CN105624146B - 基于CRISPR/Cas9和酿酒酵母细胞内源的同源重组的分子克隆方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的分子克隆方法，具体而言，涉及通过组合利用CRISPR/Cas9系统和酿酒酵母细胞内源的同源重组系统对初始载体进行改造，以获得重组载体的方法，所述方法仅通过一次转化筛选操作，即可同时完成将一个或多个目的DNA片段插入初始载体、从初始载体上删除一个或多个DNA片段和/或将载体上的一个或多个DNA片段替换为一个或多个目的DNA片段。本发明还涉及用于方便有效地实施本发明所述方法的试剂盒。

Description

基于CRISPR/Cas9和酿酒酵母细胞内源的同源重组的分子克 隆方法

技术领域

本发明涉及一种新的分子克隆方法，具体而言，涉及通过组合利用CRISPR/Cas9系统和酿酒酵母细胞内源的同源重组系统对初始载体进行改造，以获得重组载体的方法，所述方法仅通过一次转化筛选操作，即可同时完成将一个或多个目的DNA片段插入初始载体、从初始载体上删除一个或多个DNA片段和/或将载体上的一个或多个DNA片段替换为一个或多个目的DNA片段。本发明还涉及用于方便有效地实施本发明所述的分子克隆方法的试剂盒。

背景技术

分子克隆是将目的DNA片段与载体DNA组装为重组载体后导入宿主细胞或生物体，使其在宿主内复制的分子生物学实验方法。在宿主细胞扩增过程中，带有目的DNA片段的重组载体能够作为宿主基因组的一部分或者独立地复制，从而被后代细胞继承。通过这样的方式，能够获得带有所述目的DNA片段的细胞群体，从而实现从单个目的DNA片段获得大量完全相同的目的DNA片段。这一过程即克隆过程。其中，所述目的DNA可来源于对宿主而言为同源或异源的生物体，或者为人工序列。分子克隆技术作为现代生物学的核心技术，被广泛地用于测序、遗传工程、蛋白纯化、生物制药等各方面。

在传统的分子克隆技术中，一般利用“酶切-连接”的方式将目的DNA与载体进行连接：首先通过限制性酶切在目的DNA和载体DNA上制造互补的黏性末端或者平末端，再用连接酶将二者连在一起，生成带有目的DNA的载体，也称为重组载体(Nathans D.等，1975，Restriction endonucleases in the analysis and restructuring of DNA molecules，Annu.Rev.Biochem.44：273–93)。限制性内切酶特异性地识别靶DNA序列(即酶切位点)。因此，为了能够对多个目的DNA片段进行操作，常用的工程化及商业化的载体通常具有多克隆位点，且针对目的DNA片段的操作(例如插入、替换和/或删除)大多在多克隆位点处进行。在实践中，对目的DNA的每次操作都需要进行一系列的酶切连接、转化和筛选步骤，该过程需要数天时间。此外，常常发生需要操作的位置没有酶切位点、或希望使用的限制性内切酶在载体或目的片段上存在多个靶点的情况，此时需要更多的时间和更繁琐的步骤对载体进行改造。当需要将多个片段连入载体时，传统的分子克隆技术费时耗力且成本极高。

作为改进，基于酶切-连接的Biobrick方法利用同尾酶实现片段的逐级组装(Sleight S.C.等，In-Fusion BioBrick assembly and re-engineering.Nucleic AcidsRes，2010，38(8)：2624-36)。该方法仅使用4个限制性内切酶EcoRI、XbaI、SpeI以及PstI即可完成任意数量片段的组装，省去了挑选合适的限制性内切酶的复杂过程。然而，每操作一个片段仍需要进行一系列的酶切连接、转化和克隆筛选。该方法不能同时实现多个片段的拼接。目前最有效的DNA操作方法为Gibson拼接(Gibson Assembly)。该方法的原理在于，将20～80bp的短重叠序列添加至各待连接的片段(例如需要首尾相连的多个DNA片段)的末端，重叠序列的设置用于保证各片段的组装顺序。在50℃的孵育温度下，Gibson拼接混合物中的DNA外切酶从5'端降解部分核苷酸产生黏性末端，从而待拼接的两相邻片段的重叠区之间可以通过退火而互补，然后在DNA聚合酶和DNA连接酶的作用下将缺口补齐，形成完整的双链DNA，实现无痕拼接(Gibson,D.G.等，Enzymatic assembly of DNA molecules upto several hundred kilobases.Nature methods 6，343-345，2009)。Gibson拼接技术不区分载体片段和目的片段，其优势在于简便快速、能直接使用PCR片段、不需要回收步骤、且可以处理多个片段。然而，传统的Gibson拼接方法对片段大小要求严格。例如，小于100bp的片段不能正确拼接。另外，当片段数增多时，正确拼接效率下降。

最近报道了组合利用CRISPR/Cas9系统和Gibson拼接的体外克隆方法。以色列专利申请62043公开了一种大基因簇钓取方法(CATCH)，该方法包含如下步骤：将细菌包埋到琼脂块中，经过溶菌酶、蛋白酶K处理后，将所述琼脂块与包含Cas9蛋白、预先设计的针对抓取位点的sgRNA对及缓冲液混合，孵育2小时，使得琼脂块中酶充分扩散且基因组DNA被充分酶切；通过脉冲场电泳分离目的片段并纯化，随后利用Gibson拼接，将被钓取的大片段DNA连入BAC载体。类似地，Jia-Wang Wang等提出了组合利用CRISPR/Cas9核酸酶酶切与Gibson拼接的无缝克隆方法。该方法首先利用CRISPR/Cas9将载体线性化，随后在Gibson拼接系统中将线性化的载体与一个编码青色荧光蛋白的DNA片段(853bp)孵育，获得Gibson拼接产物。将Gibson拼接产物转化入大肠杆菌，并筛选阳性克隆(Wang J-W.等，2015，CRISPR/Cas9nuclease cleavage combined with Gibson assembly for seamless cloning，BioTechniques 58:161-170.doi 10.2144/000114261)。然而，这些方法并未提及是否可同时对多个目的片段进行操作，也未考虑多片段拼接的效率问题。

目前，本领域还未提出利用CRISPR/Cas9系统作为分子生物学工具，针对载体上的多个靶点或针对多个目的DNA片段进行操作的体外分子克隆方法。

发明内容

一方面，本发明提供了一种分子克隆方法，所述方法通过将一个或多个目的DNA片段插入初始载体、从初始载体上删除一个或多个DNA片段和/或将所述初始载体上的一个或多个DNA片段替换为目的DNA片段，获得重组载体，所述方法包含如下步骤：

(1)定位：针对初始载体上待实施插入、删除和/或替换的的各个位点，设计并通过体外转录合成单导向RNA(single-guide RNA，sgRNA)；

(2)酶切：在体外利用Cas9核酸酶和步骤(1)获得的sgRNA对所述初始载体进行酶切，使得所述待实施插入、删除和/或替换的各个位点处的DNA双链断裂，对酶切后的各初始载体片段进行回收和纯化；

(3)制备同源臂序列：针对待连接的各相邻片段，制备用于酿酒酵母同源重组的同源臂序列，所述同源臂序列位于第一待连接片段和/或第二待连接片段的侧翼，或者所述同源臂序列以同源臂片段的形式单独存在；

(4)连接和转化：将步骤(3)制备的所述同源臂序列、步骤(2)获得的所述初始载体片段以及任选的所述目的DNA片段转化入酿酒酵母细胞；

(5)筛选和获得重组载体：筛选出带有所述重组载体的酿酒酵母细胞阳性克隆，从而获得带有重组载体的酿酒酵母细胞，

其中，所述重组载体为能够在所述酿酒酵母细胞中复制的载体。

另一方面，本发明还提供了用于方便有效地实施本发明所述的分子克隆方法的试剂盒，所述试剂盒包含独立包装的sgRNA克隆载体、Cas9核酸酶以及酿酒酵母细胞。

有益效果

本发明的方法组合利用CRISPR/Cas9和酿酒酵母内源的同源重组系统替代传统的“酶切”和“连接”，仅通过一次转化筛选，即可在初始载体的任意位置实现将一个或多个目的DNA片段插入初始载体、从初始载体上删除一个或多个DNA片段和/或将载体上的一个或多个DNA片段替换为一个或多个目的DNA片段。特别地，针对某一待实施插入的位点而言，可同时插入一个或多个目的DNA片段。这是第一次在体外实现同时针对多个位点、对多个DNA片段进行多种操作的一步克隆方法。

具体而言，Cas9核酸酶的作用位点完全取决于所设计的sgRNA序列。由于sgRNA通常为约20bp，远大于限制性内切酶所识别的6-8bp的序列，因此特异性大大提高。并且，由于可针对任意的DNA序列设计所匹配的sgRNA，因此能够针对载体的任何位点实施操作。利用CRISPR/Cas9使得初始载体的一个或多个位点发生双链断裂便于对初始载体进行片段化处理，从而在随后的同源重组过程中，能够在同源臂序列的指引下，将一个或多个载体片段与任选的目的片段按顺序拼接。通过这样的方式，能够同时针对多个待操作位点实施插入、删除和/或替换。

另一方面，本发明利用酿酒酵母内源的高效的同源重组系统，使得多片段的连接和转化同时完成。其中，同源臂可位于第一待连接片段和/或第二待连接片段侧翼，或者以同源臂片段(寡核苷酸片段)的形式单独存在，无论待连接片段来自于PCR产物、酶切产物还是人工合成序列，以如上任一种方式设置的同源臂都能保证各待连接片段的顺序连接，从而方便地实施连接和转化操作。由于本发明方法中的连接和转化步骤利用酿酒酵母细胞内源的同源重组系统，要求重组载体带有酿酒酵母的复制起始位点，以允许重组载体在酵母细胞内复制。然而，重组载体也可带有允许在其它宿主内复制的其它复制起始位点。在这种情况下，所构建的重组载体为能够在两种以上宿主中复制的穿梭质粒。通过这样的方式，本发明的方法可用于构建针对更宽的宿主范围的载体。

特别地，在优选实施方式中，待实施插入、删除和/或替换的一个或多个DNA片段可以编码与抗生素抗性、营养缺陷筛选和/或宿主特异性复制起始位点相关的基因。从而与初始载体相比，重组载体的抗性、营养缺陷性质和/或允许其复制的宿主发生改变。例如，通过将初始载体上的一种抗生素抗性或营养缺陷筛选相关基因替换为另一抗生素抗性或营养缺陷筛选相关基因，能够显著提高本发明方法的阳性率。

