CN113373150B - 一种靶向dat基因的sgRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向dat基因的sgRNA及其应用，所述靶向dat基因的sgRNA包括SEQ ID No.1所示的核酸序列。本发明还提供了一种靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统、一种重组细胞及其构建方法和一种可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的构建方法。通过基因插入及筛选，得到的可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型在第17号内含子中插入了目标片段，并且可以进行转录，实现了多巴胺能神经元受损与修复的实时观测，为帕金森病的机制研究及药物筛选等工作提供了有力的工具，具有广阔的应用前景。

Description

一种靶向dat基因的sgRNA及其应用
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，尤其涉及一种靶向dat基因的sgRNA及其应用。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见的中老年人神经系统退行性疾病，在65～69岁的老年人群中的发病率约为0.5％～1％，在80岁以上的老年人群中的发病率约为1％～3％。帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡，从而引起纹状体多巴胺(Dopamine，DA)含量显著减少最终导致疾病的发生。随着相关研究的开展，已有一些方法可以缓解帕金森病的症状，但仍然缺乏彻底治愈的方法。
目前，帕金森病的致病机理尚不明确。因此，建立有关帕金森病的模型对于机理的研究及药物筛选具有重要的意义。CN105878251B公开了一种帕金森病动物模型的制备方法及其用途，所述帕金森病动物模型的制备方法包括：(1)在每只动物皮下注射大麻素受体拮抗剂，每天一次，连续5～15天；(2)将步骤(1)中得到的动物样本进行检测运动协调性的实验；(3)取步骤(2)评估后动物的脑部组织进行检测，即得帕金森病动物模型。根据上述方法制备的动物模型具有造模成功率高、无其他毒副作用的优点，且获得的帕金森病动物模型可用于研究大麻素系统与帕金森病的病理进程的机制，但该动物模型无法遗传，需要不断进行药物注射以获得新的动物模型，且不同个体之间也存在一定的差异性，对实验结果的影响较大。
因此，如何提供一种可以稳定遗传的帕金森病动物模型，相应的表型可以进行遗传，无需反复制备，且受外界环境的影响较小，稳定性好，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种靶向dat基因的sgRNA及其应用，通过在斑马鱼的多巴胺能神经元特征基因dat基因(多巴胺转运体基因)的17号内含子中插入增强绿色荧光蛋白(EGFP)和硝基还原酶(NTR)的编码序列，配合甲硝唑(MTZ)的使用，实现了在荧光显微镜下进行多巴胺能神经元的丢失与再生的实时观察。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种靶向dat基因的sgRNA，所述靶向dat基因的sgRNA包括SEQ ID No.1所示的核酸序列。
SEQ ID No.1：GTTATGAGCGAGTGCATTTC。
本发明中，所述sgRNA的靶点位于dat基因的第17号内含子，不影响dat基因的编码序列，并且可以实现定点插入，保证了目标片段的特异性插入；插入后的目标片段与dat基因共用相同的启动子，从而实现目标片段的组织特异性表达，相应的转基因斑马鱼仅在多巴胺能神经元中表达EGFP，方便观察与信号追踪。
第二方面，本发明提供了一种靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统，所述靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统包括第一方面所述的靶向dat基因的sgRNA。
优选地，所述靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统还包括Cas9和/或供体质粒，优选为Cas9和供体质粒。
优选地，所述Cas9包括Cas9核酸酶和/或Cas9 mRNA，优选为Cas9 mRNA。
本发明中，选用Cas9 mRNA与sgRNA配合使用，毒害作用较小，受精卵的存活率较高，获得的F0代个体数量较多，减少了工作量。
优选地，所述供体质粒包括所述靶向dat基因的sgRNA的核酸序列、dat基因的18号外显子序列、融合蛋白接头编码序列、荧光蛋白编码序列或硝基还原酶编码序列中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述融合蛋白接头编码序列包括P2A编码序列。
本发明中，所述P2A表示来源于猪捷申病毒(Porcine Teschovirus)的融合蛋白接头编码序列。
优选地，所述荧光蛋白编码序列包括增强绿色荧光蛋白编码序列。
优选地，所述供体质粒的目标片段顺次连接所述靶向dat基因的sgRNA的核酸序列、dat基因的18号外显子序列、P2A编码序列、增强绿色荧光蛋白编码序列和硝基还原酶编码序列。
本发明中，所述靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统的工作原理如图1所示。
供体质粒中含有所述靶向dat基因的sgRNA的核酸序列，当与sgRNA和Cas9一同导入细胞质中时，sgRNA和Cas9复合体可以同时对基因组DNA和供体质粒中的核酸序列进行切割，当基因组发生非同源性修复时，供体质粒中的目标片段有概率连入基因组中。
