CN101528930B - 用于在梭菌属中进行染色体整合和dna序列替换的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种在梭菌属中替换和删除DNA序列的新方法，该方法效率高、易于实施并且适于工业水平应用。该方法可用于以常规方式修饰梭菌属中的数个基因位点。该方法是基于携带至少两个标志基因的复制型载体。

Description

用于在梭菌属中进行染色体整合和DNA序列替换的方法
发明背景
梭菌属(Clostridia)是革兰氏阳性、厌氧、低GC的细菌，由于它们产生溶剂，特别是丁醇、乙醇和丙酮、还有二醇如1，3-丙二醇、有机酸如乙酸、丁酸或乳酸，以及疫苗等的能力而在工业上得到了广泛使用。
重组梭菌属的构建是在本领域中开发的一个重要的部分。对梭菌属菌株进行基因修饰来改进它们的产业能力。
为了进行这些修饰，同源重组是在所有种类的生物中使用最多的技术。本领域中对于数种微生物中的转化和同源重组已经有了详尽的描述。参见例如(Datsenko和Wanner；PNAS，2000)及(Fabret等，Molecular Microbiology，2002)。
梭菌属并不是可天然转化的，现有可用于它们的转化的方法效率不高，而且不能导入多个突变。这一点已经阻碍了该领域的产业开发。
梭菌属通常产生胞外DNAse和限制酶，这些酶在外源DNA导入待转化细胞之前或之后会将其降解。基于PCR片段导入的经典方法在许多微生物如大肠杆菌或酵母中行之有效，但在这些生物中不实用，因为待重组的DNA构建体的胞内及胞外半衰期太短，而且重组效率一般不高。在其它生物中，人们利用了能在宿主中复制从而增加重组事件可能性的载体来应付这些难题。然而，在重组事件之后，必须去除掉携带上完整的靶DNA序列的载体。这个问题在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中通过使用可在非许可(non-permissive)温度下予以去除的温度敏感型复制子而得到了解决(Biswas等，J Bacteriol.，1993)。对于梭菌，目前没有具备这些性质的载体可供使用。因此，迄今为止，梭菌属中突变体的构建是非常费力的，而且往往不成功。
梭菌属中基因的失活在下列文献中有报道(见表1)。
表1
  菌株   基因型   参考文献
  丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)PJC4BK   buk-，MLSR   Green等，1996
  丙酮丁醇梭菌PJC4PTA   pta-，MLSR   Green等，1996
  丙酮丁醇梭菌PJC4AAD   aad-，MLSR   Green和Bennett，1996
  产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)SM101和F4969 Δcpe，CatP Sarker等，1999
  产气荚膜梭菌菌株13   ΔluxS   Ohtani等，2002
  丙酮丁醇梭菌SKO1   ΔspoA，MLSR   Harris等，2002
  产气荚膜梭菌A型   Δspo0A   Huang等，2004
  产气荚膜梭菌SM101   ccpA-，CatP   Varga等，2004
  丙酮丁醇梭菌ATCC 824 buk-   ΔSpoIIE，buk-，CatP   WO 2006/007530
迄今为止，梭菌属中的基因失活是通过用不能在靶菌株中复制的环状DNA转化来进行的。由于存在于梭菌属中的DNAse和DNA限制性内切核酸酶快速地降解导入的DNA，而且该属中的重组频率通常不是很高，因此突变体的获得是非常费力的。
此外，到目前已描述的重组菌株(见上文)都是对MLS或氯霉素有抗性的，而且在重组事件发生后不能去除相应的标志基因。这就将可能的重组次数限制在这些细菌中可用的抗性标志的数目，最大为3。此外，对于这些细菌的产业应用，不带标志的菌株可能是有用的，以避免将抗性素抗性基因释放到发酵培养基中。
此外，这些菌株中的一些通过单重组事件得到的菌株具有这样的缺点，即它们如果在没有任何选择压力下培养是不稳定的。
因此，当前技术仍然需要这样的梭菌属转化方法：其具有高效率，具有容易的重组菌株选择步骤，容许在同一菌株中进行连续的DNA序列替换，从而可获得遗传上稳定的、不含标志的重组梭菌属。