附图说明

图1为根据本发明方法的步骤(3)中同源臂序列设置的示意图。对于一个待操作位点而言，同源臂序列可以位于待连接片段中其中一个的侧翼(a)、位于各待连接的片段的侧翼(b)或者以同源臂片段的形式单独存在(c)。

图2为本发明实施例中使用的初始载体pHY-wt的质粒图谱。

图3为根据本发明实施例1-12，对初始载体的多个靶点进行如下操作的示意图(为方便描述，以编号I-V表示待操作的各位点，以编号1-9表示各片段)：将位点I和位点II之间的ura3替换为trp1，在位点III、IV和V处分别插入片段7(lacZ片段)、片段8(mRFP片段)以及片段9(Apr片段)。

图4为对本发明实施例1-3获得的克隆进行菌落PCR后利用琼脂糖凝胶电泳进行分析的结果。M为DL2000plus DNA marker(TransGen Biotech)，其它各泳道为利用表3所示的引物，对随机挑选的20个克隆进行菌落PCR后琼脂糖凝胶电泳的结果。

图5为对本发明实施例4-6获得的克隆进行菌落PCR后利用琼脂糖凝胶电泳进行分析的结果。M为DL2000plus DNA marker(TransGen Biotech)，其它各泳道为利用表3所示的引物，对随机挑选的20个克隆进行菌落PCR后琼脂糖凝胶电泳的结果。

图6为对本发明实施例7-9获得的克隆进行菌落PCR后利用琼脂糖凝胶电泳进行分析的结果。M为DL2000plus DNA marker(TransGen Biotech)，其它各泳道为利用表3所示的引物，对随机挑选的20个克隆进行菌落PCR后琼脂糖凝胶电泳的结果。

图7为对本发明实施例10-12获得的克隆进行菌落PCR后利用琼脂糖凝胶电泳进行分析的结果。M为DL2000plus DNA marker(TransGen Biotech)，其它各泳道为利用表3所示的引物，对随机挑选的20个克隆进行菌落PCR后琼脂糖凝胶电泳的结果。

具体实施方式

分子克隆方法

如上所述，本发明的方法组合利用了CRISPR/Cas9和酿酒酵母内源的同源重组系统，首先在体外利用sgRNA导向的Cas9核酸酶在初始载体的待实施插入、删除和/或替换的一个或多个位点制造双链断裂，将全部片段纯化回收，获得初始载体各片段；随后将获得的初始载体片段、同源臂序列和任选的目的DNA片段共同转化入酿酒酵母，利用酿酒酵母自身的同源重组系统将各片段顺序连接，在理想情况下，转化子含有各片段均按顺序连接的重组载体；最后筛选带有重组载体的阳性克隆。利用本发明的方法，能够仅通过一步转化筛选操作，将一个或多个目的DNA片段插入初始载体、从初始载体上删除一个或多个DNA片段和/或将载体上的一个或多个DNA片段替换为一个或多个目的DNA片段。所述一个或多个目的DNA片段可以是例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个以上DNA片段，所述待实施插入、删除和/或替换的位点可以是例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个以上位点。在一些实施方式中，能够仅通过一步转化筛选操作，将一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个以上)目的DNA片段插入初始载体的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个以上)位点；将初始载体上一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个以上)位置的片段替换为一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个以上)目的DNA片段；和/或将初始载体上一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个以上)位置的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个以上)待实施删除的片段删除。由于本发明的方法对初始载体同样采取片段化处理，针对某一插入或替换位点而言，待插入或待替换的目的DNA片段数量没有特别的限制。在一些实施方式中，可将一个以上(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个以上)目的DNA片段插入同一待插入位点。在一些实施方式中，可用一个以上(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个以上)目的DNA片段替换初始载体上的一个(被替换)片段。

本发明中使用的术语“初始载体”是指实施目的片段的插入、替换和/或删除前的载体。初始载体可为环状质粒或线状载体，例如但不限于宿主特异性质粒、穿梭质粒、细菌人工染色体(BAC)或酵母人工染色体(YAC)。初始载体也可为克隆载体或表达载体。作为宿主特异性质粒，初始载体可为仅能在大肠杆菌(Escherichia coli)、链霉菌(Streptomyces)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、真菌(fungi)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(S.pombe)、毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、哺乳动物细胞(mammalian cells)中复制的质粒。或者，初始载体可为穿梭质粒，例如大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒、大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭质粒、细菌-哺乳动物细胞穿梭质粒、细菌-植物细胞穿梭质粒、大肠杆菌-丝状真菌穿梭质粒、大肠杆菌-链霉菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-丝状真菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌-酿酒酵母穿梭质粒、细菌-哺乳动物-酿酒酵母细胞穿梭质粒或细菌-植物细胞-酿酒酵母穿梭质粒。所述丝状真菌例如但不限于黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黄曲霉(Aspergillus flavus)。在初始载体不能在酿酒酵母中复制的实施方式中，待实施插入和/或替换的目的片段包含酿酒酵母源复制起始位点。可在两种以上物种中复制的穿梭质粒或穿梭载体为本领域技术人员所熟知，并可为商购可得的。

本发明中使用的术语“重组载体”是指期望获得的、实施目的片段的插入、删除和/或替换后的载体。本发明所述的重组载体能够在酵母体内复制，即重组载体必然包含酿酒酵母源复制起始位点。重组载体也可带有允许在其它宿主内复制的其它复制起始位点。在一些实施方式中，重组载体为能够在两种以上宿主中复制的穿梭质粒。优选地，所述重组载体为大肠杆菌-链霉菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-丝状真菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌-酿酒酵母穿梭质粒、细菌-哺乳动物-酿酒酵母细胞穿梭质粒、细菌-植物细胞-酿酒酵母穿梭质粒。所述丝状真菌例如但不限于黑曲霉、米曲霉、黄曲霉。为筛选方便的考虑，所述重组载体为严谨型质粒、优选单拷贝质粒。在本发明的上下文中，可将不存在于初始载体上的、期望通过实施插入和/或替换操作而被加入至重组载体的片段称为待实施插入和/或替换的目的(DNA)片段；将存在于初始载体上的、由于被待实施替换的目的片段所取代而不存在于重组载体上的片段称为被替换片段；将存在于初始载体上的、由于实施删除操作而不存在于重组载体上的片段称为待实施删除的片段。对应地，将初始载体上进行插入、删除和/或替换的位点称为待实施插入、删除和/或替换的位点。在本发明的上下文中，在仅将一个或多个片段从初始载体上删除的情况下，不需要额外引入目的片段。

本发明中使用的术语“DNA片段”可以是人工合成的DNA片段、天然DNA片段或经修饰的天然DNA片段。待实施插入和/或替换的片段、待实施删除的片段以及被替换片段可为编码功能性蛋白的片段，从而在插入、删除和/或替换后载体编码的蛋白的种类和/或功能发生改变。所述编码功能性蛋白的片段例如但不限于编码β-半乳糖苷酶、荧光蛋白或融合荧光蛋白、抗生素抗性或营养缺陷耐受性相关基因的DNA片段。或者，待实施插入和/或替换的片段、待实施删除的片段以及被替换片段可为非编码的冗余序列、无义序列、调控序列(例如编码microRNA的序列、增强子序列、启动子序列、RBS序列)或功能未知的序列，从而破坏或改变原蛋白的功能、对未知序列的性质进行研究或实施测序。待实施删除的片段或被替换片段的长度没有特别限制，例如1bp-100kbp。待实施插入的目的片段可具有任意的长度，例如1bp-100kbp。待实施替换的目的片段可具有任意的长度，例如1bp-100kbp。待实施替换的目的片段与被替换片段的长度和/或数目可不同。在一些实施方式中，待实施插入的一个目的片段是编码抗生素抗性或营养缺陷相关蛋白的DNA片段。在另一些实施方式中，待实施替换的一个目的片段是编码抗生素抗性或营养缺陷相关蛋白的DNA片段，且相应的被替换片段是编码另一抗生素抗性或营养缺陷相关蛋白的DNA片段。抗生素抗性基因例如为对G418耐受的Kan基因，营养缺陷相关基因例如为组氨酸、酪氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、腺嘌呤合成通路的基因，例如ura3、trp1、his3、his2、leu2、ade等。在此类实施方式中，例如可在无抗性的初始载体上插入kan基因，并对一个或多个其它片段进行插入、删除和/或替换操作，从而获得重组载体；或者，可将初始载体上的his2替换为trp1，并对一个或多个其它片段进行插入、删除和/或替换操作，从而获得重组载体。插入和/或替换表达抗生素抗性或营养缺陷相关蛋白的DNA片段赋予重组载体与初始载体不同的抗性或营养缺陷表型，自连(即未成功实施插入和/或替换)的初始载体将不能在选择性培养基上生长，从而有效地提高阳性率。

在本发明中，利用CRISPR/Cas9系统完成对待实施插入、删除和/或替换的位点的定位和酶切。

CRISPR即成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspacedshort palindromic repeats)的首字母缩写，其作为细菌和古细菌的“免疫系统”广泛存在于细菌和古生菌基因组中。CRISPR系统的免疫干扰过程主要包括三个阶段：适应、表达和干扰。在适应阶段，CRISPR系统会将来自噬菌体或质粒的DNA短片段整合到前导序列和第一段重复序列之间，每一次整合都伴随着重复序列的复制，进而形成一个新的重复-间隔序列单元。该间隔序列(spacer)记录了之前入侵的外源DNA。在表达阶段，CRISPR基因座会被转录成一段CRISPR RNA(crRNA)前体(pre_crRNA)，该前体被Cas蛋白剪切并进一步加工成小的crRNA。成熟的crRNA与Cas蛋白形成Cas/crRNA复合体。在干扰阶段，crRNA通过其与靶序列互补的区域引导Cas/crRNA复合体寻找靶点，并在靶点位置通过Cas蛋白的核酸酶活性造成靶点位置的双链DNA断裂，从而使入侵的靶标DNA失去原有功能。其中与靶点3'端紧邻的3个碱基必须是5'-NGG-3'(PAM序列)的形式。

CRISPR/Cas已被用作对多种生物体的基因组进行编辑的工具。其中，最常用的是来自产脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的CRISPR/Cas9系统。Cas9蛋白在crRNA的成熟和靶DNA的剪切中发挥重要作用。在该系统中，反式编码小RNA(trans-encoded small RNA，tracrRNA)扮演了导向的角色。Jinek等将tracrRNA与spacer RNA组合为sgRNA分子，将其与Cas9进行混合，发现能够正确地对靶DNA进行切割(Pennisi E，The CRISPR craze，Science341(6148)：833–836，2013)。