供体质粒中还含有dat基因的第18个外显子，保证了表达出的dat蛋白的完整性；通过P2A将EGFP和NTR连入供体质粒，EGFP和NTR可以在P2A处发生断裂，不影响蛋白的高级结构。通过上述结构可以最大程度地保证dat蛋白维持正常的生物学功能，保证了相应研究的结果的准确性。
第三方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有第一方面所述的靶向dat基因的sgRNA。
优选地，所述重组细胞含有第二方面所述的靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统；
优选地，所述重组细胞为经过第二方面所述的靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统插入后，基因组中插入了供体质粒的目标片段的受精卵。
本发明中，选择受精卵作为受体细胞进行相关的插入操作，可以保证基因插入的稳定性与可遗传性，插入片段可以通过细胞分裂的方式进行传递，降低了筛选的工作量。
第四方面，本发明提供了一种第三方面所述的重组细胞的构建方法，所述构建方法包括：
将第二方面所述的靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统导入受精卵的细胞质内，得到所述重组细胞。
本发明中，将所述靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统直接导入受精卵的细胞质内，提高了插入的效率；同时也降低了嵌合体出现的概率，降低了后期筛选的工作量。
优选地，所述导入包括显微注射。
第五方面，本发明提供了一种可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的构建方法，所述可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的构建方法包括：
将第二方面所述的靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统导入受精卵的细胞质内，得到重组细胞；
重组细胞发育成F0代个体，与野生型交配，得到F1代杂合子；
对所述F1代杂合子进行鉴定，得到所述的可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型。
本发明中，所述可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的应用原理如图2所示。
甲硝唑(MTZ)本身无毒性，但被NTR还原后转化为具有细胞毒性的氨基化合物。通过向斑马鱼胚胎培养液中添加MTZ底物，与组织特异性表达的NTR反应，靶向性杀死多巴胺能神经元；当去除外源底物后，细胞毒性消失，多巴胺能神经元可再生恢复；配合EGFP，即可在荧光显微镜下对多巴胺能神经元的凋亡与再生进行实时观测。
优选地，所述靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统的制备方法包括：
构建供体质粒；
对Cas9基因进行体外转录，得到所述Cas9 mRNA；
将所述供体质粒、Cas9 mRNA与第一方面所述的靶向dat基因的sgRNA混合，得到所述靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统。
优选地，所述受精卵包括斑马鱼的受精卵。
优选地，所述鉴定通过PCR扩增和测序进行。
优选地，所述PCR扩增的引物包括SEQ ID No.2～3所示的核酸序列。
SEQ ID No.2：GCCACCTTCAATCCTCCCAAGTAC；
SEQ ID No.3：GCTCACCATAGGTCCAGGGTTCTC。
作为优选技术方案，本发明所述可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建供体质粒，体外转录Cas9 mRNA，与靶向dat基因的sgRNA混合，得到所述靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统；
(2)收集斑马鱼的受精卵，将所述靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统显微注射入所述斑马鱼的受精卵的细胞质内，得到重组细胞；
(3)培养所述重组细胞，生长为斑马鱼个体后，提取尾鳍组织的DNA，使用SEQ IDNo.2～3进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序鉴定，挑选基因组中插入了供体质粒的目标片段的斑马鱼个体作为F0代斑马鱼；
(4)将所述F0代斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，得到F1代杂合子斑马鱼，提取尾鳍组织的DNA，使用SEQ ID No.2～3进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序鉴定，筛选出基因组中插入了供体质粒的目标片段的斑马鱼个体，即所述的可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型。
第六方面，本发明提供了第一方面所述的靶向dat基因的sgRNA、第二方面所述的靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统、第三方面所述的重组细胞、第四方面所述的重组细胞的构建方法或第五方面所述的可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的构建方法中的任意一种或至少两种的组合在帕金森病药物筛选中的应用。