本发明涉及在梭菌属中替换或删除DNA序列的新方法，其容易实施并适于在产业水平应用。该方法可用来以常规方式对梭菌属中的数个基因位点进行修饰。
该方法是基于可用于高效转化梭菌属的复制型载体。
利用这种新方法，通过从基因组中去除抗性盒并将它们重新用于后续轮次的DNA序列替换中，可以将数目不限的突变导入基因组中。
向梭菌属中高效导入多个突变将使得工业界能够改善现有的工业用菌株并开发新的方法。
发明详述
本发明提供在梭菌属中通过同源重组替换靶DNA序列的方法，其包括：
-用载体转化所述菌株，所述载体包含：
-允许其在梭菌属中复制的复制起点，和
-替换盒，其包含第一标志基因，该标志基因被两个与靶DNA序列周围的选定区域同源的序列所包围，从而允许该盒的重组，和
-第二标志基因，
-选择已在其基因组中整合了所述盒，并且表达所述第一标志基因的菌株，
-选择已去除了所述载体的不表达所述第二标志基因的菌株。
用于实现本发明的所有分子生物学技术都在Sambrook、Fritsch和Maniatis所著的《Molecular cloning：a laboratory manual》，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989中有完整描述。
在本发明的语境中使用时，术语对靶DNA序列的“替换”意思是在靶DNA序列的基因座(locus)导入与原序列不同的序列。
根据本发明，DNA序列定义为基因或基因间序列。它们二者都可以包含启动子或调控序列。
表述“靶DNA序列”意思是本领域技术人员所选择的任何感兴趣的基因、基因间区域、启动子或调控序列。该表述特别意指编码感兴趣的蛋白质(例如涉及细胞代谢的酶)的基因。
被替换上/插入的DNA序列可以是编码的或者非编码的。它可以是靶基因的突变序列、启动子或调控序列、和/或标志如抗生素抗性基因或生色酶(color generating enzyme)。它可以长于或短于被替换下的序列，这依赖于两个同源区域之间相隔的距离。
作为插入的结果，靶基因的表达常常被干扰、部分或全部抑制、或者增加。用与原序列相近但包含突变的序列来替换靶DNA序列导致突变的蛋白、启动子或调控序列的实际表达。
如果靶DNA序列替换的结果导致所述DNA序列被完全去除，则将该基因作为被“删除的”。
表述“同源重组”是指DNA区段被另一具有相同区域(同源)或大体如此的DNA区段替代的事件。这样的事件也称为DNA交换(crossover)。
术语“转化”是指细胞纳入外源核酸，这种新基因的获取是暂时性的(如果携带基因的质粒被清除的话)或者永久性的(在外源DNA整合到染色体的情况下)。
术语“载体”是指一种携带基因或盒的染色体外元件(extra-chromosomalelement)，其通常是环状双链DNA分子的形式，但也可以是单链DNA分子。术语“载体”和“质粒”可以无区别地使用。
根据本发明的载体是复制型载体。其包含至少一个复制起点，优选数个复制起点，从而容许它在不同的物种中是有功能的。
特别地，优选的载体可包含两个复制起点：
-Ori，在大肠杆菌中有功能；
-来自在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)发表的pIM13的RepL，在梭菌属中有功能(Mermelstein等，Biotechnology，1992)。
表述“与靶DNA序列同源的序列”是指与靶序列中所选区域具有高序列相似性的序列。
术语“标志基因”是指梭菌属中有功能的调控元件的控制下编码标志蛋白的序列。这样的蛋白是本领域公知的。例如，本领域技术人员可使用抗生素抗性基因、荧光或有色标志、或营养缺陷型标志。有用的标志基因的实例将在下文给出。
发生同源重组事件之后，当前的质粒携带完整的靶DNA序列，因此必须予以去除。复制型载体的去除通常这样发生：连续培养克隆，然后负选择或正选择去除了该载体的克隆。载体的去除也可以是方法中的主动步骤(active step)，使用特异性地切割载体中存在的DNA序列的内切核酸酶。一旦清除了该载体，菌株不再表达第二标志基因，并可根据该特性加以选择。
在本发明的一个具体的实施方案中，第二标志基因是抗生素抗性基因。在有用的抗生素抗性基因中，本领域技术人员将知道哪种是最适合的。例如，可使用下列基因：CatP基因，其提供针对氯霉素和甲砜霉素的抗性，或MLSR基因，其提供针对红霉素的抗性。
在本发明的一个优选的实施方案中，第二抗性基因是可反选择的(counter-seletable)标志基因。