本领域已知的是，可针对任意DNA序列的任意位点设计相应的sgRNA，Cas9蛋白可在该sgRNA的导向下对该位点进行酶切。设计针对特定位点的sgRNA的方法以及sgRNA的体外转录合成方法为本领域已知。例如，可利用在线的CRISPR设计工具，例如http://crispr.mit.edu/或http://www.biootools.com/en/来设计sgRNA序列，人工合成所对应的sgDNA序列，将sgDNA连入sgRNA克隆载体，或通过重叠延伸获得sgRNA转录模板，并利用T7RNA聚合酶和该sgRNA克隆载体实施体外转录来获得sgRNA片段。可使用商购的试剂盒完成该过程，例如使用T7Quick High-Yield RNA synthesis Kit(NEB)、sgRNA体外转录和筛选试剂盒(Clontech，Cat.No.631439)、T7sgRNA MICscript^TM KIT/sgRNA synthesisproduct(Biomics Biotech)或Epicenter ASF3257体外转录试剂盒。

需要指出的是，对于待实施插入的位点，仅需在初始载体上制造一处双链断裂，因此需要一条sgRNA；而对于待实施替换或删除的位点而言，由于需要同时在被替换目的片段或待实施删除片段的上游和下游产生双链断裂，需要两条sgRNA。对于需要同时对多个位点进行一种或多种操作的情况，可将多条sgRNA预先混合。

在体外利用Cas9核酸酶和所设计合成的sgRNA对初始载体进行酶切的方法为本领域已知。例如，Wang,J-W.，Wang,A.,Li K.，Wang,B.等，2015，CRISPR/Cas9nucleasecleavage combined with Gibson assembly for seamless cloning，BioTechniques 58:161-170.doi 10.2144/000114261描述的技术方案中采用NEB推荐的30μL反应系统(NEB#M0386)。也可使用NEB的Cas9Nuclease，S.pyogenes(Cat.No.M0386L)及相应的缓冲液。酶切后的DNA片段的回收纯化可使用商购的试剂盒，例如Qiangen的胶回收试剂盒(#DP209)。优选地，可在回收纯化前进行琼脂糖凝胶电泳，以对酶切结果进行鉴定。

在本发明的上下文中，本文使用的“待连接的相邻片段”是指在步骤(2)之后以初始载体片段或目的DNA片段的形式存在、并在重组载体中首尾相接的片段。根据其连接顺序，分别称为“上游片段”和“下游片段”。如图1所示，步骤(3)中同源臂序列的设置用于将各上游片段与下游片段相连。

本发明的连接利用酿酒酵母细胞内源的同源重组系统实施。同源重组(homologous recombination)是真核细胞中发生在有丝分裂或减数分裂期间，非姐妹染色单体之间、同一染色体上含有同源序列的DNA之间或分子之内具有相似序列的片段发生交换而重新组合，从而在后代中产生变异的机制。同源重组在各类生物体中均广泛存在。甚至在细菌中，噬菌体整合入细菌基因组也是通过同源重组方式。在生物技术领域，多种同源重组体系被广泛地用于针对生物体基因组的编辑，例如大肠杆菌的RecA、Lambda Red系统等。酿酒酵母的同源重组机制尚未完全知晓。然而，作为针对基因组的遗传操作工具，将目的DNA片段插入带有营养缺陷标记和同源臂序列的酵母整合质粒，利用整合质粒的同源臂与基因组DNA之间的同源重组，用目的DNA片段替代酵母基因组内源的片段，并利用营养缺陷标记筛选重组子，已成为本领域惯用的技术。通过这样的方式实现针对酵母基因组的插入和基因敲除。本领域技术人员知晓的是，同源臂是指同源重组时，发生同源双交换的同源序列。发生所述同源双交换的同源序列的一致性一般大于70％、优选大于80％。在针对酵母基因组的操作中，同源臂最少为15bp，为了提高重组的正确率可为500-800bp，然而同源臂过长时效率下降。可参照酵母基因组操作的条件设置同源臂，例如，同源臂可为15-800bp。为简便的目的，本发明中同源臂为15-80bp、优选40bp。本发明的同源臂长度可以完成多个片段的有效组装。

基因工程领域的普通技术人员所知晓的是，同源臂应为与待连接片段的末端同源的序列。同源臂序列可以同源臂片段的形式单独存在、位于一个待连接片段侧翼或位于两个待连接片段的侧翼。具体而言，在将两个待连接片段5'-A-3'与5'-B-3'连接为5'-AB-3'的情况下，可通过如下的任一种方式设置同源臂序列(分别以h₁、h₂、h₂h₁表示)：

(a)通过PCR或重叠延伸等方法将h₁连接到5'-A-3'的3'末端，其中，h₁序列为与B片段5'末端15-80bp、优选40bp的序列同源的序列。在该情况下，同源重组发生在Ah₁片段的h₁与B片段的h₁之间，从而将5'-Ah₁-3'与5'-B-3'连接为5'-AB-3'；

(b)通过PCR或重叠延伸等方法将h₂连接到5'-B-3'的5'末端，其中，h₂序列为与A片段3'末端15-80bp、优选40bp的序列同源的序列。在该情况下，同源重组发生在A片段的h₂与h₂B片段的h₂之间，从而将5'-A-3'与5'-h₂B-3'连接为5'-AB-3'(即图1(a)示出的方式)；

(c)通过PCR或重叠延伸等方法将h₁连接到5'-A-3'的3'末端，并将h₂连接到5'-B-3'的5'末端，其中，h₁序列为与B片段5'末端15-80bp、优选40bp的序列同源的序列，h₂序列为与A片段3'末端15-80bp、优选40bp的序列同源的序列。在该情况下，同源重组发生在Ah₁片段的h₂h₁与h₂B片段的h₂h₁之间，从而将5'-Ah₁-3'与5'-h₂B-3'连接为5'-AB-3'(即图1(b)示出的方式)；

或者，

(d)通过PCR或合成等方法制备具有h₂h₁序列的独立片段，其中，h₁序列为与B片段5'末端15-80bp、优选40bp的序列同源的序列，h₂序列为与A片段3'末端15-80bp、优选40bp的序列同源的序列。在该情况下，同源重组发生在B片段的h₁、A片段的h₂以及h₂h₁之间，从而将5'-A-3'与5'-B-3'连接为5'-AB-3'(即图1(c)示出的方式)。

在全部情况下，同源臂序列与待连接序列末端的一致性大于70％、优选大于80％。在同源臂序列与待连接序列末端的一致性为100％的情况下不引入突变。就同源臂序列与待连接序列末端的一致性为大于70％且小于100％的情况而言，在待连接序列的末端引入点突变或插入短的序列(例如短的调控序列)。例如，在同源臂为40bp的情况下，可在同源臂序列内插入约12bp的调控序列。

在本发明的实施方式中，直接将带有同源臂序列的待连接的各片段转化入酿酒酵母细胞，或者将独立的同源臂片段和待连接的各片段转化入酿酒酵母细胞，酵母内源的同源重组系统即可将待连接的各片段按顺序相连。需要说明的是，由于待删除片段或被替换片段不带有同源臂序列，不能连入重组载体，因此，无需在步骤(2)的载体片段回收纯化过程中(例如类似以色列专利申请62043所述的，使用琼脂糖凝胶电泳将各片段分离)将其去除。

在本发明涉及将一个目的DNA片段插入一个待实施插入位点或将载体上的一个被替换片段替换为一个目的DNA片段的实施方式中，由于被替换片段不带有同源臂，不能被连入重组载体，对于涉及插入操作和替换操作的位点而言，步骤(3)的同源臂设置的目的均为将上游载体片段的3'末端与待实施插入和/或替换的目的片段的5'末端相连，同时将待实施插入和/或替换的目的片段的3'末端与下游载体片段的5'末端按顺序相连，形成上游载体片段-(待实施插入和/或替换的)目的片段-下游载体片段的结构。可通过如上(a)-(d)四种方式中的任一种来设置使得上游载体片段与(待实施插入和/或替换的)目的DNA片段相连的同源臂，并可独立地通过如上(a)-(d)四种方式中的任一种来设置使得(待实施插入和/或替换的)的目的DNA片段与下游载体片段相连的同源臂。按照排列组合原理，共有16种同源臂设置方式。例如，可通过选自于由如下方式组成的组中的任一种方式来设置同源臂：

(a1)将第一同源臂序列设置于上游载体片段的3'末端，所述第一同源臂具有与所述目的DNA片段的5'末端序列同源的序列，将第二同源臂序列设置于下游载体片段的5'末端，所述第二同源臂具有与所述目的DNA片段的3'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：带有第一同源臂序列的上游载体片段、带有第二同源臂序列的下游载体片段和目的DNA片段；

(b1)将第一同源臂序列设置于上游载体片段的3'末端，所述第一同源臂具有与所述目的DNA片段的5'末端序列同源的序列，将第二同源臂序列设置于目的DNA片段的3'末端，所述第二同源臂具有与下游载体片段的5'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：带有第一同源臂序列的上游载体片段、带有第二同源臂序列的目的DNA片段和下游载体片段；

(c1)将第一同源臂序列设置于目的DNA片段的5'末端，所述第一同源臂具有与上游载体片段的3'末端序列同源的序列，将第二同源臂序列设置于下游载体片段的5'末端，所述第二同源臂具有与所述目的DNA片段的3'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：上游载体片段、带有第一同源臂序列的目的DNA片段和带有第二同源臂序列的下游载体片段；

(d1)将第一同源臂序列设置于目的DNA片段的5'末端，所述第一同源臂具有与上游载体片段的3'末端序列同源的序列，将第二同源臂序列设置于目的DNA片段的3'末端，所述第二同源臂具有与下游载体片段的5'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：上游载体片段、带有第一同源臂序列和第二同源臂序列的目的DNA片段以及下游载体片段；

(e1)将第一同源臂序列设置于上游载体片段的3'末端，所述第一同源臂具有与所述目的DNA片段的5'末端序列同源的序列，将第二同源臂序列设置于目的DNA片段的5'末端，所述第二同源臂具有与上游载体片段的3'末端序列同源的序列，将第三同源臂序列设置于目的DNA片段的3'末端，所述第三同源臂具有与下游载体片段的5'末端序列同源的序列，将第四同源臂序列设置于下游载体片段的5'末端，所述第四同源臂具有与所述目的DNA片段的3'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：带有第一同源臂序列的上游载体片段、带有第二同源臂序列和第三同源臂序列的目的DNA片段以及带有第四同源臂序列的下游载体片段；

(f1)制备独立的第一同源臂片段和第二同源臂片段，其中，所述第一同源臂片段具有与上游载体片段的3'末端序列同源的序列和与所述目的DNA片段的5'末端序列同源的序列，所述第二同源臂片段具有与所述目的DNA片段的3'末端序列同源的序列和与下游载体片段的5'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：上游载体片段、目的DNA片段、下游载体片段、第一同源臂片段和第二同源臂片段。