本发明中，所述靶向dat基因的sgRNA特异性良好，所述靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统设计科学，所述重组细胞及重组细胞的构建方法提高了插入效率，工作量较小；所述可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的构建方法技术成熟，稳定性好，重复性强，为帕金森病病理研究及药物筛选与治疗提供了新的思路与强有力的平台。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所述靶向dat基因的sgRNA特异性良好，所述靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统设计科学合理，实现了目标片段的定点插入，且目标片段插入后不影响dat蛋白正常的生理功能；目标片段可以通过细胞分裂的方式传递给子代细胞，稳定性较好；降低了筛选的工作量；
(2)本发明通过构建顺次连接所述靶向dat基因的sgRNA的核酸序列、dat基因的18号外显子序列、P2A编码序列、增强绿色荧光蛋白编码序列和硝基还原酶编码序列的目标片段，再将所述供体质粒插入到dat基因的17号内含子中，构建了一种可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型；通过扩增及测序验证，转基因动物模型在所述靶向dat基因的sgRNA的靶点附近出现了多种类型的突变，测序结果显示为多重峰；以基因组和cDNA为模板进行扩增均可以检测到目标片段的存在，证明所述可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的基因组中成功插入了目标片段，实现了多巴胺能神经元损伤与修复的实时观察，在帕金森病的机理研究与药物筛选中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明所述靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统的工作原理图；
图2为本发明所述可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的应用原理；
图3为本发明实施例4中F1代斑马鱼的测序结果图片；
图4为本发明实施例5中所述可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的扩增验证结果图片，图中，M-DNA Marker，泳道1-以基因组为模板的扩增结果；泳道2-以cDNA为模板的扩增结果。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料：
体外转录试剂盒购自Ambion公司；
PCR扩增试剂购自Genestar公司；
NaOH和Tris购自sigma；
RNA提取试剂购自Thermo fisher公司；
反转录试剂盒购自TaKaRa公司；
Gibson组装预混液购自NEB公司，货号为E2611S；
斑马鱼来自国家斑马鱼资源中心品系TU；
斑马鱼的饲养条件为：在温度为28℃、盐度为0.25‰、pH为7.0的条件下进行饲养，光暗条件为14h/10h，每日喂食2次，以新鲜的丰年虫作为饲料，提供足量的饲料供斑马鱼自由取食。
实施例1
本实施例提供一种靶向dat基因的sgRNA，所述靶向dat基因的sgRNA包括SEQ IDNo.1所示的核酸序列。
SEQ ID No.1：GTTATGAGCGAGTGCATTTC。
所述靶向dat基因的sgRNA靶向dat基因的第17号内含子，可以实现外源目标片段的定点插入，特异性好，插入效率高。
实施例2
本实施例提供一种靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统，所述靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统包括实施例1所述的靶向dat基因的sgRNA、Cas9 mRNA和供体质粒，所述供体质粒的目标片段顺次连接所述靶向dat基因的sgRNA的核酸序列、dat基因的18号外显子序列、P2A编码序列、增强绿色荧光蛋白编码序列和硝基还原酶编码序列。
通过sgRNA、Cas9 mRNA和供体质粒的相互配合，可以将供体质粒上的目标片段定点插入到dat基因的17号内含子中，对细胞的毒害作用较小，效率较高；供体质粒的结构可以保证表达的dat蛋白的完整性，并且引入了EGFP和NTR，在相关转基因动物模型的构建中具有广阔的应用前景。
实施例3
本实施例提供一种重组细胞，所述重组细胞为经过实施例2所述的靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统插入后，基因组中插入了供体质粒的目标片段的受精卵。
所述重组细胞通过如下方法进行构建：
(1)构建供体质粒，方法如下：
以pMD19T载体为骨架，依次将dat基因17号内含子(包括靶点及其同源片段)、18号外显子、P2A信号肽序列、EGFP基因序列、柔性linker、NTR基因序列及18号外显子3’UTR序列通过Gibson组装进行克隆测序。
使用的引物序列如SEQ ID No.4～9所示：
SEQ ID No.4：
GCGCGGATCTTCCAGAGATtTCAATAATGGTGCCGAAGTAGACAA；
SEQ ID No.5：
AACCACCAGCCAGTGATGGAGCGTGAACTGCCGCACCTCAC；
