CN111471680A

CN111471680A - 斑马鱼模型的重构卵及其构建方法和应用、斑马鱼模型的构建方法

Info

Publication number: CN111471680A
Application number: CN201910082939.XA
Authority: CN
Inventors: 林硕; 秦伟
Original assignee: Peking University Shenzhen Graduate School
Current assignee: Peking University Shenzhen Graduate School
Priority date: 2019-01-24
Filing date: 2019-01-24
Publication date: 2020-07-31

Abstract

本发明涉及一种斑马鱼模型的重构卵及其构建方法和应用、斑马鱼模型的构建方法。该斑马鱼模型的重构卵的构建方法包括如下步骤：合成向导RNA，向导RNA含有能够与靶标片段互补结合的RNA片段，靶标片段针对atp6v1h基因设计；将向导RNA和Cas9mRNA导入野生型斑马鱼受精卵中，形成重构卵。上述方法构建的重构卵能够用于构建筛选骨质疏松药物的斑马鱼模型。

Description

斑马鱼模型的重构卵及其构建方法和应用、斑马鱼模型的构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种斑马鱼模型的重构卵及其构建方法和应用、斑马鱼模型的构建方法。

背景技术

骨是人体内最坚硬的组织，它具有运动、支持、保护身体内部器官的功能。骨的力学性质为运动提供支持，也为体内脆弱的内脏器官提供保护。同时，骨也是体内钙和磷酸盐的储藏地，人体内99％的钙都集中在骨头中，因此骨是维持人体血钙平衡的重要器官。另外，骨还给骨髓的产生提供了环境，骨髓具有造血和免疫功能，骨髓中的造血干细胞可以被诱导分化成为血细胞进入血液中，所以造血细胞的发育也离不开骨。传统的将骨作为响应激素和饮食影响的被动组织的观念在过去半个世纪受到了颠覆，人们重新认识到骨是一个能对力学需求做出响应的动态适应性组织。因此，骨的健康对于维持人正常生理活动是非常重要的。

骨由骨组织、骨髓、骨膜构成。从组织成分上来讲，骨组织是一种结缔组织，其主要组成成分为细胞、纤维和基质。骨组织内的细胞主要有四种：骨原细胞、成骨细胞、骨细胞和破骨细胞。骨原细胞是干细胞，可增殖分化成成骨细胞。成骨细胞是骨组织形成的重要细胞，负责向周围分泌纤维和胞外基质(extracellular，ECM)把自己包裹起来，形成类骨质。而后矿物质沉积到类骨质，形成坚硬的骨组织，而其中的成骨细胞则成熟成为骨细胞。骨细胞嵌在骨内部，它们伸出树突到骨基质中，和其他细胞形成微管网络。破骨细胞来源于造血干细胞，多个巨噬细胞分化、融合形成多核的破骨细胞。破骨细胞分泌蛋白酶、碳酸酐酶和酸等，有着溶解骨胞外基质的功能。骨在生命周期中一直进行着重建，从而保持适当的量。重建过程累积形成的骨量，是由骨形成(bone formation)和骨吸收(bone resorption)之间的平衡来决定。在青少年成长阶段，成骨细胞的活动大于破骨细胞，从而使得骨增长；在老年阶段，破骨细胞的活动大于成骨细胞，从而骨质逐渐丢失。在正常情况下，成骨细胞和破骨细胞的平衡决定着骨质的稳定，而一旦这个平衡被打破，则出现骨异常、骨硬化病(osteopetrosis)或骨质疏松(osteoporosis)等。

骨质疏松，是由多种原因导致的骨密度和骨量的下降，其主要特征为骨头疼痛、易骨折。骨质疏松分为原发性骨质疏松和继发性骨质疏松。造成骨质疏松的原因有多种多样，如内分泌性疾病、绝经后雌激素缺乏、营养吸收障碍、类风湿性关节炎、肿瘤等。因此，研究能够治疗骨质疏松的药物迫在眉睫。