或者，也可通过除上述六种方式之外的其它十种方式来设置同源臂。

对于要将多个目的DNA片段插入和/或替换至多个待实施插入和/或替换的位点，且每个位点插入或替换一个目的DNA片段的情况，独立设置各第一同源臂、第二同源臂以及任选的第三同源臂和第四同源臂。

对于要在一个待实施插入的位点插入两个以上目的片段，或将一个被替换片段替换为两个以上目的片段的实施方式而言，可根据重组载体上(即连接后)各片段的顺序在相邻的待连接片段之间按照如上(a)-(d)四种方式中的任一种来设置同源臂。

在本发明的一些实施方式中，将载体上的目的片段删除。对于待实施删除的位点而言，步骤(3)的同源臂设置方式为将上游载体片段的3'末端与下游载体片段的5'末端相连，形成上游载体片段-下游载体片段的结构。可通过如上(a)-(d)四种方式中的任一种来设置同源臂。具体而言，

(a2)将同源臂序列设置于上游载体片段的3'末端，所述同源臂具有与下游载体片段的5'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：下游载体片段和带有同源臂序列的上游载体片段；

(b2)将同源臂序列设置于下游载体片段的5'末端，所述同源臂具有与上游载体片段的3'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：上游载体片段和带有同源臂序列的下游载体片段；

(c2)将第一同源臂序列设置于上游载体片段的3'末端，并将第二同源臂序列设置于下游载体片段的5'末端，所述第一同源臂具有与下游载体片段的5'末端序列同源的序列，所述第二同源臂具有与上游载体片段的3'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：带有第一同源臂序列的上游载体片段和带有第二同源臂序列的下游载体片段；

(d2)制备独立的同源臂片段，其中，所述同源臂片段具有与上游载体片段的3'末端序列同源的序列和与下游载体片段的5'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：上游载体片段、下游载体片段和同源臂片段。

通过如上(a2)-(d2)中的任一种方式设置同源臂，可将位于待删除片段上下游的两个载体片段相连。对于要将多个目的DNA片段从多个位点处删除的情况，可通过如上(a2)-(d2)中的任一种方式来独立设置各同源臂。

对于同时在多个位点实施插入、删除和/或替换操作的实施方式而言，根据重组载体上各片段的顺序对每个位点独立设置同源臂。同源臂序列的长度优选15-80bp、更优选40bp。

本领域技术人员理解的是，在从载体上删除一个或多个片段的实施方式中，不需要额外引入目的DNA。

需要指出的是，本发明所述的载体片段、目的片段均为互补的双链DNA片段。虽然上下文中仅描述了同源臂第一链的同源臂设计方式，本领域技术人员能够理解的是，同源臂的第二链与第一链互补。可通过PCR扩增或对合成的寡核苷酸进行退火得到带有同源臂序列的双链待连接片段或双链同源臂片段。

对于连接和转化步骤，本领域技术人员熟知将一个或多个线性DNA片段转化入酵母细胞的方法。例如，可采用传统的乙酸锂转化、原生质体转化或电转化的方法。上述方法的步骤和材料例如在《精编分子生物学实验指南(第5版)》(2008年)第509-514页描述。也可采用商购的试剂盒，例如Sigma-Aldrich的酵母转化试剂盒(Cat.No.YEAST1-1KT)。

筛选获得带有重组载体的酵母转化子的技术为本领域技术人员已知。对于不带有筛选标记的重组载体，可采用对一个或多个目的片段进行扩增的单重或多重PCR对转化子进行检测，从而筛选出带有重组载体的转化子。需要指出的是，本发明的步骤(4)的转化使用的是初始载体片段和任选的目的片段，上述片段均为线性化的DNA片段。因此，在步骤(2)的酶切完全的情况下，初始载体自连的概率不高，因此不外加筛选标记是可行的。然而，也可使得重组载体带有与初始载体不同的抗生素抗性基因或营养缺陷筛选标记，从而转化子能够在添加有抗生素或不含某种必须营养成分的选择性培养基上生长。由于初始载体上不含这些选择标记，不含任何载体的酵母转化子以及含有自连的初始载体的酵母转化子均不能够在选择性培养基上生长。通过这样的方法筛选带有重组质粒的酵母转化子可进一步降低假阳性率。当重组载体另外包含编码报告子蛋白的DNA片段时，可通过检测报告基因的表达来筛选阳性克隆，所述报告子蛋白例如为荧光蛋白、萤光素酶或用于蓝白斑筛选的β-半乳糖苷酶。

此外，可另外通过常规PCR、菌落PCR或酶切等方法对获得的重组子进行鉴定。这些鉴定方法均是分子生物学领域的常规方法。例如参见《分子克隆实验指南》(第4版)。

当重组载体为大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒或大肠杆菌-链霉菌-酿酒酵母等穿梭质粒时，可将重组载体再次转化入大肠杆菌进行扩增。

试剂盒

本发明还提供了用于方便有效地实施本发明所述的分子克隆方法的试剂盒。所述试剂盒包含独立包装的sgRNA克隆载体、Cas9核酸酶以及酿酒酵母细胞。在一些实施方式中，所述试剂盒还可包含初始载体、sgRNA体外转录试剂、Cas9核酸酶切缓冲液、酵母转化试剂或上述物质的任意组合。

本文所述各方面的实施方式可由如下编号的段落说明：

1.一种分子克隆方法，所述方法通过将一个或多个目的DNA片段插入初始载体、从所述初始载体上删除一个或多个DNA片段和/或将所述初始载体上的一个或多个DNA片段替换为目的DNA片段，获得重组载体，所述方法包含如下步骤：

(1)定位：针对所述初始载体上待实施插入、删除和/或替换的各个位点，设计并通过体外转录合成sgRNA；

(2)酶切：在体外利用Cas9核酸酶和步骤(1)获得的sgRNA对所述初始载体进行酶切，使得所述待实施插入、删除和/或替换的各个位点处的DNA双链断裂，对酶切后的各初始载体片段进行回收和纯化；

(3)制备同源臂序列：针对待连接的各相邻片段，制备用于酿酒酵母同源重组的同源臂序列，所述同源臂序列位于第一待连接片段和/或第二待连接片段的侧翼，或者所述同源臂序列以同源臂片段的形式单独存在；

(4)连接和转化：将步骤(3)制备的所述同源臂序列、步骤(2)获得的所述初始载体片段以及任选的所述目的DNA片段转化入酿酒酵母细胞；

(5)筛选和获得重组载体：筛选出带有所述重组载体的酿酒酵母细胞阳性克隆，从而获得带有重组载体的酿酒酵母细胞，

其中，所述重组载体为能够在所述酿酒酵母细胞中复制的载体。

2.如段落1所述的方法，其特征在于，所述方法通过一次转化筛选，将1-10个所述目的DNA片段插入所述初始载体、将所述初始载体上的1-10个DNA片段删除和/或将所述初始载体上的1-10个DNA片段替换为1-10个所述目的DNA片段。

3.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，待实施插入和/或替换的所述目的DNA片段的长度为1bp-100kbp。

4.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，所述初始载体上待实施删除和/或被替换的DNA片段的长度为1bp-100kbp。

5.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，待实施替换的所述目的DNA片段与所述初始载体上被替换的DNA片段的长度之差为0-100kbp。

6.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组载体的长度不超过100kbp。

7.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，所述初始载体为宿主特异性质粒。

8.如段落7所述的方法，其特征在于，所述初始载体为能够在大肠杆菌、链霉菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、真菌、哺乳动物、植物、酿酒酵母、裂殖酿酒酵母和/或毕赤酿酒酵母中复制的质粒。

9.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，所述初始载体为穿梭质粒。

10.如段落9所述的方法，其特征在于，所述初始载体为大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒、大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭质粒、细菌-哺乳动物细胞穿梭质粒、细菌-植物细胞穿梭质粒、大肠杆菌-丝状真菌穿梭质粒、大肠杆菌-链霉菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-丝状真菌-酿酒酵母穿梭质粒，大肠杆菌-枯草芽孢杆菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌-酿酒酵母穿梭质粒、细菌-哺乳动物-酿酒酵母细胞穿梭质粒或细菌-植物细胞-酿酒酵母穿梭质粒。

11.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，待实施插入和/或待实施替换的所述目的DNA片段中的一个或多个为编码抗生素抗性蛋白和/或营养缺陷相关蛋白的DNA片段。

12.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，所述初始载体上被替换的DNA片段中的一个或多个为编码抗生素抗性蛋白或营养缺陷相关蛋白的DNA片段。

13.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，待实施替换的所述目的DNA片段中的一个为编码抗生素抗性蛋白或营养缺陷相关蛋白的DNA片段，所述初始载体上被替换的DNA片段为编码另一抗生素抗性蛋白或营养缺陷相关蛋白的DNA片段。

14.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，待实施插入和/或待实施替换的所述目的DNA片段中的一个包含酿酒酵母源复制起始位点。

15.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组载体为穿梭质粒。

16.如段落15所述的方法，其特征在于，所述重组载体为大肠杆菌-链霉菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-丝状真菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌-酿酒酵母穿梭质粒、细菌-哺乳动物-酿酒酵母细胞穿梭质粒、细菌-植物细胞-酿酒酵母穿梭质粒。

17.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组载体为严谨型质粒。

18.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组载体为单拷贝质粒。

19.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，通过如下方法设计并通过体外转录合成sgRNA：首先在所述初始载体的待实施插入、删除和/或替换的位点处搜寻“NGG”序列，其中N表示任意核苷酸，设计针对所述待实施插入、删除和/或替换的位点的sgRNA；随后通过重叠PCR获得所述sgRNA的体外转录模板；利用T7RNA聚合酶进行体外转录，获得针对各实施插入、删除和/或替换的位点的sgRNA。

20.如段落19所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的体外转录模板包含T7启动子、crRNA以及tracRNA序列。

21.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，利用如下体系对所述初始载体进行酶切：

22.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)还包括利用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。

23.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，对于待实施插入和/或替换的各个位点而言，可通过如下任一种方式设置同源臂序列：

(a1)将第一同源臂序列设置于上游载体片段的3'末端，所述第一同源臂具有与所述目的DNA片段的5'末端序列同源的序列，将第二同源臂序列设置于下游载体片段的5'末端，所述第二同源臂具有与所述目的DNA片段的3'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：带有第一同源臂序列的上游载体片段、带有第二同源臂序列的下游载体片段和目的DNA片段；