SEQ ID No.6：
TCCATCACTGGCTGGTGGTTGGAAGCGGAGCTACTAACTT；
SEQ ID No.7：
TGTGTAAGCGGCTCACCTCACACTTCGGTTAAGGTGATGT；
SEQ ID No.8：TGAGGTGAGCCGCTTACACACACACA；
SEQ ID No.9：
ACGCCTGCCGTTCGACGATtTGTGATAACAGCGCAGGGAAATG。
体外转录Cas9 mRNA，与靶向dat基因的sgRNA混合，得到所述靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统，其中，所述sgRNA的终浓度为100ng/μL，Cas9 mRNA的终浓度为1μM，供体质粒的终浓度为30ng/μL；
(2)收集斑马鱼的受精卵，将所述靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统显微注射入所述斑马鱼的受精卵的细胞质内，得到重组细胞；
其中，需要将所述靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统注射入1细胞时期的斑马鱼的受精卵的细胞质中，每颗受精卵注射3nL。
将所述靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统显微注射入斑马鱼的受精卵的细胞质中，提高了插入效率，降低了嵌合体出现的概率；重组细胞的基因型可以通过细胞分裂遗传给子代，降低了筛选的工作量。
实施例4
本实施例培养实施例3构建的重组细胞，构建所述可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的构建方法，包括以下步骤：
(1)培养实施例3所述的重组细胞，生长为斑马鱼个体后，提取尾鳍组织的DNA，使用SEQ ID No.2～3进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序鉴定，挑选基因组中插入了供体质粒的目标片段的斑马鱼个体作为F0代斑马鱼；
DNA提取的步骤如下：
剪取长度为1mm的斑马鱼尾鳍，加入50μL浓度为50mM的NaOH溶液，95℃孵育15min，再加入5μL浓度为1M的Tris-HCl中和，离心取上清，即为扩增的模板。
PCR扩增的体系及程序如下：
Figure BDA0003122302720000111
预变性：98℃，30s；
循环扩增：98℃，10s；72℃，40s；35个循环；
延伸：72℃，5min。
SEQ ID No.2：GCCACCTTCAATCCTCCCAAGTAC；
SEQ ID No.3：GCTCACCATAGGTCCAGGGTTCTC。
(2)将所述F0代斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，得到F1代杂合子斑马鱼，提取尾鳍组织的DNA，使用SEQ ID No.2～3进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序鉴定，筛选出基因组中插入了供体质粒的目标片段的斑马鱼个体，即所述的可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型。
本发明筛选所述可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的原理如下：
扩增使用的正向引物位于17号外显子上，反向引物位于供体质粒的目标片段上，若17号内含子中插入了目标片段则可以扩增出对应的产物，若基因组中未插入目标片段或插入方向相反则不能扩增出相应的产物，因此，通过PCR扩增即可筛选出插入了目标片段且插入方向正确的转基因个体，即所述的可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型。
经过筛选，本实施例成功构建了所述可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型。经测序鉴定，靶点附近出现了多种类型的突变，如SEQ ID No.10～14所示，未经插入的野生型斑马鱼的靶点序列如SEQ ID No.15所示。
SEQ ID No.10：GAATCAGTTATGAGCGAGTGCATTCAGGCTAATG(-1bp)；
SEQ ID No.11：GAATCAGTTATGAGCGAGTGCGTTCAGGCTAATG(-2bp，+1bp)；
SEQ ID No.12：GAATCAGTTATGAGCGAGTGTATTCAGGCTAATG(-3bp，+2bp)；
SEQ ID No.13：
GAATCAGTTATGAGCGAGTGCTAATGTTCAGGCTAATG(-2bp，+5bp)；
SEQ ID No.14：
GAATCAGTTATGAGCGAGTGCAGGCTAACAGCAGGCTAATG(-3bp，+9bp)；
SEQ ID No.15：GAATCAGTTATGAGCGAGTGCATTTCAGGCTAATG。
所述F1代斑马鱼的测序结果如图3所示。F1代斑马鱼为杂合子，且靶点附近具有多种突变类型，因此测序结果呈多峰状。
实施例5
本实施例对实施例4筛选到的可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型进行扩增验证，步骤如下：
(1)基因组扩增验证
提取斑马鱼尾鳍组织的DNA，使用SEQ ID No.2～3进行PCR扩增；
DNA提取的步骤、PCR扩增的体系及程序与实施例4相同。
(2)cDNA扩增验证
提取斑马鱼胚胎的RNA，并反转录成cDNA，使用SEQ ID No.2～3进行PCR扩增；
