007),裂殖酵母（Saccharomyces pombe）(Mousdale,2008),或卵形酵母（Saccharomycesoviformis）菌株。在其它实施例中，该酵母宿主为乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）(O.W.Merten,2001),胞壁克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis）(Pestal等人，2006;Siso,1996),马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxiamus）(K.Kourkoutas等人，2008),树干毕赤酵母（Pichia stipitis）(Almeida等人，2008),休哈塔假丝酵母（Candida shehatae）(Ayhan

Demirbas,2003),或热带假丝酵母菌（Candida tropicalis）(Jamai等人，2006)。在其它实施例中，该酵母宿主为解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）(Biryukova E.N.,2009),卡斯特酒香酵母（Brettanomyces custersii）(Spindler D.D.等人，1992),或鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces roux）(Chaabane等人，2006)。在一个优选的实施例中，该酵母宿主为酿酒酵母。

在其它实施例中，该酵母宿主为丝状真菌菌株。“丝状真菌”包括真菌门和卵菌门的分支的所有菌丝体（如Hawksworth等人，1995，同上，所定义）。丝状真菌的一般特点是由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复杂多糖组成菌丝体细胞壁。营养生长是通过菌丝伸长，并且碳代谢是专性好氧的。相反，酵母，比如酿酒酵母，的营养生长是通过单细胞体的芽殖，并且碳代谢可以是发酵性的。

在一些实施例中，该丝状真菌宿主是，但不限于枝顶孢霉（Acremonium）、曲霉（Aspergillus）、链孢霉（Fusarium）、腐质霉（Humicola）、毛霉（Mucor）、毁丝霉属（Myceliophthora）、脉孢菌（Neurospora）、青霉菌（Penicillium）、节格孢（Scytalidium）、梭孢壳（Thielavia）、弯颈霉（Tolypocladium）、或木霉菌株（Trichoderma）菌株。

在某些实施例中，丝状真菌宿主是泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉，构巢曲霉，黑曲霉，或者米曲霉菌株。在一些实施例中，该丝状真菌宿主是杆孢状镰孢（Fusarium bactridioides），禾谷镰孢（Fusarium cerealis），克地镰刀菌（Fusarium crookwellense），大刀镰孢（Fusariumculmorum），禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum），禾赤镰孢（Fusarium graminum），异孢镰孢（Fusarium heterosporum），合欢木镰孢（Fusarium negundi），尖镰孢（Fusariumoxysporum），多枝镰孢（Fusarium reticulatum），粉红镰孢（Fusarium roseum），接骨木镰刀菌（Fusarium sambucinum），肤色镰孢（Fusarium sarcochroum），拟枝孢镰刀菌（Fusarium sporotrichioides），硫色镰孢（Fusarium sulphureum），Fusarium torulosum，拟丝孢镰刀菌（Fusarium trichothecioides），或粗糙脉胞菌（Fusarium venenatum）菌株。在另一些实施例中，该丝状真菌宿主是特异腐质霉（Humicola insolens），柔毛腐质霉（Humicolalanuginosa），米黑毛霉（Mucor miehei），嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila），粗糙脉胞菌（Neurospora crassa），产紫青霉（Penicillium purpurogenum），嗜热革节孢（Scytalidium thermophilum），嗜热侧孢霉（Sporotrichum thermophile）(Topakas等人2003)，或斯梭孢壳霉菌（Thielavia terrestris）菌株。在另一个实施例中，该丝状真菌宿主是哈茨木霉（Trichoderma harzianum），康宁木霉（Trichoderma koningii），长梗木霉（Trichodermalongibrachiatum），里氏木霉（Trichoderma reesei），或者绿色木霉菌（Trichoderma viride）菌株。

在其它实施例中，该宿主细胞为原核细胞，并且在一些实施例中，该原核细胞为大肠杆菌（E.coli）(Dien,B.S.等人，2003;Yomano,L.P.等人，1998;Moniruzzaman等人，1996)、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）(Susana Romero等人，2007)、运动发酵单胞菌（Zymomonasmobilis）(B.S.Dien等人，2003;Weuster Botz,1993;Alterthum和Ingram,1989)、嗜热厌氧菌（Thermoanaerobacterium saccharolyticum）(Marietta Smith,2009)，或产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）(Dien,B.S.等人，2003;Zhou等人，2001;Brooks和Ingram,1995)。在其它实施例中，该原核宿主细胞为Carboxydocella sp.(Dominik等人，2007)、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）(Masayuki Inui等人，2004),肠杆菌科细菌（Enterobacteriaceae）(Ingram等人，1995)、菊欧氏杆菌（Erwinia chrysanthemi）(Zhou和Ingram,2000;Zhou等人2001)、乳酸杆菌属（Lactobacillus sp.）(McCaskey,T.A.,等人，1994)、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）(Zhou,S.等人，2003)、荚膜红假单胞菌（Rhodopseudomonas capsulata）(X.Y.Shi等人，2004)、乳链球菌（Streptococcus lactis）(J.C.Tang等人，1988)、弗氏弧菌（Vibrio furnissii）(L.P.Wackett,2010)、弗氏弧菌M1（Vibrio furnissii M1）(Park等人，2001)、解糖热解纤维素菌（Caldicellulosiruptorsaccharolyticus）(Z.Kadar等人，2004)，或野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）(S.T.Yang等人，1987)。在其它实施例中，该宿主细胞为蓝藻。细菌宿主细胞的另外的实施例包括，但不限于分类到大肠杆菌（Escherichia）、肠杆菌（Enterobacter）、固氮菌（Azotobacter）、欧文菌（Erwinia）、杆菌属（Bacillus）、假单胞菌（Pseudomonas）、克雷白氏杆菌（Klebsiella）、变形杆菌（Proteus）、沙门氏菌（Salmonella）、沙雷氏菌（Serratia）、志贺菌（Shigella）、根瘤菌（Rhizobia）、透明颤菌（Vitreoscilla）、聚球藻细菌（Synechococcus）、集包蓝细菌（Synechocystis），和副球菌（Paracoccus）分类学中的那些物种。

本发明的宿主细胞可以进行遗传修饰，其中重组核酸导入该宿主细胞中并且，在自然中不产生这种遗传修饰的宿主细胞。本发明的合适的宿主细胞为能表达一种或更多种的核酸构建体的细胞，该核苷酸构建体编码不同功能的一种或更多种蛋白质。

在此使用的“重组核酸”或“异源核酸”或“重组多聚核苷酸”指的是核酸的聚合体，其中以下的至少一个为真：(a)对于给定的宿主细胞，该核酸序列是外来的(即不是在给定的宿主细胞中自然发现的)；(b)该序列可以在给定的宿主细胞中自然发现，但数量是反常的(例如，比预期更大)；或(c)该核酸序列含有与在自然界中找到相互之间关系不相同的两个或两个以上序列。例如，对于例子(c)，重组核酸序列具有来自不相关基因的、设计成产生新功能的核酸的两个或两个以上序列。特别地，本发明描述了表达载体导入宿主细胞，其中该表达载体含有编码在宿主细胞中不能自然发现的蛋白质的核酸序列，或含有编码能在细胞中自然发现但处于不同的调控序列的控制下的蛋白质的核酸。结合宿主细胞的基因组，那么，编码该蛋白质的核酸序列是重组体。蛋白质被称为重组体通常表示该蛋白质是由宿主细胞中的重组核酸序列编码的。

本发明的“重组”多肽、蛋白质、或酶是由“重组核酸”或“异源核酸”或“重组多聚核苷酸”编码的多肽、蛋白质、或酶。

在一些实施例中，编码想要的蛋白质的、宿主细胞中的基因可以是与该宿主细胞异源的并且这些基因可以与宿主细胞具有可以是与该宿主细胞异源的或这些基因可以为与宿主细胞是内源的，但有效地连接至异源启动子和/或控制在宿主细胞中使基因表达更高的区域。在一些实施例中，该宿主细胞不是自然产生想要的蛋白质，并且含有异源核酸构建体，该异源核酸构建体能表达产生这些分子所需的一个或更多个基因。

结合核酸分子或多肽和特定的细胞或微生物，在此使用的“内源的”指的是胞内的并且不是用重组基因工程技术导入到胞内的核酸序列；例如，当该细胞从自然界中首次分离时，存在于该细胞中的基因。

“遗传工程”或“遗传修饰”指的是用于创造以上升水平、下降水平或突变的形式表达蛋白质的原核或真核宿主细胞的重组DNA或RNA方法。换句话说，用重组多聚核苷酸分子转染、转化或转导该宿主细胞，从而改变该宿主细胞以使该细胞改变想要的蛋白质的表达。本领域周知用于基因工程宿主细胞的方法和载体；例如在Ausubel等人编辑的现代分子生物学实验指南（Current Protocols in Molecular Biology）(Wiley&Sons,纽约,1988,并且每季度的更新)一文中描述了各种技术。基因工程技术包括，但不限于，表达载体和靶向同源重组和基因激活（参见，例如，美国专利5,272,071）

纤维糊精转运蛋白

本发明的一些方面涉及宿主细胞，该宿主细胞含有重组纤维糊精转运蛋白。纤维糊精转运蛋白为任何将纤维糊精分子从细胞外部转运到细胞内部和/或从细胞内部转运到细胞外部的跨膜蛋白。在一些实施例中，该纤维糊精转运蛋白为保持将纤维糊精分子从细胞外部转运到细胞内部和/或从细胞内部转运到细胞外部的的能力的功能片段。

本发明的重组纤维糊精转运蛋白可以由在表10，Tian等人，2009，第3页，补充数据Dataset S1（Table10,in Supplemental Data,Dataset S1,and page3in Tian et al.,2009），以及表1和2中所列举的基因编码。

表1:编码纤维糊精转运蛋白的序列表

表2:纤维糊精转运蛋白的直系同源物表.

￥当不能获得登录号时，使用JGI编号。JGI编号使得能够通过该生物体的JGI基因组门户访问基因序列（可从以下页面登陆：genome.jgi-psf.org/programs/fungi/index.jsf）。黄曲霉或构巢曲霉识别符使得可分别通过cadre-genomes.org.uk/and webpage

broadinstitute.org/annotation/genome/aspergillus_group/MultiHome.html页面上的它们的基因组门户访问到基因。

在其它实施例中，本发明的重组纤维糊精转运蛋白与在表10，Tian等人，2009，第3页，补充数据Dataset S1，以及表1和2中所列举的基因中的任何基因编码的多肽具有约20%，或至少约29%、或至少约30%、或至少约40%、或至少约50%、或至少约55%、或至少约60%、或至少约65%、或至少约70%、或至少约75%、或至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约92%、或至少约94%、或至少约96%、或至少约98%、或至少约99%、或至少约100%的氨基酸残基序列一致性。

此外，本发明的纤维糊精转运蛋白包括，但不限于NCU00801、NCU00809、NCU08114、XP_001268541.1、LAC2、NCU00130、NCU00821、NCU04963、NCU07705、NCU05137、NCU01517、NCU09133和NCU10040。在一些实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白与NCU00801、NCU00809、NCU08114、XP_001268541.1、LAC2、NCU00130、NCU00821、NCU04963、NCU07705、NCU05137、NCU01517、NCU09133和NCU10040中的任何序列编码的多肽具有至少约20%、或至少约29%、或至少约30%、或至少约40%、或至少约50%、或至少约55%、或至少约60%、或至少约65%、或至少约70%、或至少约75%、或至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约92%、或至少约94%、或至少约96%、或至少约98%、或至少约99%、或至少约100%的氨基酸残基序列一致性。

在一些优选的实施例中，该宿主细胞含有NCU00801编码的纤维糊精转运蛋白，该纤维糊精转运蛋白也称为CDT-1或CBT1。在其它优选的实施例中，该宿主细胞含有NCU08114编码的纤维糊精转运蛋白，该纤维糊精转运蛋白也称为CDT-2或CBT2。在一些实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白具有这样的氨基酸序列：与CDT-1(SEQ ID NO:9)或CDT-2(SEQ ID:10)具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性。

本发明的合适的纤维糊精转运蛋白也包括，但不限于公布号为US2011/0262983的美国专利申请和公布号为WO2011/123715的PCT中所描述的那些纤维糊精转运蛋白。例如，合适的纤维糊精转运蛋白可以包括，但不限于HXT2.1、HXT2.2、HXT2.3、HXT2.4、HXT2.5、HXT2.6和HXT4。在一些实施例中，本发明的重组纤维糊精转运蛋白与公布号为US2011/0262983的美国专利申请和公布号为WO2011/123715的PCT中所列举的任何基因编码的多肽（例如，HXT2.1、HXT2.2、HXT2.3、HXT2.4、HXT2.5、HXT2.6或HXT4）具有约20%、或至少约29%、或至少约30%、或至少约40%、或至少约50%、或至少约55%、或至少约60%、或至少约65%、或至少约70%、或至少约75%、或至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约92%、或至少约94%、或至少约96%、或至少约98%、或至少约99%、或至少约100%的氨基酸残基序列一致性。

本发明的重组纤维糊精转运蛋白也可以包括，但不限于，由多聚核苷酸编码的多肽，该多聚核苷酸编码上述列举的基因编码的多肽的保守修饰变体。本发明的重组纤维糊精转运蛋白进一步包括由多聚核苷酸编码的多肽，该多聚核苷酸编码表10，Tian等人，2009，第3页的补充数据Dataset S1，和表1和2中以及公布号为US2011/0262983的美国专利申请和公布号为WO2011/123715的PCT中列举的任何基因编码的多肽的同源物或直系同源物

纤维糊精转运蛋白序列基序

如在此所述，本发明的重组纤维糊精转运蛋白包括主要协助转运蛋白超家族糖转运蛋白家族（Major Facilitator Superfamily sugar transporter family），包括，但不限于，NCU00988、NCU10021、NCU04963、NCU06138、NCU00801、NCU08114和NCU05853。转运蛋白中的主要协助转运蛋白超家族（MFS）成员（转运蛋白分类#2.A.1）几乎总是含有12种跨膜α螺旋，和胞内N端和C端(Pao et al.,Microbiol Mol Biol Rev62,1,March1998)。虽然MFS转运蛋白的一级序列变化很大，但所有的一级序列被认为共有E.coli乳糖通透酶的三级结构(LacY)(J.Abramson et al.,Science301,610,2003)和E.coli Pi/甘油-3-磷酸(GlpT)(Huanget al.,Science301,616,2003)。在这些实施例中，6个N端和C端螺旋在螺旋6和7之间形成长胞内环连接的两个有区别的结构域。这个对称性与被认为是MFS引起的复制事件对应。底物结合在由N端结构域的螺旋1、2、4和5与C端结构域的螺旋7、8、10和11形成的亲水腔内。螺旋3、6、9和12使该腔稳定。

MFS的糖转运蛋白家族（转运蛋白分类#2.A.1.1）用跨膜螺旋6和12(PESPR(SEQ IDNO:231)/PETK(SEQ ID NO:232))，和环2和8(GRR/GRK)(M.C.Maiden,E.O.Davis,S.A.Baldwin,D.C.Moore,P.J.Henderson,Nature325,641(1987年2月12-18))中发现的基序定义。在pfam.janelia.org/family/PF00083#tabview=tab3中可以看到该家族的全部的隐马尔可夫模型(HMM)。PROSITE(N.Hulo et al.,Nucleic Acids Res34,D227(Jan1,2006))使用两条基序以鉴定该家族的成员。第一是[LIVMSTAG]-[LIVMFSAG]-{SH}-{RDE}-[LIVMSA]-[DE]-{TD}-[LIVMFYWA]-G-R-[RK]-x(4,6)-[GSTA](SEQ ID NO:198)。第二是[LIVMF]-x-G-[LIVMFA]-{V}-x-G-{KP}-x(7)-[LIFY]-x(2)-[EQ]-x(6)-[RK](SEQ ID NO:199)。作为如何读PROSITE基序的例子，以下基序[AC]-x-V-x(4)-{ED}(SEQ IDNO:200)翻译为[丙氨酸或半胱氨酸]-任何氨基酸-缬氨酸-任何氨基酸-任何氨基酸-任何氨基酸-任何氨基酸-{除了谷氨酸或天冬氨酸之外的任何氨基酸}(SEQ ID NO:200)（[Ala orCys]-any-Val-any-any-any-any-{any but Glu or Asp}(SEQ ID NO:200)）。

多序列比对在假定的纤维糊精转运蛋白的直系同源之间的T-COFFEE中产生并确认鉴定保守基序的纤维糊精转运蛋白。该保守基序用PROSITE标记法限定。作为如何读PROSITE基序的例子，以下基序[AC]-x-V-x(4)-{ED}(SEQ ID NO:200)翻译为[丙氨酸或半胱氨酸]-任何氨基酸-缬氨酸-任何氨基酸-任何氨基酸-任何氨基酸-任何氨基酸-{除了谷氨酸或天冬氨酸之外的任何氨基酸}(SEQ ID NO:200)。跨膜螺旋1含有基序[LIVM]-Y-[FL]-x(13)-[YF]-D(SEQ ID NO:1)。跨膜螺旋2含有基序[YF]-x(2)-G-x(5)-[PVF]-x(6)-[DQ](SEQ ID NO:2)。连接跨膜螺旋2和跨膜螺旋3的环含有基序G-R-[RK](SEQ ID NO:3)。跨膜螺旋5含有基序R-x(6)-[YF]-N(SEQ ID NO:4)。跨膜螺旋6含有基序WR-[IVLA]-P-x(3)-Q(SEQ ID NO:5)。跨膜螺旋6和跨膜螺旋7之间的序列含有基序P-E-S-P-R-x-L-x(8)-A-x(3)-L-x(2)-Y-H(SEQ ID NO:6)。跨膜螺旋7含有基序F-[GST]-Q-x-S-G-N-x-[LIV](SEQ ID NO:7)。跨膜螺旋10和跨膜螺旋11以及跨膜螺旋10和跨膜螺旋11之间的序列含有基序L-x(3)-[YIV]-x(2)-E-x-L-x(4)-R-[GA]-K-G(SEQ ID NO:8)。

因此，本发明的一些方面涉及重组纤维糊精转运蛋白或含有一个或多个公开的保守基序的功能片段。在一些实施例中，重组纤维糊精转运蛋白或其功能片段包括含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋1含有SEQ ID NO:1。在其它实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白包括含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋2含有SEQ ID NO:2。在其它实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白包括含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且连接跨膜α-螺旋2和跨膜α-螺旋3的环含有SEQ ID NO:3。在其它实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白包括含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋5含有SEQ ID NO:4。在其它实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白包括含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6含有SEQ ID NO:5。在其它实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白包括含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6和跨膜α-螺旋7之间的序列含有SEQ ID NO:6。在其它实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白包括含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋7含有SEQ ID NO:7。在其它实施例中，该重组纤维糊精转运蛋白包括含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋10和跨膜α-螺旋11及它们之间的序列含有SEQ ID NO:8。

此外，上述的每个实施例可以以任何数量结合。根据上述实施例的重组纤维糊精转运蛋白可以包括含有SEQ ID NOs:1-8中的任何1、2、3、4、5、6或7种序列的多肽，或者该多肽可以含有SEQ ID NOs:1-8中的所有序列。例如，重组纤维糊精转运蛋白可以包括含有跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，其中跨膜α-螺旋1含有SEQ ID NO:1，连接跨膜α-螺旋2和跨膜α-螺旋3的环含有SEQ ID NO:3，并且跨膜α-螺旋7含有SEQID NO:7。或，在其它实施例中，重组纤维糊精转运蛋白可以包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-

螺旋11、α-螺旋12的多肽，其中跨膜α-螺旋2含有SEQ ID NO:2，跨膜α-螺旋3含有SEQID NO:3，跨膜α-螺旋6含有SEQ ID NO:5，并且跨膜α-螺旋10和跨膜α-螺旋11及它们之间的序列含有SEQ ID NO:8。

突变型纤维糊精转运蛋白

本发明的其它方面涉及突变型纤维糊精转运蛋白，该突变型纤维糊精转运蛋白可以用于增加本发明的纤维糊精转运蛋白的功能和/或活性。突变型纤维糊精转运蛋白可以通过使编码本发明的纤维糊精转运蛋白的多聚核苷酸发生突变而产生。在一些实施例中，本发明的突变型纤维糊精转运蛋白可以含有至少一个突变，该至少一个突变包括，但不限于，导致纤维糊精转运蛋白的功能和/或活性增加的点突变、错义突变、置换突变、移码突变、插入突变、重复突变（duplication mutation）、倍增突变、易位突变、或反转突变。

在感兴趣的纤维糊精转运蛋白中产生至少一个突变的方法在本领域是周知的，并且包括，但不限于随机突变和筛选、定点突变、PCR突变、插入突变、化学突变、和辐射。

在一些实施例中，该突变型纤维糊精转运蛋白含有一个或更多个氨基酸替换。例如，本发明的纤维糊精转运蛋白在与CDT-1(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置可以含有氨基酸替换。合适的一个或更多个位置包括，但不限于，与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸170对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸174对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸194对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，及其组合。

在一个非限制实施例中，在一个或更多个位置的氨基酸替换为：在与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，甘氨酸(G)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，谷氨酰胺(Q)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸170对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸174对应的位置，精氨酸(R)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸194对应的位置，谷氨酸(E)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为赖氨酸(L)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)，或其组合。在优选的实施例中，在一个或更多个位置的氨基酸替换为在与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，甘氨酸(G)替换为丙氨酸(A)和/或在与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为赖氨酸(L)。

在一些实施例中，突变型纤维糊精转运蛋白的增加的功能和/或活性导致宿主细胞以比缺乏该突变型纤维糊精转运蛋白的细胞中的纤维糊精的消耗速率更快的速率消耗纤维糊精。例如，在含有突变型转运蛋白的宿主细胞中，纤维糊精的消耗速率可以比在含有相应的野生型纤维糊精转运蛋白的宿主细胞中纤维糊精的消耗速率快至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少125%、至少150%、至少175%、至少200%、至少225%、至少250%、至少275%、至少300%，或至少更高的百分比。

与纤维糊精转运蛋白结合

本发明的另一方面涉及宿主细胞，该宿主细胞含有与本发明的重组纤维糊精磷酸化酶、本发明的重组β-葡萄糖苷酶、本发明的重组葡萄糖磷酸变位酶和本发明的重组己糖激酶中的一种或更多种结合的本发明的至少一种重组纤维糊精转运蛋白。

