CN101203608A

CN101203608A - 在噬菌体中产生重组基因

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Publication number: CN101203608A
Application number: CNA2005800297341A
Authority: CN
Inventors: 亚历山德罗·卢克; 海克·斯特罗贝尔; 简·T·马丁索恩; 玛丽-阿格尼斯·珀蒂; 米罗斯拉夫·雷德曼
Original assignee: Mixis France SA
Current assignee: Mixis France SA
Priority date: 2004-07-06
Filing date: 2005-07-06
Publication date: 2008-06-18
Also published as: WO2006003001A1; ZA200610406B; MX2007000037A; NZ551993A; KR20070029240A; AU2005259411A1; EP1763579A1; CA2573023A1; US20100055669A1; JP2008504832A

Abstract

本发明涉及在噬菌体或包含噬菌体序列的质粒中制备和检测重组DNA序列的体内方法，利用噬菌体和含有噬菌体序列的质粒制备杂合基因和由这些杂合基因编码的杂合蛋白的方法，可用于这些方法的噬菌体和质粒，包含合适的细菌宿主细胞和噬菌体或质粒的试剂盒。与这些方法相关的DNA序列包括蛋白质编码序列和非编码序列。

Description

在噬菌体中产生重组基因

本发明涉及在噬菌体或含噬菌体序列的质粒中产生和检测重组DNA序列的体内方法，利用噬菌体和含噬菌体序列的质粒产生杂合基因和由这些杂合基因编码的杂合蛋白的方法，可用于这些方法的噬菌体和质粒，以及包括合适的细菌宿主细胞和噬菌体或质粒的试剂盒。与这些方法相关的DNA序列包括蛋白质编码序列和非编码序列。

用于开发酶的新特性的传统诱变手段，如定点诱变、随机诱变和易错PCR有许多限制。这些手段只适用于已被克隆并进行功能鉴定，并且具有无关功能的基因或序列。还有，传统诱变手段只能探测数目非常有限的置换总数，即便是对于单个基因也是如此。然而，在某些情况下，不只修饰一个基因，而还要修饰其他的基因，以表达具有新特性的蛋白质可能是有必要的。这些其他的基因可以是例如互相协同而赋予单一表型的基因，或者是在一种或多种细胞机理如转录、翻译、翻译后修饰、分泌或基因产物的蛋白水解降解中起作用的基因。通过传统诱变手段分别优化具有这种功能的所有基因的努力实际上将会是不可能的任务。

另外，许多传统诱变手段都以遗传工程方法如限制酶切和连接的应用为基础。然而，所述限制酶切-连接手段有几种实践限制，即只有当可得到方便的限制性位点时DNA分子才能够精确组合，并且由于有用的限制性位点通常在长的DNA中重复，因而能够被操作的DNA片段的大小是有限制的，通常为小于约20kb。

大多数与传统诱变手段相关的问题都能够通过重组手段克服，所述重组手段必然伴随随机重组功能性基因的不同序列，使天然类似的或随机突变的基因能够进行分子混合。由于其试验简易性和不存在DNA-序列所施加的限制，重组提供改选DNA的替代方法。另外，使用重组手段获得表型改善的突变的概率明显高于应用传统诱变方法包括遗传工程技术获得突变的概率。

重组与DNA复制和修复紧密偶联。重组与DNA复制之间的这种紧密相互关系首先在噬菌体T4和相关的T-偶数噬菌体中发现。因为T4及其宿主埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)的DNA在碱基组成和修饰上有所不同，并且因为噬菌体感染后宿主DNA被快速降解，所以T4复制和重组的分子状态可以很容易地通过生物化学、生物物理学、和遗传学方法研究。大多数必须基因中突变的早期鉴定和复制与重组对噬菌体编码蛋白几乎完全的依赖性允许分析重组和复制蛋白，以及用遗传学和生化方法所获得的结果的“真实性检查(reality checks)”。

不考虑噬菌体中重组的详细特征，与其中存在许多引发重组的不同系统的单细胞生物如细菌或酵母相反，只有少数引发重组的基于噬菌体的系统是已知的，其可用于产生新的嵌合或杂合基因。然而，大多数基于噬菌体的这些系统都有几个缺点。特别是，大多数基于噬菌体的系统都不能容易有效地检测新重组的DNA序列。

因此，本领域仍然需要有效的噬菌体检测系统，该系统特别允许在选择压力下快速简单地检测重组体和/或选择重组体。

因此本发明根本的技术问题是提供在噬菌体系统中简单有效地产生重组嵌合基因的改进的方法和手段(means)，特别是筛选和检测这种重组序列的改进的方法和手段。

本发明通过提供在包含噬菌体和细菌宿主细胞的系统中制备并检测重组DNA序列的方法来解决该根本性技术问题，其中噬菌体包含侧翼有要重组的第一个和第二个DNA序列的启动子和位于第一个DNA序列下游的至少第一种标志基因，其中两个DNA序列之间的重组导致启动子以翻滚(flip-flop)方式翻转，并且，取决于启动子的方向，一个或另一个DNA序列和至少第一种标志基因能够被转录或不被转录，该方法包括步骤：

a)在选择性条件下孵育含噬菌体的第一种宿主细胞，在这样的条件下，只有启动子的方向使第一种标志基因的基因产物表达时，才允许细胞和/或噬菌体增殖，和

b)分离衍生于第一种宿主细胞的噬菌体后代，所述噬菌体后代生长和/或增殖于选择性条件下，并包含第一个和第二个重组DNA序列。

本发明提供基于噬菌体的系统，以在体内筛选至少两个有差别的(divergent)DNA序列或重组底物之间的重组事件。本发明的系统允许通过涉及来自两个重组底物的DNA体内交换的方法以快速有效的方式产生新的有益的DNA序列，所述DNA序列具有改善的特性，其中所述两个重组底物也就是以翻转的方向位于噬菌体上的要重组的两个有差别的DNA序列。在所述噬菌体上，这两个重组底物以给定构象位于启动子的侧翼。该启动子能够以翻滚方式(flip-flop)改变其方向。取决于启动子的方向，两个重组底物中的一个或另一个被转录，类似地，重组底物下游的标志基因也处于该转录控制之下。这些下游标志基因的表达可以在合适条件下检测和选择，因此允许选择特定的启动子方向。由于涉及两个重组底物的交换重组导致启动子翻转，因而可以在选择特定下游标志基因表达的条件下鉴定重组体。

在本发明的重组方法中，在选择第一种标志基因的基因产物存在的条件下孵育包含噬菌体的宿主细胞。所使用的选择性条件包括这些条件：如果第一种标志基因的基因产物被表达，则这些条件阻止宿主细胞的生长和/或增殖并因此还阻止噬菌体的增殖。这意味着只有第一种标志基因自存在于本发明载体上的启动子转录时宿主细胞的增殖和噬菌体的增殖才能发生，意味着所述启动子必须由于两个要重组的DNA序列之间的重组而翻转了它的方向，以使之能够引导第一种标志基因转录。因此，可以很容易地通过在选择性条件下孵育宿主细胞而追踪重组事件，所述选择性条件选择启动子的翻转并因此选择重组DNA序列的产生。

然而，本发明的方法具有可重复的优势，即其允许更多轮的重组。这些更多轮的重组以启动子的翻转为基础，启动子的翻转起因于涉及两个重组底物的交换重组。启动子在第二轮重组中的翻转有以下结果，即第一种标志基因不能再被转录。然而，启动子翻转使现在相对于第一种标志基因，位于启动子另一侧的其它标志基因可以被转录。因此，包含第一轮重组的产物即第一个和第二个重组DNA序列的噬菌体后代可以再次被导入适当的宿主细胞中，以引发第二轮重组。在本发明方法的一个实施方案中，包含第一轮重组中获得的噬菌体后代的宿主细胞在选择第一种标志基因的基因产物缺失的条件下孵育。在另一实施方案中，包含第一轮重组中获得的噬菌体后代的宿主细胞在选择第二种标志基因的基因产物存在的条件下孵育。以此方式，可以通过简单地改变选择性条件并选择启动子的交替翻转而进行多轮重组。