(b1)将第一同源臂序列设置于上游载体片段的3'末端，所述第一同源臂具有与所述目的DNA片段的5'末端序列同源的序列，将第二同源臂序列设置于目的DNA片段的3'末端，所述第二同源臂具有与下游载体片段的5'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：带有第一同源臂序列的上游载体片段、带有第二同源臂序列的目的DNA片段和下游载体片段；

(c1)将第一同源臂序列设置于目的DNA片段的5'末端，所述第一同源臂具有与上游载体片段的3'末端序列同源的序列，将第二同源臂序列设置于下游载体片段的5'末端，所述第二同源臂具有与所述目的DNA片段的3'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：上游载体片段、带有第一同源臂序列的目的DNA片段和带有第二同源臂序列的下游载体片段；

(d1)将第一同源臂序列设置于目的DNA片段的5'末端，所述第一同源臂具有与上游载体片段的3'末端序列同源的序列，将第二同源臂序列设置于目的DNA片段的3'末端，所述第二同源臂具有与下游载体片段的5'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：上游载体片段、带有第一同源臂序列和第二同源臂序列的目的DNA片段以及下游载体片段；

(e1)将第一同源臂序列设置于上游载体片段的3'末端，所述第一同源臂具有与所述目的DNA片段的5'末端序列同源的序列，将第二同源臂序列设置于目的DNA片段的5'末端，所述第二同源臂具有与上游载体片段的3'末端序列同源的序列，将第三同源臂序列设置于目的DNA片段的3'末端，所述第三同源臂具有与下游载体片段的5'末端序列同源的序列，将第四同源臂序列设置于下游载体片段的5'末端，所述第四同源臂具有与所述目的DNA片段的3'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：带有第一同源臂序列的上游载体片段、带有第二同源臂序列和第三同源臂序列的目的DNA片段以及带有第四同源臂序列的下游载体片段；

(f1)制备独立的第一同源臂片段和第二同源臂片段，其中，所述第一同源臂片段具有与上游载体片段的3'末端序列同源的序列和与所述目的DNA片段的5'末端序列同源的序列，所述第二同源臂片段具有与所述目的DNA片段的3'末端序列同源的序列和与下游载体片段的5'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：上游载体片段、目的DNA片段、下游载体片段、第一同源臂片段和第二同源臂片段。

24.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，对于待实施删除的各位点而言，可通过选自于由如下方式组成的组中的任一种方式设置同源臂：

(a2)将同源臂序列设置于上游载体片段的3'末端，所述同源臂具有与下游载体片段的5'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：下游载体片段和带有同源臂序列的上游载体片段；

(b2)将同源臂序列设置于下游载体片段的5'末端，所述同源臂具有与上游载体片段的3'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：上游载体片段和带有同源臂序列的下游载体片段；

(c2)将第一同源臂序列设置于上游载体片段的3'末端，并将第二同源臂序列设置于下游载体片段的5'末端，所述第一同源臂具有与下游载体片段的5'末端序列同源的序列，所述第二同源臂具有与上游载体片段的3'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：带有第一同源臂序列的上游载体片段和带有第二同源臂序列的下游载体片段；或

(d2)制备独立的同源臂片段，其中，所述同源臂片段具有与上游载体片段的3'末端序列同源的序列和与下游载体片段的5'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：上游载体片段、下游载体片段和同源臂片段。

25.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述同源臂序列的长度为15-80bp。

26.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述同源臂序列的长度为40bp。

27.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述同源臂序列与相应的待连接序列末端的一致性为70％-100％。

28.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，将步骤(3)获得的所述同源臂序列、步骤(2)获得的所述初始载体片段以及任选的所述目的DNA片段转化入酿酒酵母细胞利用如下任一种方法进行：

乙酸锂转化、原生质体转化或电转化。

29.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，利用如下的一种或多种方法实施所述筛选：

多重PCR、利用抗生素抗性或营养缺陷培养基进行培养以及报告子检测。

30.如在前段落中任一项所述的方法，其特征在于，在大肠杆菌中对所述重组载体进行扩增。

31.一种实施段落1-30中任一项所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包含独立包装的sgRNA克隆载体、Cas9核酸酶以及酿酒酵母细胞。

32.如段落31所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含初始载体、sgRNA体外转录试剂、Cas9核酸酶切缓冲液、酵母转化试剂，或上述物质的任意组合。

下列实施例阐明了本发明的一些实施方式和方面。对相关领域技术人员来说显而易见的是，可以在不改变本发明的精神或范围的情况下进行各种修改、增加、替换等，这些修改和变化都涵盖于所附权利要求书所限定的本发明的范围之内。下述实施例不以任何方式对本发明进行限制。

实施例

在本发明实施例中使用的初始载体为pHY-wt(SEQ.ID.NO：1)。pHY-wt为大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒，其质粒图谱如图2所示。其中，pUC/pMB1Ori序列为大肠杆菌复制起始位点。ampR序列为编码氨苄青霉素抗性蛋白的序列。ura3序列为编码酵母尿嘧啶酸合成途径的乳清酸核苷5'-磷酸脱羧酶的序列，为尿嘧啶营养缺陷筛选标记。CEN/ARS为酿酒酵母复制起始位点。pHY-wt不具有多克隆位点。

本发明实施例中操作的目的片段为trp1(SEQ.ID.NO：2)、lacZ(SEQ.ID.NO：3)、mRFP(SEQ.ID.NO：4)和Apr(SEQ.ID.NO：5)。trp1为编码酿酒酵母酪氨酸酶相关蛋白-1的序列，lacZ为编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶的序列，mRFP为编码红色荧光蛋白的序列，Apr为编码安普霉素抗性蛋白的序列。

本发明实施例中的作为宿主的酿酒酵母为高转化率的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株VL6-48(购自American Type Culture Collection，ATCC编号MYA-3666)(MATα，ura3-Δ200，trp1-Δ1，ura3-52，lys2，ade2-101，met14，psi+cir0)。该菌株中ura3和trp1基因被敲除。

该宿主细胞可在补充有100mg/L腺嘌呤的YPD琼脂固体培养基上生长，该培养基在4℃储存备用。

本发明实施例中使用的各培养基为(如未特别指出，如下使用的化合物购自SIGMA)：

10×葡萄糖储液：葡萄糖浓度为20％(w/v)，0.22μm滤器过滤除菌。

YPD培养基(1L)：将10g酵母提取物、20g蛋白胨溶于水中，121℃高压灭菌20min，冷却后加入100mL 10×葡萄糖储液。

YPD固体培养基(1L)：将10g酵母提取物、20g蛋白胨、20g琼脂溶于水中，121℃高压灭菌20min，冷却至60℃后加入100mL 10×葡萄糖储液，制成平板。

10×无氨基酸、无硫酸铵的酵母氮源(YNB)(m/v＝6.7％)。

10×Drop-out储液(500mL)：将0.1g L-Arg、0.1g L-Met、0.15g L-Tyr、0.15g L-Ile、0.25g L-Phe、0.5g L-Glu、0.5g L-Asp、0.75gL-Val、1g L-Thr、2g L-Ser溶于500mLMilli-Q水中，用0.22μm滤器过滤。

100×Leu储液(200mL)：2g L-亮氨酸溶于200mL Milli-Q水中。

100×His储液(200mL)：0.4g L-组氨酸溶于200mL Milli-Q水中。

100×Trp储液(200mL)：0.4g L-色氨酸溶于200mL Milli-Q水中。

100×Ura储液(200mL)：0.4g尿嘧啶溶于200mL Milli-Q水中。

100×Ade储液(200mL)：0.4g腺嘌呤溶于200mL Milli-Q水中。

上述100×Leu、100×His、100×Trp、100×Ura和100×Ade储液均用0.22μm滤器过滤除菌。

SC-Ura培养基(1L)：100mL 10×无氨基酸、无硫酸铵的酵母氮源、100mL 10×葡萄糖储液、100mL 10×Drop-out储液、10mL 100×His储液、10mL 100×Leu储液、10mL 100×Trp储液、10mL 100×Ade储液、660mL Milli-Q水。

SC-Trp培养基(1L)：100mL 10×无氨基酸、无硫酸铵的酵母氮源、100mL 10×葡萄糖储液、100mL 10×Drop-out储液、10mL 100×His储液、10mL 100×Leu储液、10mL 100×Ura储液、10mL 100×Ade储液、660mL Milli-Q水。

SC-Ura和SC-Trp的固体培养基制备方法均为：将20g琼脂溶于660mL Milli-Q水中，121℃高压灭菌20min，冷却至60℃后按液体培养基配方加入各储液，制成平板。

本实施例使用的各转化试剂为(如未特别指出，如下使用的化合物购自SIGMA)：

1M山梨醇(121℃高压灭菌20min)。

Milli-Q水(121℃高压灭菌20min)。

SPE溶液：1M山梨醇、10mM HEPES(pH 7.5)、10mM EDTA(用0.22μm滤器过滤除菌)。

STC溶液：1M山梨醇、10mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM CaCl₂(用0.22μm滤器过滤除菌)。

SOS溶液：1M山梨醇、6.5mM CaCl₂、0.25％(w/v)酵母提取物、0.5％(w/v)蛋白胨(用0.22μm滤器过滤除菌)。

20％PEG：20％(w/v)PEG 8000、10mM CaCl₂、10mM Tris-HCl(pH 7.5)、(用0.22μm滤器过滤除菌)。

溶细胞酶Zymolyase-20T：10mg/mL zymolyase-20T(MP Bio)、25w/v％甘油、50mMTris-HCl(pH 7.5)。

酵母原生质体转化下层选择性培养基：下层尿嘧啶选择性固体培养基和下层色氨酸固体选择性培养基分别为终浓度为1M山梨醇的SC-Ura固体培养基和SC-Trp固体培养基。

酵母原生质体转化上层选择性培养基：除了琼脂的终浓度为3％，其它成分与酵母原生质体转化下层选择性培养基一致。

酵母原生质体转化选择培养基(上层)：除了3％琼脂，其余成分与下层一致。

本发明实施例中涉及的sgRNA、制备同源臂的引物和检测引物如下表1-3所示。

表1：实施例1-12的sgDNA序列与制备sgRNA体外转录模板的引物

表2：实施例1-12中制备同源臂的引物

表3：实施例1-12的检测引物序列

本实施例中全部利用试剂盒的操作均按照制造商的说明实施。

实施例1-3：将1-3个目的片段分别插入初始载体的不同位置，同时用另一目的片段替换初始载体另一位置的一个被替换片段；其中，同源臂序列位于相邻待连接片段中一条的侧翼

实施例1：将一个目的片段插入初始载体，同时用另一目的片段替换初始载体另一位置的被替换片段

本实施例的目的在于，将目的片段mRFP(SEQ.ID.NO：4)插入至初始载体的位点IV，同时，将位点I和II之间的片段ura3(SEQ.ID.NO：6)替换为目的片段trp1(SEQ.ID.NO：2)。

