CN114645042A - 一种构建具有表达荧光素酶和红色荧光蛋白的重组巨噬细胞的转基因小鼠的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种构建具有表达荧光素酶和红色荧光蛋白的重组巨噬细胞的转基因小鼠的方法。本发明提供了序列1所示的特异DNA分子。本发明还提供了具有所述特异DNA分子的重组质粒，即打靶载体。本发明还保护一种制备转基因小鼠的方法：在小鼠受精卵中导入打靶载体、特异sgRNA和Cas9 mRNA，然后移植至代孕小鼠子宫内；代孕小鼠分娩得到子代鼠，从中筛选转基因小鼠；所述特异sgRNA的靶序列结合区如序列表的序列3中第1‑17位核苷酸所示。所述转基因小鼠的巨噬细胞表达荧光素酶和红色荧光蛋白。本发明得到的转基因小鼠，可以作为研究巨噬细胞的鼠模型，可以作为研究炎症反应的鼠模型，从而用于机理研究、药物研发或诊断试剂研发。

Description

一种构建具有表达荧光素酶和红色荧光蛋白的重组巨噬细胞 的转基因小鼠的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种构建具有表达荧光素酶和红色荧光蛋白的重组巨噬细胞的转基因小鼠的方法。
背景技术
当创伤发生后，循环单核细胞迁移到创伤局部并分化为巨噬细胞。在创伤修复的不同阶段，局部的巨噬细胞可以清除坏死细胞，促进细胞增殖、血管生成、胶原沉积和组织重塑。此外,巨噬细胞还会随着微环境的变化而发生表型和功能的改变,并且与其他细胞(主要是中性粒细胞)发生相互作用,最终完成组织修复。
研究巨噬细胞的作用过程和机理，开发以巨噬细胞为靶标的药物或诊断物均需要用到动物模型。鼠模型，是最为常见的动物模型。
发明内容
本发明的目的是提供一种构建具有表达荧光素酶和红色荧光蛋白的重组巨噬细胞的转基因小鼠的方法。
本发明提供了特异DNA分子(命名为特异DNA分子甲)，为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的DNA分子；
(a2)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：上游同源臂、融合基因、转录调控元件WPRE、poly(A)终止序列、下游同源臂；所述融合基因中自上游至下游依次包括如下区段：编码荧光素酶的区段、编码P2A肽的区段和编码红色荧光蛋白的区段；所述上游同源臂如序列表的序列1中第1-1122位核苷酸所示；所述下游同源臂如序列表的序列1中第4367-6063位核苷酸所示。
所述融合基因中自上游至下游依次由如下区段组成：编码荧光素酶的区段、编码P2A肽的区段和编码红色荧光蛋白的区段。
本发明还提供了特异DNA分子(命名为特异DNA分子乙)，为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列1中第1123-4360位核苷酸所示的DNA分子；
(b2)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：融合基因、转录调控元件WPRE、poly(A)终止序列；所述融合基因中自上游至下游依次包括如下区段：编码荧光素酶的区段、编码P2A肽的区段和编码红色荧光蛋白的区段。
所述融合基因中自上游至下游依次由如下区段组成：编码荧光素酶的区段、编码P2A肽的区段和编码红色荧光蛋白的区段。
本发明还提供了具有所述特异DNA分子甲的重组质粒，命名为重组质粒甲。所述重组质粒甲具体可为将所述特异DNA分子甲插入载体PL451-EGFP的多克隆位点(例如BamHI和EcoRI酶切位点之间)得到的重组质粒。
本发明还提供了具有所述特异DNA分子乙的重组质粒，命名为重组质粒乙。所述重组质粒乙具体可为将所述特异DNA分子乙甲插入载体PL451-EGFP的多克隆位点(例如BamHI和EcoRI酶切位点之间)得到的重组质粒。
本发明还提供了一种试剂盒，包括所述特异DNA分子甲或所述特异DNA分子乙或所述重组质粒甲或所述重组质粒乙。所述试剂盒还包括特异sgRNA和Cas9 mRNA；所述特异sgRNA的靶序列结合区如序列表的序列3中第1-17位核苷酸所示。具体的，所述特异sgRNA如序列表的序列3所示。所述Cas9 mRNA如序列表的序列4所示。
本发明还保护所述特异DNA分子甲或所述特异DNA分子乙或所述重组质粒甲或所述重组质粒乙或以上任一所述试剂盒在制备转基因小鼠中的应用。所述转基因小鼠的巨噬细胞表达荧光素酶和红色荧光蛋白。
本发明还保护一种制备转基因小鼠的方法，包括如下步骤：在小鼠受精卵中导入打靶载体、特异sgRNA和Cas9 mRNA，然后移植至代孕小鼠子宫内；代孕小鼠分娩得到子代鼠，从中筛选转基因小鼠；
所述打靶载体为所述重组质粒甲或所述重组质粒乙；
所述特异sgRNA的靶序列结合区如序列表的序列3中第1-17位核苷酸所示。
具体的，所述特异sgRNA如序列表的序列3所示。所述Cas9 mRNA如序列表的序列4所示。
所述方法还包括如下步骤：将转基因小鼠中的雌鼠和雄鼠交配，获得子代鼠，从中筛选转基因小鼠。
所述转基因小鼠的基因组中具有所述特异DNA分子甲或所述特异DNA分子乙。
所述转基因小鼠中，所述融合基因由基因组DNA中的ADGRE1基因启动子启动表达。
所述转基因小鼠的巨噬细胞表达荧光素酶和红色荧光蛋白。
所述导入的方式具体可为注射。
本发明还保护所述特异DNA分子甲或所述特异DNA分子乙或所述重组质粒甲或所述重组质粒乙或以上任一所述试剂盒在制备炎症鼠模型中的应用。炎症鼠模型即巨噬细胞表达荧光素酶和红色荧光蛋白的转基因小鼠。
本发明还保护以上任一所述方法在制备炎症鼠模型中的应用。炎症鼠模型即巨噬细胞表达荧光素酶和红色荧光蛋白的转基因小鼠。
以上任一所述荧光素酶如序列表的序列7中第1-550位氨基酸残基组成。
以上任一所述红色荧光蛋白如序列表的序列7中第573-804位氨基酸残基组成。
以上任一所述P2A肽如序列表的序列7中第551-572位氨基酸残基组成。
编码荧光素酶的区段如序列表的序列1中第1123-2772位核苷酸所示。
编码P2A肽的区段如序列表的序列1中第2773-2838位核苷酸所示。
编码红色荧光蛋白的区段如序列表的序列1中第2839-3534位核苷酸所示。
转录调控元件WPRE如序列表的序列1中第3538-4126位核苷酸所示。
poly(A)终止序列如序列表的序列1中第4153-4360位核苷酸所示。
所述融合基因编码序列表的序列7所示的融合蛋白。
所述小鼠具体为C57BL/6N小鼠。
本发明中，将特异DNA分子整合至小鼠基因组的特定位置，得到了转基因小鼠，特异DNA分子表达荧光素酶(luciferase)基因和红色荧光蛋白(mKate2)基因，并且所述两个基因由小鼠基因组DNA中的ADGRE1基因启动子启动表达。ADGRE1蛋白为巨噬细胞的特征性蛋白，因此荧光素酶和红色荧光蛋白也成为了巨噬细胞的特征性蛋白，可用于观察巨噬细胞。为了促进特异DNA分子的整合效率，本发明还借助了CRISPR/Cas9系统，采用特定sgRNA在目标位点制作缺口，从而增加特异DNA分子整合至小鼠基因组DNA的效率。与转绿色荧光蛋白基因小鼠相比，本发明方法制备得到的转基因小鼠中巨噬细胞的荧光强度明显增高，从而检测灵敏度明显提升。本发明得到的转基因小鼠，可以作为研究巨噬细胞的鼠模型，可以作为研究炎症反应的鼠模型，从而用于机理研究、药物研发或诊断试剂研发。
附图说明
图1为实施例2中PCR扩增产物的电泳图。
图2为实施例2中采用UCATM检测7种oligo的结果。
图3为实施例3中的工作原理示意图。
图4为实施例3中southern杂交的结果。
图5为实施例3中红色荧光蛋白成像的照片。
图6为实施例3中荧光素酶成像的结果(左图为注射10分钟后的雄鼠照片，右图为注射15分钟后的雄鼠照片)。