因此，本发明的方法提供鉴定重组DNA序列的简易快速的选择系统，其基于标志基因的交替表达，所述交替表达取决于启动子的方向。

根据本发明，开发了两种选择策略以在体内高效构建和检测嵌合基因。这些选择策略基于裂解性和温和性噬菌体的不同生活周期，允许检测裂解期期间的或作为细菌溶原菌的重组体。例如，在噬菌体发育的裂解期期间检测的例子中，所述选择以噬菌体本身的一个或多个基因，如λgam基因的表达或不表达为基础。在插入序列的一个方向上，自启动子的转录激活例如gam基因，其允许在E.coli recA菌苔上形成噬菌斑并阻止在E.coli P2溶原菌菌苔上形成噬菌斑。当启动子以反方向存在时，gam不转录则允许P2溶原菌上的裂解生长并阻止recA宿主上的生长。

然而，重组体也可以作为溶原菌，即在其染色体中含有前噬菌体形式的噬菌体基因组回收，而不是作为噬菌斑回收。在一个方向上启动子可以激活表达抗生素抗性标志的基因且在另一方向上其激活另一表达不同抗生素抗性标志的基因，而不是激活gam基因的转录。

利用本发明的两种不同选择策略，惊奇地发现噬菌体特别是噬菌体λ以10^-3至10^-6的频率有效地重组有差别的序列，该频率取决于差别的程度。对于利用λred和gam基因作为标志基因的重组来说尤其是这样，其中获得了10^-3的重组频率。如果使用错配修复缺陷型宿主细胞如E.coli ΔmutS突变体，则获得更高的频率。用本发明的方法获得的结果是令人惊讶的，因为迄今为止只知道噬菌体能够重组非常相似的，几乎相同的序列，如Kleckner和Ross(J.Mol.Biol.，144(1980)，215-221)所述。然而，关于噬菌体重组有差别的序列特别是差别非常大的序列的能力却一无所知。

因此，本发明产生和检测噬菌体中的重组DNA序列的方法的优势在于能够重组差异非常大的DNA序列。出人意料地，发现能够重组总体差异程度很高且只共享非常短片段的同源性或同一性的序列。重组序列的分析显示发生重组的同一性序列中只能够包含少许核苷酸，例如少于10个核苷酸。利用本发明的方法获得的重组底物的多样化显然是非常有效的。不能鉴定明显的重组热点。在42种“flip”重组体中只有三种鉴定了相同的重组产物，它们都是通过重组两个相同的有差别的序列即Oxa7和Oxa5获得的。

有利地，本发明的方法可以在野生型或错配修复缺陷型细菌宿主细胞中实施。修复破坏的DNA的方法与遗传重组的机理是紧密相关的，并且已知错配修复机构对有差别的序列之间重组即部分同源重组的频率有抑制性影响。因此错配修复系统的突变大大增强了细菌细胞中重组事件的总频率。根据本发明，发现如果将错配修复缺陷型细菌宿主细胞用于本发明的方法，则能够实质性地提高重组的频率。例如，E.coli ΔmutS突变体中重组的频率大约比相应野生型细胞中高十倍。另外，发现如果在错配修复缺陷型背景如在mutS背景中实施本发明的方法，除了产生新的嵌合基因之外，重组还伴随点突变的引入。

与所用底物序列在序列水平上观测到的多样化一起，利用本发明的方法获得的结果显示，可以利用本发明提供的噬菌体工具在定向进化试验中构建大型多样化基因文库。用本发明的方法可以很容易地制备大型的重组、突变DNA序列的文库，然后获得了所需功能的变体可以利用适当的选择或筛选系统鉴定。

另外，本发明噬菌体用于引发重组方法的用途具有DNA序列操作容易和能够在大型噬菌体群体中研究同步诱导的特定重组事件的明显优势。因此，利用噬菌体能够在短时间内实施多轮重组，产生许多新的重组DNA序列。

本发明在噬菌体中产生和检测重组DNA序列的方法的优选实施方案涉及第二轮重组，包括步骤：

a)将1b)中获得的噬菌体后代导入到第二种细菌宿主细胞中，

b)在选择性条件下孵育含噬菌体后代的第二种宿主细胞，在这样的条件下，只有启动子的方向使第一种标志基因的基因产物不表达，才允许细胞和/或噬菌体的增殖，和

c)分离衍生于第二种宿主细胞的噬菌体后代，所述噬菌体后代生长和/或增殖于选择性条件下，并包含第三个和第四个重组DNA序列。

在本发明方法的另一优选实施方案中，通过对第二轮重组中获得的噬菌体后代进行至少一次引发第一轮重组的另一步骤循环或引发第一和第二轮重组的另一步骤循环，产生更多的重组DNA序列。

根据本发明，通过将包含启动子侧翼的两个重组底物和第一种标志基因的噬菌体导入到合适的细菌细胞中而制备含噬菌体的第一和/或第二种细菌宿主细胞，从而允许噬菌体进入裂解或溶菌生活周期。在本发明的上下文中，“噬菌体”是具有活力特征和非活力特征的病毒，其只感染细菌。特别地，所述噬菌体由DNA组成。有两种主要的噬菌体类型，即裂解性噬菌体和温和噬菌体。在溶菌性生活周期中自始至终进行复制的裂解性噬菌体终止其感染并突破宿主细胞的外壳，即裂解宿主细菌，以将其后代释放到胞外环境中。温和噬菌体是能够显示溶原性感染的噬菌体。溶原性感染以包含噬菌体的宿主细菌既不产生噬菌体后代也不将噬菌体后代释放到胞外环境中为特征。相反，噬菌体的遗传物质插入或整合到宿主菌的DNA中。噬菌体的遗传物质与宿主细菌的DNA一起增殖。温和噬菌体典型地显示作为其营养期即非溶原期的裂解周期。根据本发明用于导入噬菌体的宿主细胞可以是不包含前噬菌体的细胞，或者是在其基因组中已含有前噬菌体的细胞，即溶原菌。在后一种情况中，优选前噬菌体和所导入的噬菌体共有一些同源序列，以使导入的噬菌体能够通过重组整合到宿主细胞的基因组中。

在本发明方法特别优选的实施方案中，所使用的噬菌体是噬菌体λ。λ噬菌体是温和噬菌体，其能够显示裂解性或溶原性感染。λ噬菌体有其自身的重组系统(red)。λcrosses中Red介导的重组的特征是断裂-与-接合(break-and-join)机制、非交互性DNA交换和占总基因组大约10％的长度的异源双链。然而，如果λ自身的重组基因是突变的，那么它能够通过宿主重组系统重组。在具有red^-gam^-噬菌体的crosses中，重组使用E.coli的recA和recBC基因。特征是断裂-与-接合机制，可能为DNA的交互性交换并且通常为重组的热点。

在本发明的另一实施方案中，包含噬菌体的第一种细菌宿主细胞通过将包含噬菌体序列的质粒、位于启动子侧翼的所要重组的两个DNA序列和至少第一种标志基因导入到溶原菌，即在其基因组中含有前噬菌体的细胞中而制备。前噬菌体优选包含与质粒中所包含的噬菌体序列同源的序列，使包含启动子和两个侧翼重组底物的质粒的至少一部分和第一种标志基因能够整合到宿主细胞的基因组中。在本发明的另一优选实施方案中，将来自这种质粒的线性序列导入到溶原菌中以制备第一种细菌宿主细胞。