(1)定位：设计针对图3的位点I、II和IV的sgDNA序列(sgDNA-1、sgDNA-2、sgDNA-3，如表1所示)。利用重叠PCR的方法将各sgDNA连接入sgRNA体外转录模板(SEQ.ID.NO：7)，重叠PCR所使用的引物参见表1。

利用PCR纯化试剂盒(Omega-D6492)对获得的sgRNA体外转录模板进行回收纯化。

采用Epicenter ASF3257商用试剂盒实施利用T7RNA聚合酶的体外转录，获得针对各待操作的位点的sgRNA(sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3)，将获得的全部sgRNA等浓度混合。

(2)酶切：在体外利用Cas9核酸酶和步骤(1)获得的sgRNA对所述初始载体进行酶切，使得位点I、位点II和位点IV处DNA双链断裂，所述酶切体系为：

其中所述5×缓冲液成分为(100mM HEPES(pH 7.5)；750mM KCl；0.5mM EDTA；50mMMgCl₂)

该反应在37℃进行2h。通过琼脂糖凝胶电泳进行产物检测，利用乙醇沉淀法回收各片段。

(3)制备同源臂序列：

制备5'和3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段：分别以引物1-1F和2-2R(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得5'和3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段，其中，所述5'和3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段的5'末端40bp为与图3的片段5的3'末端40bp一致的序列；其3'末端40bp为与图3的片段2的5’末端40bp一致的序列。

制备5'和3'侧翼带有同源臂序列的mRFP片段：分别以引物BF1和BR2(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得5'和3'侧翼带有同源臂序列的mRFP片段，其中，所述5'和3'侧翼带有同源臂序列的mRFP片段的5'末端40bp为与图3的片段3的3'末端40bp一致的序列；其3'末端40bp为与图3的片段4的5'末端40bp一致的序列。

利用PCR纯化试剂盒(Omega-D6492)纯化回收上述带有同源臂序列的片段。

(4)连接和转化：利用乙酸锂转化的方法，将步骤(3)制备的带有同源臂序列的trp1片段、带有同源臂序列的mRFP片段以及步骤(2)获得的载体片段转化入酵母细胞。

所述乙酸锂转化方法的步骤为：(a)将酵母宿主VL6-48从甘油管活化至YPD固体平板上，30℃培养48h。挑取单菌落到1-2mL YPD液体培养基中，过夜培养测OD₆₀₀，根据OD值按比例用YPD液体培养基稀释至OD₆₀₀＝0.1。继续培养2.5h，此时OD达到0.4。每份转化需OD值0.4的菌液5mL。(b)在2500rcf对菌液室温离心5min，用乙酸锂溶液(1体积10×TE，pH7.5、1体积10×乙酸锂、8体积无菌超纯水，终浓度100mM)洗涤两次，轻柔吹打。每5mL收集的菌体用30μL乙酸锂(100mM)进行悬浮，在离心菌体的同时处理鲑鱼精DNA(ssDNA)，煮沸5min后迅速放在冰上，避免双链DNA退火。(c)准备如下所述的转化缓冲液体系，将该体系于30℃孵育30min，随后42℃热休克15min。(d)2500rcf室温离心1min，弃去上清。用150μL YPD液体培养基温柔重悬细胞，在30℃摇床上复苏2～3h。最后将菌液涂布在SC-Trp固体培养基上，培养48h。

所述转化体系为：

(5)筛选和获得重组载体：对在SC-Trp选择性培养基上生长的菌落进行菌落PCR，挑选阳性克隆(即带有重组载体的克隆)，提取质粒进行保存。所述菌落PCR的引物对如表3所示，菌落PCR的琼脂糖凝胶电泳结果在图4中示出。本实施例方法的效率和统计结果如表4所示。

实施例2：将两个目的片段插入初始载体的不同位置，同时用另一目的片段替换初始载体另一位置的被替换片段

本实施例的目的在于，将目的片段mRFP(SEQ.ID.NO：4)和lacZ(SEQ.ID.NO：3)分别插入至初始载体的位点IV和位点III，同时，将位点I和II之间的片段ura3替换为目的片段trp1。

(1)定位：通过与实施例1所述类似的方法，设计并合成针对图3的位点I、位点II、位点IV和位点III的sgRNA序列(sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3和sgRNA-4，如表1所示)。将获得的全部sgRNA等浓度混合。

(2)酶切：通过与实施例1所述类似的方法，在体外利用Cas9核酸酶和步骤(1)获得的sgRNA对所述初始载体进行酶切，使得位点I、位点II、位点IV和位点III处DNA双链断裂。通过琼脂糖凝胶电泳进行产物检测，利用乙醇沉淀法回收各片段。

(3)制备同源臂序列：通过与实施例1所述相同的方法，制备5'和3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段和5'和3'侧翼带有同源臂序列的mRFP片段。

制备5'和3'侧翼带有同源臂序列的lacZ片段：分别以引物AF1和AR2(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得5'和3'侧翼带有同源臂序列的lacZ片段，其中，带有同源臂序列的lacZ片段的5'末端40bp为与图3的片段2的3'末端40bp一致的序列；其3'末端40bp为与图3的片段3的5'末端40bp一致的序列。

利用PCR纯化试剂盒(Omega-D6492)纯化回收上述带有同源臂序列的片段。

(4)连接和转化：利用如实施例1所述的乙酸锂转化的方法，将步骤(3)制备的5'和3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段、5'和3'侧翼带有同源臂序列的mRFP片段、5'和3'侧翼带有同源臂序列的lacZ片段以及步骤(2)获得的载体片段转化入酵母细胞。

(5)筛选和获得重组载体：对在SC-Trp选择性培养基上生长的菌落进行菌落PCR，挑选阳性克隆(即带有重组载体的克隆)，提取质粒进行保存。所述菌落PCR的引物对如表3所示，菌落PCR的琼脂糖凝胶电泳结果在图4中示出。本实施例方法的效率和统计结果如表4所示。

实施例3：将三个目的片段插入初始载体的不同位置，同时用另一目的片段替换初始载体另一位置的被替换片段

本实施例的目的在于，将目的片段mRFP(SEQ.ID.NO：4)、lacZ(SEQ.ID.NO：3)、Apr(SEQ.ID.NO：5)分别插入至初始载体的位点IV、位点III和位点V，同时，将位点I和II之间的片段ura3替换为目的片段trp1。

(1)定位：通过与实施例1所述类似的方法，设计并合成针对图3的位点I、位点II、位点IV、位点III和位点V的sgRNA序列(sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3、sgRNA-4和sgRNA-5，如表1所示)。将获得的全部sgRNA等浓度混合。

(2)酶切：通过与实施例1所述类似的方法，在体外利用Cas9核酸酶和步骤(1)获得的sgRNA对所述初始载体进行酶切，使得位点I、位点II、位点IV、位点III和位点V处DNA双链断裂。通过琼脂糖凝胶电泳进行产物检测，利用乙醇沉淀法回收各片段。

(3)制备同源臂序列：通过与实施例2所述相同的方法，制备5'和3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段、5'和3'侧翼带有同源臂序列的mRFP片段和5'和3'侧翼带有同源臂序列的lacZ片段。

制备5'和3'侧翼带有同源臂序列的Apr片段：分别以引物CF1和CR2(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得带有同源臂序列的Apr片段，其中，带有同源臂序列的Apr片段的5'末端40bp为与图3的片段4的3'末端40bp一致的序列；其3'末端40bp为与图3的片段5的5'末端40bp一致的序列。

利用PCR纯化试剂盒(Omega-D6492)纯化回收上述带有同源臂序列的片段。

(4)连接和转化：通过与实施例1所述相同的方法，利用乙酸锂转化的方法，将步骤(3)制备的5'和3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段、5'和3'侧翼带有同源臂序列的mRFP片段、5'和3'侧翼带有同源臂序列的lacZ片段、5'和3'侧翼带有同源臂序列的Apr片段以及步骤(2)获得的载体片段转化入酵母细胞。

(5)筛选和获得重组载体：对在SC-Trp选择性培养基上生长的菌落进行菌落PCR，挑选阳性克隆(即带有重组载体的克隆)，提取质粒进行保存。所述菌落PCR的引物对如表3所示，菌落PCR的琼脂糖凝胶电泳结果在图4中示出。本实施例方法的效率和统计结果如表4所示。

表4

*2/20表示在检验的20个克隆中，所有待插入片段均未插入的克隆数为2个。**转化子数目为每个平板的克隆数。

需要指出的是，ura3片段未被trp1替换的克隆不能在SC-Trp选择性培养基上生长。因此，可见的克隆中ura3均被trp1正确替换。从表4的结果可以看出，本发明方法的实施例1-3均具有超过85％的阳性率，平板上的克隆数目也很多。这表明本发明方法的效率和正确率均高。

实施例4-6：将1-3个目的片段分别插入初始载体的不同位置，同时用另一目的片段替换初始载体另一位置的一个被替换片段；其中，一些待实施插入和/或替换的位点的同源臂序列以独立的同源臂片段的形式存在，另一些待实施插入和/或替换的位点的同源臂序列存在于待插入和/或替换的片段的侧翼

实施例4：将一个目的片段插入初始载体，同时用另一目的片段替换初始载体另一位置的被替换片段

本实施例与实施例1的目的相同，将目的片段mRFP(SEQ.ID.NO：4)、插入至初始载体的位点IV，同时，将位点I和II之间的片段ura3替换为目的片段trp1。通过与实施例1相同的方法实施步骤(1)和步骤(2)。

对于步骤(3)制备同源臂序列，

制备3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段：分别以引物trp1-F和2-2R(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段，其中，3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段的3'末端40bp为与图3的片段2的5'末端40bp一致的序列；

制备3'侧翼带有同源臂序列的mRFP片段：分别以引物rfp-F和BR2(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得3'侧翼带有同源臂序列的mRFP片段，其中，3'侧翼带有同源臂序列的mRFP片段的3'末端40bp为与图3的片段4的5'末端40bp一致的序列；

制备第一同源臂片段：分别以引物1-1F和1-1R(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得第一同源臂序列T1，T1片段的5'末端40bp为与图3的片段5的3'末端40bp一致的序列，T1片段的3'末端40bp为与图3的片段6的5'末端40bp一致的序列，

制备第二同源臂片段：分别以引物BF1和BR1(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得第二同源臂序列T2，T2片段的5'末端40bp为与图3的片段3的3'末端40bp一致的序列，T2片段的3'末端40bp为与图3的片段8的5'末端40bp一致的序列；