通常，一旦本发明的纤维糊精转运蛋白将纤维糊精比如纤维二糖转运到细胞中，该细胞必定降解该纤维糊精。但是，在一些实施例中，本发明的宿主细胞，比如酵母细胞并非自然含有将纤维糊精降解为不太复杂的、可以被细胞所利用的糖所需的酶。因此，该宿主细胞可以改造成表达重组纤维糊精磷酸化酶和/或重组β-葡萄糖苷酶以降解纤维糊精。因此，在一些实施例中，本发明的宿主细胞表达与至少一种重组纤维糊精磷酸化酶和/或至少一种重组β-葡萄糖苷酶结合的至少一种纤维糊精转运蛋白。此外，在不同的压力条件下，在含有纤维糊精转运蛋白的细胞中同时表达重组纤维糊精磷酸化酶和重组β-葡萄糖苷酶可以是有利的。另外，可以改造这种宿主细胞从而在不同的压力条件下使纤维糊精磷酸化酶途径和β-葡萄糖苷酶途径最优化。因此，在一些实施例中，含有纤维糊精转运蛋白的本发明的宿主细胞也表达至少一种重组纤维糊精磷酸化酶和至少一种重组β-葡萄糖苷酶。

在一些实施例中，含有纤维糊精转运蛋白的宿主细胞能通过磷酸解将纤维糊精裂解成葡萄糖-1-磷酸和更短的纤维糊精。为了使细胞能利用产生的葡萄糖-1-磷酸，需要将葡萄糖-1-磷酸转化成葡萄糖-6-磷酸，以进入细胞的糖酵解途径。葡萄糖-1-磷酸可以通过在宿主细胞中自然表达的葡萄糖磷酸变位酶转化成葡萄糖-6-磷酸。但是在糖酵解期间可以通过转录下调葡萄糖磷酸变位酶。此外，其它重组蛋白质或酶的表达或利用的生长条件也可以影响细胞中内源葡萄糖磷酸变位酶的表达。这些缺点可以通过在细胞中重组表达至少一种葡萄糖磷酸变位酶来克服。因此，在一些实施例中，本发明的宿主细胞表达与至少一种重组葡萄糖磷酸变位酶结合的至少一种重组纤维糊精转运蛋白。

在其它实施例中，含有纤维糊精转运蛋白的宿主细胞能将纤维糊精，比如纤维二糖降解为葡萄糖。但是，为了使细胞利用葡萄糖，需要将葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸。通常，通过细胞中自然表达的己糖激酶将葡萄糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸。但是，本发明的宿主细胞表达的己糖激酶的活性量可能不足以有效地转化纤维糊精降解产生的所有的葡萄糖。此外，其它重组蛋白质或酶的表达或利用的生长条件也可以影响细胞中内源己糖激酶的表达。这些缺点可以通过在细胞中重组表达至少一种己糖激酶来克服。因此，在一些实施例中，本发明的宿主细胞表达与至少一种重组己糖激酶结合的至少一种重组纤维糊精转运蛋白。

纤维糊精磷酸化酶

本发明的其它方面涉及宿主细胞，该宿主细胞含有重组纤维糊精磷酸化酶。本发明的纤维糊精磷酸化酶通过利用无机磷酸盐裂解纤维糊精的葡萄糖部分之间的β糖苷键催化纤维糊精的降解。本发明的纤维糊精磷酸化酶可以包括具有EC2.4.1.49活性的多肽，具有EC2.4.1.49活性的多肽催化以下反应：(1,4-β-D-葡萄糖基)n+无机磷酸盐

(1,4-β-D-葡萄糖基)n-1+α-D-葡萄糖-1-磷酸盐。具有EC2.4.1.49活性的多肽属于糖基水解酶GH94家族。具有EC2.4.1.49活性的多肽包括，但不限于1,4-β-D-低聚-D-葡聚糖：磷酸α-D-葡糖基转移酶（1,4-beta-D-oligo-D-glucan:phosphate alpha-D-glucosyltransferases）和β-1,4低聚葡聚糖：正磷酸葡糖基转移酶（beta-1,4-oligoglucan:orthophosphate glucosyltransferases）。

本发明的纤维糊精磷酸化酶也包括具有EC2.4.1.20活性的纤维二糖磷酸化酶，具有EC2.4.1.20活性的纤维二糖磷酸化酶催化以下反应：纤维二糖+无机磷酸盐

α-D-葡萄糖-1-磷酸盐+D-葡萄糖。具有EC2.4.1.20活性的酶属于糖基水解酶己糖基转移酶家族。具有EC2.4.1.20活性的酶包括，但不限于，纤维二糖磷酸化酶和纤维二糖磷酸α-D-葡糖基转移酶（cellobiose:phosphate alpha-D-glucosyltransferases）。

在一些实施例中，本发明的纤维糊精磷酸化酶是保持相应的全长纤维糊精磷酸化酶的催化活性的功能性片段。

合适的纤维糊精磷酸化酶可以从分解纤维素的微生物中获得。这种微生物的例子包括，但不限于纤维弧菌、Sacharophagus degradans和热纤梭菌。合适的纤维糊精磷酸化酶的例子包括，但不限于，表3中所列举的纤维糊精磷酸化酶、其同源物及其直系同源物。

表3:纤维二糖磷酸化酶

在一些实施例中，该纤维糊精磷酸化酶为纤维二糖磷酸化酶(CBP)。合适的纤维二糖磷酸化酶的例子包括，但不限于纤维弧菌纤维二糖磷酸化酶CgCBP、Sacharophagusdegradans纤维二糖磷酸化酶SdCBP、热纤梭菌纤维二糖磷酸化酶CtCBP、其同源物，及其直系同源物。

表4:纤维二糖磷酸化酶

本发明的纤维糊精磷酸化酶可以包括，但不限于，缓徐瘤梭菌（Clostridium lentocellum）纤维糊精磷酸化酶CDP_Clent、热纤梭菌纤维糊精磷酸化酶CDP_Ctherm、和Acidovibriocellulolyticus纤维糊精磷酸化酶CDP_Acell。在一些实施例中，该纤维糊精磷酸化酶具有这样的氨基酸序列：与CDP_Clent、CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或至少约100%氨基酸一致性。

在一些优选的实施例中，本发明的纤维糊精磷酸化酶具有这样的氨基酸序列：与CgCBP(SEQ ID NO:11)、SdCBP(SEQ ID NO:12)，或CtCBP(SEQ ID NO:13)具有至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或至少约100%氨基酸一致性。

在其它实施例中，本发明的宿主细胞含有至少一种另外的重组纤维糊精磷酸化酶，或其功能性片段。优选地，该至少一种另外的重组纤维糊精磷酸化酶为选自CgCBP、SdCBP、和CtCBP的纤维二糖磷酸化酶。

纤维糊精磷酸化酶序列基序

通过PSI-BLAST同时分析热纤梭菌(BAA22081.1)、Acidovibrio cellulolyticus(ZP_07328763.1)和缓徐瘤梭菌（Clostridium lentocellum）(YP_004310865.1)纤维糊精磷酸化酶的氨基酸序列以鉴定注释为“纤维糊精磷酸化酶”的多肽。接着，所有这种鉴定的多肽用作PSI-BLAST的第二轮输入。通过PRATT分析(ExPASy生物信息学网站)从这些结果中分析纤维糊精磷酸化酶序列，其中PRATT分析鉴定保守的PROSITE基序。该保守序列为

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:14)。作为如何读PROSITE基序的例子，以下基序[AC]-x-V-x(4)-{ED}(SEQ ID NO:200)，翻译为[丙氨酸或半胱氨酸]-任何氨基酸-缬氨酸-任何氨基酸-任何氨基酸-任何氨基酸-任何氨基酸-{除了谷氨酸或天冬氨酸之外的任何氨基酸}(SEQ ID NO:200)。该保守基序可以用于鉴定另外的纤维糊精磷酸化酶。例如，SEQ ID NO:14通过利用PROSITE服务器(PROSITE ExPASy网站)鉴定16种另外的纤维糊精磷酸化酶。因此，本发明合适的纤维糊精磷酸化酶包括表4中列举的16种鉴定的纤维糊精磷酸化酶。

表4:通过PROSITE鉴定的纤维糊精磷酸化酶

表3中列举的纤维二糖磷酸化酶蛋白质的氨基酸序列比对和PRATT分析(ExPASy生物信息学网站)揭示这些蛋白质含有保守PROSITE基序。该保守序列为：

Y-Q-[CN]-M-[IV]-T-F-[CN]-[FILMV]-[AS]-R-[ST]-[AS]-S-[FY]-[FY]-E-[STV]-G-x-[GS]-R-G-[IM]-G-F-R-D-S-[ACNS]-Q-D-[ILV]-[ILMV]-G-x-V-H-x-[IV]-P-[ADEST]-x-[AV]-[KR]-[AEQ]-x-[IL]-[FIL]-D(SEQ ID NO:15)。该保守基序可以用于鉴定其它纤维二糖磷酸化酶。例如，通过PROSITE服务器(PROSITE ExPASy网站)将SEQ ID NO:15用于鉴定另外的另外的91种纤维二糖磷酸化酶。因此，本发明的合适的纤维二糖磷酸化酶包括表5中列举的鉴定的91种纤维二糖磷酸化酶。取决于可以包含在宿主细胞中的纤维糊精转运蛋白可以优选特定的纤维糊精磷酸化酶。

表5:由PROSITE鉴定的纤维二糖磷酸化酶

此外，纤维弧菌纤维二糖磷酸化酶的x-射线晶体结构与PDB ID3QG0一起使用，并且用PRATT分析(ExPASy生物信息学网站)分析以鉴定在纤维二糖磷酸化酶和纤维糊精磷酸化酶两者中都保守的保守PROSITE基序。该保守基序为

Y-x(2)-G-x-[KR]-E-N-[AG]-[AG]-[IV]-F-x(2)-[ANST]-[NST]-x(2)-[AIV]-x(2)-[AGT]-x(4)-[AG]-x(4)-[ADNS](SEQ ID NO:233)。该保守基序可以用于鉴定另外的纤维二糖磷酸化酶和纤维糊精磷酸化酶。

因此，本发明的一些方面涉及具有保守基序的纤维糊精磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶。在一些实施例中，本发明的纤维糊精磷酸化酶或纤维二糖磷酸化酶或其功能性片段含有序列SEQ ID NO:233。在其它实施例中，本发明的纤维糊精磷酸化酶，或其功能性片段含有序列SEQ ID NO:14。在另外的实施例中，本发明的纤维二糖磷酸化酶，或其功能性片段含有序列SEQ ID NO:15。

突变型纤维糊精磷酸化酶

本发明的其它方面涉及突变型纤维糊精磷酸化酶，该突变型纤维糊精磷酸化酶可以用于增加本发明的纤维糊精磷酸化酶的功能和/或活性。在一些实施例中，该突变型纤维糊精磷酸化酶为纤维二糖磷酸化酶。突变型纤维糊精磷酸化酶可以通过使编码本发明的纤维糊精磷酸化酶的多聚核苷酸发生突变而产生。在一些实施例中，本发明的突变型纤维糊精磷酸化酶可以含有至少一个突变，该至少一个突变包括，但不限于，导致纤维糊精磷酸化酶的功能和/或活性增加的点突变、错义突变、置换突变、移码突变、插入突变、重复突变（duplication mutation）、倍增突变、易位突变、或反转突变。

在感兴趣的纤维糊磷酸化酶中产生至少一个突变的方法在本领域是周知的，并且包括，但不限于随机突变和筛选、定点突变、PCR突变、插入突变、化学突变、和辐射。

在一些实施例中，该突变型纤维糊精磷酸化酶含有一个或更多个氨酸替换。例如，本发明的纤维糊精磷酸化酶在与表3和表4中分别列举的纤维糊精磷酸化酶或纤维二糖磷酸化酶中的任何氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置可以含有氨基酸替换。此外，本发明的纤维糊精磷酸化酶在与CDP_Clent、CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置可以含有氨基酸替换。在其它实施例中，本发明的纤维二糖磷酸化酶在与CgCBP(SEQ ID NO:11)、SdCBP(SEQ ID NO:12)或CtCBP(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置可以含有氨基酸替换。

此外，本发明的突变型纤维二糖磷酸化酶在与SdCBP(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置可以含有氨基酸替换。合适的一个或更多个位置包括，但不限于，在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置、在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置、在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置、在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置、在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，及其组合

在一个非限制性实施例中，在一个或更多个位置的氨基酸替换为：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ IDNO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。在一些优选的实施例中，在一个或更多个位置的氨基酸替换为：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)和/或在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)。

在一些实施例中，突变型纤维糊精磷酸化酶的增加的功能和/或活性导致宿主细胞以比表达野生型（即，非突变型）纤维糊精磷酸化酶的细胞中纤维糊精的降解速率更快的速率降解纤维糊精。例如，在含有突变型纤维糊精磷酸化酶的宿主细胞中，纤维糊精的降解速率可以比含有相应的野生型纤维糊精磷酸化酶的宿主细胞中纤维糊精的降解速率快至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少125%、至少150%、至少175%、至少200%、至少225%、至少250%、至少275%、至少300%，或至少更高的百分比。

与纤维糊精磷酸化酶结合

本发明的另一方面涉及宿主细胞，该宿主细胞含有与本发明的重组β-葡萄糖苷酶、本发明的重组葡萄糖磷酸变位酶和本发明的重组己糖激酶中的一种或更多种结合的本发明的至少一种重组纤维糊精磷酸化酶。

在一些实施例中，含有重组纤维糊精磷酸化酶的本发明的宿主细胞能将纤维糊精，比如纤维二糖转运至细胞中。这种宿主细胞能通过表达内源蛋白或转运纤维糊精的重组蛋白将纤维糊精，比如纤维二糖转运至细胞中。在这种实施例中，含有重组纤维糊精磷酸化酶的宿主细胞能在不同的压力条件下生长，其中该不同的压力条件对表达与重组β-葡萄糖苷酶的重组纤维糊精磷酸化酶可能是有利的。另外，该宿主细胞可以改造成在不同的压力条件下使纤维糊精磷酸化酶途径和β-葡萄糖苷酶途径最优化。因此，在一些实施例中，本发明的宿主细胞表达与至少一种重组β-葡萄糖苷酶结合的至少一种重组纤维糊精磷酸化酶。

在其它实施例中，含有重组纤维糊精磷酸化酶的宿主细胞能通过磷酸解将纤维糊精裂解成葡萄糖-1-磷酸和更短的纤维糊精。为了能被细胞利用，需要将葡萄糖-1-磷酸转化成葡萄糖-6-磷酸。葡萄糖-1-磷酸可以通过在宿主细胞中自然表达的葡萄糖磷酸变位酶转化成葡萄糖-6-磷酸。但是在糖酵解期间可以通过转录下调葡萄糖磷酸变位酶。此外，其它重组蛋白质或酶的表达或利用的生长条件也可以影响细胞中内源葡萄糖磷酸变位酶的表达。这些缺点可以通过在细胞中重组表达至少一种葡萄糖磷酸变位酶来克服。因此，在一些实施例中，本发明的宿主细胞表达与至少一种重组葡萄糖磷酸变位酶结合的至少一种重组纤维糊精磷酸化酶。

在进一步的实施例中，含有重组纤维糊精磷酸化酶的宿主细胞能将纤维糊精，比如纤维二糖降解为葡萄糖。为了使细胞利用产生的葡萄糖，需要将葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸。通常，细胞中自然表达的己糖激酶使葡萄糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸。但是，本发明的宿主细胞表达的己糖激酶的活性量可能不足以有效地使产生的所有的葡萄糖磷酸化。此外，其它重组蛋白质或酶的表达或利用的生长条件也可以影响细胞中内源性己糖激酶的表达。这些缺点可以通过在细胞中重组表达至少一种己糖激酶来克服。因此，在一些实施例中，本发明的宿主细胞表达与至少一种重组己糖激酶结合的至少一种重组纤维糊精磷酸化酶。

β-葡萄糖苷酶

本发明的另一方面涉及宿主细胞，除了纤维糊精磷酸化酶之外，该宿主细胞还利用胞内β-葡萄糖苷酶，或在ATP不限的实施例中，利用胞内β-葡萄糖苷酶代替纤维糊精磷酸化酶。对宿主细胞来说，β-葡萄糖苷酶可以是内源的或重组的。在此使用的β-葡萄糖苷酶指的是β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶（β-D-glucoside glucohydrolase）(E.C.3.2.1.21)，β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。β-葡萄糖苷酶为催化β-D-葡萄糖苷中末端非还原性残基水解并释放葡萄糖的酶。

在一些实施例中，本发明的β-葡萄糖苷酶为保持相应的全长β-葡萄糖苷酶的催化活性的功能性片段。

合适的β-葡萄糖苷酶包括，但不限于糖苷水解酶的糖苷水解酶家族1(GH1)家族的成员。在一些实施例中，β-葡萄糖苷酶来自粗糙脉孢菌，并且在一些优选的实施例中，β-葡萄糖苷酶为NCU00130，NCU00130也称为GH1-1。本发明合适的β-葡萄糖苷酶也包括NCU00130的同源物和直系同源物。NCU00130的例子包括，但不限于黑孢块菌,CAZ82985.1;米曲霉,BAE57671.1;绵腐卧孔菌,EED81359.1;黄孢原毛平革菌,BAE87009.1;乳酸克鲁维酵母,CAG99696.1;双色蜡蘑,EDR09330;葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）,EEQ37997.1;和树干毕赤酵母,ABN67130.1。

β-葡萄糖苷酶序列基序

如在此的公布，本发明的β-葡萄糖苷酶包括糖苷水解酶的GH1家族。该团体的成员的PRATT分析(ExPASy生物信息学网站)鉴定两条保守PROSITE基序的存在。第一条PROSITE基序与N端的保守部分匹配并且具有以下序列：F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:16)。第一条PROSITE基序与周围的活性位点的保守部分匹配并且具有以下序列：[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:17)。在此，E为催化的谷氨酸。作为如何读PROSITE基序的例子，以下基序[AC]-x-V-x(4)-{ED}(SEQ ID NO:200)，翻译为[丙氨酸或半胱氨酸]-任何氨基酸-缬氨酸-任何氨基酸-任何氨基酸-任何氨基酸-任何氨基酸-{除了谷氨酸或天冬氨酸之外的任何氨基酸}(SEQ ID NO:200)。虽然这两条保守基序可以主要用于鉴定另外的β-葡萄糖苷酶，应该注意，不是所有的糖苷水解酶的GH1家族的β-葡萄糖苷酶都含有这两条保守基序。例如，NCU00130含有SEQ ID NO:16保守基序但缺乏SEQ ID NO:17的保守基序。

另外的合适的β-葡萄糖苷酶包括来自于糖苷水解酶的糖苷水解酶家族3家族的β-葡萄糖苷酶。该团体的成员的PRATT分析(ExPASy生物信息学网站)鉴定与周围活性位点的保守部分匹配的PROSITE基序的存在。该保守序列为

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:18)。在此，D为催化的天冬氨酸。该保守基序可以用于鉴定另外的β-葡萄糖苷酶。

此外，合适的β-葡萄糖苷酶也可以包括任何含有NCBI序列COG2723中发现的β-葡萄糖苷酶/6-磷酸-β-葡萄糖苷酶/β-半乳糖苷酶的保守区域的β-葡萄糖苷酶。取决于宿主细胞中可能含有的纤维糊精转运蛋白，可以优选特定的β-葡萄糖苷酶。

因此，本发明的一些方面涉及具有一个或多个保守基序的β-葡萄糖苷酶。在一些实施例中，本发明的β-葡萄糖苷酶或其功能性片段含有选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18中的一个或多个序列。在其它实施例中，本发明的β-葡萄糖苷酶或其功能性片段含有选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18中的两个或两个以上序列。

与β-葡萄糖苷酶结合

本发明的另一方面涉及宿主细胞，该宿主细胞含有与本发明的重组葡萄糖磷酸变位酶和本发明的重组己糖激酶中的一种或更多种结合的本发明的至少一种重组β-葡萄糖苷酶。

在一些实施例中，含有重组β-葡萄糖苷酶的本发明的宿主细胞能将纤维糊精比如，纤维二糖转运到细胞中。这种宿主细胞能通过表达内源蛋白或转运纤维糊精的重组蛋白将纤维糊精，比如纤维二糖转运至细胞中。

在一些实施例中，含有重组β-葡萄糖苷酶的宿主细胞液能通过磷酸解裂解纤维糊精。该宿主细胞可以通过表达内源或重组纤维糊精磷酸化酶，通过磷酸化裂解纤维糊精。可选地，该宿主细胞可以表达导致纤维糊精的磷酸解裂解的替代途径，在这种实施例中，纤维糊精的磷酸解裂解导致葡萄糖-1-磷酸的产生。但是，为了使细胞能利用产生的葡萄糖-1-磷酸，必须将葡萄糖-1-磷酸转化成葡萄糖-6-磷酸。葡萄糖-1-磷酸可以通过在宿主细胞中自然表达的葡萄糖磷酸变位酶转化成葡萄糖-6-磷酸。但是在糖酵解期间可以通过转录下调葡萄糖磷酸变位酶。此外，其它重组蛋白质或酶的表达或利用的生长条件也可以影响细胞中内源性葡萄糖磷酸变位酶的表达。这些缺点可以通过在细胞中重组表达至少一种葡萄糖磷酸变位酶来克服。因此，在一些实施例中，本发明的宿主细胞表达与至少一种重组葡萄糖磷酸变位酶结合的至少一种重组β-葡萄糖苷酶。

在其它实施例中，含有重组β-葡萄糖苷酶的宿主细胞能将纤维糊精，比如纤维二糖降解为葡萄糖。但是，为了使细胞利用葡萄糖，需要将葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸。通常，通过细胞中自然表达的己糖激酶将葡萄糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸。但是，本发明的宿主细胞表达的己糖激酶的活性量可能不足以有效地使产生的所有的葡萄糖磷酸化。此外，其它重组蛋白质或酶的表达或利用的生长条件也可以影响细胞中内源己糖激酶的表达。这些缺点可以通过在细胞中重组表达至少一种己糖激酶来克服。因此，在一些实施例中，本发明的宿主细胞表达与至少一种重组己糖激酶结合的至少一种重组β-葡萄糖苷酶。

葡萄糖磷酸变位酶

本发明的其它方面涉及宿主细胞，该宿主细胞含有葡萄糖磷酸变位酶。在此使用的“葡萄糖磷酸变位酶”指的是具有EC5.4.2.2活性的多肽，具有EC5.4.2.2活性的多肽催化α-D-葡萄糖单体上的磷酸基团在向前方向从1'位置转移到6'位置或在相反的方向从6'位置转移到1'位置。特别地，具有EC5.4.2.2活性的多肽催化葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖-6-磷酸的相互转换。在一些实施例中，本发明的葡萄糖磷酸变位酶为保持相应的全长纤维糊精磷酸化酶的催化活性的功能性片段。