在本发明方法的特别优选的实施方案中，所使用的质粒为质粒pMIX-LAM，它是质粒pACYC 184的衍生物，其包含pL+N启动子区和噬菌体λ的侧翼序列cI+rexa和cIII+IS10。另外pMIX-LAM还包含Cm^R基因。所述载体还包含多克隆位点MCS1和MCS2，其位于包含启动子的λpL+N片段的侧翼，用于插入外源DNA序列。在λ侧翼区域cI和cIII中用适当的限制酶剪切包含要重组的两个DNA序列的质粒DNA，产生包含重组底物的片段和能够被靶向到受体宿主溶原菌中的λ基因组的片段。

在本发明方法的又一特别优选的实施方案中，所使用的载体是质粒pAC-OX-OY，其来源于低拷贝数质粒并包含colE1复制起点。质粒pAC-OX-OY另外还包含位于两个重组底物侧翼的两个抗性标志Spec^R和Cm^R，和位于重组底物末端的靶向序列LG和LD。所述靶向序列促进整合至λ前噬菌体基因组中。包含重组底物的线性DNA片段通过限制酶切和纯化或者通过表达盒(cassette)的PCR扩增获得。

在本发明的上下文中，“启动子”为位于DNA序列如蛋白质编码序列上游的DNA区域，RNA-聚合酶能够结合该DNA区域。如果启动子处于正确的方向，那么位于下游的DNA序列的转录可以被启动。根据本发明，所述启动子的侧翼为所要重组的两个不相同的DNA序列，这两个DNA序列以翻转构型存在。这两个DNA序列之间的重组导致启动子的翻转。两个侧翼DNA序列之间的另一重组再次导致启动子翻转，如此所述启动子翻转回其原来的方向。因此，用于本发明的启动子受制于翻滚机制，通过翻滚机制，启动子方向在每轮重组中被翻转。在本发明方法的优选实施方案中，所述启动子为λ的pL启动子。在本发明方法的优选实施方案中，所述启动子为人工启动子Pro。

根据本发明，用于制备第一种细菌宿主细胞的噬菌体或质粒包含至少一种标志基因即第一种标志基因。在本发明的上下文中，术语“标志基因”指独特的编码蛋白质的DNA序列，其只存在于所使用的噬菌体或质粒上，而不存在于宿主细胞基因组的其他位置，并且位于噬菌体或质粒上两个重组底物中一个或两个已重组DNA序列中一个的下游和所使用的启动子的下游。在作为重组底物的相同DNA分子上或已重组的DNA序列上存在一个或多个标志基因，可使重组事件发生，从而可以识别和选择重组DNA序列，特别是用遗传学方法进行识别和选择。

根据本发明，第一种标志基因位于要重组的第一个DNA序列的下游，并且也位于启动子的下游。这种排列允许选择涉及两个重组底物即两个要重组的DNA序列的交换(crossovers)，因为第一个和第二个DNA序列之间的重组导致启动子翻转，由此，依据启动子的方向，第一种标志基因能够或不能够被转录。因此第一种标志基因基因产物的存在或缺失可用于选择重组事件。这种排列也允许重复实施更多轮重组。

在本发明的优选实施方案中，第一种标志基因选自λ基因、营养标志基因、抗生素抗性标志基因和编码酶亚基的序列。

“营养标志”是编码基因产物的标志基因，所述基因产物能够补偿生物或细胞的营养缺陷，并因此能够在该营养缺陷型生物或细胞上赋予其原养型。在本发明的上下文中，术语“营养缺陷型”意思是生物或细胞必须生长在含有不能由营养缺陷型生物本身合成的必需营养的培养基中。营养标志基因的基因产物促进营养缺陷型细胞中缺失的这种必需营养的合成。因此，营养标志基因表达时，无需向培养所述生物或细胞的培养基添加该必需营养，因为所述生物或细胞已获得原养型。

“抗生素抗性标志”是一种标志基因，其表达的基因产物赋予表达它的细胞在给定浓度的指定抗生素存在下生长的能力，而没有抗生素抗性标志的细胞不能生长。

如果细胞不能合成组装完整酶结构和获得完全酶活性所需的所有酶亚基，并且如果酶活性的存在或缺失能够通过遗传学手段监测，则“编码酶亚基的序列”可以用作标志基因。例如，如果酶活性是细胞的基本生化途径所需的，所述基本生化途径使细胞能够在特定环境中生长和/或增殖，并且所述细胞不能合成完整酶结构的所有组件，那么所述细胞不能在该环境中存活。因此，表达时，用作标志基因的“编码酶亚基的序列”允许完整酶的组装和细胞存活。

在本发明特别优选的实施方案中，第一种标志基因是λ的gam基因。gam基因连同redX(或exo)和redβ属于引发重组的三种λ基因。没有Gam，λ不能启动滚动复制循环，因为RecBCD降解被置换的DNA线性末端。在本发明的方法中，gam基因自启动子尤其是pL的转录允许在埃希氏大肠杆菌recA宿主细胞的菌苔上形成噬菌斑，并阻止在E.coli P2溶原性宿主细胞的菌苔上形成噬菌斑。相反，由于启动子尤其是pL方向翻转而使gam基因不转录，则允许在E.coli P2溶原性宿主细胞的菌苔上形成噬菌斑，并阻止在E.coli recA宿主细胞的菌苔上形成噬菌斑。

在本发明特别优选的实施方案中，第一种标志基因是Cm^R，其基因产物赋予细胞氯霉素抗性。因此，在本发明的方法中，Cm^R基因自启动子尤其是Pro一个方向的转录允许细菌宿主细胞在含氯霉素的培养基上生长，而Cm^R基因由于启动子尤其是Pro方向翻转而不转录则阻止细菌宿主细胞在含氯霉素的培养基上生长。

在本发明的另一优选实施方案中，一个以上的标志可以位于所用噬菌体或质粒上，由此导入其他标志以增加选择的严谨性。根据本发明，所用的噬菌体或质粒可以包含至少第二种标志基因，所述第二种标志基因位于所要重组的第二个DNA序列的下游，同时也位于启动子的下游。因此，第一种和第二种标志基因以翻转构象位于所用启动子的侧翼，由此，取决于启动子的方向，两个标志基因中只有一个能够自所述启动子转录。

优选第二种标志基因选自营养标志基因、抗生素抗性标志基因和编码酶亚基的序列。

在本发明特别优选的实施方案中，第二种标志基因是Spec^R，其优选与作为第一种标志基因的Cm^R基因组合。Spec^R基因自启动子尤其是Pro的转录允许细菌宿主细胞在含壮观霉素的培养基上生长，而Spec^R基因由于启动子尤其是Pro的方向翻转而不转录则阻止细菌宿主细胞在含壮观霉素的培养基上生长。

根据本发明，细菌细胞用作宿主细胞，用于导入包含要重组的两个DNA序列的噬菌体或质粒。术语“细菌细胞”和“细菌宿主细胞”包括任何细胞，在该细胞中基因组以环形结构自由地存在于细胞质内，即其中的基因组不由核膜包绕。所述宿主细胞可以已经含有前噬菌体。

在本发明的优选实施方案中，细菌宿主细胞是革兰氏阴性细菌尤其是E.coli、革兰氏阳性细菌或蓝细菌的细胞。

根据本发明，可以优选将具有功能性修复系统的细菌宿主细胞用于本发明的方法。错配修复(MMR)系统是避免突变的其中一个最大的贡献者，所述突变起因于复制中DNA聚合酶错误。然而，错配修复通过确保遗传重组的保真度也提升遗传稳定性。而在细菌中以及在酵母和哺乳动物细胞中，包含少量错配(＜1％)的部分同源DNA底物之间与相同序列之间相比，发生重组的效率要低得多，在MMR-缺陷型株系中重组(基因转换和/或交换)的频率显著升高。这意味着重组的高保真度不仅由重组酶的本质属性所引起，还由错配修复系统对重组的编辑所引起。因此错配修复机制对有差别的序列之间的重组有抑制效应。在E.coli中，甲基定向的MMR系统的两种蛋白质即MutS和MutL是这种强烈的抗重组活性所需的，而其它MMR系统蛋白质MutH和UvrD的影响较不显著。除了其在MMR和部分同源重组中的作用，MMR蛋白还在基因转换期间去除非同源DNA中扮演重要角色。