可反选择的标志是这样的基因，在特定环境下，如存在它的相关底物时，它的存在对宿主生物是致死的。可反选择的标志可用作针对质粒丧失的正选择。
优选的是，可反选择的标志基因是这样的基因，它可恢复缺失的或被删除的非必需内源基因的活性。
用得最多的可反选择的标志是赋予蔗糖、链霉素、或镰孢菌酸(fusaricacid)敏感性的基因。它们已被用来在数种细菌菌株中构建突变体或疫苗株。详情见Reyrat等，1998，Infection and Immunity中的综述。可在梭菌属中使用的可反选择的标志包括赋予对5-氟-尿嘧啶(5-FU)、γ-谷氨酰肼(GBS)或8-氮杂-2，6-二氨基嘌呤(8ADP)的敏感性的基因。
在一个优选的实施方案中，可反选择的标志是upp基因，其编码尿嘧啶磷酸核糖基转移酶，该酶促进5-氟-尿嘧啶(5-FU)转化成毒性产物。具有Upp活性的细胞不能在5-FU培养基上生长。
如果被转化的梭菌属是Δupp，并因此在去除载体之后、转化之前能够在含5-FU的培养基上生长，则使用这样的可反选择的标志是特别有用的。可以正向选择去除了所述载体的菌株。
在5-FU存在条件下可能在upp基因中产生的抑制突变体(suppressormutants)有时可导致关于质粒丧失的错误假定。在本发明的一个优选的实施方案中，所述载体还包含第三标志，优选是抗生素抗性基因，其容许再次选择对该抗生素敏感的菌株。可以在基于upp基因的正选择之外可使用这样的负选择。
在本发明的一个优选的实施方案中，通过在发生重组事件后用内切核酸酶消化来去除载体。优选地，载体包含这样的DNA序列，它们被限制性内切核酸酶所识别，同时不存在于所用的梭菌属物种的基因组中。这样，载体被特异性地破坏而无损于梭菌属基因组的完整性。
限制性内切核酸酶是这样的酶，它们能在特异性碱基序列的位置，即限制性内切核酸酶位点切割DNA分子。本领域的专家将能够确定哪些限制性内切核酸酶位点是感兴趣的梭菌属菌株的基因组中不存在的。可适用于丙酮丁醇梭菌的可能的限制性内切核酸酶有AscI、FseI、NotI、SfiI、SrfI。在另一个实施方案中，可以使用大范围核酸酶(meganucleases)，如I-SceI、HO或I-CreI，它们识别大的(12-45bp)DNA靶位点。
在本发明的一个优选的实施方案中，待转化的梭菌属菌株在其基因组上包含至少一个编码内切核酸酶的基因，所述核酸酶识别存在于所述载体上的限制性内切核酸酶位点。任选地，所述限制性内切核酸酶的表达处于诱导型启动子的控制之下。
诱导型启动子是这样的DNA元件，其允许通过添加相应的诱导物来有条件地表达靶序列。例如，Girbal等，2003，Appl.Env.Microbiol.69：4985-8中描述了本领域专家已知的梭菌属中的诱导型启动子系统。
在重组事件发生之后，筛选已去除载体的菌株之前，可以诱导所述限制性内切核酸酶的表达。所述限制性内切核酸酶将切割梭菌属中存在的载体，致使其被去除。
任选地，可以在将载体导入菌株之前，将限制性内切核酸酶编码基因插入到基因组上。
在本发明的另一个实施方案中，限制性内切核酸酶编码基因还可以通过增加细胞中线性DNA的量(已知线性DNA的重组好于环状DNA)来增加质粒去除之前的重组频率。
在本发明的一个特定的实施方案中，所述第一标志基因是被导入到替换盒中间的抗生素抗性基因。
在本发明的一个具体的实施方案中，该第一标志基因可以从被转化的梭菌属菌株的基因组上除去。特别地，该第一标志基因可以被两个重组酶靶位点所包围，并且在同源重组事件发生之后在重组酶的作用下被去除。
在本发明的一个有利的实施方案中，重组酶是由携带相应基因的第二载体所表达的，所述载体是通过转化导入所述梭菌属的。
优选地，重组酶靶位点是FRT序列。源自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的FLP重组酶对于一种特定的34碱基对DNA序列有活性，该序列称作FRT序列(代表“FLP重组酶靶标”)。当存在两个这样的FRT位点时，FLP酶在DNA链中产生双链缺口，将第一FRT的末端与第二靶序列的末端交换，然后将经过交换的链重新连接。该过程导致位于这两个位点之间的DNA被删除。
在实施本发明的一个特定的方式中，与靶DNA序列周围的所选区域同源的序列可在构成重组事件所用的DNA片段的多达10％的碱基对中包含突变。
在本发明的一个有利的实施方案中，待转化的梭菌属菌株被删除了编码限制性内切核酸酶的基因。这些菌株的优点在于可以容易地转化它们而无需任何事先的体内质粒甲基化。