目前，主要通过构建骨质疏松小鼠模型来筛选治疗骨质疏松的药物。然而，骨质疏松小鼠模型的饲养周期长，十分不利于药物的筛选。

发明内容

基于此，有必提供一种斑马鱼模型的重构卵的构建方法，该方法构建的重构卵能够用于构建筛选骨质疏松药物的斑马鱼模型。

此外，还提供一种斑马鱼模型的重构卵及其应用、斑马鱼模型的构建方法。

一种斑马鱼模型的重构卵的构建方法，包括如下步骤：

合成向导RNA，所述向导RNA含有能够与靶标片段互补结合的RNA片段，所述靶标片段针对atp6v1h基因设计；及

将所述向导RNA和Cas9mRNA导入野生型斑马鱼受精卵中，形成重构卵。

研究发现，atp6v1h基因与骨骼密度减少有一定的关系，是导致出现骨质疏松的相关基因。上述斑马鱼模型的重构卵的构建方法中，设计针对atp6v1h基因设计的靶向片段，以合成向导RNA，并采用CRISPR/Cas9基因编辑系统对野生型斑马鱼基因组进行修复以敲除野生型斑马鱼的atp6v1h基因，得到的重构卵能够用于构建骨质疏松的斑马鱼模型，同时，斑马鱼的生长周期短，有利于骨质疏松药物的筛选。经试验证明，采用上述构建方法得到的重构卵构建的斑马鱼模型具有脊柱弯曲、椎体钙化结构缺失以及骨量、骨密度降低的表型。

其中一个实施例中，所述靶标片段针对所述atp6v1h基因的第四个外显子设计。

其中一个实施例中，所述靶标片段的序列如SEQ ID No.1所示。

其中一个实施例中，所述合成向导RNA的步骤包括：

以骨架质粒为模板，采用正向引物和反向引物进行PCR反应，得到PCR产物，所述正向引物含有所述靶标序列；及

将所述PCR产物进行体外转录，得到所述向导RNA。

其中一个实施例中，所述骨架质粒为pT7-gRNA质粒；

及/或，所述正向引物的序列如SEQ ID No.2所示，所述反向引物的序列如SEQ IDNo.3所示。

其中一个实施例中，所述将所述向导RNA和Cas9mRNA导入野生型斑马鱼受精卵中的步骤之前，还包括合成所述Cas9mRNA的步骤：将pT3TS-nCas9n质粒线性化后进行体外转录，得到所述Cas9mRNA。

一种由上述斑马鱼模型的重构卵的构建方法构建得到的重构卵。

一种斑马鱼模型的构建方法，包括如下步骤：

将所述重构卵培养，得到初代斑马鱼突变体；

将所述初代斑马鱼突变体内交，得到第二代斑马鱼突变体；及

将所述第二代斑马鱼突变体内交，得到所述斑马鱼模型。

其中一个实施例中，所述将所述重构卵培养，得到初代斑马鱼突变体的步骤之后，还包括验证所述初代斑马鱼突变体的步骤：

将所述初代斑马鱼突变体与所述野生型斑马鱼外交，得到待验证斑马鱼；

采用序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的扩增引物对对所述待验证斑马鱼的基因组进行PCR反应，得到PCR产物；及

采用T7核酸内切酶法对所述PCR产物进行鉴定。

上述重构卵或上述斑马鱼模型构建方法构建得到的斑马鱼模型在制备治疗骨质疏松的药物中的应用。

附图说明

图1为atp6v1h基因的结构示意图；

图2为野生型斑马鱼与斑马鱼模型中基因组DNA的T7核酸内切酶法鉴定对比图；

图3为实施例3中初代斑马鱼突变体与野生型斑马鱼的测序比对图；

图4为斑马鱼模型与野生型斑马鱼的身体弯曲对比图；

图5为X-RAY方式检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼的脊柱弯曲对比图；

图6为X-RAY方式检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼的椎骨对比图；

图7为X-RAY方式检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼的椎骨的椎体腔对比图；

图8为X-RAY方式检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼中单个椎骨对比图；

图9为X-RAY方式检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼的骨密度的对比图；

图10为X-RAY方式检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼的骨量的对比图；

图11为X-RAY方式检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼的骨面积的对比图；

图12为斑马鱼模型与野生型斑马鱼的染色对比图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

本发明提供了一种斑马鱼模型的重构卵的构建方法，通过CRISPR/Cas9基因编辑系统对野生型斑马鱼基因组进行修复以敲除野生型斑马鱼的atp6v1h基因，得到的斑马鱼模型的重构卵能够用于构建骨质疏松的斑马鱼模型，斑马鱼的生长周期短，有利于大规模骨质疏松药物的筛选，进而能够应用于制备骨质疏松的药物中。