在本发明的另一优选实施方案中，使用错配修复系统缺陷的细菌细胞。在本发明的上下文中，术语“错配修复系统缺陷的”意思是细菌细胞的MMR系统是暂时或永久损坏的。细菌细胞的MMR缺陷可以通过暂时或永久损坏MMR系统的任何策略获得，所述策略包括但不限于突变和/或删除涉及MMR的一个或多个基因、用试剂如UV光处理，其导致MMR的整体损伤，用试剂如2-氨基嘌呤或包含过量错配的异源双链处理以暂时饱和和灭活MMR系统，以及涉及MMR的一个或多个基因的可诱导表达或抑制，例如通过可调节的启动子诱导表达或进行抑制，其允许发生短暂失活。

在本发明的优选实施方案中，细菌宿主细胞的错配修复缺陷起因于至少一个涉及MMR的基因的突变。在优选实施方案中，细菌细胞具有突变的mutS基因、突变的mutL基因、突变的mutH基因和/或突变的UvrD基因。

在本发明的上下文中，术语“要重组的DNA序列”和“重组底物”指能够通过重组过程发生重组的任意两个DNA序列。重组底物可以包括已经重组的DNA序列。重组底物之间的重组可以起因于同源或非同源重组。几种类型的同源重组事件以损坏的DNA链与同源伴侣的碱基配对为特征，其中相互作用范围可涉及数百个几乎完美配对的碱基对。术语“同源性”指存在于两个核酸分子序列之间的同一性程度。相反，不正常的或非同源的重组以不共有或者仅共有几个互补碱基对的DNA末端发生的接合为特征。

所要重组的第一个和第二个DNA序列是有差别的序列，即不相同但显示一定程度的同源性的序列。这意味着所要重组的DNA序列至少有一个核苷酸或至少有两个核苷酸的差异。在本发明的优选实施方案中，所要重组的第一个和第二个DNA序列的整体组成差异超过0,1％、超过5％、超过10％、超过20％、超过30％、超过40％或者超过50％。这意味着所要重组的第一个和第二个DNA序列差异也可以为55％、60％、65％甚至更高，优选所要重组的DNA序列为共有至少一个或多个同源区域的序列，所述同源区域可以非常短。所述同源区域可以具有约5-50个核苷酸的长度。

所要重组的重组底物或DNA序列可以具有天然或合成起源。因此，在本发明的优选实施方案中，所要重组的第一个和第二个DNA序列为天然发生的序列和/或人工序列。所要重组的天然发生的DNA序列可以衍生于任何天然来源，包括病毒、细菌、真菌、动物、植物和人。所要重组的人工或合成DNA序列可以用任何已知的方法制备。

在本发明的优选实施方案中，所要重组的DNA序列是编码蛋白质的序列，例如编码酶的序列，其可以用于天然和非天然化合物的工业产生。酶或借助于酶所产生的化合物可用于药物、化妆品、食品等的产生。蛋白质编码序列也可以是编码在人和动物健康领域具有治疗应用的蛋白质的序列。医学上重要的蛋白质的重要类别包括细胞因子和生长因子。蛋白质编码序列的重组允许产生新的突变序列，所述突变序列编码具有改变的，优选改进的功能和/或新获得的功能的蛋白质。以此方式，例如有可能提高蛋白质的热稳定性、改变蛋白质的底物特异性、提高其活性、演变出新的催化部位和/或融合来自两种不同酶的结构域。所要重组的编码蛋白质的DNA序列可以包括来自不同物种的序列，所述序列编码相同或相似的蛋白质，所述蛋白质在其正常环境中具有相似的或相同的功能。所要重组的编码蛋白质的DNA序列可以包括来自相同蛋白质或酶家族的序列。所要重组的编码蛋白质的序列也可以是编码具有不同功能的蛋白质的序列，例如编码酶的序列，所述酶催化给定代谢途径的不同步骤。在本发明的优选实施方案中，所要重组的第一个和第二个DNA序列选自beta-内酰胺酶Oxa超家族的基因序列。

在本发明的另一优选实施方案，所要重组的DNA序列是非编码序列，例如在其正常的细胞环境中涉及蛋白质编码序列的表达调节的序列。非编码序列的例子包括但不限于启动子序列、包含核糖体结合位点的序列、内含子序列、多聚腺苷酸化序列等。通过重组这样的非编码序列，有可能衍变出突变的序列，其在细胞环境中导致对细胞学进程的调节发生改变，例如基因表达的改变。所要重组的非编码DNA序列可以包括来自不同物种的序列，例如在其正常环境中具有相似的或相同的调节功能的序列。

当然，根据本发明，所要重组的重组底物或DNA序列可以包含一个以上的蛋白质编码序列和/或一个以上的非编码序列。例如，重组底物可以包含一个蛋白质编码序列和一个非编码序列，或者包含不同蛋白质编码序列和不同非编码序列的组合。因此，在本发明的另一实施方案中，所要重组的DNA序列可以由具有插入的和/或侧翼的非编码序列的一个或多个编码序列组成。这意味着所要重组的DNA序列可以是例如在其5’-末端和/或3’-非翻译区域具有调节序列的基因序列或者是具有外显子/内含子结构的哺乳动物基因序列。在本发明的又一实施方案中，所要重组的DNA序列可以由更大的连续序列所组成，所述连续序列包含超过一个具有插入的非编码序列的编码序列，例如可能属于生物合成途径或操纵子的那些。所要重组的DNA序列可以是已经历一个或多个重组事件，例如同源和/或非同源重组事件的序列。

重组底物可以包含非突变的野生型DNA序列和/或突变的DNA序列。因此在优选实施方案中，有可能重组已存在突变序列的野生型序列以衍变出新的突变序列。

在本发明方法的优选实施方案中，包含侧翼有两个重组底物的启动子的噬菌体或质粒通过用遗传工程方法将片段插入到各自的载体中制备，所述片段各包含两个重组底物的其中一个。各包含一个重组底物的这些片段可以例如用一种或两种合适的限制酶剪切DNA分子，例如剪切包含要重组的两个DNA序列中一个的质粒获得。由此获得包含各个要重组的DNA序列的片段，所述DNA序列的侧翼为末端如平端或突出端，所述末端使所述片段可以以所需方向插入到事先用一种或两种限制酶剪切过且具有相同末端的噬菌体或质粒中。也可以通过PCR扩增获得要插入的片段，然后PCR产物也可以用限制酶剪切。

在本发明方法的另一优选实施方案中，包含侧翼有两个重组底物的启动子的噬菌体或质粒通过包含各重组底物的片段的同源重组而制备。在这种情况下，所要重组的片段的侧翼具有与噬菌体或质粒的序列同源的序列，使所述片段能够同源重组到载体中启动子的左侧和右侧。

包含两个重组底物的噬菌体或质粒导入到宿主细胞，并在选择性条件下孵育含各载体的宿主细胞后，分离包含重组DNA序列的噬菌体后代，所述选择性条件为：仅仅当启动子处于使标志基因的基因产物表达的方向时，允许细胞和/或噬菌体增殖。根据是否选择哪种选择策略，即检测在裂解期期间的重组体或作为溶原菌的重组体，而从噬菌斑或者从溶原菌分离包含重组DNA序列的噬菌体后代。