在本发明的另一个有利的实施方案中，待转化的梭菌属菌株被删除了编码胞外DNAses的基因。
在本发明的另一个实施方案中，待转化的梭菌属菌株被删除了upp基因。
在本发明的另一个有利的实施方案中，待转化的梭菌属菌株选自下组：丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌(Clostridium bejeirinckii)、Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum、丁酸梭菌(Clostridium butylicum)、酪酸梭菌(Clostridium butyricum)、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、解糖梭菌(Clostridium saccharolyticum)(现称解糖嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum))、热产硫磺梭菌(Clostridiumthermosulfurogenes)(现称热产硫磺嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterthermosulfurigenes))、热硫化氢梭菌(Clostridium thermohydrosulfuricum)(现称乙醇嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus))。
优选的梭菌属菌株是丙酮丁醇梭菌。
在本发明的一个优选的实施方案中，待转化的丙酮丁醇梭菌菌株是菌株ΔCac15，其删除了编码限制性内切核酸酶Cac 824I的基因。该菌株具有这样的优点：它可容易地转化而无需任何事先的体内质粒甲基化。
在本发明的另一个优选的实施方案中，待转化的丙酮丁醇梭菌菌株是删除了其upp基因的菌株，称为Δupp。结果是，通过用携带upp基因的载体转化该菌株，可以选择对5-FU培养基敏感的菌株，然后正选择失去了该质粒的不再对5-FU培养基敏感的菌株。
待转化的丙酮丁醇梭菌菌株也可以是ΔCac15Δupp。
该方法可有利地用来在同一梭菌属菌株中通过同源重组来连续替换两个或更多个靶基因。
本发明还涉及易于通过本发明的方法获得的重组梭菌属菌株。有利的是，所述本发明的方法可以用来获得其中cac15基因被删除的重组梭菌属菌株(Δcac15菌株)、其中upp基因被删除的重组梭菌属菌株(Δupp菌株)、及其中cac15基因和upp基因都被删除的重组梭菌属菌株(Δcac15Δupp菌株)。
本发明还涉及用于转化所述菌株的载体，如上述的载体。
附图说明
图1：pUC18-FRT-MLS2载体的图。
图2：pCons2-1载体的图。
图3：pCIP2-1载体的图。
图4：pCons::UPP载体的图。
图5：pCLF1载体的图。
图6：用于梭菌属的删除方法的示意图。
连续地进行下列步骤：
A-扩增靶DNA序列周围的两个选定区域；1、2、3、4代表PCR引物；
B-将所得的PCR片段克隆到克隆载体pTOPO中
C-将标志插入PCR引物中存在的StuI限制性位点中
D-将替换盒克隆到pCONS 2.1的BamHI位点：
构建pREP clo Y载体
E-用pREP cloY载体转化梭菌属
F-在传代培养中通过双交换将替换盒整合到染色体中
G-筛选具有EryR和ThiamS表型的克隆
H-进行PCR分析以检验基因替换和质粒丧失。
或者
D’-将替换盒克隆到pCONS::UPP的BamHI位点：
构建pREP clo Y:UPP载体
E’-用pREP cloY:UPP载体转化梭菌Δupp
F’-在传代培养中通过双交换将替换盒整合到染色体中
G’-筛选具有EryR和5-FUR(ThiamS)表型的克隆
H’-进行PCR分析以检验基因替换和质粒丧失。
实施例
实施例1：载体的构建
1.1pUC18-FRT-MLS2的构建
这种质粒含有MLSr基因，该基因在梭菌属中有功能，其侧翼有两个FRT位点和两个StuI位点；该质粒可用于替换盒的构建。以pKD4作为模板质粒(Datsenko和Wanner，2000)，以寡核苷酸PKD4.1和PKD4.2作为引物，使用Pwo DNA聚合酶进行反向聚合酶链式反应(IPCR)来扩增带有FRT位点但不带有Kmr标志的质粒区域。然后将该平末端片段与用HindIII消化pETSPO质粒(Harris等，2002，J.Bacteriol)并经Klenow处理后得到的MLSr基因连接。然后将相应的质粒(pKD4-Ery1)用作模板，使用寡核苷酸FRT-MLSR-F和FRT-MLSR-R作为引物，利用Pwo DNA聚合酶进行PCR反应，以扩增侧翼具有两个FRT位点和两个StuI位点的MLSr基因。将该片段直接克隆到用SmaI消化的pUC18中以得到pUC18-FRT-MLS2质粒(图1)。