本发明的葡萄糖磷酸变位酶可以在本发明的宿主细胞中内源或异位表达。在本发明的宿主细胞中异位表达葡萄糖磷酸变位酶的实施例中，宿主细胞进一步包括重组葡萄糖磷酸变位酶。

在一些优选的实施例中，该葡萄糖磷酸变位酶为酿酒酵母葡萄糖磷酸变位酶PGM2。在其它实施例中，该葡萄糖磷酸变位酶为酿酒酵母葡萄糖磷酸变位酶PGM2的同源物或直系同源物。在另外的实施例中，该葡萄糖磷酸变位酶是过表达的。

葡萄糖磷酸变位酶序列基序

已知的葡萄糖磷酸变位酶基因的氨基酸序列比对和PRATT分析(ExPASy生物信息学网站)揭示这些蛋白质含有保守PROSITE基序。保守序列为：

[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)。该保守基序可以用于鉴定另外的葡萄糖磷酸变位酶。

因此，本发明的一些方面涉及具有保守基序的葡萄糖磷酸变位酶或其功能性片段。在一些实施例中，本发明的葡萄糖磷酸变位酶含有序列SEQ ID NO:19。

与葡萄糖磷酸变位酶的结合

本发明的另一方面涉及宿主细胞，该宿主细胞含有与本发明的一种或更多种己糖激酶结合的至少一种重组葡萄糖磷酸变位酶。

在一些实施例中，含有重组葡萄糖磷酸变位酶的本发明的宿主细胞能将纤维糊精比如纤维二糖转运到细胞中，并能降解转运的纤维糊精。这种宿主细胞能通过表达内源蛋白或转运纤维糊精的重组蛋白将纤维糊精，比如纤维二糖转运至细胞中。这种宿主细胞也能通过表达内源蛋白或降解纤维糊精的重组蛋白降解转运的纤维糊精。在这些实施例中，含有重组葡萄糖磷酸变位酶的宿主细胞能将纤维糊精比如纤维二糖降解成葡萄糖。为了使细胞利用产生的葡萄糖，需要将葡萄糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸。通常，通过细胞中自然表达的己糖激酶将葡萄糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸。但是，本发明的宿主细胞表达的己糖激酶的活性量可能不足以有效地使产生的所有的葡萄糖磷酸化。此外，其它重组蛋白质或酶的表达或利用的生长条件也可以影响细胞中内源性己糖激酶的表达。这些缺点可以通过在细胞中重组表达至少一种己糖激酶来克服。因此，在一些实施例中，本发明的宿主细胞表达与至少一种重组己糖激酶结合的至少一种重组葡萄糖磷酸变位酶。

己糖激酶

本发明的另一方面涉及宿主细胞，该宿主细胞含有己糖激酶。在此使用的“己糖激酶”指的是具有EC2.7.1.1活性的多肽，该“己糖激酶”催化六碳糖，己糖，磷酸化成磷酸己糖。优选地，本发明的己糖激酶使葡萄糖磷酸化。在一些实施例中，本发明的己糖激酶为保持相应的全长的己糖激酶的催化活性的功能性片段。

本发明的己糖激酶可以在本发明的宿主细胞中内源或异位表达。在本发明的宿主细胞异位表达己糖激酶的实施例中，该宿主细胞进一步包括重组己糖激酶。

在一些实施例中，该己糖激酶为酿酒酵母己糖激酶HXK1、HXK2或GLK1。优选地，该己糖激酶为酿酒酵母己糖激酶HXK1。在其它实施例中，该己糖激酶为酿酒酵母己糖激酶HXK1、HXK2或GLK1的同源物或直系同源物。在另外的实施例中，该己糖激酶是过表达的。

己糖激酶序列基序

已知的己糖激酶基因的氨基酸序列比对和PRATT分析(ExPASy生物信息学网站)揭示这些蛋白质含有保守PROSITE基序。保守序列为：

[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQID NO:20)。该保守基序可以用于鉴定另外的己糖激酶。

因此，本发明的一些方面涉及具有保守基序的己糖激酶或其功能性片段。在一些实施例中，本发明的己糖激酶含有序列SEQ ID NO:20。

葡萄糖应答基因

本发明的宿主细胞进一步含有一种或更多种葡萄糖应答基因。该一种或更多种葡萄糖应答基因对宿主细胞来说可以是重组的或内源的。在此使用的“葡萄糖应答基因”指的是编码参与细胞对葡萄糖的响应的蛋白质的基因。典型地，葡萄糖应答基因编码的蛋白质能使细胞“感觉到”或“意识到”可作为细胞营养的葡萄糖的量并且使代谢和生长速率与葡萄糖的可用量匹配。葡萄糖应答基因编码的蛋白质的活性确保细胞的代谢是最优的并且有效利用葡萄糖。

在优选的实施例中，该一个或更多个葡萄糖应答基因选自Snf3、Rgt1、Rgt2、Yck1/2、Std1、Mth1、Snf1/4、Grr1、Gpr1、Gpa2、Ras2、Stb3、Hxk2、Pfk27、Pfk26、Sch9、Yak1、Mig1、Rim15、Kcs1、和Tps1。在其它实施例中，该一个或更多个葡萄糖应答基因可以为Snf3、Rgt1、Rgt2、Yck1/2、Std1、Mth1、Snf1/4、Grr1、Gpr1、Gpa2、Ras2、Stb3、Hxk2、Pfk27、Pfk26、Sch9、Yak1、Mig1、Rim15、Kcs1、或Tps1的直系同源物；或编码与Snf3、Rgt1、Rgt2、Yck1/2、Std1、Mth1、Snf1/4、Grr1、Gpr1、Gpa2、Ras2、Stb3、Hxk2、Pfk27、Pfk26、Sch9、Yak1、Mig1、Rim15、Kcs1、或Tps1编码的多肽具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的多肽的任何基因。

Snf3(NM_001180254.1)编码检测低浓度的胞外葡萄糖的高亲和力葡萄糖感受器(Ozcan,PNAS,1996)。

Rgt1(NM_001179604.1)编码在对葡萄糖的应答中调节若干葡萄糖转运蛋白(HXT)基因的表达的葡萄糖响应转录因子(Kim and Johnston,J Biol Chem,2006)。

Rgt2(NM_001180198.1)为检测高浓度的胞外葡萄糖的低亲和力葡萄糖感受器(Ozcan,PNAS,1996)。

Yck1/2(NM_001179265.1,NM_001182992.1)为参与葡萄糖感应的膜联蛋白激酶。Yck1/2由Snf3或Rgt2的跨膜部分激活。Yck1/2使结合至Snf3或Rgt2的Mth1和Std1磷酸化，这使得它们被Grr1泛素连接酶识别并随后降解(Moriya and Johnston,PNAS,2004)。

Std1(NM_001183466.1)或Mth1(NM_001180585.1)的缺失导致Rgt1的磷酸化，这防止其与DNA结合和抑制HXT基因。

Snf1/4(NM_001180785.1,NM_001180980.1)一起形成SNF1激酶复合体，SNF1激酶复合体在增加葡萄糖后被灭活。

Grr1(NM_001181747.1)为含有Mth1、Std1、Pfk27、Tye7、Stp2、Aro1、His4、Hom3、和Mae1的泛素连接酶。

Gpr1(NM_001180094.1)为cAMP-PKA途径中的G蛋白偶联受体。当存在磷酸糖时，Gpr1在对葡萄糖的应答中诱导产生cAMP(Rolland et al.,FEMS Yeast Res,2002)。

Gpa2(NM_001178911.1)为cAMP-PKA途径中与Gpr1结合的G-α亚单位。当存在磷酸糖时，Gpa2在对葡萄糖的应答中诱导产生cAMP(Rolland等人，FEMS Yeast Res,2002)。

Ras2(NM_001182936.1)为GTP结合蛋白，在对葡萄糖的应答中，该GTP结合蛋白在细胞中发生的转录变化中的发挥作用(Wang等人，PLOS Biology,2004)。

Stb3(NM_001180476.1)为抑制生长基因转录的核糖体RNA加工元件(RRPE)结合蛋白。抑制通过葡萄糖解除(Liko等人，Genetics,2010)。

Hxk2(NM_001181119.1)为在葡萄糖，果糖和甘露糖上的生长期间所用的主要的同工酶。非发酵性碳源抑制Hxk2。Hxk2对葡萄糖的完整的转录应答是必须的并且调节自身的表达。Hxk2介导的转录应答与Hxk2的己糖激酶活性不相关，表明Hxk2的信号传导和激酶活性是有区别的(Moreno和Herrero,FEMS Microbiol Rev,2002)。

Pfk27(NM_001183390.1)催化果糖-2,6-二磷酸的合成，果糖-2,6-二磷酸是激活糖酵解并抑制糖异生作用的第二信使(Benanti,Nat Cell Biol,2007)。发酵碳源诱导Pfk27并使其稳定。Pfk27通过Snf1磷酸化并通过Grr1靶向降解。

Pfk26(NM_001179455.1)催化果糖-2,6-二磷酸的合成，果糖-2,6-二磷酸是激活糖酵解并抑制糖异生作用的第二信使。

Sch9(NM_0011799336.1)为参与高渗胁迫应答基因（osmostress-responsive gene）的转录激活，调节G1进程、cAPK活性、FGM途径的氮激活；参与寿命的调节、与哺乳动物的Akt/PKB同源的蛋白激酶。

Yak1(NM_001181574.1)为在对葡萄糖的可用性的应答中，参与生长控制的葡萄糖感受系统的一部分，在对葡萄糖信号的应答中从细胞质易位到细胞核并且使Pop2p磷酸化的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。

Mig1(NM_00180900.1)为参与葡萄糖抑制的转录因子、含有2个Cys2His2锌指模型的序列特异性DNA结合蛋白、通过SNF1激酶和GLC7磷酸酶调节。

Rim15(NM_001179933.1)为在细胞增殖期间参与对营养物的应答的信号转导，特别是稳定期的建立的葡萄糖阻遏蛋白激酶，Rim15被认为是IME2的调节剂、Pho80p-Pho85p激酶的底物。

Kcs1(NM_001180325.1)为肌醇六磷酸(inositol hexakisphosphate,IP6)和肌醇七磷酸(inositol heptakisphosphate,IP7)激酶。通过Kcs1p产生高能肌醇焦磷酸对许多过程来说是必须的，比如液泡的生物合成，应激反应和端粒的维持。

Tps1(NM_00117874.1)为海藻糖-6-磷酸合成酶/磷酸酶复合体的合成酶亚单位，Tps1合成存储型碳水化合物海藻糖（storage carbohydrate trehalose）；还发现单体形式；通过应激反应诱导表达并被Ras-cAMP途径抑制。

改变的蛋白质活性水平

在含有一种葡萄糖应答基因的宿主细胞中，该一种或更多种葡萄糖应答基因编码的一种或更多种蛋白质的活性水平与该一种或更多种蛋白质的野生型活性水平相比是可以改变的。该一种或更多种蛋白质的活性水平与该一种或更多种蛋白质的野生型活性水平相比是可以提高或降低的。

蛋白质活性水平的改变可以通过对宿主细胞进行遗传修饰实现。导致基因表达或蛋白质活性提高的遗传修饰可以称为基因的扩增、生成过剩、过表达、激活、增强、增加、或上调。蛋白质活性水平的改变可以包括编码蛋白质的表达和/或活性提高，并且包括更高的蛋白质的活性或作用(例如，比活性或体内酶活性)，蛋白质的抑制或降解降低，和蛋白质的过度表达。例如，可以增加基因拷贝数，可以使用提供比天然启动子更高的表达水平的启动子提高表达水平，或通过基因工程或传统诱变改变基因以提高酶的生物活性或蛋白质的作用来改变基因。引起基因连续表达或引起编码的蛋白质组成性激活的突变为导致蛋白质活性提高的遗传修饰的另外的例子。上述任何修饰的结合也是可能的。

导致基因报道或蛋白质活性下降的遗传修饰可以指的是基因表达的失活（完全或部分）、缺失、中断、阻塞、沉默、下调或弱化。例如，导致这种基因编码的蛋白质的活性下降的基因的遗传修饰可以是基因的完全缺失（即，该基因不存在，因此该蛋白质不存在）、导致该蛋白质不完整或不翻译（例如，该蛋白质不表达）的基因突变、或降低或取消蛋白质的天然功能（例如，表达的蛋白质的酶活性或作用降低或没有）的基因突变的结果。更具体地，在此讨论的降低蛋白质的作用指的是，导致蛋白质的表达和/或生物活性下降的、在所述宿主细胞中的任何遗传修饰并且包括蛋白质的活性下降、蛋白质的抑制或降解的增加、和蛋白质的表达的降低或消失。例如，可以通过阻断或减少蛋白质的产生、降低蛋白质的作用、或抑制蛋白质的作用而降低蛋白质的作用或活性。这些修饰中的一些组合也是可能的。阻断或减少蛋白质的产生可以包括将编码该蛋白质的基因置于要求生长培养基中存在诱导组合物的启动子的控制下。通过建立条件，使得诱导剂从培养基中耗尽，从而可以关闭编码该蛋白质的基因的表达（并且，因此关闭蛋白质的合成）。阻断或降低蛋白质的作用也可以包括使用与美国专利4,743,546所述的方法类似的切除技术方法。为了使用该方法，在特定的基因序列之间克隆编码感兴趣的蛋白质的基因，该特定的基因序列允许从基因组中具体，受控地切除该基因。例如，如在美国专利4,743,546中，培养基的培养温度，或一些其它的物理或营养信号的改变可以引起切除。

通常，根据本发明，根据来自于相同的生物体（来自于相同的来源或母序列）的野生型（即，正常，未修饰的）蛋白质的相同特征进行蛋白质活性改变，这在相同或相等的条件下测量或建立的。这些条件包括测量蛋白质活性的分析或培养条件（例如，培养基成分、温度、PH等等），以及所用的分析类型，评估的宿主细胞等等。如上所述，相等的条件为类似的，但无需一致的（例如，在条件中可以允许一些保守改变），并且与相同的条件下产生的对照相比，基本不改变细胞生长的效果或生物活性的条件（例如，培养条件）。

戊糖转运蛋白

本发明的宿主细胞可以进一步包括至少一种重组戊糖转运蛋白，该重组戊糖转运蛋白使细胞能利用半纤维素戊糖生产碳水化合物或碳水化合物衍生物。戊糖转运蛋白为任何将戊糖分子从细胞外部转运到细胞内部和/或从细胞内部转运到细胞外部的跨膜蛋白。在此使用的戊糖，指的是任何带有五个碳原子的单糖。戊糖的例子包括，但不限于：木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和鼠李糖。

在一些实施例中，本发明的戊糖转运蛋白为保持将戊糖分子从细胞外部转运到细胞内部和/或从细胞内部转运到细胞外部的能力的功能性片段。

合适的戊糖转运蛋白的例子包括，但不限于表6中所列举的戊糖转运蛋白。

表6：戊糖转运蛋白

基因名称	生物体	NCBI参考序列
			Ap31/SUT2	树干毕赤酵母	ABN66266
Ap26/XP_001387242	树干毕赤酵母	XP001387242
			AN49/NCU01494	粗糙脉孢菌	EAA2669I
AN41/NCU09287	粗糙脉孢菌	EAA28903
			AN29-2/NCU04963	粗糙脉孢菌	EAA30175
AN28-3/NCU02188	粗糙脉孢菌	EAA30346
			AN25/NCU00821	粗糙脉孢菌	EAA35128
Xy50/NCU04537	粗糙脉孢菌	EAA26741
			Xy31/NCU06138	粗糙脉孢菌	EAA30764
Xy33/NCU00988	粗糙脉孢菌	EAA34662
			Xyp37/SUT3	树干毕赤酵母	ABN67990
Xyp33/XUT3	树干毕赤酵母	EAZ63115
			Xyp32/XUTl	树干毕赤酵母	ABN67554
Xyp30/STLl	树干毕赤酵母	ABN65745
			Xyp31/XUT2	树干毕赤酵母	AAVQOIOOOO02
Xyp29/STLl2/XUT6	树干毕赤酵母	ABN68560
			Xyp30-1/HGT3	树干毕赤酵母	ABN68686
Xyp28/XUT7	树干毕赤酵母	EAZ63044

在一些实施例中，该戊糖转运蛋白为木糖转运蛋白。合适的木糖转运蛋白的例子包括但不限于表7中所列举的木糖转运蛋白。

表7：木糖转运蛋白

在其它实施例中，该戊糖转运蛋白为阿拉伯糖转运蛋白。合适的阿拉伯糖转运蛋白的例子包括，但不限于表8所列举的阿拉伯糖转运蛋白。

表8：阿拉伯糖转运蛋白

在一些实施例中，本发明的戊糖转运蛋白包括，但不限于：木糖转运蛋白NCU08221和STL12/XUT6、阿拉伯糖转运蛋白XUT1、阿拉伯糖/葡萄糖转运蛋白NCU06138、木糖/葡萄糖转运蛋白SUT2、SUT3和XUT3、木糖/阿拉伯糖/葡萄糖转运蛋白NCU04963、其同源物、及其直系同源物。

在其它实施例中，本发明的宿主细胞进一步含有参与戊糖利用的一种或更多种重组酶。对该宿主细胞来说，该一种或更多种酶为内源的或异源的。涉及戊糖利用的该一种或更多种酶可以包括，但不限于：任意组合的L-阿拉伯糖异构酶、L-核酮糖激酶、L-核酮糖-5-P4差向异构酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、醛糖还原酶、L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶、L-木酮糖还原酶，和木糖醇脱氢酶。这些酶可以来自自然代谢戊糖的任何生物体。这些生物体的例子包括，但不限于克鲁维酵母属（Kluyveromyces sp.）、发酵单胞菌属(Zymomonassp.)、大肠杆菌（E.coli）、梭状芽胞杆菌（Clostridium sp.），和毕赤酵母菌属（Pichia sp.）。

制备和培养本发明的宿主细胞的方法

本发明的其它方面涉及宿主细胞的制备，该宿主细胞含有重组纤维糊精转运蛋白、重组纤维糊精磷酸化酶、重组β-葡萄糖苷酶、重组葡萄糖磷酸变位酶或重组己糖激酶中的一种或更多种。在一些实施例中，该宿主细胞可以进一步包括本发明的一种或更多种葡萄糖应答基因、本发明的一种或更多种戊糖转运蛋白、和/或参与戊糖利用的、本发明的一种或更多种重组酶。这些宿主细胞可以用于降解纤维糊精并且从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物。

生产和培养本发明的宿主细胞的方法可以包括将含有重组多聚核苷酸的表达载体导入或转化到该宿主细胞中。本领域普通技术人员知晓这些将表达载体转化到宿主细胞的方法。例如，用表达载体转化E.coli的一种方法涉及氯化钙处理，其中该表达载体通过钙沉淀物导入。其它盐，例如，磷酸钙，也可以用于类似的过程。另外，电穿孔（即，施加电流以提高细胞对核酸序列的通透性），可用于转染宿主细胞。同样，核酸序列的显微注射提供转染宿主细胞的能力。也可以采用其它手段，比如，脂质复合物、脂质体、和树枝状聚合物（dendrimer）。利用这些或其它方法，本领域普通技术人员可以用想要的序列转染宿主细胞。

该载体可以为自主复制型载体，即，作为染色体外的实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外因子、微型染色体，或人工染色体。该载体可以含有确保自我复制的工具。可选地，该载体为这样的载体：当导入宿主中时，该载体整合到基因组中并且与所整合的染色体一起复制。此外，可以使用单个载体或质粒，或者两个或两个以上的载体或质粒，或者转座子，所述两个或两个以上的载体或质粒共同含有要被导入到宿主的基因组中的总的DNA，。

该载体优选含有一个或更多个可选标记，该一个或更多个可选标记易于转化的宿主的选择。可选的标记是这样的基因：其产物提供，例如，抗微生物剂或病毒抗性，重金属抗性，原养型向营养缺陷型变化。细菌细胞的选择可以基于基因赋予的耐药性，比如amp、gpt、neo和hyg基因。

酵母宿主的合适的标记为，例如，ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1，和URA3。用于丝状真菌宿主的可选标记包括，但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶（phosphinothricin acetyltransferase）)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸盐腺苷基转移酶（sulfate adenyltransferase）)，和trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)，及其等同物。优选用于曲霉的为构巢曲霉或米曲霉的amdS或pyrG基因，和吸水链霉菌的bar基因。优选用于木霉的为bar和amdS。

载体优选含有允许该载体整合到宿主的基因组中的，或该载体在细胞中独立于基因组自主复制的因子。

为了整合到宿主基因组中，该载体可以依靠载体的基因序列或任何其他因子以通过同源或非同源重组将载体整合到基因组中。可选地，该载体可以含有另外的核苷酸序列以通过同源重组直接整合到宿主的基因组中。该另外的核苷酸序列能将载体整合到宿主基因组的染色体的精确位置中。整合因子应该优选含有足量的核酸，比如，100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且更优选800至10,000碱基对，这些核酸与相应的目标序列高度同源以提高同源重组的可能性。整合因子可以为任何与宿主基因组中的目标序列同源的序列。此外，该同源因子可以为非编码或编码核苷酸序列。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主基因组中。

对于自主复制，载体可以进一步含有能使该载体在所讨论的宿主中自主复制的复制起源。复制起源可以为任何调节自主复制，在细胞中起作用的质粒复制子。术语“复制起源”或“质粒复制子”在此限定为能使质粒或载体在体内复制的序列。用于酵母宿主中的复制起源的例子为2微米的复制起源，ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的结合，以及ARS4和CEN6的结合。用于丝状真菌的复制起源的例子为AMA1和ANS1(Gems等人，1991;Cullen等人，1987;WO00/24883)。可以根据WO00/24883所公布的方法实现AMA1基因的分离和含有该基因的质粒或载体的构建。

对于其它宿主，例如：对于克鲁维酵母，可以在Jeremiah D.Read,et al.,Applied andEnvironmental Microbiology,Aug.2007,p.5088–5096一文中，对于发酵单胞菌，可以在Osvaldo Delgado,et al.,FEMS Microbiology Letters132,1995,23-26一文中，对于树干毕赤酵母，可以在申请号为7,501,275的美国专利中，对于梭状芽孢杆菌，可以在WO2008/040387中找到转化步骤。