噬菌体后代分离后，可以分离和/或分析第一种细菌宿主细胞的噬菌体后代中包含的第一个和第二个重组DNA序列和/或第二种细菌宿主细胞的噬菌体后代中包含的第三个和第四个重组序列。例如，可以通过PCR扩增和/或限制酶裂解分离重组DNA序列。如果所述重组DNA序列编码蛋白质，那么可以对分离的重组DNA序列测序和/或将其插入在表达载体中，处于一个或多个合适的调节单元的功能性控制下，以在合适的宿主细胞中产生基因产物。如果重组DNA序列包含具有调节功能的非编码序列，可以对分离的重组DNA序列测序和/或将其插入在包含报道基因的表达载体中，以研究它们对该报道基因表达的调节效应。

因此，本发明还涉及在包含噬菌体和细菌宿主细胞的系统中产生杂合或嵌合基因的方法，其中实施产生和检测重组DNA序列的本发明的方法，并从包含于细菌细胞的噬菌体后代或者从包含于细菌细胞菌苔上的噬菌斑中的噬菌体后代选择和/或分离如此获得的杂合或嵌合基因。根据本发明的方法，分析分离的杂合基因和/或将其插入到表达载体中，处于至少一个调节单元的功能性控制下。

本发明还涉及可以通过产生和检测重组DNA序列的本发明的方法和/或产生杂合或嵌合基因的本发明的方法获得的杂合基因。

本发明还涉及在包含噬菌体和细菌宿主细胞的系统中产生由杂合基因编码的杂合蛋白质的方法，其中实施用于产生和检测重组DNA序列的本发明的方法和/或用于产生杂合基因的本发明的方法使杂合基因形成，并且其中由杂合基因所编码的杂合蛋白表达后从细菌细胞或者细菌细胞菌苔上噬菌斑中选出和/或分离出。因此在本发明的一个实施方案中，如果选择裂解选择策略，则由杂合基因编码的杂合蛋白可以在噬菌斑中选择和/或可以由其分离。如果所述选择策略基于溶原菌，则杂合蛋白可以在溶原菌中选择和/或由其分离。在本发明方法的另一实施方案中，通过分离编码杂合蛋白的杂合基因，将该基因插入到表达载体中处于至少一个调节单元的功能性控制下，并且将所述表达载体导入合适的宿主细胞中而选择和/或分离杂合蛋白。然后，在允许杂合蛋白表达的条件下培养包含所述表达载体的宿主细胞。接下来可以在合适的条件下表达、选择、分离和/或分析杂合蛋白。

本发明还涉及蛋白质，所述蛋白质由杂合基因编码，并且能够通过产生杂合蛋白的本发明的方法获得。

另外，本发明还涉及噬菌体λ构建体，其包含启动子Pro，Spec^R标志和Cm^R标志位于启动子Pro的侧翼，其中启动子和Spec^R标志之间至少排列有用于插入第一个外源DNA序列的第一个和第二个限制性位点，并且在启动子和Cm^R之间至少排列有用于插入第二个外源DNA序列的第三个和第四个限制性位点。

另外，本发明还涉及质粒pMIX-LAM，它是质粒pACYC184的衍生物，包含pL+N启动子区和噬菌体λ的侧翼序列cI+rexa和cIII+IS10。另外pMIX-Lam还包含Cm^R基因。所述载体还包含多克隆位点MCS1和MCS2，其位于包含启动子的λpL+N片段的侧翼，用于插入外源DNA序列。在λ侧翼区域cI和cIII中用适当的限制酶剪切包含要重组的两个DNA序列的质粒DNA，产生包含重组底物且能够被靶向到受体宿主溶原菌中的λ基因组的片段。

本发明还涉及质粒pAC-OX-OY，其来源于低拷贝数质粒并包含colE1复制起点。质粒pAC-OX-OY包含位于两个重组底物侧翼的两个抗性标志Spec^R和Cm^R，位于重组底物末端的靶向序列LG和LD。所述靶向序列促进向λ前噬菌体基因组中整合。包含重组底物的线性DNA片段通过限制酶切和纯化或者通过盒子(cassette)的PCR扩增获得。

本发明还涉及可用于实施本发明的方法的试剂盒。根据本发明的优选实施方案，所述试剂盒有至少三个容器，第一个容器容纳含启动子pL和gam基因的噬菌体λ的DNA或者包含该噬菌体的E.coli recA^-菌株细胞，第二个容器容纳E.coli recA^-菌株细胞，第三个容器容纳E.coli P2溶原性菌株细胞。

本发明的另一实施方案涉及试剂盒，所述试剂盒有至少三个容器，第一个容器容纳质粒pMIX-LAM的DNA或容纳含有质粒pMIX-LAM的E.colirecA^-菌株细胞，第二个容器容纳E.coli recA^-菌株细胞，第三个容器容纳E.coli P2溶原性菌株细胞。

本发明的又一实施方案涉及试剂盒，所述试剂盒有至少两个容器，第一个容器容纳含启动子Pro及其侧翼的Spec^R标志和Cm^R标志的噬菌体λ的DNA或者包含该噬菌体的E.coli菌株细胞，第二个容器容纳E.coli菌株细胞。

本发明的另一实施方案涉及试剂盒，所述试剂盒有至少两个容器，第一个容器容纳质粒pAC-OX-OY的DNA或含有质粒pAC-OX-OY的E.coli菌株细胞，第二个容器容纳E.coli菌株细胞

根据本发明，包含于所述试剂盒中的E.coli菌株的细胞是mutS^-。

本发明还涉及质粒pMIX-LAM、质粒pAC-OX-OY、包含启动子pL和gam基因的噬菌体λ或者包含侧翼为Spec^R标志和Cm^R标志的启动子Pro的噬菌体λ在产生和/或检测重组DNA序列的本发明的方法中、在产生杂合基因的本发明的方法中、或者在产生杂合蛋白的本发明的方法中的用途。

通过以下附图和实施例阐述本发明。

图1显示裂解选择策略的原理。重组底物(Oxa7-Oxa11或Oxa7-Oxa5基因对)以翻转方向克隆在pL启动子侧翼。λgam基因位于导入的Oxa7序列的下游。其中pL右向转录的噬菌体为gam-，其能够在P2溶原菌上裂解性增殖但不能在E.coli recA-细胞上裂解性增殖。其中pL左向转录的噬菌体为gam+，其能够在E.coli recA-细胞上裂解性增殖但不能在P2溶原菌上裂解性增殖。涉及所插入的重组底物的交换通过pL的翻转完成，因此可以在合适的宿主上选择重组体。该策略是可重复的，因为可以实施多轮重组。

图2显示溶原性选择策略的原理。重组底物(所显示的是Oxa7-Oxa11基因对)以翻转的方向克隆在Pro启动子侧翼。赋予抗生素抗性(此处为氯霉素和壮观霉素)的基因位于Oxa序列的下游。其中Pro右向转录的溶原菌可以在含壮观霉素的培养基上选择，其中Pro左向转录的溶原菌可以在含氯霉素的培养基上选择。涉及所插入的重组底物的交换通过Pro的翻转完成，并且可以在涂布于适当抗生素上的溶原菌中选择。该策略是可重复的，因为可以实施多轮重组。

图3显示用于裂解选择策略的载体pMAP188。将重组底物(OxaX和OxaY)导入到含启动子的λpL+N片段侧翼的位点中。所得质粒DNA用酶消化，所述酶在λ侧翼区域cI和cIII中剪切以产生包含改组盒的片段，可以将其定向到受体宿主溶原菌的λ基因组。

图4显示由裂解选择策略获得的λgt11oxa7-5“flip”重组体对的示意性比对。a)在野生型背景中获得的重组体。b)在mutS背景中获得的重组体。Oxa7序列，灰色；Oxa5序列，黑色。条带上所示点突变区域表示Oxa7和Oxa5之间相同序列的间距。