Pcr引物：
PKD4.1(SEQ ID N°1)：5’-ctggcgccctgagtgcttgcggcagcgtgagggg-3’
PKD4.2(SEQ ID N°2)：5’-agcccggggatctcatgctggagttcttcgccc-3’
FRT-MLSR-F(SEQ ID N°3)：5’-tacaggccttgagcgattgtgtaggctggagc-3’
FRT-MLSR-R(SEQ ID N°4)：5’-aacaggcctgggatgtaacgcactgagaagccc-3’
1.2pCons 2.1的构建
这种质粒含有在梭菌属中有功能的pIM13复制起点(滚环复制机制)，可赋予对于甲砜霉素抗性的catP基因，和一个独有的用于克隆替换盒的BamHI位点。在两步法中从pETSPO质粒(Harris等，2002，J.Bacteriol)构建这种质粒，以去除部分多接头以及一个BamHI位点和一个EcoRI位点等等。以pETSPO为模板，寡核苷酸PCONSAccI和PCONSEcoRI为引物，使用Pwo DNA聚合酶进行IPCR，并对PCR产物进行磷酸化和连接。转化大肠杆菌后，获得了pCons0质粒。然后将该质粒用BamHI消化以去除spo0A盒，纯化适当的DNA片段并进行连接而得到质粒pCons2-1。pCons2-1的图谱示于图2中。
PCR引物：
PCONSAccI(SEQ ID N°5)：5’-ccggggtaccgtcgacctgcagcc-3’
PCONSEcoRI(SEQ ID N°6)：5’-gaattccgcgagctcggtacccggc-3’
1.3pCIP 2-1载体的构建
在这项构建中，将pCons2-1的pIM13复制起点用pSOL1质粒(一种具有θ复制机制的质粒)的复制起点所替代。为此目的，使用丙酮丁醇梭菌的总DNA作为模板，以寡核苷酸ori-3-D和ori-4-R为引物，使用Pwo DNA聚合酶PCR扩增pSOL1的复制起点。将该PCR产物克隆到pCR-BluntII-TOPO中并将得到的质粒用EcoRI消化，纯化2.2kb片段。类似地，用EcoRI消化pCons2.1质粒，纯化2.4kb片段，并与含有pSOL1复制起点的2.2kb EcoRI片段连接，得到质粒pCIP2-1(图3)。
Pcr引物：
ORI-3-D(SEQ ID N°7)：5’-ccatcgatgggggtcatgcatcaatactatcccc-3’
ORI-4-R(SEQ ID N°8)：5’-gcttccctgttttaatacctttcgg-3’
1.4pCons::upp载体的构建
将upp基因与其自身的核糖体结合位点(rbs)一起克隆到pCons2.1中紧邻CatP基因下游的BcgI位点处，以构建upp在CatP启动子控制下表达的人工操纵子。以此方式，没有引入这样的同源区域，所述同源区域使得在使用upp基因作为质粒丧失的可反选择的标志的进一步的删除实验中，upp基因可能整合到Δcac15Δupp菌株的染色体中。
使用寡核苷酸REP-UPP F和REP-UPP R作为引物从丙酮丁醇梭菌基因组DNA PCR(Pfu)扩增upp基因及其rbs。将664bp的PCR产物用PvuII消化并克隆到用BcgI消化并用T4DNA聚合酶处理以钝化末端的pCons2.1中。以此方式获得了pCons::UPP(见图4)复制型载体。
PCR引物：
REP-UPP F(SEQ ID N°9)：5’-aaaacagctgggaggaatgaaataatgagtaaagttacac-3’
REP-UPP R(SEQ ID N°10)：5’-aaaacagctgttattttgtaccgaataatctatctccagc-3’
1.5pCLF1载体的构建
将编码FLP重组酶的酿酒酵母FLP1基因克隆到pCons2.1载体中，处于丙酮丁醇梭菌硫解酶(thl)基因的RBS和启动子的控制之下，以允许在这种生物中的高表达。
使用FLP1-D和FLP1-R寡核苷酸为引物，pCP20质粒(Datsenko和Wanner，2000)为模板PCR(Pfu)扩增FLP1基因。