在其中一个实施例中，斑马鱼模型的重构卵的构建方法包括如下步骤S110～S120：

S110、合成向导RNA，向导RNA含有能够与靶标片段互补结合的RNA片段，靶标片段针对atp6v1h基因设计。

研究发现，V-ATPase(即囊泡ATP酶)广泛分布于真核细胞原生质膜和各种细胞器内膜中，是生物体内水解ATP、调节pH值和产生电势梯度等生命活动的重要参与者。V-ATPase包含V1和V0两个亚单位，全酶的聚集和解聚是酶活性的主要调节方式之一。V1亚单位位于细胞质内，是一种外周蛋白复合体，包括8种亚基(A3、B3、C、D、E、F、G2、H)，参与ATP水解；V0是一种跨膜蛋白，由6个亚基(a、c、c'、c″、d、Ac45)组成，形成一个环状结构，其主要功能是进行氢离子的跨膜转运，以调节组织细胞的酸碱环境。V-ATPase发生异常改变时，会引起较为严重的疾病，例如骨骼、神经系统、肾脏疾病和肿瘤、糖尿病等。ATP6V1H基因是液泡质子泵ATP酶(vacuolarproton pump H+-adenosine triphosphatase，V-ATPase)的重要组成部分。研究发现，atp6v1h基因与骨骼密度减少有一定的关系，是导致出现骨质疏松的相关基因。

在其中一个实施例中，靶标片段针对atp6v1h基因的第四个外显子设计。具体地，atp6v1h基因的Gene ID:51606。如图1所示，ATP6V1H基因具有13个外显子，针对atp6v1h基因的第四个外显子设计的靶标片段的脱靶率较低。atp6v1h基因的第四个外显子的序列如SEQ ID No.6所示。图1中ATP4gRNA1即为靶标片段。具体地，如SEQ ID No.6所示的序列为：5’-ggatacaattctgctagctagctagacatagcatgcaaactgcgcacgtagttcagggataatccatgctacgtgcata gcaactggcaaatgtttaaggccattgcctgcatgcaatggttaaccgtacattagcaatgctgcatgctcgaacctgac-3’。

进一步地，靶标片段符合T7转录启动子的转录起始位点要求。

在一个具体示例中，靶标片段的序列如SEQ ID No.1所示。具体地，如SEQ ID No.1所示的序列为：5’-GTGTGTCATCAATCAGGGTCAGG-3’。

在其中一个实施例中，合成向导RNA的步骤包括S111～S112：

S111、以骨架质粒为模板，采用正向引物和反向引物进行PCR反应，得到PCR产物，正向引物含有靶标序列。

在一个具体示例中，骨架质粒为pT7-gRNA质粒。

在其中一个实施例中，正向引物还含有T7启动子序列。

在一个具体示例中，正向引物的序列如SEQ ID No.2所示，反向引物的序列如SEQID No.3所示。具体地，如SEQ ID No.2的序列为：5’-TAATACGACTCACTATAgGTGTGTCATCAATCAGGGTCGTTTTAGAGCTA-3’；如SEQ ID No.3的序列为：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’。

在一个具体示例中，进行PCR反应的体系为：2.5μL 10μmol/L的正向引物、2.5μL10μmol/L的反向引物、25μL 2×Phusion Master Mix、1μL 20ng/μL的模板、19μL的ddH₂O(即双蒸水)。

在一个具体示例中，进行PCR反应的程序为：98℃30s；98℃10s，58℃10s，72℃10s、39个循环；72℃10min；16℃Forever。

S112、将PCR产物进行体外转录，得到向导RNA。

在其中一个具体示例中，体外转录的反应体系如下：总体积20μL，2μL的10×Reaction Buffer、1μL的ATP、1μL的UTP、1μL的CTP、1μL的GTP、1μg的模板、2μL的T7Enzyme及余量的RNase-free ddH₂O(即无核酸水)。

在其中一个具体示例中，体外转录的反应条件为：37℃反应1h；然后加入1μL的TURBO Dnase(TURBO DNA酶)于37℃反应15min。

S120、将向导RNA和Cas9mRNA导入野生型斑马鱼受精卵中，形成重构卵。

斑马鱼个体小，繁殖能力强，饲养成本低；斑马鱼生长周期短，在实验室条件下，从胚胎到性成熟一般需要三个月时间；斑马鱼的单倍体、雌核发育二倍体、突变体的制造相对其他模式生物比较容易，其精子也能够冷冻保存，适合用作胚胎学和遗传发育生物学的研究；斑马鱼是体外受精、体外发育，容易进行观察和组织移植、化学药物筛选等操作；斑马鱼胚胎透明，这使得其整个发育过程都可以在光学显微镜下观察和追踪到。综上，斑马鱼能够用于大规模筛选骨质疏松药物。本研究，通过将向导RNA和Cas9mRNA导入野生型斑马鱼受精卵中，通过CRISPR/Cas9基因编辑系统对野生型斑马鱼基因组进行修复以敲除野生型斑马鱼的atp6v1h基因，得到的重构卵能够用于构建骨质疏松的斑马鱼模型，能够用于大规模筛选骨质疏松药物。