图5显示用于裂解选择策略的载体pMIX-LAM。将所要改组的基因插入到多克隆位点MCS1和MCS2中，MCS1和MCS2位于包含启动子的λpL+N片段的侧翼。所得质粒DNA用酶消化，所述酶在λ侧翼区域cI和cIII中剪切以产生包含改组盒的片段，可以将其定向到受体宿主溶原菌的λ基因组。

图6显示包含两个重组底物(OxaX和OxaY)的载体pAC-OX-OY的一般性示意图，该载体用于溶原菌选择策略。该质粒源于具有colE1复制起点的低拷贝数质粒。两个抗性标志(此处为壮观霉素和氯霉素)位于所要改组的基因的侧翼。促进向λ前噬菌体基因组特异性整合的靶向序列(LG和LD)位于改组盒的末端。包含改组盒的线性DNA片段通过限制酶切和纯化或者通过改组盒的PCR扩增获得。

图7显示通过溶原性选择策略获得的重组体Oxa7-Oxa11和Oxa7-Oxa5基因对的序列分析结果。(在两个例子中，ORF最末端的序列信息丢失)。

实施例

一般策略

为了在体内高效构建嵌合基因，开发了两种选择策略。两种系统都利用了使两个重组底物位于启动子侧翼并采取翻转构型的构建体。取决于启动子的方向，两个重组底物中的一个或另一个被转录，类似地，这些底物下游的基因也处于该转录控制之下。这些下游基因的表达可以在合适条件下检测和选择，因此允许选择特定的启动子方向。由于涉及两个重组底物的交换重组导致启动子翻转，因而可以在选择特定下游基因表达的条件下鉴定重组体。

a)裂解选择策略

基于裂解选择策略的系统允许在裂解期期间检测重组体。如图1所示克隆有差别的序列。选择是基于λgam基因的表达或不表达。在插入序列的一个方向上，自λ启动子pL的转录激活gam基因，其允许在E.coli recA-菌苔上形成噬菌斑并阻止在E.coli P2溶原菌菌苔上形成噬菌斑。当pL以相反方向存在时，gam不转录，从而允许P2溶原菌上的裂解生长并阻止recA-宿主上的生长。

b)溶原性选择策略

在该系统中，回收重组体作为溶原菌-在它们的染色体中含有λ基因组的细胞-而不是作为噬菌斑。代替gam基因的激活转录，在一个方向，人工启动子Pro激活表达抗生素抗性标志的基因(此处为壮观霉素)，而在另一个方向其激活另一个表达抗生素抗性的基因(此处为氯霉素；参见图2)。

检测了两个基于λ的策略在野生型和MMR缺陷型E.coli菌株中重组成对的有差别的序列的能力。挑选编码beta-内酰胺酶Oxa7、Oxa11和Oxa5的三个部分同源基因作为重组底物以检测这两种系统。Oxa11和Oxa7核苷酸序列差别程度为4.5％，Oxa5和Oxa7序列差别程度为22％。在两个例子中，在质粒中构建由位于可翻转的启动子侧翼的两个重组底物组成的重组盒，然后转化到合适的宿主溶原菌中，以构建包含这些盒的起始溶原菌。将这些溶原菌置于启动λ裂解周期的条件下，导致噬菌体的释放，在所述噬菌体中已发生了滚环介导的重组。按照特异于各系统的方法选择重组序列并通过测序鉴定。利用拥有重组盒的噬菌体显示该系统可重复属性以启动新一轮的重组，其中所述重组盒具有嵌合序列。

生物JM105 2Xlambda6T11 pMIX-LAM于2005年6月20日由MIXISFrance S.A.，Paris保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany(DSMZ)：DSM 17434。生物JM105 pACOX-OY(AA)于2005年6月20日由MIXIS France S.A.，Paris保藏于DSMZ：DSM 17435。

方法与材料

所用菌株

所使用的E.coli菌株列于表1。

表1.E.coli菌株

菌株	基因型	参考文献或来源
菌株	基因型	参考文献或来源	AB1157	thr1 leu6 proA2 his4，thil argE3 lacY1 galK2aral4 xyl15 mtl1 tsx33str31 supE44thr⁺	ATCC
AB1157 CI854	AB1157+前噬菌体λCI854	MIXIS菌种保藏中心	AB1157		ATCC
AB1157 CI854	AB1157+前噬菌体λCI854	MIXIS菌种保藏中心	C600	thi-1thr-1 leuB6lacY1 tonA21 supE44	DSMZ
C600hfT(^*)	C600+hflA150(chrr::Tn10)	DSMZ	C600	thi-1thr-1 leuB6lacY1 tonA21 supE44	DSMZ
C600hfT(^*)	C600+hflA150(chrr::Tn10)	DSMZ	C600recA(^*)	C600+recA^-	M.Radman
NK5196(P2)(^*)	QI supII TI-lac^-	N.Kleckner	C600recA(^*)	C600+recA^-	M.Radman
NK5196(P2)(^*)	QI supII TI-lac^-	N.Kleckner	JM105	endA1 thi rpdLsbcB15 hsdR4Δ(lac-pro-AB)(F’traD36proAB lacIqZΔM15)	ATCC
JM105(gt11X2)	JM105+2前噬菌体λGT11	M.Radman	JM105		ATCC

(^*)这些菌株的mutS衍生物通过转导制备

将重组盒导入λ溶原菌和产生原始噬菌体原种(stock)

对于两种选择策略，均用合适的限制酶消化含重组盒的质粒，以产生线性DNA片段，线性DNA片段的侧翼为与目标λ前噬菌体同源的序列。使E.coli AB1157:λCI854::pKD46细胞成为感受态的，并用纯化的线性DNA转化。诱导感受态之前，用L-阿拉伯糖处理细胞，L-阿拉伯糖促进pKD46上编码的red-gam复合体的转录。该复合体介导改组盒通过同源重组整合到前噬菌体基因组(Kirill A.et al，PNAS 2000，97，6640-6645)。在合适的抗生素存在下于30℃选择含有整合的改组盒的溶原菌。为产生噬菌体原种，溶原菌于许可温度下在液体培养基中培养，直至OD＝0.2。将培养物转移到42℃10min，然后转移到37℃，直至裂解完成。离心后，将氯仿(1/500)添加到上清，所得噬菌体原种存储于4℃。

用裂解选择策略选择重组体

野生型和mutS P2溶原菌(NK5196[P2]衍生物)用原始噬菌体原种感染，并涂布在富含营养的培养基上以获得噬菌斑。为选择第一轮重组体(“flip”)，从这些噬菌斑制备噬菌体，并用于感染C600recA细胞和NK5196(P2)溶原菌。为选择第二轮重组体(“flop”)，从recA宿主上长出的噬菌斑制备噬菌体，并用于再感染C600recA细胞和NK5196(P2)溶原菌。用各宿主上形成噬菌斑的相对频率测定重组频率。

用溶原性选择策略选择重组体

用原始噬菌体原种感染C600hfl和C600hfl mutS细胞，并在壮观霉素上涂布以获得抗性溶原菌。对于第一轮重组体选择，诱导溶原菌以使之裂解，制备噬菌体原种并用于感染C600hfl细胞。在氯霉素或壮观霉素上选择溶原菌。

改组序列的分子分析

对于两种选择策略，均用特异性引物对PCR扩增第一轮和第二轮重组体分子并用标准方法测序。

结果

利用裂解选择策略在λ中重组-实施例I

构建了包含改组盒的质粒，所述改组盒具有Oxa7-Oxa7、Oxa7-Oxa11和Oxa7-Oxa5重组底物。图3显示包含两个不同Oxa底物的质粒pMAP188的结构。从质粒切出改组盒并导入到宿主溶原菌中，然后将其用于产生原始噬菌体原种。包含两种不同λ衍生物λgt11(Young，RA and Davis，RW，1983PNAS 80：1194-1198)和λcl857(Hendrix，RW et al.(eds)in Lambda II，1983，CSH)的溶原菌用作重组研究的宿主。表2显示两种λ衍生物均可用于制备重组体，取决于Oxa差别程度和λ宿主，mutS背景中频率通常比野生型背景中高十倍。