多于一个拷贝的基因可以插入宿主中以提高基因产品的产量。基因拷贝数的增加可以通过以下方式实现：将该基因的至少一个另外的拷贝整合到宿主基因组中，或者包含带有这样的核苷酸序列的可扩增、可选择标记基因：在该核苷酸序列中，细胞含有可选择标记的基因的扩增拷贝，因此在存在合适的可选择试剂的情况下，可以通过培养该细胞来选择该基因的另外的拷贝。

本领域的技术人员知晓用于连接上述因子以构建本发明的重组表达载体的步骤(参见，例如，Sambrook等人，1989,同上)。

该宿主用至少一种表达载体转化。但仅仅使用单一的表达载体（没添加中间物）时，该载体含有所有必须的核酸序列。

一旦用表达载体转化宿主细胞，该宿主细胞就能生长。本发明的方法可以包括培养宿主细胞，使得细胞中的重组核酸得以表达。对于微生物宿主，该过程需要在合适的培养基中培养细胞。典型地，细胞在合适的培养基中，在35℃生长。在本发明中，优选的生长培养基包括，例如，普通商业制备培养基，比如Luria Bertani(LB)肉汤，Sabouraud Dextrose(SD)肉汤或酵母(YM)培养基肉汤。也可以使用其它规定的或合成的生长培养基，并且在微生物学，发酵科学领域的技术人员知晓适于特定宿主细胞的培养基。本领域知晓适合生长的温度范围和其它条件(参见，例如，Bailey和Ollis1986)。

根据本发明的一些方面，该培养基含有用于宿主细胞的碳源。这种“碳源”通常指的是适于作为原核细胞或简单的真核细胞生长的碳源的底物或化合物。碳源可以为各种形式，包括，但不限于：聚合物、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽等。这些碳源包括，例如，各种单糖如葡萄糖、低聚糖如纤维糊精、多糖、生物质聚合物如纤维素或半纤维素、木糖、阿拉伯糖、二糖如蔗糖、饱和或不饱和脂肪酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、乙醇等，或其混合物。另外，碳源可以为光合作用的产物，包括，但不限于葡萄糖。

木质纤维素是由纤维素，半纤维素，和木质素组成的。在一些实施例中，碳源为生物质聚合物比如纤维素或半纤维素。在此描述的“生物质聚合物”为在生物材料中含有的任何聚合物。该生物材料可以是活的或死的。生物质聚合物包括，例如：纤维素、木聚糖、木糖、半纤维素、木质素、甘露聚糖，和生物质中常见的其它材料。生物质聚合物的来源的非限制性例子包括草（例如，柳枝稷，芒草(Miscanthus)）、稻壳、甘蔗渣、棉、黄麻、大麻、亚麻、竹、剑麻、蕉麻、秸秆、树叶、剪下的草（grass clipping）、玉米秸秆、玉米芯、酒糟、豆科植物、高粱、甘蔗、甜菜渣、木屑、锯末，和生物质农作物（例如，海甘蓝（Crambe））。

除了合适的碳源，培养基必须含有本领域技术人员知晓的、适于培养物的生长和促进各种糖的发酵以及碳水化合物和碳水化合物衍生物的生产所需的酶途径的合适的矿物质、盐，辅助因子，缓冲液和其它成分。反应可在好氧或厌氧条件下进行，其中好氧，缺氧或厌氧条件优先基于微生物的要求。随着宿主细胞的生长和/或繁殖，各种糖或生物质聚合物的生长、糖发酵、或碳水化合物或碳水化合物衍生物的合成所需的酶、转运蛋白或其它蛋白质的表达将受影响。

共发酵的方法

本发明的其它方面涉及纤维素衍生的和半纤维素衍生的糖的共发酵的方法。在此使用的共发酵指的是宿主细胞同时利用在相同的容器中的多于一种的糖。该方法包括提供宿主细胞的步骤，其中该宿主细胞含有本发明的重组纤维糊精转运蛋白，以及本发明的重组纤维糊精磷酸化酶、本发明的重组β-葡萄糖苷酶、本发明的重组葡萄糖磷酸变位酶、或本发明的重组己糖激酶中的一种或更多种；以及在宿主细胞共发酵纤维素衍生的糖和半纤维素衍生的糖的条件下，在含有纤维素衍生的糖和半纤维素衍生的糖的培养基中培养宿主细胞。可以使用任何在此描述的并且含有本发明的重组纤维糊精转运蛋白和本发明的重组纤维糊精磷酸化酶、本发明的重组β-葡萄糖苷酶、本发明的重组葡萄糖磷酸变位酶、或本发明的重组己糖激酶中的一种或更多种的宿主细胞。在一些实施例中，该宿主细胞可以进一步含有本发明的一种或更多种葡萄糖应答基因、本发明的一种或更多种戊糖转运蛋白，和/或参与戊糖利用的本发明的一种或更多种重组酶。

在一些实施例中，该宿主细胞也可以含有至少一种重组戊糖转运蛋白和参与戊糖利用的一种或更多种重组酶。可选地，对宿主细胞来说，该至少一种戊糖转运蛋白和参与戊糖利用的一种或更多种酶可以为是内源的。该一种或更多种酶可以包括，但不限于L-阿拉伯糖异构酶、L-核酮糖激酶、L-核酮糖-5-P4差向异构酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、醛糖还原酶、L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶、L-木酮糖还原酶、木糖醇脱氢酶，或本领域技术人员所知的任何其它戊糖利用酶。

在此描述的共发酵的方法中，纤维素衍生的糖可以包括，但不限于：纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖等等，并且半纤维素衍生的糖可以包括，但不限于，木糖和阿拉伯糖。典型地，为了制备用于宿主细胞共发酵的纤维素衍生的糖和半纤维素衍生的糖，首先预处理木质纤维素生物质以改变其结构并使纤维素更好地进行酶水解。预处理可以包括物理或化学方法，包括，例如，氨纤维/冻结爆破，基于氢氧化钙或氢氧化钠的石灰法（the limemethod），和具有或不具有酸催化的蒸汽爆破。酸处理将从木质纤维素生物质的半纤维素成分中释放木糖和阿拉伯糖。接着，优选地，预处理的生物质的纤维素成分被纤维素酶混合物水解。市售纤维素酶混合物的例子包括(Novozymes),

(Genencor)(Scott W.Pryor,2010,Appl Biochem Biotechnol),和Cellulyve50L(Lyven)。

降解纤维糊精的方法

本发明的其它方面提供用于在宿主细胞中降解纤维糊精的方法。在一方面，本发明提供一种降解纤维糊精的方法，通过提供一种宿主细胞，其中该宿主细胞含有本发明的重组纤维糊精转运蛋白、重组纤维糊精磷酸化酶、本发明的重组β葡萄糖苷酶、本发明的重组葡萄糖磷酸变位酶或本发明的己糖激酶中的两种或更多种；以及在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养该宿主细胞，藉此降解纤维糊精。可以使用任何在此描述的并且含有本发明的重组纤维糊精转运蛋白、重组纤维糊精磷酸化酶、本发明的重组β葡萄糖苷酶、本发明的重组葡萄糖磷酸变位酶或本发明的己糖激酶中的两种或更多种的宿主细胞。在一些实施例中，该宿主细胞可以进一步含有本发明的一种或更多种葡萄糖应答基因、本发明的一种或更多种戊糖转运蛋白，和/或参与戊糖利用的本发明的一种或更多种重组酶。

在一些实施例中，纤维糊精的来源为木质纤维素生物质，该木质纤维素生物质含有纤维素含有纤维素、半纤维素，和木质素。在其它实施例中，纤维糊精的来源为半纤维素。在一些优选的实施例中，纤维糊精的来源为纤维素。典型地，该纤维糊精为纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖，或纤维六糖。可以通过本领域知晓的任何方法检测纤维糊精至细胞的转运，包括US2011/0020910中所述的方法。

足以用于宿主细胞降解纤维糊精的培养条件对本领域来说是周知的，并且包括在此描述的任何合适的培养条件。典型地，为了制备在培养基中含有的、宿主细胞所利用的纤维糊精或纤维糊精的来源，首先预处理木质纤维素生物质以改变其结构并使纤维素能更好地进行酶水解。预处理可以包括物理或化学方法，包括，例如，氨纤维/冻结爆破，基于氢氧化钙或氢氧化钠的石灰法，和具有或不具有酸催化的蒸汽爆破。接着，优选地，预处理的生物质的纤维素成分被纤维素酶混合物水解。市售的纤维素酶混合物的例子包括

(Novozymes),

(Genencor)(Scott W.Pryor,2010,Appl BiochemBiotechnol),和Cellulyve50L(Lyven)。

碳水化合物或碳水化合物衍生物的合成方法

本发明的另一方面提供从纤维糊精生产碳酸化合物或碳水化合物衍生物的方法。

在此使用的“碳水化合物”为完全由氢和碳组成的有机化合物。碳水化合物包括，但不限于：甲烷、乙烷、乙烯、乙炔、丙烷、丙烯、丙炔、环丙烷、丙二烯、丁烷、丁烯、异丁烯、丁炔、环丁烷、甲基环丙烷、丁二烯、戊烷、异戊烷、季戊烷、戊烯、戊炔、环戊烷、甲基环丁烷、乙基环丙烷、戊二烯、异戊二烯、己烷、己烯、己炔、环己烷、甲基环戊烷、乙基环丁烷、丙基环丙烷、己二烯、庚烷、庚烯、庚炔、环庚烷、甲基环己烷、庚二烯、辛烷、辛烯、辛炔、环辛烷、辛二烯、壬烷、壬烯、壬炔、环壬烷、壬二烯、癸烷、癸烯、癸炔、环癸烷，和癸二烯。

在此使用的“碳水化合物衍生物”为碳和至少一个其它元素不是氢的有机化合物。碳水化合物衍生物包括，但不限于，醇（例如，阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、丙三醇、甲醇、1,3-丙二醇、山梨醇，和木糖醇）、有机酸（如，乙酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡萄糖酸、甲酸、延胡索酸、葡糖二酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸，和木糖酸）、酯、酮（例如，丙酮）、醛（例如，糠醛）、氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸，和苏氨酸），和气体（例如，二氧化碳和一氧化碳）。

在优选的实施例中，碳水化合物或碳水化合物衍生物可以用作燃料。在特别优选的实施例中，该碳水化合物或碳水化合物衍生物为乙醇或丁醇。

在一些实施例中，该碳水化合物或碳水化合物为乙醇。在一些实施例中，乙醇以下面的范围中的速率生产：从至少0.10到至少50g/L-h、从至少0.1到至少40g/L-h、从至少0.1到至少30g/L-h、从至少0.1到至少20g/L-h、从至少0.1到至少10g/L-h、从至少0.1到至少5g/L-h、从至少0.1到至少1g/L-h、从至少0.5到至少40g/L-h、从至少0.5到至少20g/L-h、从至少0.5到至少10g/L-h、从至少0.5到至少5g/L-h、从至少0.5到至少1g/L-h、从至少1到至少40g/L-h、从至少1到至少20g/L-h、从至少1到至少10g/L-h、从至少1到至少5g/L-h、从至少5到至少40g/L-h、从至少5到至少20g/L-h、从至少5到至少10g/L-h、从至少10到至少50g/L-h、从至少10到至少40g/L-h、或从至少10到至少20g/L-h。

在其它实施例中，乙醇以如下速率生产：约0.10、约0.15、约0.20、约0.25、约0.30、约0.35、约0.40、约0.45、约0.50、约0.55、约0.60、约0.65、约0.70、约0.75、约0.80、约0.85、约0.90、约0.95、约1.00、约1.25、约1.50、约1.75、约2.00、约2.25、约2.50、约2.75、约3.00、约3.25、约3.50、约3.75、约4.00、约4.25、约4.50、约4.75、约5.00、约5.25、约5.50、约5.75、约6.00、约6.25、约6.50、约6.75、约7.00、约7.25、约7.50、约7.75，或约8.00、约8.25、约8.50、约8.75、约9.00、约9.25、约9.50、约9.75、约10、约10.5、约11、约11.5、约12、约12.5、约13、约13.5、约14、约14.5、约15、约15.5、约16、约16.5、约17、约17.5、约18、约18.5、约19、约19.5、约20、约20.5、约21、约21.5、约22、约22.5、约23、约23.5、约24、约24.5、约25、约25.5、约26、约27、约28、约29、约30、约35、约40、约45、约50，或更多g/L-h。应该注意，在此描述的乙醇的生产速率能以±0.02g/L-h变化。例如，约10g/L-h的速率可以从9.98g/L-h变化到10.02g/L-h。

根据本发明的一个方面，从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法包括提供宿主细胞的步骤，该宿主细胞含有本发明的重组纤维糊精转运蛋白、本发明的重组纤维糊精磷酸化酶，本发明的重组β-葡萄糖苷酶、本发明的重组葡萄糖磷酸变位酶，或本发明的重组己糖激酶中的两种或更多种；以及在含有纤维糊精后纤维糊精来源的培养基中培养所述宿主细胞，藉此该宿主细胞从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物。可以使用在此描述的、并且含有本发明的重组纤维糊精转运蛋白、本发明的重组纤维糊精磷酸化酶，本发明的重组β-葡萄糖苷酶、本发明的重组葡萄糖磷酸变位酶，或本发明的重组己糖激酶中的两种或更多种的任何宿主细胞。在一些实施例中，该宿主细胞可以进一步含有本发明的一种或更多种葡萄糖应答基因，本发明的一种或更多种戊糖转运蛋白，和/或参与戊糖利用的本发明的一种或更多种重组酶。

在一些实施例中，纤维糊精的来源为木质纤维素生物质，木质纤维素生物质含有纤维素，半纤维素，和木质素。在其它实施例中，纤维糊精的来源为半纤维素。在一些优选的实施例中，纤维糊精的来源为纤维素。典型地，该纤维糊精为纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖或纤维六糖

降低葡萄糖利用期间的ATP消耗的方法

本发明的其它方面是提供在宿主细胞中降低葡萄糖利用期间的ATP消耗的方法。在一个方面，本发明提供一种降低葡萄糖利用期间的ATP消耗的方法，通过提供宿主细胞，该宿主细胞含有本发明的重组纤维糊精转运蛋白、本发明的重组葡萄糖磷酸变位酶，或本发明的重组己糖激酶中的一种或更多种，并且含有重组多肽，该重组多肽含有

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性；以及在含有纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养该宿主细胞，藉此通过该重组多肽将纤维糊精降解为葡萄糖-1-磷酸，其中与缺乏该重组多肽的相应的细胞相比，从纤维糊精生产葡萄糖-1-磷酸降低了ATP的消耗。可以使用在此描述的并且含有本发明的重组纤维糊精转运蛋白本、公布的重组葡萄糖磷酸变位酶，或本发明的重组己糖激酶中的一种或更多种以及本发明的重组纤维糊精转运蛋白的宿主细胞。在一些实施例中，该宿主细胞可以进一步含有本发明的一种或更多种葡萄糖应答基因，本发明的一种或更多种戊糖转运蛋白，和/或参与戊糖利用的本发明的一种或更多种重组酶。

当纤维糊精磷酸化酶利用无机磷酸盐通过使纤维糊精磷酸解裂解为葡萄糖-1-P时，包含具有纤维糊精磷酸化酶活性的重组多肽的宿主细胞降低ATP的消耗，随后葡萄糖-1-P通过葡萄糖磷酸变位酶转化为葡萄糖-6-磷酸。相反，降解纤维糊精的水解途径，比如利用β-葡萄糖苷酶的那些水解途径，产生葡萄糖，接着需要通过利用ATP作为磷酸供体将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸。因此，在每次裂解反应中利用纤维糊精磷酸化酶能节约1ATP，这在ATP用于糖酵解之前降低了使纤维糊精来源的葡萄糖磷酸化必须消耗的ATP的量。可以通过本领域技术人员知晓的任何方法，并包括在此公布的任何合适的方法测量ATP的消耗。

应该理解的是，虽然本发明的描述与优选的特定实施例结合，但其旨在描述而不是限制本发明的范围。对本领域技术人员来说，在本发明的范围内的、本发明的其它方面、优势和修改是显而易见的。

提供以下例子描述所提供的实施例并且这些实施例并非旨在限制本发明的范围。

实施例

实施例1

引言

使工程微生物将植物细胞壁中发现的糖转化为燃料和其它化学制品获得了相当多的关注。植物细胞壁由纤维素（葡萄糖的聚合物）、半纤维素（戊糖、己糖和糖酸的异源聚合物），和木质素（异源酚醛聚合物）组成。植物细胞壁在农业和城市垃圾中是丰富的，并且是专用能源作物。酵母，酿酒酵母，是用于这些工程计划的青睐平台，因为其稳定，遗传操纵简单，并且能使高碳变迁。除此之外，酿酒酵母具有众多缺陷，包括不能使戊糖自然发酵，对溶剂敏感并且对分解的植物材料中发现的抑制性化合物敏感。

另一个缺陷是酿酒酵母不能使纤维糊精自然发酵，比如纤维二糖。纤维糊精为β(1→4)连接的葡萄糖的短聚物，是纤维素的重复单元，并且通过用纤维素酶对纤维素进行酶消化而产生。为了消耗纤维糊精，修饰酿酒酵母以分泌或在表面展示β葡萄糖苷酶，从而在胞外将纤维糊精水解为葡萄糖，或用纤维糊精转化蛋白引入纤维糊精，以通过β葡萄糖苷酶在胞内水解纤维糊精。

在两种水解途径中，通过水解酶和H2O裂解纤维糊精的O-糖苷键生产葡萄糖；而在磷酸解途径中，通过磷酸化酶和无机磷酸盐（Pi）裂解纤维糊精的O-糖苷键产生葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸。这种差异是显着的，因为的糖酵解途径的Embden-Meyerh的第一步骤消耗ATP以使葡萄糖磷酸化。因此，当ATP供应不足时，磷酸解途径可以是优选的，因为葡萄糖磷酸化消耗更少的ATP。

从木质纤维素底物生产燃料和化学制品优选低ATP要求的途径。木质纤维素通常用稀酸处理以水解半纤维素并且从木质素中释放纤维素。纤维素的酶水解导致低PH水解液，该水解液不但含有己糖和戊糖，还有高浓度的半纤维素来源的乙酸。在低PH，乙酸自由移动跨过酿酒酵母的细胞膜并且进入细胞质，在细胞质中乙酸去质子化成为乙酸盐。为了保持平衡，离解的质子和乙酸盐必须经由都消耗ATP的膜结合H⁺泵，Pma1，和弱酸性的外排泵，Pdr12，排出。

因此，下面的实施例比较两种纤维二糖发酵途径的表现，该两种纤维二糖发酵途径的差别仅在于进入的纤维二糖的裂解机制（图2）。第一途径采用胞内的水解酶，而第二途径采用在胞内产生磷酸解的酶（图2）。

材料和方法

克隆纤维二糖磷酸化酶和葡萄糖磷酸变位酶

优化来自纤维弧菌(CgCBP,登录号：AB010707)、Sacharophagus degradans(SdCBP,登录号：YP_526792)，和热纤梭菌(CtCBP,登录号：YP_001036707)的纤维二糖磷酸化酶（CBP）基因的密码子，并且通过DNA2.0合成。该基因插入2μ质粒pRS425中的限制性位点SpeI和PstI之间，质粒pRS425在之前已经修饰过从而包括酿酒酵母PGK1启动子和Cyc转绿终止子(PGK1_pRS426)。

The C.gilvus CBP gene was inserted into the PGK1_pRS426plasmid to create the plasmidPGK1_CgCBP_425.The C.gilvus CBP gene was inserted using the following primers:

5’-TTA CTA GTA TGG GAT CAT CTC ACC ACC-3’(SEQ ID NO:201);and5’-ATT CTG CAGTTA ATG ATG ATG ATG ATG ATG TAC TGT CAC TTCGAC TCT CAC AGT AG-3’(SEQ ID NO:202)

纤维弧菌CBP基因插入PGK1_pRS426质粒以产生质粒PGK1_CgCBP_425。使用以下引物插入纤维弧菌CBP基因：

5’-TTACTAGTA TGG GAT CAT CTC ACC ACC-3’(SEQ ID NO:201)；和5’-ATT CTG CAG TTA ATG ATG ATG ATG ATG ATG TAC TGT CAC TTC GAC TCTCAC AGT AG-3’(SEQ ID NO:202)

S.degradans CBP基因插入PGK1_pRS426质粒以产生质粒PGK1_SdCBP_425。用以下引物插入S.degradans CBP基因：

5’-TTA CTA GTA TGA AAT TCG GGC ACT TTG-3’(SEQ ID NO:203)；和5’-ATT CTG CAG TTA ATG ATG ATG ATG ATG ATG TCC AAG TGT TAC CTC GACATT G-3’(SEQ ID NO:204)

热纤梭菌CBP基因插入PGK1_pRS426质粒以产生质粒PGK1_CtCBP_425。用以下引物插入热纤梭菌CBP基因：

5’-TTA CTA GTA TGA AGT TTG GCT TTT TCG ATG-3’(SEQ ID NO:205)；和5’-ATT CTG CAG TTA ATG ATG ATG ATG ATG ATG TCC AAG TGT TAC CTC GACATT G-3’(SEQ ID NO:206)

对于在此公布的所有引物，加下划线的为限制性位点，斜体为6个组氨酸标签。

为了构建含有CBP基因和酿酒酵母葡萄糖磷酸变位酶基因的质粒，首先在质粒PGK1_pRS426中的SpeI和PstI限制性位点克隆Pgm2(登录号：CAA89741)以产生质粒PGK1_PGM_425。用以下引物插入Pgm2基因：

5’-TTACTAGTATGTCATTTCAAATTGAAACGGTTC-3’(SEQ ID NO:207)；和5’-ATTCTGCAGTTAAGTACGAACCGTTGGTTCTTC-3’(SEQ ID NO:208)

用以下引物从PGK1_PGM_425质粒中扩增PGK1启动子和Cyc转录终止子囊括的Pgm2基因：

5’-ATGAGCTCTGAATAATACGACTCACTATAGGGCGAATTG-3’(SEQ ID NO:209)；和

5’-ATGAGCTCTGAATGGAAACAGCTATGACCATGATTACG-3’(SEQ ID NO:210)

接着该片段插入PGK1_SdCBP_pRS425质粒、PGK1_CgCBP_425质粒和PGK1_CtCBP_425质粒的SacI限制性位点，产生质粒PGK1_SdCBP_PGM_425、PGK1_CgCBP_PGM_425，和PGK1_CtCBP_PGM_425。