在其中一个实施例中，导入野生型斑马鱼受精卵的向导RNA和Cas9mRNA的质量比为1：1～1：6。此种设置，有利于提高野生型斑马鱼的基因突变效率。进一步地，导入野生型斑马鱼受精卵的向导RNA和Cas9mRNA的质量比为1:4。

在其中一个实施例中，向导RNA和Cas9mRNA导入野生型斑马鱼受精卵的方式为显微注射。

在其中一个实施例中，在S120的步骤之前，还包括合成Cas9mRNA的步骤：将pT3TS-nCas9n质粒线性化后进行体外转录，得到Cas9mRNA。

在其中一个实施例中，将pT3TS-nCas9n质粒(addgene#46757)与XbaI酶的摩尔比为1：1混合后，于36℃～38℃水浴4h，以将pT3TS-nCas9n质粒线性化。

进一步地，线性化的pT3TS-nCas9n质粒进行体外转录的反应体系如下：总体积20μL，2μL的10×Reaction Buffer、10μL的2×NTP/CAP、1μL的模板及余量的RNase-free ddH₂O(即无核酸水)。更进一步地，线性化的pT3TS-nCas9n质粒进行体外转录的反应条件为：37℃水浴2h；然后加入1μL的TURBO Dnase(TURBO DNA酶)于37℃反应15min。

在其中一个实施例中，在S120的步骤之后，还包括验证重构卵的步骤。具体地，验证重构卵的步骤包括S131～S134：

S131、将重构卵培养，得到初代斑马鱼突变体。

S132、将初代斑马鱼突变体与野生型斑马鱼外交，得到待验证斑马鱼。

S133、提取待验证斑马鱼的基因组DNA，采用序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的扩增引物对对待验证斑马鱼的基因组进行PCR反应，得到PCR产物。通过PCR反应扩增出带有突变位点DNA片段，长度约500bp。

具体地，如SEQ ID No.4所示的序列为：5’-GCTCGACCAGTGCTTGTGAT-3’；如SEQ IDNo.5所示的序列为：5’-CAGCTCAAGGACCCCACTTT-3’。

S134、采用T7核酸内切酶法对PCR产物进行鉴定。

具体地，将2μL的NEB buffer 2.0、1μg的PCR产物及ddH₂O补齐20μL，得到反应液，并以如下程序进行反应：95℃5min；94℃2sec，-0.1℃/cycle，200个循环；75℃1sec，-0.1℃/cycle，200个循环；16℃2min；反应结束后，加入0.8μL的T7E1酶于37℃反应30min，将反应产物跑质量百分含量为2％的琼脂糖凝胶电泳检测。需要说明的是，“94℃2sec，-0.1℃/cycle”表示的是从第一个循环的94℃起每个循环降低反应温度0.1℃；“75℃1sec，-0.1℃/cycle”表示的是从第一个循环的75℃起每个循环降低反应温度0.1℃。

上述斑马鱼模型的重构卵的构建方法中，设计针对atp6v1h基因设计的靶向片段，以合成向导RNA，并采用CRISPR/Cas9基因编辑系统对野生型斑马鱼基因组进行修复以敲除野生型斑马鱼的atp6v1h基因，得到的重构卵能够用于构建骨质疏松的斑马鱼模型，同时，斑马鱼的生长周期短，有利于大规模骨质疏松药物的筛选。经试验证明，采用上述构建方法得到的重构卵构建的斑马鱼模型具有脊柱弯曲、椎体钙化结构缺失以及骨量、骨密度降低的表型。

一般地，主要通过化学试剂诱导来筛选骨质疏松动物模型，筛选周期较长，突变效率较低，得到的骨质疏松动物模型的稳定性较差。上述斑马鱼模型的重构卵的构建方法通过CRISPR/Cas9基因编辑系统能更加高效且精准地在斑马鱼基因组上沉默atp6v1h基因，突变效率高，得到的重构卵的稳定性较好，操作简单方便。

一实施方式的斑马鱼模型的构建方法，包括如下步骤S210～S230：

S210、将重构卵培养，得到初代斑马鱼突变体。

在其中一个实施例中，重构卵的培养温度为26℃～28℃。培养时间为60天～90天。需要说明的是，当重构卵为胚胎阶段时，置于斑马鱼生长的水环境中进行生长。当重构卵呈鱼形态时，按照常规斑马鱼的饲养方式进行饲养。

在其中一个实施例中，S210之后还包括验证初代斑马鱼突变体的步骤。具体地，验证初代斑马鱼突变体的步骤包括S211～S213：

S211、将初代斑马鱼突变体与野生型斑马鱼外交，得到待验证斑马鱼。

S212、提取待验证斑马鱼的基因组DNA，采用序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的扩增引物对对待验证斑马鱼的基因组进行PCR反应，得到PCR产物。通过PCR反应扩增出带有突变位点DNA片段，长度约500bp。