表2.用λgt11和λcI857宿主在野生型和mutS背景中获得的“flip”重组频率。以(活菌数gam⁺)/(活菌数gam⁺+活菌数gam^-)计算重组频率，表示为三个独立试验的平均值±标准偏差。^*用更敏感的方案测定Oxa7-Oxa11基因对的重组频率的试验结果。

在“flip”和“flop”重组循环后分离出四十六个重组Oxa对并测序(22个Oxa7-Oxa11；24个Oxa7-Oxa5)。图4示意性显示重组Oxa基因的例子，是于第一轮重组后在λgt11宿主中由Oxa7-Oxa5底物对获得的。重组底物的多样化是有效的。没有鉴定出明显的重组热点：42个分离的“flip”重组体(所有的Oxa7-Oxa5重组体)中，只在三例中回收了相同的重组产物。非常短的序列同一性间距足以允许重组(参见例如图4b oxa 7-5no.1)。在mutS背景中，重组还伴随点突变的引入。正如所期望的，第二个重组循环(“flop”)导致底物基因多样化增加。

这些结果显示λ噬菌体系统能够有效地重组有差别的序列。在所用条件下总的重组频率高得令人吃惊。λred和gam基因的重组尤其是这样，其频率达到10^-3(参见表3)。

表3.野生型和mutS背景中用λgt11和λcI857获得的“flop”重组频率。Oxa7-11和Oxa7-5底物对用具有不同长度的相同序列片段的两个“flip”重组产物构建。bp：碱基对；sz：相同序列的大小；n.d.：未测定。

这些结果与在序列水平上观测的底物基因多样化一起，表明λ工具能够用于在定向进化试验中构建多样化基因的大型文库。

利用裂解选择策略在λ中重组-实施例II

由于载体pMAP188(参见图3)较大，显示对宿主细菌有毒性，并且不具有用于进一步克隆的合适的限制性位点，因而构建了新的质粒pMlX-LAM(参见图5)。将两个关键特征掺入到该构建体中：1)新的载体包含几簇λ序列，包括可翻转的启动子和编码基本λ功能的基因，并且还允许改组盒靶向到前噬菌体基因组；和2)所述载体提供容易亚克隆的独特位点，这些位点能够交换其它多克隆位点以方便更多复合基因或基因簇的导入。pMIX-LAM是pACYC184衍生物，包括可翻转的λpL启动子区域及其侧翼存在的多克隆位点，是以pMAP188作模板扩增而获得的产物。它还包括cI和cIII侧翼序列，是从pMAP188分离的限制性片段。

利用溶原菌选择策略在λ中重组

在这个方法中，重组体的鉴别取决于个体细胞(含改组盒的溶原菌)的选择，所述细胞中位于两个重组底物之间的人工启动子转换方向，允许重组底物下游的两个抗生素抗性标志的其中一个或另一个表达。图6描述载体的基本特征，所述载体具有要重组的包含改组盒的基因。

构建了包含Oxa7-Oxa7、Oxa7-Oxa11和Oxa7-Oxa5重组底物的改组盒。改组盒整合到受体溶原菌中后，通过诱导裂解获得噬菌体原种。用噬菌体原种感染野生型和MMR缺陷型E.coli改组菌株。这些菌株还具有hflB突变，其促进更高的溶原菌产率(Herman，C.et al.1993.PNAS.90：10861-10865)。然后在含合适抗生素的平板上通过选择回收新的溶原菌。从在氯霉素上选出的溶原菌回收重组的Oxa7-Oxa11和Oxa7-Oxa5基因对并测序。

氯霉素抗性克隆的序列显示它们都是重组体，具有不同程度的嵌合(参见图7)。所有测序的ORFs都是全长的并可能编码功能性蛋白。在从MMR缺陷型背景(mutS-)获得的四个重组体序列中观测点突变。值得注意的是分离了包括有较大差别的基因(Oxa7-Oxa5，22％差别程度)的重组体。

Claims

1.在包含噬菌体和细菌宿主细胞的系统中制备并检测重组DNA序列的方法，其中噬菌体包含启动子、其侧翼的要重组的第一个和第二个DNA序列、和位于第一个DNA序列下游的至少第一种标志基因，其中所述两个DNA序列之间的重组导致启动子的翻滚方式翻转，并且，取决于启动子的方向，一个或另一个DNA序列和所述标志基因能够被转录或不被转录，该方法包括步骤：

a)在选择性条件下孵育含所述噬菌体的第一种细菌宿主细胞，在这样的条件下，只有所述启动子的方向使第一种标记基因的基因产物被表达，才允许细胞和/或噬菌体增殖，和

b)从第一种宿主细胞分离噬菌体后代，所述后代在选择性条件下生长和/或增殖，并包含第一个和第二个重组DNA序列。

2.权利要求1的方法，进一步包括步骤：

a)将1b)中获得的噬菌体后代导入到第二种细菌宿主细胞中，

b)在选择性条件下孵育含噬菌体后代的第二种宿主细胞，所述选择性条件允许进行重组，并且在这样的条件下，只有启动子的方向使第一种标记基因的基因产物不表达，才允许细胞和/或噬菌体的增殖，和

c)从第二种宿主细胞分离噬菌体后代，所述后代在选择性条件下生长和/或增殖，并包含第三个和第四个重组DNA序列。

3.权利要求1或2的方法，其中通过对2c)中获得的噬菌体后代进行另一个从步骤1a)至1b)或从步骤1a)至1b)加步骤2a)至2c)的循环至少一次而制备其他的重组DNA序列。

4.权利要求1至3任一项的方法，其中包含噬菌体的第一种和/或第二种宿主细胞通过将噬菌体导入到其基因组中有或没有前噬菌体的细菌细胞中而制备。

5.权利要求1至4任一项的方法，其中所述噬菌体是噬菌体λ的衍生物。

6.权利要求1至3任一项的方法，其中包含噬菌体的第一种宿主细胞通过将包含噬菌体序列、启动子侧翼要重组的两个DNA序列和第一种标志基因的质粒导入到其基因组中包含前噬菌体的细菌细胞中而制备。

7.权利要求6的方法，其中将所述质粒导入到包含前噬菌体的细菌细胞中时，所述质粒通过同源重组整合到基因组中。

8.权利要求6或7的方法，其中所述质粒是质粒pMIX-LAM，它是包括噬菌体λ的pL+N启动子区域和侧翼序列cI+rexa和cIII+IS10的质粒pACYC 184的衍生物，并且能够被靶向到宿主溶原菌的λ基因组中。

9.权利要求6或7的方法，其中所述质粒是pAC-OX-OY，它来源于低拷贝数质粒并且包含colE1复制起点和促进整合到λ前噬菌体基因组的靶向序列LG和LD。

10.权利要求1至9任一项的方法，其中所述启动子是λ的pL启动子。

11.权利要求1至9任一项的方法，其中所述启动子是启动子Pro。

12.权利要求1至11任一项的方法，其中第一种标志基因选自λ基因、营养标志基因、抗生素抗性标志基因和编码酶亚基的序列。

13.权利要求12的方法，其中第一种标志基因是λ的gam基因。

14.权利要求13的方法，其中gam基因自flip状态的启动子的转录允许在E.coli recA宿主细胞的菌苔上形成噬菌斑，并阻止在E.coli P2溶原性宿主细胞的菌苔上形成噬菌斑。