利用PCR纯化试剂盒(Omega-D6492)纯化回收上述带有同源臂序列的片段和单独的同源臂片段。

(4)连接和转化：利用原生质体转化的方法，将步骤(3)制备的3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段、3'侧翼带有同源臂序列的mRFP片段、第一同源臂T1、第二同源臂T2以及步骤(2)获得的载体片段转化入酵母细胞。

所述原生质体转化的步骤为：(a)将酵母宿主VL6-48从甘油管活化至YPD固体平板上，30℃培养48h。挑取单菌落到1-2mL YPD液体培养基中，转接到50mL YPD培养基继续培养5-8h，此时OD达到0.8-1.0。(b)将菌液置于冰上10min，1800g 4℃离心3min，收集菌体，弃去上清，用50mL无菌水洗涤细胞，再加入50mL1M山梨醇，4℃放置过夜。(c)1800g，4℃离心3min，收集菌体，加入20mL SPE溶液混匀。加入40μL巯基乙醇和80μL酵母溶细胞酶溶液(zymolyase-20T),30℃反应40min。(d)补充1M山梨醇溶液到50mL后混匀，4℃、600g离心10分钟，收集细胞。用20mL 1M山梨醇溶液重悬细胞，用吸管上下吹吸几次。补充1M山梨醇溶液到50mL，混匀。4℃、600g离心10分钟，收集细胞。用4mL STC溶液重悬细胞，室温放置10min。(e)在200μL制备的原生质体中加入各初始载体片段、各目的片段和各同源臂片段的混合物(总体积小于40μL)，将原生质体/DNA片段混合物室温放置10min，加入0.8mL 20％PEG溶液，颠倒混匀10次，室温放置20min，4℃、600g离心10分钟，弃去上清。(f)加入800μL SOS溶液，混匀，30℃孵育30-40min。(g)将细胞悬液加入至7mL酵母原生质体转化上层选择性培养基(Trp-，60℃)：混匀，立即铺到下层选择性培养基平板(Trp-)上。将平板30℃培养3-5天。

(5)筛选和获得重组载体：对在SC-Trp选择性培养基上生长的菌落进行菌落PCR，挑选阳性克隆(即带有重组载体的克隆)，提取质粒进行保存。所述菌落PCR的引物对如表3所示，菌落PCR的琼脂糖凝胶电泳结果在图5中示出。本实施例方法的效率和统计结果如表5所示。

实施例5：将两个目的片段插入初始载体的不同位置，同时用另一目的片段替换初始载体另一位置的被替换片段

本实施例与实施例2的目的相同，将目的片段mRFP(SEQ.ID.NO：4)和lacZ(SEQ.ID.NO：3)分别插入至初始载体的位点IV和位点III，同时，将位点I和II之间的片段ura3替换为目的片段trp1。通过与实施例2相同的方法实施步骤(1)和步骤(2)。

对于步骤(3)制备同源臂序列，通过与实施例4所述相同的方法，制备3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段、3'侧翼带有同源臂序列的mRFP片段、第一同源臂T1、第二同源臂T2。

另外，制备3'侧翼带有同源臂序列的lacZ片段：分别以引物lacZ-F和AR2(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得3'侧翼带有同源臂序列的lacZ片段，其中，3'侧翼带有同源臂序列的lacZ片段的3'末端40bp为与图3的片段3的5'末端40bp一致的序列；

制备第三同源臂片段：分别以引物AF1和AR1(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得第三同源臂序列T3，T3片段的5'末端40bp为与图3的片段2的3'末端40bp一致的序列，T3片段的3'末端40bp为与图3的片段7的5'末端40bp一致的序列；

(4)连接和转化：通过与实施例4所述相同的方法，利用原生质体转化的方法，将步骤(3)制备的3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段、3'侧翼带有同源臂序列的mRFP片段、3'侧翼带有同源臂序列的lacZ片段、第一同源臂T1、第二同源臂T2、第三同源臂T3以及步骤(2)获得的载体片段转化入酵母细胞。

(5)筛选和获得重组载体：对在SC-Trp选择性培养基上生长的菌落进行菌落PCR，挑选阳性克隆(即带有重组载体的克隆)，提取质粒进行保存。所述菌落PCR的引物对如表3所示，菌落PCR的琼脂糖凝胶电泳结果在图5中示出。本实施例方法的效率和统计结果如表5所示。

实施例6：将三个目的片段插入初始载体的不同位置，同时用另一目的片段替换初始载体另一位置的被替换片段

本实施例与实施例3的目的相同，将目的片段mRFP(SEQ.ID.NO：4)、lacZ(SEQ.ID.NO：3)、Apr(SEQ.ID.NO：5)分别插入至初始载体的位点IV、位点III和位点V，同时，将位点I和II之间的片段ura3替换为目的片段trp1。通过与实施例3相同的方法实施步骤(1)和步骤(2)。

对于步骤(3)制备同源臂序列，通过与实施例5所述相同的方法，制备3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段、3'侧翼带有同源臂序列的mRFP片段、3'侧翼带有同源臂序列的lacZ片段、第一同源臂T1、第二同源臂T2和第三同源臂T3。

另外，制备3'侧翼带有同源臂序列的Apr片段：分别以引物Apr-F和CR2(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得3'侧翼带有同源臂序列的Apr片段，其中，3'侧翼带有同源臂序列的Apr片段的3'末端40bp为与图3的片段5的5'末端40bp一致的序列；

制备第四同源臂片段：分别以引物CF1和CR1(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得第四同源臂序列T4，T4片段的5'末端40bp为与图3的片段4的3'末端40bp一致的序列，T4片段的3'末端40bp为与图3的片段9的5'末端40bp一致的序列

(4)连接和转化：通过与实施例4所述相同的方法，利用原生质体转化的方法，将步骤(3)制备的3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段、3'侧翼带有同源臂序列的mRFP片段、3'侧翼带有同源臂序列的LacZ片段、3'侧翼带有同源臂序列的Apr片段、第一同源臂T1、第二同源臂T2、第三同源臂T3、第四同源臂T4以及步骤(2)获得的载体片段转化入酵母细胞。

(5)筛选和获得重组载体：对在SC-Trp选择性培养基上生长的菌落进行菌落PCR，挑选阳性克隆(即带有重组载体的克隆)，提取质粒进行保存。所述菌落PCR的引物对如表3所示，菌落PCR的琼脂糖凝胶电泳结果在图5中示出。本实施例方法的效率和统计结果如表5所示。

表5

*2/20表示在检验的20个克隆中，所有待插入片段均未插入的克隆数为2个。**转化子数目为每板克隆数。

需要指出的是，ura3片段未被trp1替换的克隆不能在SC-Trp选择性培养基上生长。因此，可见的克隆中ura3均被trp1正确替换。从表5的结果可以看出，本发明方法的实施例4-6均具有超过85％的阳性率，平板上的克隆数目也很多。这表明本发明方法的效率和正确率均高。

实施例7：将三个目的片段插入初始载体的不同位置，同时用另一目的片段替换初始载体另一位置的被替换片段；其中一个待实施插入的目的片段具有独立的同源臂片段，其它两个待实施插入的目的片段和待实施替换的目的片段的两个侧翼带有同源臂序列

本实施例与实施例3的目的相同，将目的片段mRFP(SEQ.ID.NO：4)、lacZ(SEQ.ID.NO：3)、Apr(SEQ.ID.NO：5)分别插入至初始载体的位点IV、位点III和位点V，同时，将位点I和II之间的片段ura3替换为目的片段trp1。通过与实施例3相同的方法实施步骤(1)和步骤(2)。

对于步骤(3)制备同源臂序列，通过与实施例3所述相同的方法，制备5'和3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段、5'和3'侧翼带有同源臂序列的lacZ片段、5'和3'侧翼带有同源臂序列的Apr片段。另外，

制备不带同源臂的mRFP片段：分别以引物rfp-F和rfp-R(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得mRFP片段自身。

制备第一同源臂片段：分别以引物BF1和BR1(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得第一同源臂序列T1，T1片段的5'末端40bp为与图3的片段3的3'末端40bp一致的序列，T1片段的3'末端40bp为与图3的片段8(mRFP片段)的5'末端40bp一致的序列。

制备第二同源臂片段：分别以引物BF2和BR2(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得第二同源臂序列T2，T2片段的5'末端40bp为与图3的片段8的3'末端40bp一致的序列，T2片段的3'末端40bp为与片段4的5'末端40bp一致的序列。

(4)连接和转化：通过酵母转化试剂盒(Sigma YEAST1)实施所述步骤，将步骤(3)制备的5'和3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段、5'和3'侧翼带有同源臂序列的lacZ片段、5'和3'侧翼带有同源臂序列的Apr片段、mRFP片段、第一同源臂T1、第二同源臂T2以及步骤(2)获得的载体片段转化入酵母细胞。

(5)筛选和获得重组载体：对在SC-Trp选择性培养基上生长的菌落进行菌落PCR，挑选阳性克隆(即带有重组载体的克隆)，提取质粒进行保存。所述菌落PCR的引物对如表3所示，菌落PCR的琼脂糖凝胶电泳结果在图6中示出。本实施例方法的效率和统计结果如表6所示。

实施例8：将三个目的片段插入初始载体的不同位置，同时用另一目的片段替换初始载体另一位置的被替换片段；其中两个待实施插入的目的片段具有独立的同源臂片段，另一待实施插入的目的片段和待实施替换的目的片段的的两个侧翼带有同源臂序列

本实施例与实施例3的目的相同，将目的片段mRFP(SEQ.ID.NO：4)、lacZ(SEQ.ID.NO：3)、Apr(SEQ.ID.NO：5)分别插入至初始载体的位点IV、位点III和位点V，同时，将位点I和II之间的片段ura3替换为目的片段trp1。通过与实施例3相同的方法实施步骤(1)和步骤(2)。

对于步骤(3)制备同源臂序列，通过与实施例7所述相同的方法，制备5'和3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段、5'和3'侧翼带有同源臂序列的Apr片段、mRFP片段、第一同源臂T1、第二同源臂T2。另外，

制备不带同源臂的lacZ片段：分别以引物lacZ-F和lacZ-R(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得lacZ片段自身。

制备第三同源臂片段：分别以引物AF1和AR1(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得第三同源臂序列T3，T3片段的5'末端40bp为与片段2的3'末端40bp一致的序列；T3片段的3'末端40bp为与图3的片段7(lacZ片段)的5'末端40bp一致的序列；

制备第四同源臂片段：分别以引物AF2和AR2(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得第四同源臂序列T4，T4片段的5'末端40bp为与图3的片段7的3'末端40bp一致的序列，T4片段的3'末端40bp为与图3的片段3的5'末端40bp一致的序列