S213、采用T7核酸内切酶法对PCR产物进行鉴定。

S220、将初代斑马鱼突变体内交，得到第二代斑马鱼突变体。

在其中一个实施例中，S220之后还包括对第二代斑马鱼突变体进行基因型检测的步骤，以确定第二代斑马鱼突变体携带突变。

S230、将第二代斑马鱼突变体内交，得到斑马鱼模型。

在其中一个实施例中，在S230之后，还包括对斑马鱼模型的重构卵进行鉴定，以确定斑马鱼突变体携带突变。进一步地，鉴定的方式选自剪尾鉴定及测序鉴定中的至少一种。

上述斑马鱼模型的构建方法构建得到的斑马鱼模型为骨质疏松的斑马鱼模型，斑马鱼的生长周期短，有利于大规模骨质疏松药物的筛选。经试验证明，上述斑马鱼模型的构建方法得到的斑马鱼模型具有脊柱弯曲、椎体钙化结构缺失以及骨量、骨密度降低的表型。

一般地，主要通过化学试剂诱导来筛选骨质疏松动物模型，筛选周期较长，突变效率较低，得到的骨质疏松动物模型的稳定性较差。上述斑马鱼模型的构建方法通过CRISPR/Cas9基因编辑系统能更加高效且精准地在斑马鱼基因组上沉默atp6v1h基因，突变效率高，得到的斑马鱼模型的稳定性较好，操作简单方便；同时，经研究发现，斑马鱼的atp6v1h基因与人类的atp6v1h基因具有高度的同源性，本研究得到的斑马鱼模型能够用于高效筛选质量骨质疏松药物，为研究固执疏松相关基因的致病机制提供有力的手段。

以下为具体实施例部分。

实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。

实施例1

gRNA(即向导RNA)的合成

(1)CRISPR/Cas9gRNA靶向序列的设计

所选用的靶向序列符合T7转录启动子的转录起始位点要求，靶向序列如SEQ IDNo.1所示。如SEQ ID No.1所示的序列为：5’-GTGTGTCATCAATCAGGGTCAGG-3’。

(2)采用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix(购于genstar公司)按照表1的反应体系及表2的反应程序进行PCR反应，得到PCR反应产物。用DNA纯化回收试剂盒(购于天根生化科技有限公司)回收PCR反应产物，并将回收的PCR反应产物溶于20μL的RNase-free(即无核酸酶)的去离子水中。用NanoDrop2000超微量分光光度计测定回收的PCR反应产物的浓度。将100ng/μL的回收PCR反应产物用作体外转录的模板。

表1 PCR反应体系

反应试剂	试剂用量
		10μmol/L的正向引物(如SEQ ID No.2所示)	2.5μL
10μmol/L的反向引物(如SEQ ID No.3所示)	2.5μL
		2×Phusion Master Mix	2.5μL
20ng/μL的pT7-gRNA质粒(addgene#46759)	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	19μL

需要说明的是，表1中，如SEQ ID No.2的序列为：5’-TAATACGACTCACTATAgGTGTGTCATCAATCAGGGTCGTTTTAGAGCTA-3’；如SEQ ID No.3的序列为：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’。

表2 PCR反应程序

(2)用

T7 Transcription Kit(购于英潍捷基上海贸易有限公司)的操作对步骤(1)得到的体外转录模板进行gRNA的合成。具体地，按照总体积20μL，2μL的10×Reaction Buffer、1μL的ATP、1μL的UTP、1μL的CTP、1μL的GTP、1μg的模板、2μL的T7Enzyme及余量的RNase-free ddH₂O(即无核酸水)配制反应体系，配制后于37℃水浴1h，然后加入1μL的TURBO Dnase(购于biowest公司)于37℃反应15min，得到反应液。取0.5μL的反应液跑琼脂的质量百分含量为1.5％的凝胶琼脂糖电泳，验证转录是否正常。验证转录反应正常后，则用

Mini Kit(购于qiagen公司)回收反应液中的gRNA，并将20μL的gRNA溶于RNase-free的去离子水，再用NanoDrop2000超微量分光光度计测定回收的gRNA浓度。选取100ng/μL的回收gRNA分装保存于-80℃备用。

实施例2

Cas9mRNA的合成

(1)将pT3TS-nCas9n质粒(addgene#46757)与XbaI酶(购于NEB公司)的摩尔比为1；1混合后，37℃水浴4h，得到反应产物。取0.5μL的反应产物跑琼脂的质量百分含量为1％的琼脂糖凝胶电泳，以确定pT3TS-nCas9n质粒被完全切开。用DNA纯化回收试剂盒(购于天根生化科技有限公司)回收反应产物中线性化的质粒，并溶于RNase-free的去离子水，再用NanoDrop2000超微量分光光度计测定线性化质粒的浓度。取浓度150ng/μL的线性化质粒作为体外转录的模板。