酿酒酵母菌株的构建和生长

为了产生该研究所用的酵母菌株，用酵母EZ-转化试剂盒(EZ-Transformation kit，BIO101,Vista,Calif.)将质粒转化至酿酒酵母菌株D452-2(MATαleu2his3ura3can1)(Hosaka,1992)中，为了用氨基酸营养缺陷型标签选择转化体，使用酵母完全合成（YSC）培养基，酵母完全合成培养基（YSC）含有6.7g/L氮基加上20g/L葡萄糖，20g/L琼脂，和CSM-Leu-Trp-Ura-His(Bio101,Vista,CA)。该培养基提供合适的核苷酸和氨基酸。

发酵

来自YSC平板的单克隆在含有的20g/L纤维二糖的5ml YP培养基（10g/L酵母提取物和20g/L蛋白胨）中过夜生长。收集在中间指数期的细胞并用灭菌水洗涤两次后接种。所有的摇瓶发酵实验用含有80g/L纤维二糖的50mL YP培养基在以下条件下进行：在250mL摇瓶中，30℃，起始OD₆₀₀为～1.0并且限氧条件。用紫外-可见光分光光度计(Biomate5,Thermo,NY)通过600nm的光密度（OD）监测细胞的生长。通过高效液相色谱（HPLC,AgilentTechnologies1200系列）确定乙醇、乙酸盐、葡萄糖和丙三醇浓度，该高效液相色谱配备折光率检测器，使用Rezex ROA-Organic Acid H+(8%)柱子(Phenomenex Inc.,Torrance,CA)。该柱子用0.005N H₂SO₄以0.6ml/min的流速，50℃洗脱。

产生磷酸解的菌株的定向进化

如上所述，开始发酵反应，用cdt-1和S.degradans CBP转化酿酒酵母的D452-2菌株。当纤维二糖浓度几乎达到零时，收集细胞并且在OD(600nm)为～0.01时用于建立新反应。在30天期限重复该过程7次。此时，将细胞涂在含有20g/L纤维二糖的YSC平板上，以分离克隆。从分离的克隆中确定改进的表现型后，从一个有代表性的克隆分离出质粒并且测序。

定向突变和转运蛋白动力学

用

实验指南(Zheng等人，Nucleic Acids Res.2004年8月10日；

32(14):e115)进行定点突变。表9列举了用于引入每个突变的引物。如之前所述并且稍微做修饰，测量转运蛋白动力学(Galazka等人，Science.2010年10月1日；330(6000):84-6.Epub2010年9月9日)。简单地，在50mL DOB-尿嘧啶中，用突变型转运蛋白转化的酵母菌株D452-2设置成OD(600nm)为0.2并且生长至OD(600nm)为1。离心收集细胞，用10mL转运缓存液(30mM MES-NaOH[pH5.6],50mM EtOH)洗3次，并且在转运缓冲液中重新悬浮，使最终的OD(600nm)为40。用Beckman Coulter Paradigm^TM酶标仪的485/535nm激发/发射波长确定100μL这些细胞的GFP荧光。为了记录95秒的过程中获取的线性速率，将合适的浓度的50μL[³H]-纤维二糖加入50μL细胞中，并且将在转运缓冲液中最终为40μCi/μmol的S.A.铺在100μL硅油上(Sigma85419)。通过油在17,000g将细胞旋转1分钟使反应停止，在乙醇/干冰中冷冻试管，并且将含有细胞团块的试管底部物体夹到1mL0.5M NaOH中。过夜溶解该团块，加入5mL Ultima Gold闪烁液，并且在Tri-Carb2900TR闪烁计数器中确定CPM。[³H]-纤维二糖购自Moravek Biochemicals,Inc.，并且比活性为4Ci/mmol，纯度>99%。在

通过非线性回归将单个矩形，2参数双曲线函数拟合成速率对纤维二糖浓度的图，确定V_max和K_M值。

图9

在发酵期间测量GFP荧光

在发酵期间，当OD(600nm)达到10.0，收集细胞并用灭菌水洗两次。将200μL细胞悬浮液转移到Corning black96孔光透明底微孔板(Corning black96-well optical bottomplate，Corning,NY)中。用Biotek Synergy HT分光光度计(Biotek,Winooski,VT)以485nm激发波长，528nm发射波长测量荧光。

细胞提取物的酶活性的测量

如之前所述在YPC80或YPD80培养基(10g/L酵母提取物,20g/L蛋白胨,80g/L葡萄糖)中建立发酵反应。与反应指数期相对应，当OD(600nm)为～10时，转移2mL培养物并且使细胞成团块，该细胞团块在500μL冰浴的提取缓冲液（50mM HEPES-NaOH[pH6.0]，2mM DTT和Roche完全无EDTA蛋白酶抑制剂混合物（Roche Complete EDTA-freeProtease Inhibitor Cocktail））中洗涤两次，并悬浮在200μL该缓冲液中，将悬浮液移到含有100μL0.4mm氧化锆/二氧化硅微珠的螺旋管。接着，利用Biospec产品Mini-BEADBEATER以每次运作之间中止30s，在4℃，30s内通过微珠敲打3次，裂解细胞，随后使碎片成团块。并且通过Bradford分析用Bio-Rad的试剂和微量滴定板实验指南确定上清液中蛋白质的浓度。

通过葡萄糖氧化酶/过氧化物酶分析确定细胞提取物中纤维二糖酶的活性含量。在10μg细胞提取液中加入由50mM磷酸盐缓冲液[pH6.0]、10U葡萄糖氧化酶、10U过氧化物酶、1mM邻联茴香胺（o-dianisidine），和10mM纤维二糖组成的1mL分析混合物。以1.17x10³乘以436nm的增长率计算每秒生产的葡萄糖的皮摩尔量，转换是从葡萄糖标准曲线建立的。

将葡萄糖-6-磷酸的生产与通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶还原NADP⁺结合确定细胞提取物中己糖激酶的活性量。在10μg细胞提取液中加入由50mM Tris-HCl[在30℃时pH为8.0]、13.3mM MgCl₂、540μM ATP、20μM NADP⁺、1U酿酒酵母葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，和112mM葡萄糖组成的分析混合物。以1.85x10³乘以340nm的增长率计算每秒生产的葡萄糖-6-磷酸的皮摩尔量，转换是从葡萄糖-6-磷酸标准曲线建立的。

GH1-1、SdCBP、Hxk1、Hxk2，和Glk1的纯化

直接从上述D452-2酵母菌株中纯化GH1-1和SdCBP。200mL培养物在DOB–尿嘧啶-亮氨酸中生长至OD(600nm)为7。使细胞成团块并用40mL双蒸水（ddH₂O）洗涤1次。细胞团块重新悬浮于25mL50mM NaH₂PO₄[pH8.0]、300mM NaCl、10mM咪唑、2mMDTT，和Roche完全无EDTA蛋白酶抑制剂混合物（Roche Complete EDTA-free ProteaseInhibitor Cocktail）中，并且通过经由Avestin EmulsiFlex C-3均质器（Avestin EmulsiFlex C-3homogenizer）的通道以20,000P.S.I裂解。接着使细胞碎片成团块，并且用来自Qiagen的Nickel-NTA琼脂糖微珠根据Qiagen提供的本土批量纯化的实验指南（the protocol for nativebatch purification）纯化蛋白质。从微珠中洗脱的蛋白质用缓冲液交换至由磷酸盐缓冲盐水（PBS）、10%丙三醇，和2mM DTT组成的缓冲液中，在(l)N2中速冻并存储于-80℃。对于GH1-1和SdCBP分别利用消光系数108750M^-1cm^-1和178540M^-1cm^-1，通过280nm的吸光度确定蛋白质浓度。

在大肠杆菌中表达并纯化Hxk1(登录号：NP_116711)、Hxk2(登录号：NP_011261)，和Glk1(登录号：NP_009890)基因。首先，将该基因克隆到表达质粒pET302的PmlI和XhoI的限制性位点。用下面的引物扩增Hxk1基因：

5’-CAT TAA CAC GTG GTT CAT TTA GGT CCA AAG AAA CCA C-3’(SEQ ID NO:225)；和

5’-CAT TAA CTC GAG CAA TGA TAC CAA GAG ACT TAC CTT CG-3’(SEQ ID NO:226)

用下面的引物扩增Hxk2基因：

5’-CAT TAA CAC GTG GTT CAT TTA GGT CCA AAA AAA CCA C-3’(SEQ ID NO:227)；和

5’-CAT TAA CTC GAG TTA AGC ACC GAT GAT ACC AAC G-3’(SEQ ID NO:228)用下面的引物扩增Glk1基因：

5’-CAT TAA CAC GTG TCA TTC GAC GAC TTA CAC AAA GC-3’(SEQ ID NO:229)；以和

5’-CAT TAA CTC GAG TCA TGC TAC AAG CGC ACA C-3’(SEQ ID NO:230)。

将这些构建体转化到大肠杆菌的BL21(DE3)菌株，表达该蛋白质，并用来自Qiagen的Nickel-NTA琼脂糖微珠根据Qiage提供的本土批量纯化实验指南（the protocol for nativebatch purification）纯化。从微珠中洗脱的蛋白质通过缓冲液交换至由50mM Tris-HCl[pH8.0at30℃]、13.3mM MgCl₂、2mM DTT，和10%丙三醇组成的缓冲液中，在(l)N₂中速冻并存储于-80℃。对于Hxk1、Hxk2和Glk1分别利用消光系数45840M^-1cm^-1、45840M^-1cm^-1和30370M^-1cm^-1，通过280nm的吸光度确定蛋白质浓度。

GH1-1和SdCBP的转糖苷活性

为了测量GH1-1和SdCBP的转糖苷活性，将100nkat每种酶在100μL20%(w/v)纤维二糖与50mM磷酸盐缓冲剂[pH6.0]和2mM DTT中，37℃中培养。12小时后，在400μL0.1M NaOH中终止该反应，并通过带有Dionex ICS-3000的离子色谱，利用CarboPac PA200柱来分析。用电化学检测器检测峰。

GH1-1和SdCBP的动力学参数

以与上述在细胞提取物中所用的相同的方式，利用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂分析，通过测量各种纤维二糖浓度下葡萄糖的生产速率，确定纯化的GH1-1和SdCBP的动力学参数。A1mL分析包括8.75皮摩尔GH1-1或20皮摩尔SdCBP。在

通过非线性回归将单个矩形，2参数双曲线函数拟合成葡萄糖生产速率对纤维二糖浓度的图，确定V_max和K_M值。

酿酒酵母己糖激酶在纤维二糖上的作用

为了测量纯化的Hxklp、Hxk2p，和Glk1p在高浓度纤维二糖上的作用，在缺乏或存在184mM纤维二糖的情况下，以与上文所述的在细胞提取物中所用的相同的方式，通过将葡萄糖-6-磷酸的生产与通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶还原NADP⁺结合，确定纯化的蛋白质的活性。使用的的Hxk1、Hxk2，或Glk1在1和10皮摩尔（pmol）之间。

结果

表达纤维二糖磷酸化酶和纤维糊精转运蛋白的酵母菌株

对来自Saccharophagus degradans(SdCBP)、纤维弧菌(CgCBP)，和热纤梭菌(CtCBP)的纤维二糖磷酸化酶（CBP）基因进行了密码子优化，合成并且克隆到2μ质粒中。将这些质粒与携带用GFP标记的纤维糊精转运蛋白基因cdt-1的质粒一起转化到酿酒酵母菌株D452-2中。

得到的所有三种菌株消耗纤维二糖并生产乙醇（图3）。这三种工程菌株中的每种的纤维二糖的消耗速率是相似的，范围为从0.95至约1.02g/L-h。这三种菌株的乙醇生产速率也是相似的，范围为约0.42至约0.44g/L-h。77小时后，几乎所有的纤维二糖通过三种菌株中的每种发酵成乙醇，并且产量范围为约0.43至约0.45g/g。此外，没有明显积累乙酸盐，葡萄糖，或丙三醇。

以前研发的转运纤维二糖的酵母菌株依赖于胞内β-葡萄糖苷酶的水解作用，并且纤维二糖的发酵伴随胞外培养基中葡萄糖和纤维糊精（例如，纤维三糖和纤维四糖）的积累。但是，在表达纤维二糖磷酸化酶而不是β-葡萄糖苷酶的三种酵母菌株中没有发现该现象。

葡萄糖磷酸变位酶的异位表达

纤维二糖磷酸化酶通过磷酸解将纤维二糖裂解为葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸，而葡萄糖-1-磷酸需要通过葡萄糖磷酸变位酶（PGM）转换成葡萄糖-6-磷酸以进入糖酵解途径。在糖酵解发展期间通过转录使PGM下调，检测酿酒酵母的PGM随着CDT-1和CBP一起异位表达的酵母菌株组，以确定PGM的异位表达是否增加乙醇的产量。但是，与不异位表达PGM的相应的酵母菌株相比，这些菌株的性能显示出轻微的下降（图4）。

改进的磷酸解酵母菌株

为了改进表达纤维糊精转运蛋白和纤维二糖磷酸化酶的工程酵母菌株的发酵结果，在30天中连续转移到含有80g/L的纤维二糖的YP培养基中富集表达CDT-1和SdCBP的菌株。改进的菌株中消耗的纤维二糖和产生的乙醇比亲本菌株快2倍。进化的菌株的乙醇生产率为1.00g/L-h，而亲本菌株展示了0.40g/L-h的乙醇生产率。

为了鉴定对改进的酵母菌株负责的突变，将两种2μ质粒（prs425sdcbp和prs426-cdt-1）从进化的菌株中分离并测序。测序鉴定在cdt-1开放阅读框中的单核苷酸突变（C639A），与翻译的多肽在位置213(F213L)苯丙氨酸变为亮氨酸相对应。该单点基因突变对改进的性能负责，如将分离的质粒重新转化至天然D452-2酵母菌株中服从的结果（图5）。表达突变型CDT-1(F213L)和SdCBP的菌株以2.06±0.04g/L-h的速率消耗纤维二糖并且以0.90±0.01g/L-h的速率产生乙醇（图5B）。在纤维二糖生产率上提高了102%并且在乙醇生产率上提高了105%。乙醇产量没有受到影响，并且没有明显积累乙酸盐、葡萄糖、丙三醇，或纤维糊精。

突变型CDT-1(F213L)表达与β-葡萄糖苷酶表达结合

表达CDT-1和胞内β-葡萄糖苷酶的菌株在之前显示了将纤维二糖发酵成乙醇。为了评估突变型CDT-1(F213L)是否也会改变这种菌株的性能，在D452-2中表达突变型CDT-1(F213L)以及胞内β-葡萄糖苷酶GH1-1。与表达WT CDT-1和GH1-1的菌株相比，仅仅在纤维二糖发酵上观察到细微的改进（图5C和5D）。

如之前报道（Ha et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2011Feb15;108(7):2735-40.Epub2011Jan31），表达CDT-1和GH1-1的菌株的纤维二糖发酵伴随葡萄糖和纤维糊精的累积进行，而到相同的模式在表达GH1-1和CDT-1F213L的菌株中也可以观察到。

纤维糊精转运蛋白突变型

为了确定其它CDT-1突变型是否在纤维二糖发酵上有相似的影响，检测7种之前鉴定的丙氨酸突变型。之前观察到与β-葡萄糖苷酶GH1-1结合的每种这些转运蛋白突变型的表达使酿酒酵母能在纤维二糖上以不同的速率生长。与野生型CDT-1的表达相比，转运蛋白突变型G91A和F335A的表达导致更快的生长速率，转运蛋白突变型Q104A和F170A的表达导致中等的生长速率，转运蛋白突变型E194A和R174A的表达导致缓慢的生长速率（图6A）。

表达与GH1-1结合的、七种转运蛋白中的各种的酵母菌株的发酵速率遵循了如下相同的趋势：G91A>F335A>F213L>WT>F170A>Q104A>R174A>E194A(图6A，7和表10)。但是，在表达与纤维二糖磷酸化酶SdCBP结合的、七种转运蛋白中的各种的酵母菌株中观察到不同的趋势。在该情况下，趋势为F213L>G91A>WT>Q104A>F170A>F335A>R174A>E194A(图6B)。最显著的区别是，在表达GH1-1和SdCBP的菌株之间最佳的转运蛋白是不同的。

表10

表10量化带有不同cdt-1突变型的工程酵母菌株的纤维二糖消耗量和乙醇生产量。以WT cdt-1或一种cdt-1突变型，和来自S.degradans的密码子优化的纤维二糖磷酸化酶基因或β-葡萄糖苷酶基因gh1-1转化酿酒酵母的D452-2菌株。表10展示了该菌株消耗纤维二糖和产生乙醇的速率。所有的值都为两个独立的发酵结果的平均值，而误差条代表两个发酵之间的结果的标准偏差。

为了直接评估转运蛋白功能，通过在不同浓度的[3H]纤维二糖，测量细胞摄取[3H]纤维二糖的速率，对4种转运蛋白(WT、G91A、F335A，和F213L)进行Michaelis-Menten分析，提供最好发酵速率（图8）。表11量化了该结果。与WT(K_M=7.6±1.5μM,V_max=0.60±0.03pmol/s)相比，所有的突变型对纤维二糖具有较低的亲和力。但是，该三种突变型具有更高的V_max。因此，具有更快的发酵速率的转运蛋白也以更高的最大速率转运纤维二糖。

表11

在上述转运蛋白动力学测量中，菌株在葡萄糖上生长，导致每种转运蛋白以相似的水平(WT的水平±～20%)表达，如通过每个细胞的GFP荧光的量所判断。但是，在纤维二糖发酵期间，不是这种情况。取决于酵母细胞表达的转运蛋白突变型，每个细胞的GFP荧光量有很大的差异（图9）。此外，这些差异与纤维二糖消耗和乙醇生产速率密切相关。

胞内纤维二糖代谢分析

尽管使用相同的转运蛋白基因，当通过水解对比通过磷酸解裂解纤维二糖时，菌株性能的明显差异表明转运的纤维二糖的命运取决于其胞内加工机制和动力学。因此，通过在整个细胞提取物中测量选择的酶活性，分析工程酵母菌株的胞内代谢。通过表达CDT-1和GH1-1或SdCBP的菌株在纤维二糖发酵的指数期从细胞中制备该提取物。该菌株根据GFP荧光量，以相同的水平表达CDT-1（图10A）。对于另外的比较，在葡萄糖发酵的指数期，从WT D452-2酵母中制备提取物。

为了确定两种菌株裂解胞内纤维二糖的能力是否明显不同，测量10μg提取物中纤维二糖酶的活性量（通过Bradford分析确定）。纤维二糖酶活性定义为无论什么机制下从纤维二糖产生葡萄糖的速率并且在表达GH1-1或SdCBP的菌株中是相似的（图10B）。如预期，WT D452-2的提取物中没有可检测的纤维二糖酶活性（图10B）。值得注意的是，该分析低估了纤维二糖磷酸化酶的50%活性，因为该酶生产的葡萄糖-1-磷酸不计算在内。

此外，在10μg这些提取物中的己糖激酶的活性量在具有GH1-1和SdCBP的菌株之间是难以区分的(图10C)。此外，比起WT D452-2菌株，该两种菌株具有稍微更大的己糖激酶活性（图10C）。

如上所述，在用表达CDT-1突变型和GH1-1的菌株进行纤维二糖发酵期间，葡萄糖和纤维糊精在培养基中积累。然而，这在表达CDT-1突变型和SdCBP的菌株发酵期间，没有观察到该现象。葡萄糖和纤维糊精的积累被认为是由于其跟随纤维二糖水解或转糖苷作用流出。β-葡萄糖苷酶的转糖苷作用是记录翔实的活性，其中高浓度的葡萄糖和纤维二糖脱水成纤维三糖和纤维四糖。

为了分析GH1-1和SdCBP的转糖苷活性，通过IMAC从细胞提取物中富集两种酶。富集的酶用20%(w/v)纤维二糖培养24小时，并且通过HPLC分析反应产物。在这些条件下，GH1-1具有明显的转糖苷活性并且从2mg纤维二糖中产生大约0.45mg的纤维三糖和大约0.1mg的纤维四糖，但SdCBP没有（图11）。也测量富集的蛋白质的动力学参数，并且图12中描述了该结果，而表12量化了该结果。

表12

己糖激酶活性

在酿酒酵母的胞液中不能天然地发现纤维二糖，并且纤维二糖的存在可能有许多无法预料的后果。一个潜在的后果可以涉及己糖激酶。己糖激酶紧密结合至葡萄糖，并且因此可能与改造成表达纤维糊精转运蛋白和纤维二糖磷酸化酶的酵母菌株中发现的高浓度的纤维二糖相互作用，或被该高浓度的纤维二糖抑制。

为了检测纤维二糖是否抑制酵母己糖激酶，从E.coli中表达该己糖激酶并且纯化，在存在或缺乏多达184mM纤维二糖的情况下，分析纯化的酶的活性。在这些极端浓度的纤维二糖中，己糖激酶Hxk1的活性不受影响（图13）。但是，己糖激酶Hxk2和Glk1的活性降低了～20%（图13）。

为了确定己糖激酶的活性是否受限于在改造的途径，在表达突变型纤维糊精转运蛋白CDT-1(F213L)和S.degradans纤维二糖磷酸化酶SdCBP的菌株中使所有三种酵母己糖激酶(HKX1、HXK2，和GLK1)过表达。HXK2或GLK1的过表达没有改变菌株的性能，HXK1的过表达导致乙醇生产率提高28%(图14C和表13)。表13总结了这些菌株的细胞密度，乙醇产量和产率，以及乙醇生产率。

表13

	OD(600nm)	乙醇(g/L)	产率(g/g)	生产率(g/L-h)
					pRS423	19	28	0.46	0.75
PRS423-HXK1	20	36	0.46	0.96
					PRS423-HXK2	19	30	0.46	0.79
PRS423-GLK1	19	31	0.46	0.81

此外，表达HXK1的菌株的乙醇生产率随着初始细胞密度的增加而线性提高，在23.1初始密度（OD）达到2.69g乙醇/L-h（图15和16）。

讨论

在此公开了在酿酒酵母中改造的两种纤维二糖发酵途径的分析，旨在提高来自木质纤维素原料的燃料和化学制品的产量。第一途径利用纤维糊精转运蛋白和胞内β葡萄糖苷酶，如之前所报道，而第二途径利用相同的纤维糊精转运蛋白和胞内的纤维二糖磷酸化酶。水解途径通常出现在分解纤维素的真菌中，在分解纤维素的真菌中，其生物角色被认为包括纤维素感应和代谢，并且实现与植物的共生关系。磷酸解途径在分解纤维素和厌氧并举的原核生物中存在，当不能呼吸时，该原核生物从纤维糊精消耗中获得最大的能量。这是因为磷酸解裂解产生葡萄糖-1-P，从而在降低了在进入糖酵解前使纤维糊精来源的葡萄糖磷酸化必须消耗的ATP的量。