PCR引物：
-FLP1-D(SEQ ID N°11)：
5’-aaaaggatccaaaaggagggattaaaatgccacaatttggtatattatgtaaaacaccacct-3’-FLP1-R(SEQ ID N°12)：
5’-aaatggcgccgcgtacttatatgcgtctatttatgtaggatgaaaggta-3’
FLP1-D具有5’延伸，该延伸包含一个BamHI位点和thl的RBS序列。
FLP1-R在PCR产物的3’引入了一个SfoI位点。
将PCR产物用BamHI和SfoI消化，并直接克隆到已用同样的酶消化的pSOS95表达载体中，得到pEX-FLP1(6281pb)质粒。
将pEX-FLP1的含FLP1表达盒的SalI片段(1585pb)克隆到pCONS2.1的SalI位点，得到pCLF1(4878pb)质粒(图5)。
实施例2：丙酮丁醇梭菌中编码cac824I限制酶的cac1502基因的删除
该方法的示意图见图6。
使用来自丙酮丁醇梭菌的总DNA作为模板，以特定的两对寡核苷酸为引物(见表2)，使用Pwo DNA聚合酶PCR扩增了围绕Cac824I编码基因(CAC1502)的两个DNA片段。使用引物对CAC 1B-CAC 2和CAC 3-CAC 4B分别获得了1493bp和999bp DNA片段。引物CAC 1B和CAC 4B都引入BamHI位点，而引物CAC 2和CAC 3具有引入StuI位点的互补5’延伸序列。用引物CAC 1B和CAC 4B在PCR融合实验中连接DNA片段CAC 1B-CAC2和CAC 3-CAC 4B，将所得的片段克隆到pCR4-TOPO-Blunt载体中得到pTOPO:cac15。在pTOPO:cac15的唯一的StuI位点导入pUC18-FRT-MLS2的1372bp StuI片段，该片段包含两侧均带有FRT序列的抗生素抗性MLSr基因。用BamHI消化所得质粒后，将获得的cac1502替换盒克隆到pCons2-1中的BamHI位点而产生pREPCAC15质粒，且克隆到pCIP2.1中而产生pCIPCAC15。
将pREPCAC15和pCIPCAC15质粒在体内甲基化，并用来通过电穿孔转化丙酮丁醇梭菌。在Petri(陪替氏)平板上选择对红霉素(40μg/ml)具有抗性的克隆后，将各个转化体的一个菌落在含40μg/ml红霉素的液体合成培养基中培养24小时，然后在不含抗生素的液体2YTG培养基中传代培养。将适合的稀释物在含40μg/ml红霉素的加强型梭菌属琼脂(reinforcedClostridium agar，RCA)上铺板。为了选择已丧失pREPCAC15或pCIPCAC15载体的整合体，将红霉素抗性克隆在含有40μg/ml红霉素的RCA和含50μg/ml甲砜霉素的RCA上影印平板。pREPCAC15转化体得到了数个具有期望表型的菌落，但pCIPCAC15转化体未得到这样的菌落。这一点表明在促进丙酮丁醇梭菌中的双交换方面，pCIPCAC15的θ复制机制不如滚环机制有利。通过PCR分析检验了对红霉素有抗性而对甲砜霉素敏感的克隆的基因型(使用位于CAC15替换盒外部的引物CAC 0及CAC 5，和位于cac1502内部的引物CAC D及CAC R)。
分离了已丧失pREPCAC15的Δcac15::mlsR菌株。
用pCLF1载体转化Δcac15::mlsR菌株，该载体表达来自酿酒酵母的编码Flp重组酶的FLP1基因。经过转化并在陪替氏平板上选择对于甲砜霉素(50μg/ml)的抗性后，将一个菌落用含50μg/ml甲砜霉素的合成液体培养基培养，并将合适的稀释物在含50μg/ml甲砜霉素的RCA上铺板。将甲砜霉素抗性克隆在含40μg/ml红霉素的RCA和含50μg/ml甲砜霉素的RCA上影印平板。用引物CAC 0和CAC 5B通过PCR分析检验了具有红霉素敏感性和甲砜霉素抗性的克隆的基因型。
将具有红霉素敏感性和甲砜霉素抗性的Δcac15菌株进行连续两轮24小时培养以释放(loose)pCLF1。根据其对红霉素和甲砜霉素二者的敏感性分离已丧失了pCLF1的Δcac15菌株。将该菌株称为丙酮丁醇梭菌MGCΔcac15。
表2
Figure G2006800560079D00121
实施例3：丙酮丁醇梭菌Δcac15中编码尿嘧啶磷酸核糖基转移酶的upp基因的删除