图7为实施例3中荧光素酶成像的结果(注射12分钟后的照片)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。UCATM CRISPR/Cas9快速构建及活性检测试剂盒(荧光素酶版)：北京百奥赛图基因生物技术有限公司。载体PL451-EGFP：BioVector NTCC Inc.。如无特殊说明，序列表中的核酸序列均为5’→3'方向。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、打靶载体的构建
制备打靶载体。打靶载体为环形质粒，是将特异DNA分子插入载体PL451-EGFP的BamHI和EcoRI酶切位点之间得到的，已进行测序验证。
特异DNA分子如序列表的序列1所示。序列表的序列1中，第1-1122位核苷酸为上游同源臂(1122bp)，第1123-3537位核苷酸为融合基因，3538-4126位核苷酸为转录调控元件WPRE(589bp)，第4153-4360位核苷酸为poly(A)终止序列(208bp)，第4367-6063位核苷酸为下游同源臂(1697bp)。序列表的序列1中，第1123-2772位核苷酸编码荧光素酶(luciferase)，第2773-2838位核苷酸编码P2A肽，第2839-3534位核苷酸编码红色荧光蛋白(mKate2)。
实施例2、sgRNA的筛选
ADGRE1(adhesion G protein-coupled receptor E1)为巨噬细胞的特征性蛋白。ADGRE1基因位于小鼠17号染色体反链上，全长125kb，Gene ID:13733(NCBI)，该基因有5个转录本。选择在ADGRE1基因的起始密码子ATG后插入特异DNA分子。
一、确定靶点区域以及测序引物
以C57BL/6N小鼠的基因组DNA为模板，采用LPMW-MSD-F和LPMW-MSD-R组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物并测序。
LPMW-MSD-F：5’-GCATCAAGCTTGGTACCGATCTGTCCACCTCTGATGGTGGCAACTC-3’；
LPMW-MSD-R：5’-ACTTAATCGTGGAGGATGATTTTCACACCCATGTTCTGCTTTGTGA-3’。
PCR扩增产物的电泳图见图1。PCR扩增产物为617bp，如序列表的序列2所示，与NCBI和Ensembl数据库中相同。
二、sgRNA的设计和筛选
1、在靶位点区域设计7种sgRNA。
7种sgRNA的靶向序列分别如下：
Guide Sequence(5’-3’)如下：
Guide#1：5’-GGGCCGAACCCCTCCAAGGT TGG-3’；
Guide#2：5’-ATGACTGCCACAGTACGATG TGG-3’；
Guide#3：5’-GACTGCCACAGTACGATGTG GGG-3’；
Guide#4：5’-ACAGTACGATGTGGGGCTTT TGG-3’；
Guide#5：5’-GCTTTTGGCTGCTCCTCTTC TGG-3’；
Guide#7：5’-CTATGGGCCGAACCCCTCCA AGG-3’；
Guide#8：5’-CTTGGAGGGGTTCGGCCCAT AGG-3’。
2、制备7种oligo，均为双链DNA分子。
LPMW-sgRNA1的Bottom oligo(5’-3’)，LPMW-sg1-dn：
CTATTTCTAGCTCTAAAACACCTTGGAGGGGTTCGGCCCTATAGTGAGTCGTATTA。
LPMW-sgRNA2的Bottom oligo(5’-3’)，LPMW-sg2-dn：
CTATTTCTAGCTCTAAAACCATCGTACTGTGGCAGTCCTATAGTGAGTCGTATTA。
LPMW-sgRNA3的Bottom oligo(5’-3’)，LPMW-sg3-dn
CTATTTCTAGCTCTAAAACCACATCGTACTGTGGCAGTCCTATAGTGAGTCGTATTA。
LPMW-sgRNA4的Bottom oligo(5’-3’)，LPMW-sg4-dn：
CTATTTCTAGCTCTAAAACAAAGCCCCACATCGTACCTATAGTGAGTCGTATTA。
LPMW-sgRNA5的Bottom oligo(5’-3’)，LPMW-sg5-dn：
CTATTTCTAGCTCTAAAACGAAGAGGAGCAGCCAAAAGCCTATAGTGAGTCGTATTA。
LPMW-sgRNA7的Bottom oligo(5’-3’)，LPMW-sg7-dn：
CTATTTCTAGCTCTAAAACTGGAGGGGTTCGGCCCATAGCCTATAGTGAGTCGTATTA。
LPMW-sgRNA8的Bottom oligo(5’-3’)，LPMW-sg8-dn：
CTATTTCTAGCTCTAAAACATGGGCCGAACCCCTCCTATAGTGAGTCGTATTA。
3、比较活性
UCATM(通用CRISPR活性测定法)是Biocytogen开发的sgRNA活性检测系统，比MSDase测定法更简单，更灵敏。
采用UCATM检测7种oligo，结果见图2。LPMW-sgRNA2效果最佳。
实施例3、
雄鼠、供卵雌鼠和代孕雌鼠均为C57BL/6N小鼠。
一、获得F0代鼠
1、第一天：供卵雌鼠被注射PMSG(腹腔注射，每只小鼠5IU)。
2、第三天：完成步骤1的供卵雌鼠被注射hCG(腹腔注射，每只小鼠5IU)。
3、第三天：完成步骤2的供卵雌鼠与雄鼠合笼交配。
4、第三天：发情代孕雌鼠与结扎雄鼠合笼交配。
5、第四天：完成步骤4后，从代孕雌鼠中挑选见栓鼠。
6、第四天：完成步骤3后，从供卵雌鼠中挑选见栓鼠，颈椎脱臼处死，获取输卵管壶腹部，将受精率卵团释放到操作液中，使用透明质酸酶进行处理，使受精卵外的卵丘细胞脱落，将受精卵转移至KSOM培养液中备用。
7、第四天：取步骤6得到的受精卵，注射实施例1制备的打靶载体、特异sgRNA和Cas9 mRNA(每只受精卵注射200ng打靶载体、50ng特异sgRNA和50ng Cas9 mRNA)。
特异sgRNA如序列表的序列3所示。
Cas9 mRNA如序列表的序列4所示。
工作原理示意图见图3。
8、第四天：收集成功注射并存活的受精卵到KSOM培养液中，然后移植到步骤5得到的见栓鼠的输卵管中。
9、第四天：对完成步骤8的代孕雌鼠做标记，分笼饲养。
10、第二十三天：仔鼠出生。
11、正常培育步骤10获得的仔鼠，从中筛选转基因鼠，即F0代转基因鼠。
筛选转基因鼠的方法：取鼠尾组织，提取基因组DNA，进行PCR扩增后测序。
PCR扩增采用的引物：LPMW-L-F1和LPMW-L-R1组成的引物对，LPMW-R-F和LPMW-R-R组成的引物对。
LPMW-L-F1：5’-GTTATTCCAGATGAATTTGAGTTGGGAT-3’；
LPMW-L-R1：5’-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3’。
LPMW-R-F：5’-TGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCA-3’；
LPMW-R-R：5’-TGTCTGTTTGTGTGGAGGTCTTGTT-3’。
如果采用LPMW-L-F1和LPMW-L-R1组成的引物对获得4036bp的扩增产物且采用LPMW-R-F和LPMW-R-R组成的引物对获得2770bp的扩增产物，该鼠为转基因鼠。
二、获得F1代转基因鼠
将雄性F0代转基因鼠和雌性F0代转基因鼠交配，雌鼠自然受孕并生产，获得F1代鼠。从F1代鼠中筛选F1代转基因鼠。
筛选转基因鼠的方法：取鼠尾组织，提取基因组DNA，进行southern杂交，进行PCR扩增并测序。
PCR扩增采用的引物：LPMW-WT-F和LPMW-WT-R组成的引物对，LPMW-WT-F和LPMW-MUT-R组成的引物对。
LPMW-WT-F：5’-GCCAGTCTGTCCACCTCTGATGG-3’；