RNA提取的步骤如下：
①取显微注射24h后的斑马鱼胚胎50枚，加入1mL Trizol，用1mL无菌注射器在通风橱中反复抽提匀浆约30次直至无可见组织样本；
②室温放置5min，使其充分裂解；
③加0.2mL氯仿，充分混匀，室温孵育3min；
④在4℃下，12000×g离心15min；
⑤将上清水相充分转移到新的EP管；
⑥加0.5mL异丙醇到上层水相，混合均匀后在4℃下孵育10min；
⑦在4℃下，12000×g离心10min；
⑧轻柔吸走上清，用1mL 75％乙醇重悬沉淀；
⑨快速涡旋，在4℃下，7500×g离心5min；
⑩轻柔吸走上清，空气中干燥RNA沉淀10min至无残余水分，用50μLRNase-free水溶解RNA，保存于-70℃冰箱备用。
反转录的步骤如下：
①退火结合：
Figure BDA0003122302720000141
65℃孵育5min，混合物置于冰上；
②反转录：
Figure BDA0003122302720000142
30℃孵育10min；
42℃孵育60min；
72℃孵育15min，-20℃保存备用。
PCR扩增的体系及程序与步骤(1)中相同。
扩增验证的结果如图4所示。由图可知，泳道1为以基因组为模板的扩增结果，片段较大；泳道2为以cDNA为模板的扩增结果，片段较小。由于扩增使用的正向引物位于17号外显子上，反向引物位于供体质粒的目标片段上，在转录的过程中17号内含子被切掉，因此扩增片段较小，与预期相符，并且由于反向引物与目标片段结合，未插入目标片段或目标片段插入方向相反的个体的基因组或cDNA的扩增结果均为阴性。上述结果进一步证明了筛选的可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的dat基因的17号内含子中确实插入了目标片段，并且可以进行表达，具有广泛的应用价值。
综上所述，本发明通过合成靶向dat基因的sgRNA，与Cas9 mRNA以及供体质粒组成靶向dat基因的特异性荧光蛋白插入系统，显微注射入1细胞时期的斑马鱼受精卵中，再经过鉴定和筛选，成功筛选到dat基因17号内含子中插入了目标片段的斑马鱼个体，即所述可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型。通过扩增实验验证了筛选到的转基因动物的基因组中确实定点插入了目标片段，并且可以进行转录，靶点附近的测序结果成多峰状，可以用于帕金森病机理的研究及相关药物的筛选中；所述可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的构建方法操作简单，工作量少，技术成熟，应用前景广阔。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 南方科技大学
<120> 一种靶向dat基因的sgRNA及其应用
<130> 2021
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gttatgagcg agtgcatttc 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gccaccttca atcctcccaa gtac 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctcaccata ggtccagggt tctc 24
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcgcggatct tccagagatt tcaataatgg tgccgaagta gacaa 45
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaccaccagc cagtgatgga gcgtgaactg ccgcacctca c 41
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tccatcactg gctggtggtt ggaagcggag ctactaactt 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgtgtaagcg gctcacctca cacttcggtt aaggtgatgt 40
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgaggtgagc cgcttacaca cacaca 26
<210> 9
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
acgcctgccg ttcgacgatt tgtgataaca gcgcagggaa atg 43
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gaatcagtta tgagcgagtg cattcaggct aatg 34
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gaatcagtta tgagcgagtg cgttcaggct aatg 34
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gaatcagtta tgagcgagtg tattcaggct aatg 34
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gaatcagtta tgagcgagtg ctaatgttca ggctaatg 38