(4)连接和转化：通过酵母转化试剂盒(Sigma YEAST1)实施所述步骤，将步骤(3)制备的5'和3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段、5'和3'侧翼带有同源臂序列的Apr片段、mRFP片段、lacZ片段、第一同源臂T1、第二同源臂T2和第三同源臂T3、第四同源臂T4以及步骤(2)获得的载体片段转化入酵母细胞。

(5)筛选和获得重组载体：对在SC-Trp选择性培养基上生长的菌落进行菌落PCR，挑选阳性克隆(即带有重组载体的克隆)，提取质粒进行保存。所述菌落PCR的引物对如表3所示，菌落PCR的琼脂糖凝胶电泳结果在图6中示出。本实施例方法的效率和统计结果如表6所示。

实施例9：将三个目的片段插入初始载体的不同位置，同时用另一目的片段替换初始载体另一位置的被替换片段；其中全部三个待实施插入的目的片段具有独立的同源臂片段，待实施替换的目的片段的两个侧翼带有同源臂序列

本实施例与实施例3的目的相同，将目的片段mRFP(SEQ.ID.NO：4)、lacZ(SEQ.ID.NO：3)、Apr(SEQ.ID.NO：5)分别插入至初始载体的位点IV、位点III和位点V，同时，将位点I和II之间的片段ura3替换为目的片段trp1。通过与实施例3相同的方法实施步骤(1)和步骤(2)。

对于步骤(3)制备同源臂序列，通过与实施例8所述相同的方法，制备5'和3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段、mRFP片段、lacZ片段、第一同源臂T1、第二同源臂T2和第三同源臂T3和第四同源臂T4。另外，

制备不带同源臂的Apr片段：分别以引物apr-F和apr-R(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得Apr片段自身。

制备第五同源臂片段：分别以引物CF1和CR1(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得第五同源臂序列T5，T5片段的5'末端40bp为与片段4的3'末端40bp一致的序列；T5片段的3'末端40bp为与图3的片段9(Apr片段)的5'末端40bp一致的序列；

制备第六同源臂片段：分别以引物CF2和CR2(表2)为上下游引物，通过PCR扩增获得第六同源臂序列T6，T6片段的5'末端40bp为与图3的片段9的3'末端40bp一致的序列，T6片段的3'末端40bp为与图3的片段5的5'末端40bp一致的序列

(4)连接和转化：通过酵母转化试剂盒(Sigma YEAST1)实施所述步骤，将步骤(3)制备的5'和3'侧翼带有同源臂序列的trp1片段、mRFP片段、lacZ片段、Apr片段、第一同源臂T1、第二同源臂T2、第三同源臂T3、第四同源臂T4、第五同源臂T5、第六同源臂T6以及步骤(2)获得的载体片段转化入酵母细胞。

(5)筛选和获得重组载体：对在SC-Trp选择性培养基上生长的菌落进行菌落PCR，挑选阳性克隆(即带有重组载体的克隆)，提取质粒进行保存。所述菌落PCR的引物对如表3所示，菌落PCR的琼脂糖凝胶电泳结果在图6中示出。本实施例方法的效率和统计结果如表6所示。

表6

*2/20表示在检验的20个克隆中，所有待插入片段均未插入的克隆数为2个。**转化子数目为每个平板的克隆数。

需要指出的是，ura3片段未被trp1替换的克隆不能在SC-Trp选择性培养基上生长。因此，可见的克隆中ura3均被trp1正确替换。从表6的结果可以看出，当通过独立的同源臂片段进行重组时，正确率和效率均有所下降。然而，独立的同源臂允许引入突变和/或调控序列，使得更复杂的目的片段操作成为可能。

实施例10-12：将1-3个目的片段插入初始载体，不改变初始载体的筛选标记

实施例10将目的片段mRFP插入位点IV，实施例11将目的片段mRFP、lacZ分别插入位点IV和III，实施例12将目的片段mRFP、lacZ和Apr分别插入位点IV、III和V。实施例10-12采取与实施例1-3类似的方式，区别仅在于不对ura3片段进行替换，步骤(4)使用SC-Ura固体培养基进行选择性培养。

对实施例10-12的克隆进行菌落PCR的结果在图7中示出，方法的效率和统计结果如表7所示。

表7

*2/20表示在检验的20个克隆中，所有待插入片段均未插入的克隆数为2个。**转化子数目为每个平板的克隆数。

从表7的结果可以看出，当待操作片段数目较少时，不改变选择标记可提高效率。然而，当待操作片段数量较多时，改变选择标记可提高阳性率。

Claims (27)

1.一种分子克隆方法，所述方法通过将一个或多个目的DNA片段插入初始载体、从所述初始载体上删除一个或多个DNA片段和/或将所述初始载体上的一个或多个DNA片段替换为目的DNA片段，获得重组载体，所述方法包含如下步骤：

(1)定位：针对所述初始载体上待实施插入、删除和/或替换的各个位点，设计并通过体外转录合成sgRNA；

(2)酶切：在体外利用Cas9核酸酶和步骤(1)获得的sgRNA对所述初始载体进行酶切，使得所述待实施插入、删除和/或替换的各个位点处的DNA双链断裂，对酶切后的各初始载体片段进行回收和纯化；

(3)制备同源臂序列：针对待连接的各相邻片段，制备用于酿酒酵母同源重组的同源臂序列，所述同源臂序列位于各待连接片段的侧翼，或者所述同源臂序列以同源臂片段的形式单独存在；

(4)连接和转化：将步骤(3)制备的所述同源臂序列、步骤(2)获得的所述初始载体片段以及任选的所述目的DNA片段转化入酿酒酵母细胞；

(5)筛选和获得重组载体：筛选出带有所述重组载体的酿酒酵母细胞阳性克隆，从而获得带有重组载体的酿酒酵母细胞，

其中，所述重组载体为能够在所述酿酒酵母细胞中复制的载体；其中，在所述方法中，同时针对多个位点实施所述插入、删除和/或替换；

其中，在步骤(2)中，利用如下体系对所述初始载体进行酶切：

其中，所述Cas9核酸酶的浓度为1mg/mL，所述步骤(1)获得的sgRNA中各sgRNA的浓度分别为100ng/μL。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法通过一次转化筛选，将1-10个所述目的DNA片段插入所述初始载体、将所述初始载体上的1-10个DNA片段删除和/或将所述初始载体上的1-10个DNA片段替换为1-10个所述目的DNA片段。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述重组载体的长度不超过100kbp。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述初始载体为宿主特异性质粒。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述初始载体为能够在大肠杆菌、链霉菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、真菌、哺乳动物、和/或植物中复制的质粒。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述真菌选自酿酒酵母、裂殖酿酒酵母和/或毕赤酿酒酵母。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述初始载体为穿梭质粒。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述初始载体为大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒、大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭质粒、细菌-哺乳动物细胞穿梭质粒、细菌-植物细胞穿梭质粒、大肠杆菌-丝状真菌穿梭质粒、大肠杆菌-链霉菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-丝状真菌-酿酒酵母穿梭质粒，大肠杆菌-枯草芽孢杆菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌-酿酒酵母穿梭质粒、细菌-哺乳动物-酿酒酵母细胞穿梭质粒或细菌-植物细胞-酿酒酵母穿梭质粒。

9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，待实施插入和/或待实施替换的所述目的DNA片段中的一个或多个为编码抗生素抗性蛋白和/或营养缺陷相关蛋白的DNA片段。

10.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述初始载体上被替换的DNA片段中的一个或多个为编码抗生素抗性蛋白或营养缺陷相关蛋白的DNA片段。

11.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，待实施替换的所述目的DNA片段中的一个为编码抗生素抗性蛋白或营养缺陷相关蛋白的DNA片段，所述初始载体上被替换的DNA片段为编码另一抗生素抗性蛋白或营养缺陷相关蛋白的DNA片段。

12.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，待实施插入和/或待实施替换的所述目的DNA片段中的一个包含酿酒酵母源复制起始位点。

13.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述重组载体为穿梭质粒。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述重组载体为大肠杆菌-链霉菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-丝状真菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌-酿酒酵母穿梭质粒、细菌-哺乳动物-酿酒酵母细胞穿梭质粒、细菌-植物细胞-酿酒酵母穿梭质粒。

15.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述重组载体为严谨型质粒。

16.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述重组载体为单拷贝质粒。

17.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，通过如下方法设计并通过体外转录合成sgRNA：首先在所述初始载体的待实施插入、删除和/或替换的位点处搜寻“NGG”序列，其中N表示任意核苷酸，设计针对所述待实施插入、删除和/或替换的位点的sgRNA；随后通过重叠PCR获得所述sgRNA的体外转录模板；利用T7RNA聚合酶进行体外转录，获得针对各实施插入、删除和/或替换的位点的sgRNA。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的体外转录模板包含T7启动子、crRNA以及tracRNA序列。

19.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)还包括利用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。

20.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，对于待实施插入和/或替换的各个位点而言，可通过如下任一种方式设置同源臂序列：

(a1)将第一同源臂序列设置于目的DNA片段的5'末端，所述第一同源臂具有与上游载体片段的3'末端序列同源的序列，将第二同源臂序列设置于目的DNA片段的3'末端，所述第二同源臂具有与下游载体片段的5'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：上游载体片段、带有第一同源臂序列和第二同源臂序列的目的DNA片段以及下游载体片段；

(b1)制备独立的第一同源臂片段和第二同源臂片段，其中，所述第一同源臂片段具有与上游载体片段的3'末端序列同源的序列和与所述目的DNA片段的5'末端序列同源的序列，所述第二同源臂片段具有与所述目的DNA片段的3'末端序列同源的序列和与下游载体片段的5'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：上游载体片段、目的DNA片段、下游载体片段、第一同源臂片段和第二同源臂片段。

21.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，对于待实施删除的各位点而言，可通过如下方式设置同源臂：

(a2)制备独立的同源臂片段，其中，所述同源臂片段具有与上游载体片段的3'末端序列同源的序列和与下游载体片段的5'末端序列同源的序列，从而发生同源重组的各片段为：上游载体片段、下游载体片段和同源臂片段。

22.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述同源臂序列的长度为15-80bp。

23.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述同源臂序列的长度为40bp。

24.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述同源臂序列与相应的待连接序列末端的一致性为70％-100％。

25.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，将步骤(3)获得的所述同源臂序列、步骤(2)获得的所述初始载体片段以及所述目的DNA片段转化入酿酒酵母细胞利用如下任一种方法进行：

乙酸锂转化、原生质体转化或电转化。

26.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，利用如下的一种或多种方法实施所述筛选：

多重PCR、利用抗生素抗性或营养缺陷培养基进行培养以及报告子检测。

27.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在大肠杆菌中对所述重组载体进行扩增。