LPMW-WT-R：5’-ACATGCCACATGAACAGCTACAGGA-3’。
LPMW-WT-F：5’-GCCAGTCTGTCCACCTCTGATGG-3’；
LPMW-MUT-R：5’-TTCTTGCTCACGAATACGACGGTGG-3’。
如果采用LPMW-WT-F和LPMW-WT-R组成的引物对获得3609bp的扩增产物且采用LPMW-WT-F和LPMW-MUT-R组成的引物对获得545bp的扩增产物，该鼠为转基因鼠。
southern杂交：取基因组DNA，采用限制性内切酶BclI酶切，然后采用序列5所示的3’probe(臂外探针)进行杂交，野生型具有8.1kb的信号，插入外源片段的重组型具有6.5kb的信号；取基因组DNA，采用限制性内切酶NcoI酶切，然后采用序列6所示的5’probe(臂内探针)进行杂交，野生型无信号，插入外源片段的重组型具有约6.2kb的信号。
southern杂交的结果见图4(Marker代表分子量标记，WT代表C57BL/6N小鼠对照，剩余每个泳道代表1只转基因鼠)，共获得了12只F1代转基因鼠，均为杂合型。
三、活体成像检测
取同天出生的，45日龄的一只F1代转基因雄鼠和一只F1代转基因雌鼠。
2020年9月23日雄鼠进行涤纶补片移植。具体步骤：背部切割1cm伤口，皮下植入0.6×0.6cm的涤纶补片。涤纶补片：北京百仁医疗科技股份有限公司。
雌鼠不进行任何处理，作为对照。
2020年9月28日，雄鼠发生炎症反应的第五天，进行红色荧光蛋白成像(激发光波长570nm，发射光波长630nm)。照片见图5。图5中，左图为植入涤纶补片的转基因雄鼠，右边为对照转基因雌鼠。可以观察到，植入涤纶补片的转基因雄鼠中，植入涤纶的部位的荧光蛋白表达强度高，说明巨噬细胞数量多，证明基因植入成功并且可以检测炎症反应强度。用成像仪计算设定面积(覆盖补片移植区)内发光强度，植入涤纶补片的转基因雄鼠的发光强度为7.12×106，对照转基因雌鼠的发光强度为4.63×106，有数据差异，说明雄鼠有炎症反应。发光强度单位为“[p/sec/cm2/sr]/[μW/cm2]”。
2020年9月28日，雄鼠发生炎症反应的第5天，注射荧光素底物(每20g小鼠注射3mg荧光素底物，荧光素底物的注射浓度为3mg/100μl)，然后进行荧光素酶成像。注射10分钟后的雄鼠照片见图6的左图，注射15分钟后的雄鼠照片见图6的右图。注射12分钟后的照片见图7，左图为植入涤纶补片的转基因雄鼠，右图为对照转基因雌鼠。用成像仪计算注射12分钟后设定面积(覆盖补片移植区)内发光强度，植入涤纶补片的转基因雄鼠的荧光素酶强度为1.191×108，对照转基因雌鼠的发光强度为8.654×107。荧光素酶强度的单位为“[p/sec/cm2/sr]”。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国食品药品检定研究院
<120> 一种构建具有表达荧光素酶和红色荧光蛋白的重组巨噬细胞的转基因小鼠的方法
<130> GNCYX202759
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6063
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcccgttta tcctttgagt agaggaaaac tactgatttg tttgaattaa ttttatatct 60
agccactaag ctgaagttgt ttatcagctg taggagttct ctggtggatt attttttagg 120
gttatttatg tattctacca catcatctgc aaatagtgat atcttgactt cctcctttct 180
aatttgtatc cctttgacct ccttttgttg cctaattgtt ctgggtagaa ctttgagtac 240
tatattaaat gataggggaa aagtggacag ccttgggtgt ggtgtgtgtg gtatggtgtg 300
gtgtgtgtat ggtgatgatg catgtggtgt gtatggtgtg gtgtatgtgg tgtggtgtgt 360
ggtggtggtg ataatgatga tggtggtctc tctgtctctg tctgtctctt tctatctctg 420
cctctctctc tctgtctctc tctgcccccc tctgtctccc tctgtctgtc tgtctgtctc 480
tttggtgtga tgtatgtggt gtgtgtgtat tctacaaggt tgacatgatg acagaattta 540
attttcttag cagcaagctc atggatcctg gtgataaatg cagcatgact ttactgaaaa 600
ggctttgtga tcttgaagag tggattgact tcactgtggg cagcacatgc aatctcactt 660
gtttggtgta atgaaagaag agaatgagag gtggaagggg gatggtaatg ttgaaaaaaa 720
gaatggtaca gaggaaactg aggttggaga gagatggggt agatggtaag agatggagaa 780
agagggaagg aaatggagag aaagacagag agacagagag agacacacag agagacacac 840
agagacagag aggaagggaa agggaaagag aaaggaagag gaagaggggg aggggaaggg 900
gaaggggaag gggaagggag agggagaaat gtggacacta gccagattta agggagaaat 960
tagggggttg ccagtctgtc cacctctgat ggtggcaact cagcagaaag ctgctgggct 1020
cagtctggct ttgttgagca accctgactc cacccctttt cttccccaca aagcaagctt 1080
ttaaagggaa ggctttcttc attgaatgac tgccacagta cgatggaaga tgccaaaaac 1140
attaagaagg gcccagcgcc attctaccca ctcgaagacg ggaccgccgg cgagcagctg 1200
cacaaagcca tgaagcgcta cgccctggtg cccggcacca tcgcctttac cgacgcacat 1260
atcgaggtgg acattaccta cgccgagtac ttcgagatga gcgttcggct ggcagaagct 1320
atgaagcgct atgggctgaa tacaaaccat cggatcgtgg tgtgcagcga gaatagcttg 1380
cagttcttca tgcccgtgtt gggtgccctg ttcatcggtg tggctgtggc cccagctaac 1440
gacatctaca acgagcgcga gctgctgaac agcatgggca tcagccagcc caccgtcgta 1500
ttcgtgagca agaaagggct gcaaaagatc ctcaacgtgc aaaagaagct accgatcata 1560
caaaagatca tcatcatgga tagcaagacc gactaccagg gcttccaaag catgtacacc 1620
ttcgtgactt cccatttgcc acccggcttc aacgagtacg acttcgtgcc cgagagcttc 1680