(2)用T7mMESSAGE

kit(购于英潍捷基上海贸易有限公司)进行zCas9mRNA的体外转录。具体地，按照总体积为20μL，2μL的10×Reaction Buffer、10μL的2×NTP/CAP、1μL的模板及余量的RNase-free ddH₂O(即无核酸水)配制反应液，混匀，37℃水浴2h，然后加入1μL的TURBO DNase于37℃继续反应15min，除去DNA模板，得到反应产物。取0.5μL反应产物跑质量百分含量为1％的琼脂糖凝胶电泳，确认是否转录成功。验证转录反应正常后，则用

Mini Kit回收合成好的zCas9mRNA，并溶于20μL的RNase-free的去离子水中。用NanoDrop2000超微量分光光度计测定其浓度，选取浓度高于1000ng/μL的zCas9mRNA溶液分装并保存于-80℃，以避免RNA的降解。

实施例3

斑马鱼模型的构建

(1)将按照终浓度为50ng/uL的gRNA与终浓度为200ng/uL的Cas9mRNA混合后，显微注入1细胞期的野生型斑马鱼受精卵中形成重构卵，将重构卵置于28℃培养箱中培养，gRNA的终浓度为50ng/uL，Cas9mRNA的终浓度为200ng/uL。待重构卵发育至24hpf时，取5枚重构卵，制备基因组DNA模板，然后使用T7核酸内切酶(T7E1)方法检测基因的突变效率，得到初代斑马鱼突变体(即F0代)。需要说明的是，当重构卵为胚胎阶段时，置于斑马鱼生长的水环境中进行生长。当重构卵呈鱼形态时，按照常规斑马鱼的饲养方式进行饲养。

具体步骤为：

(a)基因组DNA提取

取5枚发育至24hpf的重构卵置于PCR管中；吸干水分，加入40μL、50mM的NaOH水溶液，混匀后在PCR仪中95℃裂解20min；再加入4μL、1M的Tris-HCl(pH 8.0)，用枪头吹打溶液，使基因组充分裂解。

(b)用序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的扩增引物对对基因组按照表3的反应体系和表4的反应程序进行PCR反应，得到反应产物。取1μL反应产物跑质量百分含量为1.5％的琼脂糖凝胶电泳，验证PCR产物的大小是否正确。验证正确后，采用DNA产物回收试剂盒(购于天根生化科技有限公司)纯化PCR产物，并溶于ddH₂O，用NanoDrop2000超微量分光光度计测定浓度。其中，如SEQ ID No.4所示的序列为：5’-GCTCGACCAGTGCTTGTGAT-3’；如SEQ ID No.5所示的序列为：5’-CAGCTCAAGGACCCCACTTT-3’。

表3 PCR反应体系

反应试剂	试剂用量
		10μmol/L的正向引物(如SEQ ID No.4所示)	2.5μL
10μmol/L的反向引物(如SEQ ID No.5所示)	2.5μL
		2×Phusion Master Mix	2.5μL
20ng/μL的pT7-gRNA质粒(addgene#46759)	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	19μL

表4 PCR反应程序

(c)将2μL的NEB buffer 2.0(购于NEB公司)、1μg的纯化PCR产物及ddH₂O补齐20μL，得到反应液，将反应液按照表5的反应程序进行反应；反应结束后，加入0.8μL的T7E1酶(购于NEB公司)于37℃反应30min，将反应产物跑质量百分含量为2％的琼脂糖凝胶电泳检测。同时以未注射gRNA与Cas9mRNA的野生型斑马鱼受精卵作为对照，提取基因组DNA使用T7核酸内切酶(T7E1)方法进行检测(即为对照组)。检测结果如图2。图2为野生型斑马鱼与斑马鱼模型中基因组DNA的T7核酸内切酶法鉴定对比图。图2中的M为Marker，注射组即为注射gRNA与Cas9mRNA的野生型斑马鱼受精卵。

表5反应程序

95℃5min	1个循环
		94℃2sec，-0.1℃/cycle	200个循环
75℃1sec，-0.1℃/cycle	200个循环
		16℃2min	1个循环

表5中，“94℃2sec，-0.1℃/cycle”表示的是从第一个循环的94℃起每个循环降低反应温度0.1℃；“75℃1sec，-0.1℃/cycle”表示的是从第一个循环的75℃起每个循环降低反应温度0.1℃。