使用来自丙酮丁醇梭菌的总DNA作为模板，两对特定的寡核苷酸作为引物(见表3)，使用Pwo DNA聚合酶PCR扩增了upp(CAC2879)上游和下游的两个DNA片段。使用引物对UPP 1-UPP 2和UPP 3-UPP 4，分别得到了1103bp和1105bp DNA片段。引物UPP 1和UPP 4引入BamHI位点，而引物UPP 2和UPP 3具有引入StuI位点的5’延伸序列。使用引物UPP 1和UPP4在PCR融合实验中连接DNA片段UPP 1-UPP 2和UPP 3-UPP 4，并将所得片段克隆到pCR4-TOPO-Blunt中得到pTOPO:upp。在pTOPO:upp的唯一StuI位点处引入pUC18-FRT-MLS2的1372bp StuI片段，该片段包含两侧均带有FRT序列的抗生素抗性MLSr基因。用BamHI消化所得质粒后，将获得的upp替换盒克隆到pCons2-1中的BamHI位点而产生pREPUPP质粒。
使用质粒pREPUPP在不经事先体内甲基化的条件下通过电穿孔转化丙酮丁醇梭菌MGCΔcac15。在陪替氏平板上选择对红霉素(40μg/ml)具有抗性的克隆后，将一个菌落在含40μg/ml红霉素的液体合成培养基中培养24小时，然后在不含抗生素的液体2YTG培养基中传代培养。将适合的稀释物在含40μg/ml红霉素的RCA上铺板。为了选择已丧失pREPUPP载体的整合体，将红霉素抗性克隆在含有40μg/ml红霉素的RCA和含50μg/ml甲砜霉素的RCA上影印平板。通过PCR分析检验了对红霉素有抗性而对甲砜霉素敏感的克隆的基因型(使用位于UPP替换盒外部的引物UPP 0及UPP 5，和位于UPP内部的引物UPP D及UPP R)。分离了已丧失pREPUPP的Δcac15Δupp::mlsR菌株。如前文第一个实施例中所述确认了在先的cac1502删除。Δcac15Δupp::mlsR菌株对400μM 5-FU有抗性，而相比之下Δcac15菌株对50μM 5-FU有抗性。
用pCLF1载体转化Δcac15Δupp::mlsR菌株，该载体表达来自酿酒酵母的编码Flp重组酶的FLP1基因。经过转化并在陪替氏平板上选择对甲砜霉素(50μg/ml)的抗性后，将一个菌落用含50μg/ml甲砜霉素的合成液体培养基培养，并将适合的稀释物在含50μg/ml甲砜霉素的RCA上铺板。将甲砜霉素抗性克隆在含40μg/ml红霉素的RCA和含50μg/ml甲砜霉素的RCA上影印平板。用引物UPP 0和UPP 5通过PCR分析检验了具有红霉素敏感性和甲砜霉素抗性的克隆的基因型。将具有红霉素敏感性和甲砜霉素抗性的Δcac15Δupp菌株进行连续两轮24小时培养以释放pCLF1。通过确定其对红霉素和甲砜霉素二者的敏感性分离了已丧失了pCLF1的Δcac15Δupp菌株。
表3
Figure G2006800560079D00141
实施例4：利用upp和5-氟尿嘧啶作为质粒丧失的正选择的cac3535基因的删除
使用来自丙酮丁醇梭菌的总DNA作为模板和两对特定的寡核苷酸(见表4)，使用Pwo DNA聚合酶PCR扩增了cac3535基因(其编码丙酮丁醇梭菌的另一个限制性修饰系统)上游和下游的两个DNA片段。使用引物对RM1-RM 2和RM 3-RM 4，分别得到了1kbp和0.9kbp的DNA片段。引物RM 1和RM 4引入BamHI位点，而引物RM 2和RM 3具有引入StuI位点的互补5’-延伸序列。使用引物RM 1和RM 4在PCR融合实验中连接了DNA片段RM 1-RM 2和RM 3-RM 4，将所得片段克隆到pCR4-TOPO-Blunt载体中得到pTOPO:cac3535质粒。在pTOPO:cac3535的唯一StuI位点处引入pUC18-FRT-MLS2的1372bp StuI片段，该片段包含两侧均带有FRT序列的抗生素抗性MLSr基因。用BamHI消化所得质粒后，将获得的CAC3535替换盒克隆到pCons::upp中的BamHI位点而产生pREPCAC3535::upp质粒。
使用质粒pREPCAC3535::upp通过电穿孔转化丙酮丁醇梭菌MGCΔcac15Δupp菌株。在陪替氏平板上选择对红霉素(40μg/ml)具有抗性的克隆后，将一个菌落在含40μg/ml红霉素的液体合成培养基中培养24小时，并将100μl未稀释的培养物在含40μg/ml红霉素和400μM 5-FU的RCA上铺板。将对红霉素和5-FU二者有抗性的菌落在含40μg/ml红霉素的RCA和含50μg/ml甲砜霉素的RCA上影印平板，以验证5-FU抗性与甲砜霉素敏感性相关。通过PCR分析检验了对红霉素有抗性且对甲砜霉素敏感的克隆的基因型(使用位于cac3535替换盒外部的引物RM 0及RM 5，和位于cac3535基因内部的引物RM D及RM R)。以此方式，分离了已丧失pREPCAC3535::upp的Δcac15ΔuppΔcac35::mlsR菌株。