gaccgggaca aaaccatcgc cctgatcatg aacagtagtg gcagtaccgg attgcccaag 1740
ggcgtagccc taccgcaccg caccgcttgt gtccgattca gtcatgcccg cgaccccatc 1800
ttcggcaacc agatcatccc cgacaccgct atcctcagcg tggtgccatt tcaccacggc 1860
ttcggcatgt tcaccacgct gggctacttg atctgcggct ttcgggtcgt gctcatgtac 1920
cgcttcgagg aggagctatt cttgcgcagc ttgcaagact ataagattca atctgccctg 1980
ctggtgccca cactatttag cttcttcgct aagagcactc tcatcgacaa gtacgaccta 2040
agcaacttgc acgagatcgc cagcggcggg gcgccgctca gcaaggaggt aggtgaggcc 2100
gtggccaaac gcttccacct accaggcatc cgccagggct acggcctgac agaaacaacc 2160
agcgccattc tgatcacccc cgaaggggac gacaagcctg gcgcagtagg caaggtggtg 2220
cccttcttcg aggctaaggt ggtggacttg gacaccggta agacactggg tgtgaaccag 2280
cgcggcgagc tgtgcgtccg tggccccatg atcatgagcg gctacgttaa caaccccgag 2340
gctacaaacg ctctcatcga caaggacggc tggctgcaca gcggcgacat cgcctactgg 2400
gacgaggacg agcacttctt catcgtggac cggctgaaga gcctgatcaa atacaagggc 2460
taccaggtag ccccagccga actggagagc atcctgctgc aacaccccaa catcttcgac 2520
gccggggtcg ccggcctgcc cgacgacgat gccggcgagc tgcccgccgc agtcgtcgtg 2580
ctggaacacg gtaaaaccat gaccgagaag gagatcgtgg actatgtggc cagccaggtt 2640
acaaccgcca agaagctgcg cggtggtgtt gtgttcgtgg acgaggtgcc taaaggactg 2700
accggcaagt tggacgcccg caagatccgc gagattctca ttaaggccaa gaagggcggc 2760
aagatcgccg tgggaagcgg agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg 2820
gaggagaacc ctggacctat ggtgagcgag ctgattaagg agaacatgca catgaagctg 2880
tacatggagg gcaccgtgaa caaccaccac ttcaagtgca catccgaggg cgaaggcaag 2940
ccctacgagg gcacccagac catgagaatc aaggcggtcg agggcggccc tctccccttc 3000
gccttcgaca tcctggctac cagcttcatg tacggcagca aaaccttcat caaccacacc 3060
cagggcatcc ccgacttctt taagcagtcc ttccccgagg gcttcacatg ggagagagtc 3120
accacatacg aagacggggg cgtgctgacc gctacccagg acaccagcct ccaggacggc 3180
tgcctcatct acaacgtcaa gatcagaggg gtgaacttcc catccaacgg ccctgtgatg 3240
cagaagaaaa cactcggctg ggaggcctcc accgagaccc tgtaccccgc tgacggcggc 3300
ctggaaggca gagccgacat ggccctgaag ctcgtgggcg ggggccacct gatctgcaac 3360
ttgaagacca catacagatc caagaaaccc gctaagaacc tcaagatgcc cggcgtctac 3420
tatgtggaca gaagactgga aagaatcaag gaggccgaca aagagaccta cgtcgagcag 3480
cacgaggtgg ctgtggccag atactgcgac ctccctagca aactggggca cagatgaaat 3540
caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct 3600
tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg 3660
gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg 3720
cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt 3780
tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt 3840
gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg 3900
ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg aaatcatcgt cctttccttg gctgctcgcc 3960
tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat 4020
ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc 4080
cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct ccccgcatcg ataccgtcga 4140
cctcgacctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc 4200
cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg 4260
catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca 4320
agggggagga ttgggaagac aatggcaggc atgctgggga ccatgggtga gtatgaggtt 4380
gaatggggca tggatggctg aggtgtgggc tggaaatagg ttgcagggag aaaggccaac 4440
cttggagggg ttcggcccat aggctaatgt ctattgcaca cagcaaactt taccttggga 4500
aacctttgac aaaattcctt gacttaggga agtctattca ccagggtaga tcttcctgta 4560
gctgttcatg tggcatgtct gtgtttgtga gccatctcag ttttagttag aatttaacat 4620