15.权利要求13的方法，其中由于启动子的flop方向而引起的gam基因不转录允许在E.coli P2溶原性宿主细胞的菌苔上形成噬菌斑并且阻止在E.coli recA宿主细胞的菌苔上形成噬菌斑。

16.权利要求12的方法，其中第一种标志基因是Cm^R。

17.权利要求16的方法，其中Cm^R基因自flip状态的启动子的转录允许细菌宿主细胞在含氯霉素的培养基上生长，由于启动子的flop方向而引起的Cm^R基因不转录则阻止细菌宿主细胞在含氯霉素的培养基上生长。

18.权利要求1至17任一项的方法，其中所述噬菌体或质粒包含位于要重组的第二个DNA序列下游的第二种标志基因，并且，取决于启动子的方向，它能够被转录或不能被转录。

19.权利要求18的方法，其中在选择性条件下孵育包含具有第二种标志基因的噬菌体后代的第二种宿主细胞，在这样的条件下，只有启动子的方向使第二种标志基因的基因产物表达时，才允许细胞和/或噬菌体的增殖。

20.权利要求18或19的方法，其中第二种标志基因选自营养标志基因、抗生素抗性标志基因和编码酶亚基的序列。

21.权利要求20的方法，其中第二种标志基因是Spec^R。

22.权利要求21的方法，其中Spec^R基因自flop状态的启动子的转录允许细菌宿主细胞在含壮观霉素的培养基上生长，由于启动子的flip方向而引起的Spec^R基因不转录则阻止细菌宿主细胞在含壮观霉素的培养基上生长。

23.权利要求1至22任一项的方法，其中所述细菌宿主细胞是革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌或蓝细菌的细胞。

24.权利要求23的方法，其中所述革兰氏阴性细菌是E.coli。

25.权利要求1至24任一项的方法，其中所述细菌宿主细胞具有功能性错配修复系统。

26.权利要求1至24任一项的方法，其中所述细菌宿主细胞是错配修复系统暂时或永久性缺陷的。

27.权利要求26的方法，其中错配修复系统的暂时或永久性缺陷起因于，一种或多种涉及错配修复系统的基因的突变、删除、和/或可诱导的表达或抑制，用使错配修复系统饱和的试剂处理和/或用完全敲除错配修复的试剂处理。

28.权利要求26或27的方法，其中所述细菌细胞具有突变的mutS基因和/或突变的mutL基因。

29.权利要求1至28任一项的方法，其中所要重组的第一个和第二个DNA序列有至少两个核苷酸的差异。

30.权利要求1至29任一项的方法，其中所要重组的第一个和第二个DNA序列是天然发生的序列和/或人工序列。

31.权利要求30的方法，其中所要重组的第一个和/或第二个DNA序列来源于病毒、细菌、植物、动物和/或人。

32.权利要求1至31任一项的方法，其中所要重组的第一个和第二个DNA序列各包含一个或多个蛋白质编码序列和/或一个或多个非编码序列。

33.权利要求1至32任一项的方法，其中要重组的第一个和/或第二个DNA序列向噬菌体或质粒的插入，通过将包含相应DNA序列的片段克隆到事先用至少一种限制酶剪切的噬菌体或质粒的位点来实施。

34.权利要求1至32任一项的方法，其中要重组的第一个和/或第二个DNA序列向噬菌体或质粒的插入，通过包含相应DNA序列的片段的同源重组来实施，所述片段的侧翼为与噬菌体或质粒序列同源的序列。

35.权利要求1至34任一项的方法，其中包含重组DNA序列的噬菌体后代是从噬菌斑分离的。

36.权利要求1至34任一项的方法，其中包含重组DNA序列的噬菌体后代是从溶原细菌分离的。

37.权利要求1至36任一项的方法，包括分离和/或分析第一种细菌宿主细胞的噬菌体后代中包含的第一个和第二个重组DNA序列和/或第二种细菌宿主细胞的噬菌体后代中包含的第三个和第四个重组序列。

38.权利要求37的方法，其中所述重组DNA序列通过PCR扩增和/或通过限制酶裂解分离。

39.在包含噬菌体和细菌宿主细胞的系统中制备杂合基因的方法，包括实施权利要求1至38任一项的方法，并且从细菌细胞中或者细菌细胞的菌苔上形成的噬菌斑中包含的噬菌体后代选出和/或分离出所得的杂合基因。

40.权利要求39的方法，其中在至少一种调节单元的功能性控制下分析所分离的杂合基因和/或将其插入到表达载体中。

41.在包含噬菌体和细菌宿主细胞的系统中产生由杂合基因编码的杂合蛋白的方法，包括实施权利要求1至38任一项的方法，结果形成杂合基因，并且由杂合基因编码的杂合蛋白在表达后从细菌细胞或者从细菌细胞的菌苔上形成的噬菌斑中选出和/或分离出。

42.权利要求41的方法，其中在至少一种调节单元的功能性控制下分离编码杂合蛋白的杂合基因并将其插入到表达载体中。

43.权利要求42的方法，其中将包含所插入的杂合基因的表达载体导入到适当的宿主细胞中。

44.权利要求43的方法，其中在允许杂合蛋白表达的条件下培养包含所述表达载体的宿主细胞。

45.杂合基因，可以由权利要求1至38任一项的方法或者由权利要求39或40的方法获得。

46.蛋白质，其由权利要求45的杂合基因编码，并且可由权利要求41至44任一项的方法获得。

47.噬菌体λ的衍生物，包含启动子Pro及其侧翼的Spec^R标志和Cm^R标志，其中至少第一个和第二个限制性位点排列在启动子和Spec^R标志之间，用于插入第一个外源DNA序列，以及至少第三个和第四个限制性位点排列在启动子和Cm^R标志之间，用于插入第二个外源DNA序列。

48.质粒pMIX-LAM，其为质粒pACYC184的衍生物，包含噬菌体λ的pL+N启动子区域和侧翼序列cI+rexa和cIII+IS10、位于含启动子的pL+N片段侧翼的多克隆位点MCS1和MCS2、以及Cm^R标志基因，并且能够被靶向到宿主溶原菌的λ基因组中。

49.质粒pAC-OX-OY，其衍生于低拷贝数质粒，包含colE1复制起点、标志基因Cm^R和Spec^R以及靶向序列LG和LD，其促进向λ前噬菌体基因组中的整合。

50.试剂盒，有至少三个容器，第一个容器容纳含启动子pL和gam基因的噬菌体λ的DNA或者包含该噬菌体的E.coli recA菌株细胞，第二个容器容纳E.coli recA菌株细胞，第三个容器容纳E.coli P2溶原性菌株细胞。

51.试剂盒，有至少三个容器，第一个容器容纳质粒pMIX-LAM的DNA或容纳含有质粒pMIX-LAM的E.coli recA菌株细胞，第二个容器容纳E.colirecA菌株细胞，第三个容器容纳E.coli P2溶原性菌株细胞。

52.试剂盒，有至少两个容器，第一个容器容纳权利要求47所述噬菌体衍生物的DNA或容纳含权利要求47所述噬菌体衍生物的E.coli菌株细胞，第二个容器容纳E.coli菌株细胞。

53.试剂盒，有至少两个容器，第一个容器容纳质粒pAC-OX-OY的DNA或者容纳含有质粒pAC-OX-OY的E.coli菌株细胞，第二个容器容纳E.coli菌株细胞。

54.权利要求50至53任一项的试剂盒，其中所述E.coli菌株细胞为mutS^-。

55.用途，是质粒pMIX-LAM、质粒pAC-OX-OY、包含启动子pL和gam基因的噬菌体λ、或权利要求47的噬菌体，在权利要求1至38的制备和/或检测重组DNA序列的方法中、在权利要求39或40的制备杂合基因的方法中、或者在权利要求41至44任一项的产生杂合蛋白的方法中的用途。