从图2可以看出，注射gRNA与Cas9mRNA的野生型斑马鱼受精卵发生突变，且突变效率较高。

(2)将初代斑马鱼突变体与野生型斑马鱼外交，得到F1胚胎；通过测序检测F1胚胎基因型，找到携带突变的founder F0胚胎。测序检测结果详见图3。图3中“Mutant”表示的是初代斑马鱼突变体与野生型斑马鱼外交的F1胚胎，“WT”为野生型斑马鱼内交的F1胚胎。图3为实施例3中初代斑马鱼突变体与野生型斑马鱼的测序比对图。

从图3中可以看出，founder F0胚胎缺失17bp的序列。

(3)将founder F0养大，再通过剪尾鉴定并测序，从中筛选出携带了突变的F1成鱼，即为第二代斑马鱼突变体。

(4)将两个F1成鱼内交，得到斑马鱼模型，即1/4的atp6v1h+/-突变体。

测试：

1、斑马鱼模型的骨骼观察

对斑马鱼模型进行表型观察分析，同时，以未经突变的野生型斑马鱼作为对照，所检测的鱼均为培养8个月的成鱼。测定测定结果详见图4～11。图4～11中，“+/+”表示野生型斑马鱼，“+/-”表示斑马鱼模型。图4为斑马鱼模型与野生型斑马鱼的身体弯曲对比图。图5为X-RAY检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼的脊柱弯曲对比图。图6为X-RAY方式检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼的椎骨对比图。图7为X-RAY方式检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼的椎骨的椎体腔对比图。图8为X-RAY方式检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼中单个椎骨对比图。图9为X-RAY方式检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼的骨密度的对比图，图9中“BMD”表示骨密度，“WT”表示野生型斑马鱼，“Mut”表示斑马鱼模型。图10为X-RAY方式检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼的骨量的对比图，图10中“BV”表示骨密度，“WT”表示野生型斑马鱼，“Mut”表示斑马鱼模型。图11为X-RAY方式检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼的骨面积的对比图，图11中“BS”表示骨密度，“WT”表示野生型斑马鱼，“Mut”表示斑马鱼模型。

从图4可以看出，生长至8个月的斑马鱼模型躯干出现弯曲。从图5可以看出，生长至8个月的斑马鱼模型的脊柱有弯曲的问题。从图6可以看出，生长至8个月的斑马鱼模型的椎骨体积较小、表面较粗糙。从图7～8可以看出，生长至8个月的斑马鱼模型椎骨的椎体腔缺失钙化结构；椎骨表面较粗糙、体积变小、椎体腔中空，整个骨骼结构都显得比正常骨骼略小，且形态略带异常。从图9～11可以看出，与野生型斑马鱼相比，生长至8个月的斑马鱼模型骨密度、骨量、骨面积均明显下降。

2、对斑马鱼模型的染色鉴定

(1)钙黄绿素活体染色

将活体胚胎收集在培养皿或者EP管中，用质量百分含量为0.2％的钙黄绿素水溶液浸泡染色10min；染色结束后，用去离子水洗涤3次，以充分洗去剩余的染液；清洗结束后在去离子水中浸泡10min，以残留的钙黄绿素，得到处理后的胚胎。用质量百分含量为10％～20％的三卡因水溶液麻醉处理后的胚胎，然后用质量百分含量为3％的甲基纤维素水溶液将胚胎固定在载玻片上，用带有观察GFP(绿色荧光蛋白)滤片的荧光显微镜(激发片波长495nm，发射片波长525nm)观察胚胎。

(2)阿辛蓝和茜素红双染色

(a)在质量百分含量为10％的三卡因水溶液中麻醉胚胎；然后在质量百分含量为3.7％的中性甲醛水溶液中于室温下过夜固定；用Ph7.0的PBST溶液(含有质量百分含量为0.1％吐温20的PBS缓冲液，Ph7.0)清洗洗胚胎3次，每次5min；将清洗后的胚胎转移到质量百分含量为0.1％的阿辛蓝水溶液(阿辛蓝溶于有机溶剂中，有机溶剂含有质量百分含量为80％的乙醇和质量百分含量为20％的冰醋酸，用0.22μm孔径过滤器过滤)中染6h～8h或者过夜；用无水乙醇冲洗胚胎并梯度复水到Ph7.0的PBS溶液中，然后脱色液(含有质量百分含量为3％的过氧化氢和质量百分含量为1％的氢氧化钾的水溶液)脱色，当胚胎的眼部色素被清除，则立即停止反应，反应过程中保持管盖开启。用含有质量百分含量为0.05％胰酶的PBS溶液清洗胚胎1h～2h，当脑部组织清晰可见，则停止反应；用Ph7.0的PBS清洗胚胎3次，每次5分钟；将清洗后的胚胎梯度转移到质量百分含量为70％甘油水溶液中并拍照。