ggagtaaact tgtgaggctc cggtgcgtgc atctgggatg gtgcaagggg gatggaagtc 4680
cacacagcaa tggaaacagt ccccttacca ttgcgtagcc cttttttatc agccatagct 4740
cacaaagcag aacatgggtg tgaaagaggt aacttgccgg gctttggcaa cagtttagtg 4800
tgtaaagtgc ttgtcctaca agcacaaaga tctggatttg atcccagaat ttatgttaaa 4860
aaaccaagta tgtggtacac ttctacctct ggctctggag agtagagaag gaggattcct 4920
tggttcttga tggccagcta gcctagccca attggtggat tccagatcag tgagaaagtc 4980
tgtctctaaa caattaaggt agatggaact ggagaaaggt gtttgaggtc atcctctggt 5040
tcctacatgc cagtacacac aagtgcatgt tcacctgcac tacacattgc acaatgtcat 5100
gcacacacaa cacaagtgca atgcacacac agacatgcaa tgcacacaaa aggcacatgt 5160
gtactcacag atgcaaaaag aaatactgtg agcaagtctt agctaatgag gggtagagcc 5220
acggtataaa atcattccag ctctggcctt gttcaaactc ttagtcatgg ctggtttgtg 5280
ctgtgggagt cagcgaagat agtcccgttc tagaaataga ctcggggcta caccttcctt 5340
ttctggctcc tgttgctttt gttttgggca ctagcgcatt tcactgtgtg atcttccacg 5400
tcactggttt tctcgcgtgt ttgcaagatt ttttttcccc attgttttaa atttagatgg 5460
gagatatgga tttccggttt tagggatgag aagagggatc tattttgcct cacagtttga 5520
gatggtatgg tctgccatgt tgtggaagcc ttggaagagt catagttaga tggtgggctg 5580
gcactgcttt ctgcttgttg actgtgaagc agagagctaa gaagttgaac tggcgtacat 5640
attttcaggt cccctcccat ggcctcatct ctaaacttcc tcagacaaca ccaccatctg 5700
gtgaccaata ggttaaacac atgattgtgt tggttacatt tcacatccaa accacagcaa 5760
acagctagcc tgcatacatg tatatgtaca ttacatgtac atatatgtgt cttacacaca 5820
taaaggcaat aattttaata tcgtctcaag aatgaactta aaataatatc atgcttattt 5880
acttaaatac attttaattt attctttgag gatttcatac ataaaggcag taattttgat 5940
tacctgcacc tccgtgccac tctactctga gacctctctt cactgtgacc atctctaaca 6000
tcatgtccta ctttaaagaa aacccactga gagcagggtg accttctggg gcatatccct 6060
gaa 6063
<210> 2
<211> 617
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatcaagct tggtaccgat ctgtccacct ctgatggtgg caactcagca gaaagctgct 60
gggctcagtc tggctttgtt gagcaaccct gactccaccc cttttcttcc ccacaaagca 120
agcttttaaa gggaaggctt tcttcattga atgactgcca cagtacgatg tggggctttt 180
ggctgctcct cttctggggt gagtatgagg ttgaatgggg catggatggc tgaggtgtgg 240
gctggaaata ggttgcaggg agaaaggcca accttggagg ggttcggccc ataggctaat 300
gtctattgca cacagcaaac tttaccttgg gaaacctttg acaaaattcc ttgacttagg 360
gaagtctatt caccagggta gatcttcctg tagctgttca tgtggcatgt ctgtgtttgt 420
gagccatctc agttttagtt agaatttaac atggagtaaa cttgtgaggc tccggtgcgt 480
gcatctggga tggtgcaagg gggatggaag tccacacagc aatggaaaca gtccccttac 540
cattgcgtag ccctttttta tcagccatag ctcacaaagc agaacatggg tgtgaaaatc 600
atcctccacg attaagt 617
<210> 3
<211> 93
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acugccacag uacgaugguu uuagagcuag aaauagcaag uuaaaauaag gcuaguccgu 60
uaucaacuug aaaaaguggc accgagucgg ugc 93
<210> 4
<211> 4101
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacaagaagu acagcaucgg ccuggacauc ggcaccaacu cugugggcug ggccgugauc 60
accgacgagu acaaggugcc cagcaagaaa uucaaggugc ugggcaacac cgaccggcac 120
agcaucaaga agaaccugau cggagcccug cuguucgaca gcggcgaaac agccgaggcc 180
acccggcuga agagaaccgc cagaagaaga uacaccagac ggaagaaccg gaucugcuau 240
cugcaagaga ucuucagcaa cgagauggcc aagguggacg acagcuucuu ccacagacug 300
gaagaguccu uccuggugga agaggauaag aagcacgagc ggcaccccau cuucggcaac 360
aucguggacg agguggccua ccacgagaag uaccccacca ucuaccaccu gagaaagaaa 420
cugguggaca gcaccgacaa ggccgaccug cggcugaucu aucuggcccu ggcccacaug 480
aucaaguucc ggggccacuu ccugaucgag ggcgaccuga accccgacaa cagcgacgug 540