用与三种不同的厌氧细菌具有不超过71%的氨基酸一致性的纤维二糖磷酸化酶成功构建功能性纤维二糖发酵途径，表明除了酶核心功能之外，其它的特性不是必须的。但是，上述结果表明，酿酒酵母中这些用于表达的基因的密码子优化是很重要的，并且结果随着使用的优化算法的变化而变化。

比起具有CDT-1和胞内β葡萄糖苷酶的菌株，没有优化的、具有纤维糊精转运蛋白，CDT-1和胞内纤维二糖磷酸化酶（CBP）的菌株将纤维二糖发酵成乙醇更慢。虽然这也许表明CBP的活性为限制性的，但其它结果对此作了反驳。磷酸解菌株在纤维二糖培养基中连续传代之后，新菌株表现出发酵纤维二糖如具有水解途径的菌株近似一样快，并且该改进中所需的点突变不影响CBP基因或其表达，如果CBP活性为限制性的，那么预期会影响CBP基因或其表达。相反，纤维糊精转运蛋白，CDT-1突变成低亲和力/高容量形式。此外，其它低亲和力/高容量形式的CDT-1提高磷酸解途径的发酵速率。这些观察一起表明，转运速率确实限制磷酸解菌株。

然而，理想的转运蛋白不会是仅具有最高容量的转运蛋白，而是取决于代谢环境具有最佳的转运动力学的转运蛋白。这在具有各种CDT-1突变型和胞内β-葡萄糖苷酶或纤维二糖磷酸化酶的菌株的比较中可以清楚地看出。分析表明，在水解或磷酸解途径的环境中，相同的转运蛋白没有产生相同的结果。例如，CDT-1突变型G91A对水解途径来说是最优的，而突变型F213L对磷酸解途径来说是最优的。

最终，任何代谢途径的性能可以取决于途径中酶的最大容量和其与小分子底物，产物和效应子的相互作用所需的酶体内活性。在该研究中，在纤维二糖发酵期间，在水解和磷酸解菌株之间对这些因素进行了有限的比较。导致纤维二糖变成葡萄糖-6-磷酸（糖酵解的切入点）的菌株在酶容量上没有显著差异。明显例外的是，在水解途径使纤维二糖转糖苷化，成为更长的纤维糊精例如纤维三糖和纤维四糖的能力：GH1-1具有该活性，并且具有水解途径的菌株在将纤维二糖发酵成乙醇时，造成更长的纤维糊精的明显积聚。

纤维素降解途径的最大优势可能是随着更高的细胞负载的使用，其性能继续提高。在燃料生产期间，通常采用高重力发酵以使原料快速发酵，从而使资本密集型发酵罐空间得到最佳利用，这是特别重要的。

实施例2

本实施例描述纤维糊精磷酸化酶的保守基序的鉴定和另外的纤维糊精磷酸化酶的鉴定。

以热纤梭菌(BAA22081.1)、Acidovibrio cellulolyticus(ZP_07328763.1)和Clostridiumlentocellum(YP_004310865.1)纤维糊精磷酸化酶氨基酸序列作为同步输入运行PSI-BLAST第一回合。从第一回合的结果中，使用所有注解为“纤维糊精磷酸化酶”的查询结果作为PSI-BLAST第二回合的同步输入。

从第二回合的结果中，利用所有注解为“纤维糊精磷酸化酶”的序列，从而通过T-COFFEE产生多序列比对。

使用多序列比对作为PRATT server(http://web.expasy.org/pratt/)的输入以鉴定最高得分的基序。该基序以PROSITE格式显示：

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:14)。

接着，通过利用PROSITE server(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)以该保守基序寻找纤维二糖磷酸化酶蛋白质。PROSITE server鉴定16种另外的纤维糊精磷酸化酶。上述表4列举了所述16种磷酸化酶。

实施例3

本实施例描述纤维二糖磷酸化酶中保守基序的鉴定和另外的纤维二糖磷酸化酶的鉴定

纤维二糖磷酸化酶中的保守基序

以Saccharophagus degradans(YP_526792.1)、纤维弧菌(2CQS_A)和热纤梭菌(YP_001036707.1)纤维糊精磷酸化酶氨基酸序列作为同步输入运行PSI-BLAST第一回合。从第一回合的结果中，使用所有注解为“纤维糊精磷酸化酶”或“纤维素降解产物磷酸化酶”的查询结果为PSI-BLAST第二回合的同步输入。

从第二回合的结果中，利用所有得分高于Saccharophagus degradans(YP_526792.1)、纤维弧菌(2CQS_A)和热纤梭菌(YP_001036707.1)纤维二糖磷酸化酶序列通过具有PDB文件，2CQS作为结构模板的EXPRESSO产生多序列比对。

使用该多序列比对作为PRATT服务器(http://web.expasy.org/pratt/)的输入以鉴定最高得分的基序。该基序以PROSITE格式显示：

Y-Q-[CN]-M-[IV]-T-F-[CN]-[FILMV]-[AS]-R¹-[ST]-[AS]-S-[FY]-[FY]-E-[STV]-G-x-[GS]-R²-G-[IM]-G-F-R-D-S-[ACNS]-Q-D-[ILV]-[ILMV]-G-x-V-H-x-[IV]-P-[ADEST]-x-[AV]-[KR]-[AEQ]-x-[IL]-[FIL]-D(SEQ ID NO:15)。在该基序内，R¹表示在纤维弧菌纤维二糖磷酸化酶中参与无机磷酸盐结合(R351)的精氨酸。R²表示在纤维弧菌纤维二糖磷酸化酶中参与形成纤维二糖结合口袋的精氨酸（R362）。

在纤维弧菌纤维二糖磷酸化酶PDB2CQS的晶体结构中鉴定出保守基序（图17）。

接着，使用该保守基序通过PROSITE服务器(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)寻找纤维二糖磷酸化酶蛋白质。PROSITE服务器鉴定出91种另外的纤维二糖磷酸化酶。上述表5列举了所述91种磷酸化酶。

纤维二糖磷酸化酶和纤维糊精磷酸化酶两者中发现的保守基序

在如何绑定无机磷酸盐上，纤维糊精磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶出现了分歧。例如，在纤维弧菌纤维二糖磷酸化酶中鉴定的两个保守的精氨酸在纤维糊精磷酸化酶中不是保守的。虽然不知晓纤维糊精磷酸化酶的晶体结构，但可以将类似于上文所述的方法用于纤维弧菌纤维二糖磷酸化酶的晶体结构以鉴定纤维二糖磷酸化酶和纤维糊精磷酸化酶两者之间都保守的PROSITE基序。该基序与PROSITE格式显示：

Y-x(2)-G-x-[KR]-E-N-[AG]-[AG]-[IV]-F-x(2)-[ANST]-[NST]-x(2)-[AIV]-x(2)-[AGT]-x(4)-[AG]-x(4)-[ADNS](SEQ ID NO:233)。

基于用PDB3QG0对纤维弧菌纤维二糖磷酸化酶晶体结构的分析，该保守基序看来使纤维二糖和纤维糊精磷酸化酶的底物结合位点一致。

实施例4

本实施例描述了通过表达纤维糊精转运蛋白和纤维糊精磷酸化酶的工程酿酒酵母增强纤维糊精的利用。

引言

编码纤维糊精磷酸化酶（CDP）的三个基因(CDP-Acell、CDP-Clent和CDP-Ctherm)导入到表达野生型纤维糊精转运蛋白CDT-1或突变型纤维糊精转运蛋白CDT-1(F213L)的酿酒酵母中。为了检测工程酿酒酵母菌株利用纤维二糖、纤维三糖或纤维四糖的能力，在含有纤维二糖、纤维三糖或纤维四糖的YP培养基中进行小规模的发酵试验。

材料和方法

菌株

表14描述了所用的酿酒酵母菌株。

表14

在表4中，“名称”指的是菌株名称；“CBP.CDP”指的是菌株表达的纤维二糖磷酸化酶或纤维糊精磷酸化酶基因；而“纤维糊精转运蛋白”指的是菌株表达的纤维糊精转运蛋白基因。

发酵条件

发酵试验在含有5g/L纤维二糖、纤维三糖或纤维四糖的YP培养基中进行。用96孔板监测以在纤维糊精作为唯一碳源上的生长。每个孔中的培养物容量为200μL，并且在培养物上面覆盖50μL矿物油以防止在生长测量期间培养基蒸发。起始细胞密度调节为OD600=～0.2。用Synergy H4酶标仪(Synergy H4hybrid Microplate Reader,BioTekInstruments Inc.,Winooski,VT)选择连续混合测量600nm的吸光度。

结果

通过表达野生型CDT-1基因和各种纤维糊精磷酸化酶（CDP）基因的酿酒酵母菌株利用纤维二糖或纤维糊精

来自Clostridium lentocellum,热纤梭菌,Acidovibrio cellulolyticus的三种纤维糊精磷酸化酶(CDP_Clent、CDP_Ctherm，和CDP_Acell)中的每种分别和来自粗糙脉胞菌的纤维糊精转运蛋白(cdt-1)导入酿酒酵母D452-2。得到的转化体在纤维二糖、纤维三糖，和纤维四糖上进行生长试验（图18）。使用表达纤维二糖磷酸化酶(SdCBP)和纤维糊精转运蛋白(CDT-1)的工程菌株作为生长比较的对照菌株。在纤维二糖培养基中，仅含有纤维二糖磷酸化酶(SdCBP)和纤维糊精转运蛋白(CDT-1)的D452-SdCBP-CDT-1菌株能生长得好。而具有纤维糊精磷酸化酶和纤维糊精转运蛋白的工程酿酒酵母菌株不能在纤维二糖上生长，表达来自于C.lentocellum的纤维糊精磷酸化酶(CDP_Clent)和纤维糊精转运蛋白(CDT-1)的D452-CDP_Clent-CDT-1菌株能在纤维二糖上非常缓慢地生长（图18A）。该结果表明CDP_Clent能将纤维二糖用作底物。当纤维三糖用作碳源时，没有一种工程菌株展示了可测量的生长，仅D452-CDP_Clent-CDT-1菌株非常缓慢地生长（图18B）。当纤维四糖用作唯一碳源时，D452-SdCBP-CDT-1和D452-CDP_Clent-CDT-1菌株展示了可测量的生长(图18C)。

这些结果表明当在酿酒酵母中共表达纤维糊精转运蛋白(CDT-1)时，来自C.lentocellum的纤维糊精磷酸化酶CDP_Clent能促进纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖的利用。

通过表达突变型CDT-1F213L基因和各种CDP基因的酿酒酵母菌株提高纤维二糖或纤维糊精的利用

纤维糊精转运蛋白(CDT-1)的容量可以限制表达各种纤维糊精磷酸化酶的工程酿酒酵母利用纤维糊精。因此，构建新工程菌株组，该新工程菌株组表达三种纤维糊精磷酸化酶(CDP_Acell、CDP_Clent，和CDP_Ctherm)中的各种和突变型纤维糊精转运蛋白(CDT-1F213L)。为了比较这些菌株对纤维糊精的利用率，监测纤维在纤维二糖、纤维三糖，和纤维四糖上的生长。使用表达纤维二糖磷酸化酶(SdCBP)和纤维糊精转运蛋白(CDT-1F213L)的工程菌株作为生长比较的对照菌株。当纤维二糖用作碳源时，含有纤维二糖磷酸化酶(SdCBP)和突变型纤维糊精转运蛋白(CDT-1F213L)的D452-SdCBP-CDT-1_F213L菌株快速生长，如之前所观察（图19A）。表达来自Clostridium lentocellum的纤维糊精磷酸化酶(CDP_Clent)和突变型纤维糊精转运蛋白(CDT-1F213L)的D452-CDP_Clent-CDT-1_F213L菌株也能在纤维二糖上生长得好（图19A）。当纤维三糖用作碳源时，D452-SdCBP-CDT-1_F213L和CDP_Clent-CDT-1_F213L菌株都能生长(Fig.19B)。但是，与在纤维二糖的条件相比，CDP_Clent-CDT-1_F213L菌株比D452-SdCBP-CDT-1_F213L生长好得多。此外，CDP_Clent-CDT-1_F213L菌株甚至在纤维四糖上生长非常好，而D452-SdCBP-CDT-1_F213L在纤维四糖上没有展示可测量的生长（图19C）。这些结果表明，来自Clostridium lentocellum的纤维糊精磷酸化酶(CDP_Clent)能利用三种检验的纤维糊精（纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖）。

含有来自热纤梭菌纤维糊精磷酸化酶(CDP_Ctherm)和突变型转运蛋白(CDT-1F213L)的D452-CDP_Ctherm-CDT-1_F213L菌株在纤维三糖和纤维四糖上展示了可测量的生长（图19B和19C）。但是，表达来自Acidovibrio cellulolyticus的纤维糊精磷酸化酶(CDP_Acell)和突变型纤维糊精转运蛋白(CDT-1F213L)的D452-CDP_Acell-CDT-1_F213L菌株在纤维二糖，纤维三糖，或纤维四糖上没有展示任何可测量的生长。

当突变型纤维糊精转运蛋白(CDT-1F213L)与纤维二糖磷酸化酶或纤维糊精磷酸化酶成双时，观察到工程酿酒酵母提高对纤维糊精的利用，表明CDT-1F213L转运蛋白能促进纤维糊精，以及纤维二糖以更高的聚合度(DP)有效转运。

实施例5

本实施例描述了纤维二糖介导的酿酒酵母菌株的生长速率，所述酿酒酵母菌株被纤维糊精转运蛋白CDT-1和各种Sacharophagus degradans纤维二糖磷酸化酶突变型(SdCBP)转化。

材料和方法

编码含有点突变的Sacharophagus degradans纤维二糖磷酸化酶(SdCBP)的质粒转化到表达CDT-1纤维糊精转运蛋白的酿酒酵母D452-2菌株中。对于每种CBP突变型，挑选单克隆接种到含有2%纤维二糖作为碳源的YP培养基中的5mL起子培养物（starter culture）中。

发酵培养物的起始OD设置为～0.5，并且在50mL Falcon试管中，用含有8%纤维二糖作为碳源的5mL YP培养基进行发酵试验。连续摇晃，使培养物在30℃生长。同样，在含有野生型SdCBP或野生型β-葡萄糖苷酶GH1-1的酿酒酵母D452-2菌株上进行发酵试验。

每12小时测量每种培养物的OD600，并且表15展示了生长速率(每小时生长物的增加量)，每个点代表三次测量值的平均值。

结果

表15描述的结果表明含有某些CBP突变型的菌株的生长速率与含有野生型CBP的菌株的生长速率相当，或比含有野生型CBP的菌株的生长速率更大。特别地，1409M CBP突变型展示了1.06l hr^-1的生长速率，这与野生型CBP的生长速率f1.135hr^-1)是相当的，而CBP突变型N482D的生长速率为1.236hr^-1。

表15

SdCBP突变型	生长速率(hr^-1)	SdCBP突变型	生长速率(hr^-1)
				野生型CBP	1.135	野生型BGL	1.3
C484S	0.696	1409R	0.637
				E646A	0.027	D361A	0
E693A	0.184	H653A	0.879
				N647Q	0	1409M	1.06l
F651W	0.511	C484A	0.408
				D483A	0	R360A	0.264
D483N	0	N482T	0.376
				H653N	0.759	N482D	1.236
K645R	0	W48lA	0
				Q165A	0	Y640W	0.184
1409Q	0.872

实施例6

本实施例描述了在转运纤维糊精的细胞中修饰葡萄糖应答途径以使代谢最优化。

在该实施例中，修饰表达纤维糊精转运蛋白和胞内β-葡萄糖苷酶的酵母的葡萄糖应答途径以优化细胞的葡萄糖代谢。对改造成cdt-l或cdt-2与胞内β-葡萄糖苷酶(ghl-1)一起表达的酵母菌株进一步进行遗传修饰，从而表达各种葡萄糖应答基因的组成性活化等位基因(constitutively active allele)。组成性活化等位基因在诱导型启动子的控制下表达。可选地，通过定向重组，用组成性活化等位基因替换野生型等位基因。

通过诱导表达或定向重组用下面的突变型等位基因修饰酵母：Snf3R229K等位基因(Ozcan，PNAS，1996)、Rgt2R231K等位基因(Ozcan，PNAS，1996)、Yckl-Rgt2tail嵌合体(Moriya and Johnston，PNAS，2004)、Gpa2^val132(Tamaki，JofBiosciences andBiocnginccring，2007)、Gpa2^Q300L(Wang et al.,PLOS Biology,2004)、Ras2^G19V(Wang et al.,PLOS Biology,2004)、Hxk2^S14A(Moreno and Herrero,FEMS,2002)、Pfk27ΔN，并且每个Hxt葡萄糖转运蛋白基因含有Snf3或Rgt2的C端尾部。

在用突变型葡萄糖应答基因等位基因修饰之后，以纤维糊精作为唯一碳源，使酵母在发酵条件下生长。比较每种菌株生产的乙醇量和对照菌株生产的乙醇量，其中对照菌株为表达cdt-1或cdt-2和gh1-1以及所有野生型葡萄糖应答基因的酵母菌株。与对照菌株相比，试验菌株中乙醇产量的增加表明葡萄糖代谢已经得到优化。

实施例7

本实施例描述在已经改造从而利用纤维二糖的酵母菌株中修饰葡萄糖应答途径的结果。

引言

在系统化研究通过纤维素分解真菌粗糙脉孢菌降解细胞壁的基础上，发现了两种纤维糊精转运蛋白家族。异源表达三种转运蛋白和来自粗糙脉胞菌β葡萄糖苷酶的、产乙醇的酿酒酵母可以利用纤维糊精作为底物以生产乙醇。鉴定的转运蛋白途径为研究己糖，以及来自于植物细胞壁的戊糖的微生物发酵开辟了新思路[1]。但是，当使用非天然纤维糊精底物而不是使用天然底物比如葡萄糖时，酿酒酵母的停滞期延长，并且最大的生长速率降低。在酿酒酵母中，戊糖的利用也证明了该现象[2]。看来酿酒酵母不能像对可快速发酵的碳源比如葡萄糖那样感受并且代谢这些非天然底物。

酿酒酵母利用至少三种不同的途径以感受在它周围的葡萄糖[4]。这包括三种胞外途径（通过G蛋白受体Gpr1，和两种跨膜受体（transceptor）Snf3和Rgt2）和Ras/PKA参与的一条胞内途径。由于纤维二糖转运途径可能绕过Gpr1、Snf3或Rgt2，可以仅能在转运并水解纤维二糖后部分激活Ras/PKA途径。因此，对处理纤维二糖水解提供的葡萄糖通量来说，酿酒酵母在纤维二糖上生长的代谢状态不是最优化的。为了解决上述前提，通过缺失或组成性激活使信号途径中的关键基因（表16）突变，从而探测得到的菌株的停滞期的长度和生长速率。

表16

材料和方法

菌株和质粒构建体

将酿酒酵母BY4742(MATalpha his3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)用于酵母的纤维二糖代谢工程。从开放生物系统获得酵母MATalpha敲除菌株。将大肠埃希氏菌Top10（Escherichia coli Top10）用于基因克隆和操作。纤维二糖代谢由粗糙脉孢菌β葡萄糖苷酶基因(gh1-1)和纤维糊精转运蛋白基因(cdt-1)构成。如之前报道[5]，在gh1-1克隆到在PGK启动子和CYC1终止子控制下的pRS425质粒中，并且cdt-1克隆到在PGK启动子和CYC1终止子控制下并用C端GFP标记的pRS426中。

培养基和培养条件

大肠杆菌在Luria-Bertani培养基上生长。需要时，将50μg/ml羧苄青霉素加入该培养基中。在30℃，YP培养基(10g/L酵母提取物和20g/L细菌蛋白胨)和20g/L葡萄糖中培养酵母菌株。转化的菌株在补充100mg/L硫酸腺嘌呤的、合适的完全极限缺陷型培养基（complete minimal dropout media）中生长。对于碳源转移试验，使用酵母合成完全(YSC)培养基，该培养基含有6.7g/L酵母氮源加上20g/L葡萄糖或20g/L纤维二糖，和CSM-Leu-Ura，CSM-Leu-Ura提供合适的核苷酸和氨基酸。

突变型的产生

利用QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene)通过定点突变产生Ras2、Gpa2和Sch9突变型，并通过测序确认。根据报道的方法[6]构建缺失调控功能的Hxk2突变型。通过在核苷酸+19和+48之间通过PCR缺失30bp，获得截尾突变型。得到的基因HXK2△K6M15表达不含从Lys6至Met15的氨基酸的截尾Hxk2蛋白质(Hxk2wrf)。Hxk2、Ras2、Gpa2，和Sch9的突变型版本导入到染色体中从而用两步（选择，逆选择）基因取代法[7]取代野生型等位基因。利用基于PCR的基因操作方法[8]将野生型等位基因(ATG至终止密码子)取代为URA3标签。在YSC-Ura平板上选择转化体并通过PCR来验证，PCR正向引物为被取代的ORF的上游的～200bp，并且反向引物在URA3标签的序列内(表16)。接着，利用相同的方法（除了在氟乳清酸(5-FOA)中进行阳性转化体的选择之外）用突变型等位基因取代URA3标签，并通过PCR来验证，正向引物与缺失验证的相同，反向引物在被取代的ORF内（表17）。特别地，C端GFP标记的Hxk2和Hxk2wrf用于基因取代。通过测序确定准确的基因取代。

表17列举了用于产生突变型的引物。在表16中，带下划线的核苷酸是通过突变改变的核苷酸。

表17

碳源转移试验

包含纤维二糖利用途径的重组菌株在添加了葡萄糖的YSC培养基上，30℃生长64h至稳定期晚期，接着，并行接种到添加了葡萄糖的YSC和添加了纤维二糖的YSC。起始OD₆₀₀为0.2。在含有10ml培养基的50ml试管中对所有菌株进行生物学上的三重测定。