(b)同时将清洗后的胚胎转移到质量百分含量为0.05％的茜素红染液(茜素红溶于质量百分含量为1％的KOH水溶液)中染2小时；用Ph7.0的PBS缓冲液清洗胚胎，然后梯度转移到质量百分含量为70％甘油水溶液中并拍照。

上述两种染色的结果详见图12。图12为斑马鱼模型与野生型斑马鱼的染色对比图。图12A和图12B分别为受精后6dpf的野生型斑马鱼与斑马鱼模型在明场的照片。图12C和图12D分别为受精后6dpf的野生型斑马鱼和突变体经钙黄绿素染色后的图片。图12E和图12F分别为受精后8dpf的野生型斑马鱼和突变体经钙黄绿素染色后的图片。图12C～图12F中鱼腹面上明亮的荧光染色表明钙化骨。图12G和图12H分别为受精后6dpf的野生型斑马鱼与斑马鱼模型经阿辛蓝和茜素红双染色后的图片。图12G～图12H中箭头所指的深紫色部分表示硬骨，蓝色的部分表示软骨。

从图12可以看出，与野生型斑马鱼相比，突变体胚胎在6dpf和8dpf的硬骨特异性缺失，而软骨正常，骨质均明显减少，从而说明atp6v1h基因缺失影响硬骨的发育。

综上所述，上述斑马鱼模型的重构卵的构建方法得到的重构卵能够用于构建具有骨质疏松的斑马鱼模型，且该斑马鱼模型具有脊柱弯曲、椎体钙化结构缺失以及骨量、骨密度降低的表型，能够作为骨质疏松的斑马鱼模型，用于筛选骨质疏松的药物。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 北京大学深圳研究生院

<120> 斑马鱼模型的重构卵及其构建方法和应用、斑马鱼模型的构建方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgtgtcatc aatcagggtc agg 23

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taatacgact cactataggt gtgtcatcaa tcagggtcgt tttagagcta 50

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaaaaagca ccgactcggt gccac 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctcgaccag tgcttgtgat 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cagctcaagg accccacttt 20

<210> 6

<211> 159

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 6

ggatacaatt ctgctagcta gctagacata gcatgcaaac tgcgcacgta gttcagggat 60

aatccatgct acgtgcatag caactggcaa atgtttaagg ccattgcctg catgcaatgg 120

ttaaccgtac attagcaatg ctgcatgctc gaacctgac 159

Claims

1.一种斑马鱼模型的重构卵的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

合成向导RNA，所述向导RNA含有能够与靶标片段互补结合的RNA片段，所述靶标片段针对atp6v1h基因设计；

2.根据权利要求1所述的斑马鱼模型的重构卵的构建方法，其特征在于，所述靶标片段针对所述atp6v1h基因的第四个外显子设计。

3.根据权利要求1所述的斑马鱼模型的重构卵的构建方法，其特征在于，所述靶标片段的序列如SEQ ID No.1所示。

4.根据权利要求1～3任一项所述的斑马鱼模型的重构卵的构建方法，其特征在于，所述合成向导RNA的步骤包括：

将所述PCR产物进行体外转录，得到所述向导RNA。

5.根据权利要求4所述的斑马鱼模型的重构卵的构建方法，其特征在于，所述骨架质粒为pT7-gRNA质粒；

及/或，所述正向引物的序列如SEQ ID No.2所示，所述反向引物的序列如SEQ ID No.3所示。

6.根据权利要求1所述的斑马鱼模型的重构卵的构建方法，其特征在于，所述将所述向导RNA和Cas9mRNA导入野生型斑马鱼受精卵中的步骤之前，还包括合成所述Cas9mRNA的步骤：将pT3TS-nCas9n质粒线性化后进行体外转录，得到所述Cas9mRNA。

7.一种由权利要求1～6任一项所述的斑马鱼模型的重构卵的构建方法构建得到的重构卵。

8.一种斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

将所述重构卵培养，得到初代斑马鱼突变体；

将所述第二代斑马鱼突变体内交，得到所述斑马鱼模型。

9.根据权利要求8所述的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，所述将所述重构卵培养，得到初代斑马鱼突变体的步骤之后，还包括验证所述初代斑马鱼突变体的步骤：

采用T7核酸内切酶法对所述PCR产物进行鉴定。

10.权利要求7所述的重构卵或权利要求8～9任一项所述的斑马鱼模型构建方法构建得到的斑马鱼模型在制备治疗骨质疏松的药物中的应用。