gacaagcugu ucauccagcu ggugcagacc uacaaccagc uguucgagga aaaccccauc 600
aacgccagcg gcguggacgc caaggccauc cugucugcca gacugagcaa gagcagacgg 660
cuggaaaauc ugaucgccca gcugcccggc gagaagaaga auggccuguu cggaaaccug 720
auugcccuga gccugggccu gacccccaac uucaagagca acuucgaccu ggccgaggau 780
gccaaacugc agcugagcaa ggacaccuac gacgacgacc uggacaaccu gcuggcccag 840
aucggcgacc aguacgccga ccuguuucug gccgccaaga accuguccga cgccauccug 900
cugagcgaca uccugagagu gaacaccgag aucaccaagg ccccccugag cgccucuaug 960
aucaagagau acgacgagca ccaccaggac cugacccugc ugaaagcucu cgugcggcag 1020
cagcugccug agaaguacaa agagauuuuc uucgaccaga gcaagaacgg cuacgccggc 1080
uacauugacg gcggagccag ccaggaagag uucuacaagu ucaucaagcc cauccuggaa 1140
aagauggacg gcaccgagga acugcucgug aagcugaaca gagaggaccu gcugcggaag 1200
cagcggaccu ucgacaacgg cagcaucccc caccagaucc accugggaga gcugcacgcc 1260
auucugcggc ggcaggaaga uuuuuaccca uuccugaagg acaaccggga aaagaucgag 1320
aagauccuga ccuuccgcau ccccuacuac gugggcccuc uggccagggg aaacagcaga 1380
uucgccugga ugaccagaaa gagcgaggaa accaucaccc ccuggaacuu cgaggaagug 1440
guggacaagg gcgcuuccgc ccagagcuuc aucgagcgga ugaccaacuu cgauaagaac 1500
cugcccaacg agaaggugcu gcccaagcac agccugcugu acgaguacuu caccguguau 1560
aacgagcuga ccaaagugaa auacgugacc gagggaauga gaaagcccgc cuuccugagc 1620
ggcgagcaga aaaaggccau cguggaccug cuguucaaga ccaaccggaa agugaccgug 1680
aagcagcuga aagaggacua cuucaagaaa aucgagugcu ucgacuccgu ggaaaucucc 1740
ggcguggaag aucgguucaa cgccucccug ggcacauacc acgaucugcu gaaaauuauc 1800
aaggacaagg acuuccugga caaugaggaa aacgaggaca uucuggaaga uaucgugcug 1860
acccugacac uguuugagga cagagagaug aucgaggaac ggcugaaaac cuaugcccac 1920
cuguucgacg acaaagugau gaagcagcug aagcggcgga gauacaccgg cuggggcagg 1980
cugagccgga agcugaucaa cggcauccgg gacaagcagu ccggcaagac aauccuggau 2040
uuccugaagu ccgacggcuu cgccaacaga aacuucaugc agcugaucca cgacgacagc 2100
cugaccuuua aagaggacau ccagaaagcc cagguguccg gccagggcga uagccugcac 2160
gagcacauug ccaaucuggc cggcagcccc gccauuaaga agggcauccu gcagacagug 2220
aagguggugg acgagcucgu gaaagugaug ggccggcaca agcccgagaa caucgugauc 2280
gaaauggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaaug 2340
aagcggaucg aagagggcau caaagagcug ggcagccaga uccugaaaga acaccccgug 2400
gaaaacaccc agcugcagaa cgagaagcug uaccuguacu accugcagaa ugggcgggau 2460
auguacgugg accaggaacu ggacaucaac cggcuguccg acuacgaugu ggaccauauc 2520
gugccucaga gcuuucugaa ggacgacucc aucgacaaca aggugcugac cagaagcgac 2580
aagaaccggg gcaagagcga caacgugccc uccgaagagg ucgugaagaa gaugaagaac 2640
uacuggcggc agcugcugaa cgccaagcug auuacccaga gaaaguucga caaucugacc 2700
aaggccgaga gaggcggccu gagcgaacug gauaaggccg gcuucaucaa gagacagcug 2760
guggaaaccc ggcagaucac aaagcacgug gcacagaucc uggacucccg gaugaacacu 2820
aaguacgacg agaaugacaa gcugauccgg gaagugaaag ugaucacccu gaaguccaag 2880
cugguguccg auuuccggaa ggauuuccag uuuuacaaag ugcgcgagau caacaacuac 2940
caccacgccc acgacgccua ccugaacgcc gucgugggaa ccgcccugau caaaaaguac 3000
ccuaagcugg aaagcgaguu cguguacggc gacuacaagg uguacgacgu gcggaagaug 3060
aucgccaaga gcgagcagga aaucggcaag gcuaccgcca aguacuucuu cuacagcaac 3120
aucaugaacu uuuucaagac cgagauuacc cuggccaacg gcgagauccg gaagcggccu 3180
cugaucgaga caaacggcga aaccggggag aucguguggg auaagggccg ggauuuugcc 3240
accgugcgga aagugcugag caugccccaa gugaauaucg ugaaaaagac cgaggugcag 3300
acaggcggcu ucagcaaaga gucuauccug cccaagagga acagcgauaa gcugaucgcc 3360
agaaagaagg acugggaccc uaagaaguac ggcggcuucg acagccccac cguggccuau 3420