结果和讨论

通过葡萄糖感受器和受体感受胞外纤维二糖

酿酒酵母感受葡萄糖的一种方法是经由两个跨膜葡萄糖感受器Snf3和Rgt2。胞外葡萄糖使这些感受器产生胞内信号，胞内信号诱导若干HXT基因的表达，HXT基因编码己糖转运蛋白[9]。该葡萄糖信号通过影响Rgt1转录抑制因子的功能诱导所述表达。Snf3和Rgt2对葡萄糖具有不同的亲和力并且具有单独的、非冗余功能[10]。Snf3表现为低水平葡萄糖的感受器，而Rgt2为高浓度葡萄糖的感受器。除了葡萄糖，Snf3也感受果糖和甘露糖，以及葡萄糖类似物2-脱氧葡萄糖、3-O-甲基葡萄糖苷和6-脱氧葡萄糖。利用木糖的工程酵母的转录组学分析表明Rgt2和Snf3可以感受胞外木糖[2]。

酿酒酵母感受葡萄糖的一种方法是经由Gpr1，Gpr1为具有7个跨膜域的质膜的蛋白，结合至G蛋白Gpa2并参与启动信号级联反应的葡萄糖触发的cAMP水平的增加，信号级联反应刺激发酵[11]。Gpr1-Gpa2偶联对葡萄糖和蔗糖做出应答，但不对其它糖，比如果糖、2-脱氧葡萄糖或木糖做出应答，在使用的100mM糖中，甘露糖作为拮抗剂(Rolland等人，2000)。Gpr1可能需要感受高于210mM浓度的木糖[2]。

为了确定酵母细胞是否经由普通的葡萄糖感受器感受胞外纤维二糖，用单独缺失Snf3、Rgt2和Gpr1的菌株转化纤维二糖利用途径并且比较菌株在纤维二糖和葡萄糖上的生长（图21）。据报道，Snf3缺失阻止对低浓度葡萄糖的快速适应[12]，在该研究中，碳源转移试验表明Snf3缺失轻微减缓在葡萄糖上的生长，当对纤维二糖上的生长没有影响（图21）。在Rgt2缺失的情况下，没发现与野生型菌株有明显不同（图21）。这些结果表明Snf3或Rgt2的单独缺失对酵母感受纤维二糖没有影响，但不意味着纤维二糖绕过Snf3和Rgt2。在另一方面，Gpr1缺失明显减缓在纤维二糖和葡萄糖上的生长（图21）。该结果表明Gpr1可以识别纤维二糖，并且纤维二糖激活可以Gpr1/Gpa2途径。

对纤维二糖应答的胞内葡萄糖信号途径

Ras2和Gpa2。蛋白激酶A(PKA)在生长、细胞对葡萄糖的应答，和使细胞周期进程与质量累积（mass accumulatio）结合中起着重要的作用。该途径主要诱导这样的基因：参与核糖体蛋白合成、核糖体生物合成、糖酵解及参与应激反应的基因抑制、糖异生，和贮藏的碳水化合物的代谢。诱导酵母细胞中有活性的等位基因RAS2(RAS2^G19V)在丙三醇培养基中生长导致在野生型细胞中葡萄糖的增加改变其表达的所有基因中的90%的表达上具有相同的定性和定量的变化。最近在半乳糖上展示了提高的生长速率的进化菌株中发现了Ras2^Q77K和RAS2^D112Y，两个活性降低的等位基因。Gpr1和Gpa2定义了营养感受途径，该途径与Ras2平行起作用以激活PKA。这些结果提供了强有力的证据表明，Ras2在介导葡萄糖诱导的基因表达改变上起主要作用，而Gpa2在葡萄糖应答上起更多的辅助作用，并且两者都单独经由PKA调节而起作用。据报道，在缺乏Gpr1时，通过组成性活化Gpa2^G19V等位基因可以满足胞外葡萄糖的检测[15]。此外，微阵列数据表明，诱导GPA2^Q300L导致相同组的基因表达发生变化，如诱导Ras2有活性的等位基因一样[16]。

Sch9。Sch9与Ras/PKA途径平行起作用，但似乎作为转录中葡萄糖介导的变化的小通道。Sch9过表达克制PKA途径的不足并且其灭活导致生长减弱和核糖体生物合成中基因的表达下降。Sch9作为主要的通道，通过该通道，TORC1影响生长和质量累积。Sch9^2D3E(T723D、S726D、T737E、S758E，和S765E)为不依赖TOR的SCH9等位基因[17]。如此，Sch9像PKA一样对许多相同的下游靶标起作用，这可能是过量的Sch9能补偿PKA活性损失的原因。两种激酶都经由单独的信号级联反应作用。此外，在明确影响PKA和/或Sch9信号的条件下和菌株中，全基因组表达分析证明两种激酶协同地或对立地调节特定的基因靶标[18]。

Yak1。Yak1为在葡萄糖应答中与Ras/PKA途平行起作用但具有相反效果的蛋白激酶。PKA抑制应激反应并且刺激生长，而Yak1刺激应激反应并且抑制生长[4]。

基于利用包含纤维二糖利用途径的、单独缺失Ras2、Gpa2、Sch9，和Yak1的菌株的碳源转移试验，在纤维二糖上，单独缺失Ras2和Sch9的两种菌株都延长停滞期，与在葡萄糖上的相反（图22A和22B）。在另一方面，缺失Gpa2的菌株在纤维二糖介导的生长上比在葡萄糖介导的生长上具有更强烈的效果（图22A）。这些结果表明细胞在葡萄糖上的生长具有健全的信号网。缺失Yak1的菌株在纤维二糖介导的生长和葡萄糖介导的生长上都具有轻微的影响，这证实Yakl在信号途径中起较小的作用（图22C）。有趣的是，Gpa2的组成性活化等位基因(Gpa2^G19V)看来在纤维二糖介导的生长上具有调节作用，而当细胞在葡萄糖上生长时，与野生型等位基因类似（图23）。

纤维二糖激活胞内葡萄糖抑制途径

Hxk2。Hxk2具有双重的亚细胞定位：它作为细胞质中的糖酵解酶并且作为细胞核中的若干Mig1调节基因的基因转录的调节者起作用。功能研究表明Hxk2的主要调节作用是通过与转录阻遏因子Mig1和Snf1蛋白激酶相互作用以在细胞核中产生阻遏复合物而产生的[19,20]。缺乏Lys₆至Met₁₅的氨基酸的Hxk2wrf突变型等位基因不能进行葡萄糖阻遏信号传导，但保持己糖磷酸化活性[6]。

碳源转移试验表明，Hxk2缺失和缺乏Hxk2调节功能的Hxk2wrf突变型没有表现出影响在纤维二糖上或葡萄糖上的生长（图24A和24B）。这些结果表明，纤维二糖可以如葡萄糖那样强烈地激活Hxk2介导的葡萄糖阻遏。

与细胞生长相关的其它关键基因

Rim15。Rim15是在细胞增殖期间，特别是稳定期的建立中，对营养进行应答，参与信号传导的葡萄糖阻遏蛋白激酶。

Stb3。Stb3是参与葡萄糖诱导的从静止到生长的转变的核糖体RNA加工元件（RRPE）-结合蛋白。Stb3过表达产生缓慢的生长表型[21]。

Kcs1。Kcs1缺失导致高浓度的ATP和增强的糖酵解通量和发酵[22]。

Tps1。通过代谢中间产物，包括海藻糖-6-P，控制糖酵解活性和基因表达。Tps1参与海藻糖-6-P的合成，海藻糖-6-P抑制Hxk2活性[23]。

在纤维二糖和葡萄糖上，Rim15缺失菌株的生长展示了减缓的生长（图25）。在纤维二糖和葡萄糖上，Stb3缺失菌株的生长似乎表明，在纤维二糖上的生长减缓，而在葡萄糖上的生长加快（图25）。在纤维二糖上，Kcs1缺失菌株表现出生长减缓（图25）。Kcs1的结果是令人惊讶的，因为考虑到Kcs1缺失导致高浓度的ATP已经有报道，预期缺失Kcs1将有利于纤维二糖的利用。

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23.Rolland F,Baena-Gonzalez E,Sheen J(2006)Sugar sensing and signaling inplants:conserved and novel mechanisms.Annu Rev Plant Biol57:675-709.

Claims

1.一种降解纤维糊精的方法，包括：

a）提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组纤维糊精转运蛋白和重组多肽，所述重组多肽包括

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中所述重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性；以及

b）在包括纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养所述宿主细胞，藉此使纤维糊精转运到所述细胞中，并被所述重组多肽降解。

2.一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，包括：

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，

其中，所述重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性；以及

b）在包括纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养所述宿主细胞，藉此使纤维糊精转运到所述细胞中，并被所述重组多肽降解，并且使所述宿主细胞从所述纤维糊精产生碳水化合物或碳水化合物衍生物。

3.一种在葡萄糖利用期间降解ATP消耗的方法，包括：

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中，所述重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性；

以及b）在包括纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养所述宿主细胞，藉此使纤维糊精转运到所述细胞中，并被所述重组多肽降解成葡萄糖-1-磷酸；其中，与缺乏所述重组多肽的相应的细胞相比，从纤维糊精产生葡萄糖-1-磷酸能降低ATP的消耗。

4.根据权利要求1-3中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组多肽包括与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

5.根据权利要求1-3中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组多肽包括与选自SEQ ID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

7.根据权利要求1-6中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组多肽包括一个或更多个突变。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述一个或更多个突变为氨基酸替换。

9.根据权利要求1-8中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组多肽在与SEQ IDNO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置包括氨基酸替换；其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。

10.根据权利要求1-9中任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组葡萄糖磷酸变位酶。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述重组葡萄糖磷酸变位酶包括保守基序，所述保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。

12.根据权利要求1-11中任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组己糖激酶。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述重组己糖激酶包括保守基序，所述保守基序具有[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述重组己糖激酶为HXK1。

15.一种降解纤维糊精的方法，包括：

a）提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组纤维糊精转运蛋白和重组葡萄糖磷酸变位酶；以及

b）在包括纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养所述宿主细胞，藉此纤维糊精转运到所述细胞中，并被降解。

16.一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，包括：

b）在包括纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养所述宿主细胞，藉此纤维糊精转运到所述细胞中，并且藉此所述宿主细胞从转运的纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其特征在于，所述重组葡萄糖磷酸变位酶包括保守基序，其中所述保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQID NO:19)氨基酸序列。

18.根据权利要求15-17中任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组己糖激酶。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述重组己糖激酶包括保守基序，所述保守基序具有[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQ ID NO:20)氨基酸序列。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述重组己糖激酶为HXK1。

21.一种降解纤维糊精的方法，包括：

a）提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组纤维糊精的转运蛋白和重组己糖激酶；以及

b）在包括纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养所述宿主细胞，藉此纤维糊精转运到细胞中，并被降解。

22.一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，包括：

23.根据权利要求21或22所述的方法，其特征在于，所述重组己糖激酶包括保守基序，其中所述保守基序具有

[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQ IDNO:20)氨基酸序列。

24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述重组己糖激酶为HXK1。

25.根据权利要求21-24中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组葡萄糖磷酸变位酶。

26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述重组葡萄糖磷酸变位酶包括保守基序，所述保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。

27.根据权利要求15-26中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组多肽，该重组多肽包括

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中，该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性。

28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述重组多肽包括与CDP_Clent,CDP_Ctherm,或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

29.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。

30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述重组多肽包括与选自SEQ ID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

31.根据权利要求27-30中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组多肽包括一个或更多个突变。

32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述一个或更多个突变为氨基酸替换。

33.根据权利要求27-32中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组多肽在与SEQID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置的包括氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。

34.根据权利要求27-33中的任何一项所述的方法，其特征在于，与缺乏所述重组多肽的相应的细胞相比，所述重组多肽降低ATP消耗。

35.根据权利要求1-34中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括第二重组多肽，所述第二重组多肽包括选自

F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:18),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:19)，和[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中所述第二重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。

36.根据权利要求35所述的方法，其特征在于，所述第二重组多肽包括选自

F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:16),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:17)，和[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:18)中的两个或两个以上序列。

37.根据权利要求35或权利要求36所述的方法，其特征在于，所述第二重组多肽包括与NCU00130氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

38.一种降解纤维糊精的方法，包括：

a）提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组纤维糊精转运蛋白和重组多肽，该重组多肽包括选自F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQID NO:18),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ IDNO:19)和

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中，所述重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性；以及

b）在包括纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养所述宿主细胞，藉此纤维糊精转运到所述细胞中，并被所述重组多肽降解。

39.一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，包括：

a）提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组纤维糊精转运蛋白和重组多肽，所述重组多肽包括选自F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:18),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:19)，和

b）在包括纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养所述宿主细胞，藉此纤维糊精转运到所述细胞中，并被所述重组多肽降解。并且藉此，所述宿主细胞从所述纤维糊精产生碳水化合物或碳水化合物衍生物。

40.根据权利要求38或权利要求39所述的方法，其特征在于，所述重组多肽包括选自F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:16),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:17)，和[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:18)中的两个或两个以上序列。

41.根据权利要求38-40中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组多肽包括与NCU00130的氨基酸序列至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致的氨基酸序列。

42.根据权利要求38-41中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组葡萄糖磷酸变位酶。

43.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，所述重组葡萄糖磷酸变位酶包括保守基序，所述保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。

44.根据权利要求38-43中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组己糖激酶。

45.根据权利要求44所述的方法，其特征在于，所述重组己糖激酶包括保守基序，该保守基序具有[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQ ID NO:20)氨基酸序列。

46.根据权利要求45所述的方法，其特征在于，所述重组己糖激酶为HXK1。

47.根据权利要求38-46中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括第二重组多肽，该第二重组多肽包括

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中所述第二重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性。

48.根据权利要求47所述的方法，其特征在于，所述第二重组多肽包括与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

49.根据权利要求47所述的方法，其特征在于，所述第二重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。

50.根据权利要求49所述的方法，其特征在于，所述第二重组多肽包括与选自SEQ ID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

51.根据权利要求47-50中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述第二重组多肽包括一个或更多个突变。

52.根据权利要求51所述的方法，其特征在于，所述一个或更多个突变为氨基酸替换。

53.根据权利要求47-52中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述第二重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置包括氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。

54.根据权利要求1-53中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组纤维糊精转运蛋白包括多肽，该多肽选自如下多肽：包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋1包括SEQ ID NO:1；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋2包括SEQ ID NO:2；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且连接跨膜α-螺旋2和跨膜α-螺旋3的环包括SEQ ID NO:3；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋5包括SEQ ID NO:4；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6包括SEQ ID NO:5；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6和跨膜α-螺旋7之间的序列包括SEQ ID NO:6；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋7包括SEQ ID NO:7；以及包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋10和跨膜α-螺旋11及它们之间的序列包括SEQ ID NO:8。

55.根据权利要求54所述的方法，其特征在于，所述重组纤维糊精转运蛋白为纤维二糖转运蛋白。

56.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述纤维二糖转运蛋白与SEQ ID NO:9(CDT-1)或SEQ ID NO:10(CDT-2)具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性。

57.根据权利要求1-56中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组纤维糊精转运蛋白包括一个或更多个突变。

58.根据权利要求57所述的方法，其特征在于，所述一个或更多个突变为氨基酸替换。

59.根据权利要求1-58中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组纤维糊精转运蛋白在与SEQ ID NO:9(CDT-1)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置包括氨基酸替换。其中所述一个或更多个位置为选自如下位置：与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸170对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸174对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸194对应的位置，与SEQID NO:9的氨基酸213对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，及其组合。

60.根据权利要求1-58中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组纤维糊精转运蛋白在与SEQ ID NO:9(CDT-1)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置包括氨基酸替换，其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，甘氨酸(G)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，谷氨酰胺(Q)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸170对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸174对应的位置，精氨酸(R)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸194对应的位置，谷氨酸(E)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为赖氨酸(L)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)，及其组合。

61.一种降解纤维糊精的方法，包括：

a）提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组葡萄糖磷酸变位酶和重组多肽，该重组多肽包括

b）在包括纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养所述宿主细胞，藉此纤维糊精被所述重组多肽降解。

62.一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，通过：

a）提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组葡萄糖磷酸变位酶和重组多肽，所述重组多肽包括

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中，所述重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性；以及

b）在包括纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养所述宿主细胞，藉此纤维糊精被所述重组多肽降解，并且藉此，所述宿主细胞从所述纤维糊精产生碳水化合物或碳水化合物衍生物。

63.一种在葡萄糖利用期间降解ATP消耗的方法，包括：

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中，该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性；以及

b）在包括纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养所述宿主细胞，藉此纤维糊精被所述重组多肽降解成葡萄糖-1-磷酸。其中，与缺乏所述重组多肽的相应的细胞相比，从纤维糊精产生葡萄糖-1-磷酸降低了ATP的消耗。

64.根据权利要求61-63中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组葡萄糖磷酸变位酶包括保守基序，所述保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。

65.根据权利要求61-64中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组己糖激酶。

66.根据权利要求65所述的方法，其特征在于，所述重组己糖激酶包括保守基序，所述保守基序具有[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQ ID NO:20)氨基酸序列。

67.根据权利要求66所述的方法，其特征在于，所述重组己糖激酶为HXK1。

68.一种降解纤维糊精的方法，包括：

a）提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组己糖激酶和重组多肽，所述重组多肽包括Y-x(2)-G-x-[KR]-E-N-[AG]-[AG]-[IV]-F-x(2)-[ANST]-[NST]-x(2)-[AIV]-x(2)-[AGT]-x(4)-[AG]-x(4)-[ADNS](SEQ ID NO:233),

69.一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，包括：

a）提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组己糖激酶和重组多肽，该重组多肽包括Y-x(2)-G-x-[KR]-E-N-[AG]-[AG]-[IV]-F-x(2)-[ANST]-[NST]-x(2)-[AIV]-x(2)-[AGT]-x(4)-[AG]-x(4)-[ADNS](SEQ ID NO:233),

70.一种在葡萄糖利用期间降解ATP消耗的方法，包括：a）提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组己糖激酶和重组多肽，所述重组多肽包括

71.根据权利要求68-70中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组己糖激酶包括保守基序，所述保守基序具有

72.根据权利要求71所述的方法，其特征在于，所述重组己糖激酶为HXK1。

73.根据权利要求68-72中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组葡萄糖磷酸变位酶。

74.根据权利要求73所述的方法，其特征在于，所述重组葡萄糖磷酸变位酶包括保守基序，所述保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。

75.根据权利要求61-74中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组多肽包括与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

76.根据权利要求61-74中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。

77.根据权利要求76所述的方法，其特征在于，所述重组多肽包括与选自SEQ ID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

78.根据权利要求61-77中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组多肽包括一个或更多个突变。

79.根据权利要求78所述的方法，其特征在于，所述一个或更多个突变为氨基酸替换。

80.根据权利要求61-79中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组多肽在与SEQID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置包括氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。

81.一种降解纤维糊精的方法，包括：

a）提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组葡萄糖磷酸变位酶和重组己糖激酶；以及

b）在包括纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养所述宿主细胞，藉此纤维糊精被降解。

82.一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，包括：

b）在包括纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养所述宿主细胞，藉此纤维糊精被降解，并且藉此所述宿主细胞从所述纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物。

83.根据权利要求81或权利要求82所述的方法，其特征在于，所述重组葡萄糖磷酸变位酶包括保守基序，所述保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。

84.根据权利要求81-83中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组己糖激酶包括保守基序，所述保守基序具有

85.根据权利要求84所述的方法，其特征在于，所述重组己糖激酶为HXK1。

86.根据权利要求81-85中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组多肽，所述重组多肽包括

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中该重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性。

87.根据权利要求86所述的方法，其特征在于，所述重组多肽包括与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

88.根据权利要求86所述的方法，其特征在于，所述重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。

89.根据权利要求88所述的方法，其特征在于，所述重组多肽包括与选自SEQ ID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

90.根据权利要求86-89中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组多肽包括一个或更多个突变。

91.根据权利要求90所述的方法，其特征在于，所述一个或更多个突变为氨基酸替换。

92.根据权利要求86-91中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组多肽在与SEQID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置包括氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。

93.根据权利要求86-92中的任何一项所述的方法，其特征在于，与缺乏该重组多肽的相应的细胞相比，所述重组多肽降低ATP的消耗。

94.根据权利要求61-93中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括第二重组多肽，所述第二重组多肽包括选自

F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:18),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:19)和[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中所述第二重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。

95.根据权利要求94所述的方法，其特征在于，所述第二重组多肽包括选自

96.根据权利要求94或95所述的方法，其特征在于，所述第二重组多肽包括与NCU00130的氨基酸序列至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致的氨基酸序列。

97.一种降解纤维糊精的方法，包括：

a）提供宿主细胞，所述宿主细胞包括：第一重组多肽，所述第一重组多肽包括

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中，所述第一重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性；和

第二重组多肽，所述第二重组多肽含有选自

F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:18),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:19),和[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中所述第二重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性；以及

98.一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，包括：

a）提供一种宿主细胞，包括：第一重组多肽，所述第一重组多肽包括

第二重组多肽，所述第二重组多肽包括选自

b）在包括纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养所述宿主细胞，藉此纤维糊精被所述重组多肽降解，并且藉此，所述宿主细胞从纤维糊精产生碳水化合物或碳水化合物衍生物。

99.根据权利要求97或98中任何一项所述的方法，其特征在于，所述第一重组多肽含有与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

100.根据权利要求97或98中任何一项所述的方法，其特征在于，所述第一重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。

101.根据权利要求100所述的方法，其特征在于，所述第一重组多肽包括与选自SEQ IDNO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

102.根据权利要求97-101中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组多肽包括一个或更多个突变。

103.根据权利要求102所述的方法，其特征在于，所述一个或更多个突变为氨基酸替换。

104.根据权利要求97-103中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述第一重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置包括氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。

105.根据权利要求97-104中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组葡萄糖磷酸变位酶。

106.根据权利要求105所述的方法，其特征在于，所述重组葡萄糖磷酸变位酶包括保守基序，所述保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。

107.根据权利要求97-106中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组己糖激酶。

108.根据权利要求107所述的方法，其特征在于，所述重组己糖激酶包括保守基序，所述保守基序具有LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQ ID NO:20)氨基酸序列。

109.根据权利要求108所述的方法，其特征在于，所述重组己糖激酶为HXK1。

110.一种降解纤维糊精的方法，包括：

a）提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组葡萄糖磷酸变位酶和重组多肽，所述重组多肽包括选自F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:18),

[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:19)和

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中，所述重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性；

以及b）在包括纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养所述宿主细胞，藉此纤维糊精被所述重组多肽降解。

111.一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，包括：

[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:19)和

b）在包括纤维糊精或纤维糊精来源的培养基中培养所述宿主细胞，藉此纤维糊精被所述重组多肽降解。并且藉此，所述宿主细胞从所述纤维糊精产生碳水化合物或碳水化合物衍生物。

112.根据权利要求110或111所述的方法，其特征在于，所述重组葡萄糖磷酸变位酶包括保守基序，所述保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ IDNO:19)氨基酸序列。