表4
Figure G2006800560079D00151
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cccccttttt aggcctcccc gtctttaaaa agtaatttat caaaggcatc aaggc                  55
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agcatctctc ttaatgattc tccgg                                                    25

Claims (18)

1.在丙酮丁醇梭菌中通过同源重组替换靶DNA序列的方法，其包括：
-用载体转化所述菌株，所述载体包含：
-允许其在丙酮丁醇梭菌中复制的复制起点，和
-替换盒，其包含抗生素抗性基因，该抗生素抗性基因被两个与靶DNA序列周围的选定区域相同的序列所包围，从而允许该盒的重组，和
-第二标志基因，
-选择已在其基因组中整合了所述盒的表达所述抗生素抗性基因的菌株，
-选择已去除了所述载体，并且不表达所述第二标志基因的菌株，
其中所述第二标志基因是upp基因，其为可反选择的标志基因，而且其中所述待转化的丙酮丁醇梭菌被删除了upp基因。
2.根据权利要求1的方法，其中所述载体包含第三标志，其允许负选择去除了所述载体的菌株，所述第三标志为抗生素抗性基因。
3.根据权利要求1的方法，其中在所述同源重组事件发生后，所述抗生素抗性基因通过重组酶的作用而被去除。
4.根据权利要求3的方法，其中所述重组酶是由导入到所述菌株中的第二载体所携带的基因表达的。
5.根据权利要求3或4中任一项的方法，其中所述重组酶靶位点是FRT序列，且所述重组酶是FLP重组酶。
6.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中待转化的丙酮丁醇梭菌被删除了限制性内切核酸酶编码基因和/或DNAse编码基因。
7.根据权利要求5的方法，其中待转化的丙酮丁醇梭菌被删除了限制性内切核酸酶编码基因和/或DNAse编码基因。
8.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述丙酮丁醇梭菌菌株删除了编码限制内切核酸酶Cac824I的基因cac15和/或删除了基因upp。
9.根据权利要求5的方法，其中所述丙酮丁醇梭菌菌株删除了编码限制内切核酸酶Cac824I的基因cac15和/或删除了基因upp。
10.根据权利要求6的方法，其中所述丙酮丁醇梭菌菌株删除了编码限制内切核酸酶Cac824I的基因cac15和/或删除了基因upp。
11.根据权利要求7的方法，其中所述丙酮丁醇梭菌菌株删除了编码限制内切核酸酶Cac824I的基因cac15和/或删除了基因upp。
12.在丙酮丁醇梭菌菌株中通过同源重组替换两个或更多个靶基因的方法，其中将根据权利要求1-11中任一项的方法连续进行两次或更多次。
13.可通过根据权利要求1-12中任一项的方法获得的重组丙酮丁醇梭菌菌株。
14.根据权利要求13的重组丙酮丁醇梭菌菌株，其中所述菌株删除了编码限制内切核酸酶Cac824I的基因cac15。
15.在丙酮丁醇梭菌中通过同源重组替换靶DNA序列的转化载体，其包含：
-允许其在丙酮丁醇梭菌中复制的复制起点，和
-替换盒，其包含抗生素抗性基因，该抗生素抗性基因被两个与靶DNA序列周围的选定区域同源的序列所包围，从而允许该盒的重组，和
-第二标志基因，
其中所述第二标志基因是upp基因，其为可反选择的标志基因，而且其中所述待转化的丙酮丁醇梭菌被删除了upp基因。
16.根据权利要求15的载体，其中所述载体包含第三标志，其允许负选择去除了所述载体的菌株，所述第三标志为抗生素抗性基因。
17.根据权利要求15或16中任一项的载体，其中所述抗生素抗性基因被两个重组酶靶位点所包围。
18.根据权利要求17的载体，其中所述重组酶靶位点是FRT序列，且所述重组酶是FLP重组酶。
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