ucugugcugg ugguggccaa aguggaaaag ggcaagucca agaaacugaa gagugugaaa 3480
gagcugcugg ggaucaccau cauggaaaga agcagcuucg agaagaaucc caucgacuuu 3540
cuggaagcca agggcuacaa agaagugaaa aaggaccuga ucaucaagcu gccuaaguac 3600
ucccuguucg agcuggaaaa cggccggaag agaaugcugg ccucugccgg cgaacugcag 3660
aagggaaacg aacuggcccu gcccuccaaa uaugugaacu uccuguaccu ggccagccac 3720
uaugagaagc ugaagggcuc ccccgaggau aaugagcaga aacagcuguu uguggaacag 3780
cacaagcacu accuggacga gaucaucgag cagaucagcg aguucuccaa gagagugauc 3840
cuggccgacg cuaaucugga caaagugcug uccgccuaca acaagcaccg ggauaagccc 3900
aucagagagc aggccgagaa uaucauccac cuguuuaccc ugaccaaucu gggagccccu 3960
gccgccuuca aguacuuuga caccaccauc gaccggaaga gguacaccag caccaaagag 4020
gugcuggacg ccacccugau ccaccagagc aucaccggcc uguacgagac acggaucgac 4080
cugucucagc ugggaggcga c 4101
<210> 5
<211> 269
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taaagaaagt gctgcaggag aggattttta aatattctca cacaaagaaa taacaaacgt 60
tttagaggaa gcataaaagc tagaaacaaa acaagacctc cacacaaaca gacatgaaaa 120
taggggcaga cgggaaagag aggggtcaac aggtgtggga ggggagataa atgtaggtgc 180
atgagcaccg tatagagcat actcctgaat atacaaacca ccaccagtag caacaccaac 240
aaaaatatag ggctcagaga gatgtctct 269
<210> 6
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt 60
tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca 120
ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg 180
ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg 240
aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca 300
attccgtggt gttgtcgggg aaatcatcgt cctttccttg gctgctcgcc tgtgttgcca 360
cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc 420
ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc 480
agacgagtcg gatctccctt 500
<210> 7
<211> 804
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro
1 5 10 15
Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg
20 25 30
Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu
35 40 45
Val Asp Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala
50 55 60
Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val
65 70 75 80
Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu
85 90 95
Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg
100 105 110
Glu Leu Leu Asn Ser Met Gly Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val
115 120 125
Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro
130 135 140
Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly
145 150 155 160
Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe
165 170 175
Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile
180 185 190
Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val
195 200 205
Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp
210 215 220
Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val
225 230 235 240
Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu
245 250 255
Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu
260 265 270
Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val
275 280 285
Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr
290 295 300
Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser
305 310 315 320
Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile
325 330 335
Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr
340 345 350
Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe
355 360 365
Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val