113.根据权利要求110-112中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组己糖激酶。

114.根据权利要求113所述的方法，其特征在于，所述重组己糖激酶包括保守基序，所述保守基序具有[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQ ID NO:20)氨基酸序列。

115.根据权利要求114所述的方法，其特征在于，所述重组己糖激酶为HXK1。

116.一种降解纤维糊精的方法，包括：

a）提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组己糖激酶和重组多肽，所述重组多肽含有选自F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:18),

[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:19)和

117.一种从纤维糊精生产碳水化合物或碳水化合物衍生物的方法，包括：

a）提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有重组己糖激酶和重组多肽，所述重组多肽包括选自F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:18),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:19)和[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中，所述重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性；以及

118.根据权利要求116或117所述的方法，其特征在于，所述重组己糖激酶包括保守基序，该保守基序具有

119.根据权利要求118所述的方法，其特征在于，所述重组己糖激酶为HXK1。

120.根据权利要求116-119中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组葡萄糖磷酸变位酶。

121.根据权利要求120所述的方法，其特征在于，所述重组葡萄糖磷酸变位酶包括保守基序，所述保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。

122.根据权利要求110-121中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括第二重组多肽，所述第二重组多肽包括选自

123.根据权利要求122所述的方法，其特征在于，所述第二重组多肽包括与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

124.根据权利要求122所述的方法，其特征在于，所述第二重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。

125.根据权利要求124所述的方法，其特征在于，所述第二重组多肽包括与选自SEQ IDNO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

126.根据权利要求122-125中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述第二重组多肽包括一个或更多个突变。

127.根据权利要求126所述的方法，其特征在于，所述一个或更多个突变为氨基酸替换。

128.根据权利要求122-127中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述第二重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置包括氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。

129.根据权利要求61-128中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组纤维糊精转运蛋白，所述重组纤维糊精转运蛋白包括多肽，所述多肽选自如下多肽：包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋1包括SEQ ID NO:1；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋2包括SEQ ID NO:2；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且连接跨膜α-螺旋2和跨膜α-螺旋3的环包括SEQ ID NO:3；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋5包括SEQ ID NO:4；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6包括SEQ ID NO:5；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6和跨膜α-螺旋7之间的序列包括SEQ ID NO:6；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋7包括SEQ ID NO:7；以及包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋10和跨膜α-螺旋11及它们之间的序列包括SEQ ID NO:8。

130.根据权利要求129所述的方法，其特征在于，所述重组纤维糊精转运蛋白为纤维二糖转运蛋白。

131.根据权利要求130所述的方法，其特征在于，所述纤维二糖转运蛋白与SEQ ID NO:9(CDT-1)或SEQ ID NO:10(CDT-2)具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性。

132.根据权利要求129-131中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组纤维糊精转运蛋白包括一个或更多个突变。

133.根据权利要求132所述的方法，其特征在于，所述一个或更多个突变为氨基酸替换。

134.根据权利要求129-133中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组纤维糊精转运蛋白在与SEQ ID NO:9(CDT-1)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置包括氨基酸替换。其中所述一个或更多个位置为选自如下位置：与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸170对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸174对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸194对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，及其组合。

135.根据权利要求129-133中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述重组纤维糊精转运蛋白在与SEQ ID NO:9(CDT-1)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置包括氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，甘氨酸(G)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，谷氨酰胺(Q)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸170对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸174对应的位置，精氨酸(R)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ IDNO:9的氨基酸194对应的位置，谷氨酸(E)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为赖氨酸(L)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)，及其组合。

136.根据权利要求97-135中的任何一项所述的方法，其特征在于，具有β-葡萄糖苷酶活性的所述重组多肽包括选自

137.根据权利要求97-136中的任何一项所述的方法，其特征在于，具有β-葡萄糖苷酶活性的所述重组多肽包括与NCU00130的氨基酸序列至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

138.根据权利要求1-137中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括一种或更多种葡萄糖应答基因，其中，与该蛋白质的野生型激活水平相比，由至少一种葡萄糖应答基因编码的蛋白质的激活水平是变化的。

139.根据权利要求138所述的方法，其特征在于，所述一种或更多种葡萄糖应答基因选自Snf3、Rgt1、Rgt2、Yck1/2、Std1、Mth1、Snf1/4,Grr1、Gpr1、Gpa2、Ras2、Stb3、Hxk2、Pfk27、Pfk26、Sch9、Yak1、Mig1、Rim15、Kcs1和Tps1。

140.根据权利要求138或权利要求139所述的方法，其特征在于，与其野生型激活水平相比，由所述一种或更多种葡萄糖应答基因编码的一种或更多种蛋白的激活水平是提高的。

141.根据权利要求138或权利要求139所述的方法，其特征在于，所述与其野生型激活水平相比，由该一种或更多种葡萄糖应答基因编码的一种或更多种蛋白的激活水平是下降的。

142.根据权利要求1-141中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述纤维糊精的来源包括纤维素。

143.根据权利要求1-142中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述纤维糊精选自纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖和纤维六糖中的一种或多种。

144.根据权利要求2、1-14、16-20、22-37、39-60、62、64-67、69、71-80、82-96、98-109、111-115和117-143中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述碳水化合物或碳水化合物衍生物可用作燃料。

145.根据权利要求2、4-14、16-20、22-37、39-60、62、64-67、69、71-80、82-96、98-109、111-115和117-144中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述碳水化合物或碳水化合物衍生物包括乙醇。

146.根据权利要求145所述的方法，其特征在于，所述乙醇以至少约0.10至至少20g/L-h的范围的速率产生。

147.根据权利要求2、4-14、16-20、22-37、39-60、62、64-67、69、71-80、82-96、98-109、111-115和117-144中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述碳水化合物或碳水化合物衍生物包括丁醇。

148.根据权利要求1-147中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为真菌细胞。

149.根据权利要求1-148中的任何一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为酵母细胞。

150.根据权利要求149所述的方法，其特征在于，所述酵母细胞为酿酒酵母。

151.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组纤维糊精转运蛋白和重组多肽，所述重组多肽包括

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:14)或

Y-Q-[CN]-M-[IV]-T-F-[CN]-[FILMV]-[AS]-R-[ST]-[AS]-S-[FY]-[FY]-E-[STV]-G-x-[GS]-R-G-[IM]-G-F-R-D-S-[ACNS]-Q-D-[ILV]-[ILMV]-G-x-V-H-x-[IV]-P-[ADEST]-x-[AV]-[KR]-[AEQ]-x-[IL]-[FIL]-D(SEQ ID NO:15)，其中所述重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性。

152.根据权利要求151所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽含有与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

153.根据权利要求151所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。

154.根据权利要求153所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽包括与选自SEQ IDNO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

155.根据权利要求151-154中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽包括一个或更多个突变。

156.根据权利要求155所述的宿主细胞，其特征在于，所述一个或更多个突变为氨基酸替换。

157.根据权利要求151-156中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置包括氨基酸替换，其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。

158.根据权利要求151-157中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组葡萄糖磷酸变位酶。

159.根据权利要求158所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组葡萄糖磷酸变位酶包括保守基序，所述保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列。

160.根据权利要求151-159中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组己糖激酶。

161.根据权利要求160所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组己糖激酶包括保守基序，所述保守基序具有

[LIVM]-G-F-[TN]-F-S-[FY]-P-x(5)-[LIVM]-[DNST]-x(3)-[LIVM]-x(2)-W-T-K-x-[LF](SEQ IDNO:20)的氨基酸序列。

162.根据权利要求161所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组己糖激酶为HXK1。

163.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组纤维糊精转运蛋白和重组葡萄糖磷酸变位酶。

164.根据权利要求163所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组葡萄糖磷酸变位酶包括保守基序，所述保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。

165.根据权利要求163或164所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组己糖激酶。

166.根据权利要求165所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组己糖激酶包括保守基序，所述保守基序具有

167.根据权利要求166所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组己糖激酶为HXK1。

168.一种一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组纤维糊精转运蛋白和重组己糖激酶。

169.根据权利要求168所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组己糖激酶包括保守基序，所述保守基序具有

170.根据权利要求169所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组己糖激酶为HXK1。

171.根据权利要求168-170中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组葡萄糖磷酸变位酶。

172.根据权利要求171所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组葡萄糖磷酸变位酶包括保守基序，所述保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ IDNO:19)氨基酸序列。

173.根据权利要求163-172中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组多肽，该重组多肽包括

174.根据权利要173求所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽包括与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

175.根据权利要求173所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。

176.根据权利要求175所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽包括与选自SEQ IDNO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

177.根据权利要求173-176中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽包括一个或更多个突变。

178.根据权利要求177所述的宿主细胞，其特征在于，所述一个或更多个突变为氨基酸替换。

179.根据权利要求173-178中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置含有氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。

180.根据权利要求151-179中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括第二重组多肽，所述第二重组多肽包括选自

181.根据权利要求180所述的宿主细胞，其特征在于，所述第二重组多肽包括选自

F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:16),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:17)和[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:18)中的两个或两个以上序列。

182.根据权利要求180或181所述的宿主细胞，其特征在于，所述第二重组多肽包括与NCU00130氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

183.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组纤维糊精转运蛋白和重组多肽，所述重组多肽包括选自F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQID NO:18),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ IDNO:19)，和

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中所述重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。

184.根据权利要求183所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽含有选自

185.根据权利要求183或184所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽包括与NCU00130氨基酸序列至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致的氨基酸序列。

186.根据权利要求183-185中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组葡萄糖磷酸变位酶。

187.根据权利要求186所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组葡萄糖磷酸变位酶包括保守基序，所述保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。

188.根据权利要求183-187中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组己糖激酶。

189.根据权利要求188所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组己糖激酶包括保守基序，所述保守基序具有

190.根据权利要求189所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组己糖激酶为HXK1。

191.根据权利要求183-190中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括第二重组多肽，所述第二重组多肽包括

192.根据权利要求191所述的宿主细胞，其特征在于，所述第二重组多肽包括与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

193.根据权利要求191所述的宿主细胞，其特征在于，所述第二重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。

194.根据权利要求193所述的宿主细胞，其特征在于，所述第二重组多肽包括与选自SEQID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

195.根据权利要求191-194中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述第二重组多肽包括一个或更多个突变。

196.根据权利要求195所述的宿主细胞，其特征在于，所述一个或更多个突变为氨基酸替换。

197.根据权利要求191-196中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述第二重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置包括氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。

198.根据权利要求151-197中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组纤维糊精转运蛋白包括多肽，所述多肽选自如下多肽：包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋1包括SEQ ID NO:1；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋2包括SEQ ID NO:2；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且连接跨膜α-螺旋2和跨膜α-螺旋3的环包括SEQ ID NO:3；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋5包括SEQ ID NO:4；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6包括SEQ ID NO:5；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6和跨膜α-螺旋7之间的序列包括SEQ ID NO:6；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋7包括SEQ ID NO:7；以及包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋10和跨膜α-螺旋11及它们之间的序列包括SEQ ID NO:8。

199.根据权利要求198所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组纤维糊精转运蛋白为纤维二糖转运蛋白。

200.根据权利要求199所述的宿主细胞，其特征在于，所述纤维二糖转运蛋白与SEQ IDNO:9(CDT-1)或SEQ ID NO:10(CDT-2)具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性。

201.根据权利要求151-200中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组纤维糊精转运蛋白包括一个或更多个突变。

202.根据权利要求201所述的宿主细胞，其特征在于，所述一个或更多个突变为氨基酸替换。

203.根据权利要求151-202中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组纤维糊精转运蛋白在与SEQ ID NO:9(CDT-1)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置包括氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换是在选自如下位置：与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸170对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸174对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸194对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，及其组合。

204.根据权利要求151-202中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组纤维糊精转运蛋白在与SEQ ID NO:9(CDT-1)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置包括氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，甘氨酸(G)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，谷氨酰胺(Q)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸170对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸174对应的位置，精氨酸(R)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸194对应的位置，谷氨酸(E)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为赖氨酸(L)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)，及其组合。

205.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组葡萄糖磷酸变位酶和重组多肽，所述重组多肽包括[AG]-[IV]-F-x(2)-[ANST]-[NST]-x(2)-[AIV]-x(2)-[AGT]-x(4)-[AG]-x(4)-[ADNS](SEQID NO:233),

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:15)，其中所述重组多肽具有纤维糊精磷酸化酶活性。

206.根据权利要求205所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组葡萄糖磷酸变位酶包括保守基序，所述保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。

207.根据权利要求205或206所述的宿主细胞，其特征在于，所述主细胞进一步包括重组己糖激酶。

208.根据权利要求207所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组己糖激酶包括保守基序，所述保守基序具有

209.根据权利要求208所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组己糖激酶为HXK1。

210.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组己糖激酶和重组多肽，所述重组多肽包括

211.根据权利要求210所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组己糖激酶包括保守基序，所述保守基序具有

212.根据权利要求211所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组己糖激酶为HXK1。

213.根据权利要求210-212中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组葡萄糖磷酸变位酶。

214.根据权利要求213所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组葡萄糖磷酸变位酶包括保守基序，所述保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。

215.根据权利要求205-214中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽包括与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

216.根据权利要求205-214中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。

217.根据权利要求216所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽包括与选自SEQ IDNO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

218.根据权利要求205-217中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽包括一个或更多个突变。

219.根据权利要求218所述的宿主细胞，其特征在于，所述一个或更多个突变为氨基酸替换。

220.根据权利要求205-219中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置包括氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。

221.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组葡萄糖磷酸变位酶和重组己糖激酶。

222.根据权利要求221所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组葡萄糖磷酸变位酶包括保守基序，所述保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。

223.根据权利要求221或222所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组己糖激酶包括保守基序，所述保守基序具有

224.根据权利要求223所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组己糖激酶为HXK1。

225.根据权利要求221-224中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组多肽，该重组多肽包括

G-x(2)-[FY]-x-N-[AGS]-x-[AS]-W-[APS]-V-[IL]-[AS]-x(2)-A-x(2)-[DE]-x-[AI]-x(3)-[LMV]-[DEN]-[ASV]-[ILV]-x(3)-L-x-T-x(2)-G-[ILV]-x(2)-[SV]-x-P-[AG](SEQ ID NO:14)，或

226.根据权利要求225所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽包括与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

227.根据权利要求225所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。

228.根据权利要求227所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽包括与选自SEQ IDNO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

229.根据权利要求225-228中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽包括一个或更多个突变。

230.根据权利要求229所述的宿主细胞，其特征在于，所述一个或更多个突变为氨基酸替换。

231.根据权利要求225-230中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置包括氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。

232.根据权利要求205-231中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括第二重组多肽，所述第二重组多肽包括选自

F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:18),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:19)和[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，所述第二重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。

233.根据权利要求232所述的宿主细胞，其特征在于，所述第二重组多肽包括选自

234.根据权利要求232或233所述的宿主细胞，其特征在于，所述第二重组多肽包括与NCU00130氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

235.一种宿主细胞，包括：

第一重组多肽，所述第一重组多肽包括

第二重组多肽，所述第二重组多肽包括选自

F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:18),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:19),和[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中所述第二重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。

236.根据权利要求235所述的宿主细胞，其特征在于，所述第一重组多肽包括与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

237.根据权利要求235所述的宿主细胞，其特征在于，所述第一重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。

238.根据权利要求237所述的宿主细胞，其特征在于，所述第一重组多肽包括与选自SEQID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

239.根据权利要求235-238中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组多肽包括一个或更多个突变。

240.根据权利要求239所述的宿主细胞，其特征在于，所述一个或更多个突变为氨基酸替换。

241.根据权利要求235-240中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述第一重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置包括氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。

242.根据权利要求235-241中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组葡萄糖磷酸变位酶。

243.根据权利要求242所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组葡萄糖磷酸变位酶包括保守基序，所述保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。

244.根据权利要求235-243中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组己糖激酶。

245.根据权利要求244所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组己糖激酶包括保守基序，所述保守基序具有

246.根据权利要求245所述的宿主细胞，其特征在于，所述该重组己糖激酶为HXK1。

247.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组葡萄糖磷酸变位酶和重组多肽，所述重组多肽包括选自F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQID NO:18),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ IDNO:19)，和

[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中，所述重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。

248.根据权利要求247所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组葡萄糖磷酸变位酶包括保守基序，所述保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。

249.根据权利要求247或248所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组己糖激酶。

250.根据权利要求249所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组己糖激酶包括保守基序，所述保守基序具有

251.根据权利要求250所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组己糖激酶为HXK1。

252.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括重组己糖激酶和重组多肽，所述重组多肽包括选自F-x-[FYWM]-[GSTA]-x-[GSTA]-x-[GSTA](2)-[FYNH]-[NQ]-x-E-x-[GSTA](SEQ ID NO:18),[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:19)，和[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:20)中的一个或多个序列，其中，所述重组多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。

253.根据权利要求252所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组己糖激酶包括保守基序，所述保守基序具有

254.根据权利要求253所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组己糖激酶为HXK1。

255.根据权利要求252-254中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组葡萄糖磷酸变位酶。

256.根据权利要求255所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组葡萄糖磷酸变位酶包括保守基序，所述保守基序具有[GSA]-[LIVMF]-x-[LIVM]-[ST]-[PGA]-S-H-[NIC]-P(SEQ ID NO:19)氨基酸序列。

257.根据权利要求247-256中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括第二重组多肽，所述第二重组多肽包括

258.根据权利要求257所述的宿主细胞，其特征在于，所述第二重组多肽包括与CDP_Clent,CDP_Ctherm或CDP_Acell的氨基酸序列具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

259.根据权利要求257所述的宿主细胞，其特征在于，所述第二重组多肽具有纤维二糖磷酸化酶活性。

260.根据权利要求259所述的宿主细胞，其特征在于，所述第二重组多肽包括与选自SEQID NO:11(CgCBP)、SEQ ID NO:12(SdCBP)和SEQ ID NO:13(CtCBP)的氨基酸具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性的氨基酸序列。

261.根据权利要求257-260中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述第二重组多肽包括一个或更多个突变。

262.根据权利要求261所述的宿主细胞，其特征在于，所述一个或更多个突变为氨基酸替换。

263.根据权利要求257-262中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述第二重组多肽在与SEQ ID NO:12(SdCBP)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置包括氨基酸替换。其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为谷氨酰胺(Q)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸409对应的位置，异亮氨酸(I)替换为甲硫氨酸(M)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为天冬氨酸(D)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸482对应的位置，天冬酰胺(N)替换为苏氨酸(T)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸484对应的位置，半胱氨酸(C)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸651对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为色氨酸(W)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为天冬酰胺(N)；在与SEQ ID NO:12的氨基酸653对应的位置，组氨酸(H)替换为丙氨酸(A)；及其组合。

264.根据权利要求205-263中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括重组纤维糊精转运蛋白，所述重组纤维糊精转运蛋白包括多肽，所述多肽选自如下多肽：包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋1包括SEQ IDNO:1；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋2包括SEQ IDNO:2；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且连接跨膜α-螺旋2和跨膜α-螺旋3的环包括SEQ ID NO:3；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋5包括SEQ ID NO:4；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6包括SEQ ID NO:5；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋6和跨膜α-螺旋7之间的序列包括SEQ ID NO:6；包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋7包括SEQ ID NO:7；以及包括跨膜α-螺旋1、α-螺旋2、α-螺旋3、α-螺旋4、α-螺旋5、α-螺旋6、α-螺旋7、α-螺旋8、α-螺旋9、α-螺旋10、α-螺旋11、α-螺旋12的多肽，并且跨膜α-螺旋10和跨膜α-螺旋11及它们之间的序列包括SEQ ID NO:8。

265.根据权利要求264所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组纤维糊精转运蛋白为纤维二糖转运蛋白。

266.根据权利要求265所述的宿主细胞，其特征在于，所述纤维二糖转运蛋白与SEQ IDNO:9(CDT-1)或SEQ ID NO:10(CDT-2)具有至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致性。

267.根据权利要求264-266中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组纤维糊精转运蛋白包括一个或更多个突变。

268.根据权利要求267所述的宿主细胞，其特征在于，所述一个或更多个突变为氨基酸替换。

269.根据权利要求264-268中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组纤维糊精转运蛋白在与SEQ ID NO:9(CDT-1)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置包括氨基酸替换，其中所述一个或更多个氨基酸替换是在选自如下位置：与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸170对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸174对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸194对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，及其组合。

270.根据权利要求264-268中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组纤维糊精转运蛋白在与SEQ ID NO:9(CDT-1)的氨基酸序列的位置对应的一个或更多个位置包括氨基酸替换，其中所述一个或更多个氨基酸替换选自：在与SEQ ID NO:9的氨基酸91对应的位置，甘氨酸(G)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸104对应的位置，谷氨酰胺(Q)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸170对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸174对应的位置，精氨酸(R)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸194对应的位置，谷氨酸(E)替换为丙氨酸(A)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸213对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为赖氨酸(L)；在与SEQ ID NO:9的氨基酸335对应的位置，苯丙氨酸(F)替换为丙氨酸(A)，及其组合。

271.根据权利要求235-270中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，具有β-葡萄糖苷酶活性的所述重组多肽包括选自

272.根据权利要求271所述的宿主细胞，其特征在于，具有β-葡萄糖苷酶活性的所述重组多肽包括与NCU00130的氨基酸序列至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%的氨基酸一致的氨基酸序列。

273.根据权利要求151-272中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括一种或更多种葡萄糖应答基因，其中，与该蛋白质的野生型激活水平相比，由至少一种葡萄糖应答基因编码的蛋白质的激活水平是变化的。

274.根据权利要求273所述的宿主细胞，其特征在于，所述一种或更多种葡萄糖应答基因选自Snf3、Rgt1、Rgt2、Yck1/2、Std1、Mth1、Snf1/4,Grr1、Gpr1、Gpa2、Ras2、Stb3、Hxk2、Pfk27、Pfk26、Sch9、Yak1、Mig1、Rim15、Kcs1和Tps1。

275.根据权利要求273或274所述的宿主细胞，其特征在于，由所述一种或更多种葡萄糖应答基因编码的一种或更多种蛋白的激活水平与其野生型激活水平相比，是提高的。

276.根据权利要求273或274所述的宿主细胞，其特征在于，由该一种或更多种葡萄糖应答基因编码的一种或更多种蛋白的激活水平所述与其野生型激活水平相比，是下降的。

277.根据权利要求151-276中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为真菌细胞。

278.根据权利要求151-277中的任何一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为酵母细胞。

279.根据权利要求278所述的宿主细胞，其特征在于，所述酵母细胞为酿酒酵母。