370 375 380
Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly
385 390 395 400
Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly
405 410 415
Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe
420 425 430
Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln
435 440 445
Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile
450 455 460
Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu
465 470 475 480
Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys
485 490 495
Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu
500 505 510
Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly
515 520 525
Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys
530 535 540
Gly Gly Lys Ile Ala Val Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu
545 550 555 560
Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Ser Glu
565 570 575
Leu Ile Lys Glu Asn Met His Met Lys Leu Tyr Met Glu Gly Thr Val
580 585 590
Asn Asn His His Phe Lys Cys Thr Ser Glu Gly Glu Gly Lys Pro Tyr
595 600 605
Glu Gly Thr Gln Thr Met Arg Ile Lys Ala Val Glu Gly Gly Pro Leu
610 615 620
Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr Ser Phe Met Tyr Gly Ser Lys
625 630 635 640
Thr Phe Ile Asn His Thr Gln Gly Ile Pro Asp Phe Phe Lys Gln Ser
645 650 655
Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Val Thr Thr Tyr Glu Asp Gly
660 665 670
Gly Val Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr Ser Leu Gln Asp Gly Cys Leu
675 680 685
Ile Tyr Asn Val Lys Ile Arg Gly Val Asn Phe Pro Ser Asn Gly Pro
690 695 700
Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Gly Trp Glu Ala Ser Thr Glu Thr Leu
705 710 715 720
Tyr Pro Ala Asp Gly Gly Leu Glu Gly Arg Ala Asp Met Ala Leu Lys
725 730 735
Leu Val Gly Gly Gly His Leu Ile Cys Asn Leu Lys Thr Thr Tyr Arg
740 745 750
Ser Lys Lys Pro Ala Lys Asn Leu Lys Met Pro Gly Val Tyr Tyr Val
755 760 765
Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ile Lys Glu Ala Asp Lys Glu Thr Tyr Val
770 775 780
Glu Gln His Glu Val Ala Val Ala Arg Tyr Cys Asp Leu Pro Ser Lys
785 790 795 800
Leu Gly His Arg

Claims (10)

1.特异DNA分子，为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的DNA分子；
(a2)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：上游同源臂、融合基因、转录调控元件WPRE、poly(A)终止序列、下游同源臂；所述融合基因中自上游至下游依次包括如下区段：编码荧光素酶的区段、编码P2A肽的区段和编码红色荧光蛋白的区段；所述上游同源臂如序列表的序列1中第1-1122位核苷酸所示；所述下游同源臂如序列表的序列1中第4367-6063位核苷酸所示。
2.特异DNA分子，为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列1中第1123-4360位核苷酸所示的DNA分子；
(b2)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：融合基因、转录调控元件WPRE、poly(A)终止序列；所述融合基因中自上游至下游依次包括如下区段：编码荧光素酶的区段、编码P2A肽的区段和编码红色荧光蛋白的区段。
3.具有权利要求1或2所述特异DNA分子的重组质粒。
4.一种试剂盒，包括权利要求1所述特异DNA分子或权利要求2所述特异DNA分子或权利要求3所述重组质粒。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括特异sgRNA和Cas9mRNA；所述特异sgRNA的靶序列结合区如序列表的序列3中第1-17位核苷酸所示。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：特异sgRNA如序列表的序列3所示；Cas9mRNA如序列表的序列4所示。
7.权利要求1所述特异DNA分子或权利要求2所述特异DNA分子或权利要求3所述重组质粒或权利要求4所述试剂盒或权利要求5所述试剂盒或权利要求6所述试剂盒在制备转基因小鼠中的应用。
8.一种制备转基因小鼠的方法，包括如下步骤：
在小鼠受精卵中导入权利要求3所述重组质粒、特异sgRNA和Cas9 mRNA，然后移植至代孕小鼠子宫内；所述特异sgRNA的靶序列结合区如序列表的序列3中第1-17位核苷酸所示；
代孕小鼠分娩得到子代鼠，从中筛选转基因小鼠。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：
所述方法还包括如下步骤：将转基因小鼠中的雌鼠和雄鼠交配，获得子代鼠，从中筛选转基因小鼠。
10.应用甲或应用乙；
所述应用甲为权利要求1所述特异DNA分子或权利要求2所述特异DNA分子或权利要求3所述重组质粒或权利要求4所述试剂盒或权利要求5所述试剂盒或权利要求6所述试剂盒在制备炎症鼠模型中的应用。
所述应用乙为权利要求8或9所述方法在制备炎症鼠模型中的应用。
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