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gaatcagtta tgagcgagtg caggctaaca gcaggctaat g 41
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gaatcagtta tgagcgagtg catttcaggc taatg 35

Claims (10)

1.一种靶向dat基因的组合物，其特征在于，所述靶向dat基因的组合物包括靶向dat基因的sgRNA，所述靶向dat基因的组合物还包括Cas9和供体质粒；
所述靶向dat基因的sgRNA为SEQ ID No. 1所示的核酸序列；
所述Cas9包括Cas9核酸酶和/或Cas9 mRNA；
所述供体质粒的目标片段顺次连接所述靶向dat基因的sgRNA的核酸序列、dat基因的18号外显子序列、P2A编码序列、增强绿色荧光蛋白编码序列和硝基还原酶编码序列。
2.根据权利要求1所述的靶向dat基因的组合物，其特征在于，所述Cas9包括Cas9mRNA。
3.一种重组细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
将权利要求1或2所述的靶向dat基因的组合物导入受精卵的细胞质内，得到所述重组细胞。
4.根据权利要求3所述的重组细胞的构建方法，其特征在于，所述导入包括显微注射。
5.一种可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的构建方法，其特征在于，所述可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的构建方法包括：
将权利要求1或2所述的靶向dat基因的组合物导入受精卵的细胞质内，得到重组细胞；
重组细胞发育成F0代个体，与野生型交配，得到F1代杂合子；
对所述F1代杂合子进行鉴定，得到所述的可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型。
6.根据权利要求5所述的可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的构建方法，其特征在于，所述靶向dat基因的组合物的制备方法包括：
构建供体质粒；
对Cas9基因进行体外转录，得到所述Cas9 mRNA；
将所述供体质粒、Cas9 mRNA与权利要求1所述的靶向dat基因的sgRNA混合，得到所述靶向dat基因的组合物。
7.根据权利要求6所述的可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的构建方法，其特征在于，所述受精卵包括斑马鱼的受精卵。
8.根据权利要求7所述的可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的构建方法，其特征在于，所述鉴定通过PCR扩增和测序进行；
所述PCR扩增的引物为SEQ ID No. 2~3所示的核酸序列。
9.根据权利要求8所述的可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的构建方法，其特征在于，所述可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的构建方法包括：
（1）构建供体质粒，体外转录Cas9 mRNA，与所述靶向dat基因的sgRNA混合，得到所述靶向dat基因的组合物；
（2）收集斑马鱼的受精卵，将所述靶向dat基因的组合物显微注射入所述斑马鱼的受精卵的细胞质内，得到重组细胞；
（3）培养所述重组细胞，生长为斑马鱼个体后，提取尾鳍组织的DNA，使用SEQ ID No. 2~3进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序鉴定，挑选基因组中插入了供体质粒的目标片段的斑马鱼个体作为F0代斑马鱼；
（4）将所述F0代斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，得到F1代杂合子斑马鱼，提取尾鳍组织的DNA，使用SEQ ID No. 2~3进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序鉴定，筛选出基因组中插入了供体质粒的目标片段的斑马鱼个体，即所述的可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型。
10.权利要求1或2所述的靶向dat基因的组合物、权利要求3或4所述的重组细胞的构建方法或权利要求5-9任一项所述的可视化且可再生的帕金森病转基因动物模型的构建方法中的任意一种或至少两种的组合在帕金森病药物筛选中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1081225A1 (en) * 1999-08-30 2001-03-07 Biofrontera Pharmaceuticals GmbH Transgenic animal model for neurodegenerative diseases
CA2519071A1 (en) * 2003-03-13 2004-09-30 Jeffrey S. Mumm Targeted and regional cellular ablation in zebrafish
WO2006081539A2 (en) * 2005-01-27 2006-08-03 Zygogen, Llc Zebrafish models for alzheimer's disease
US20170035860A1 (en) * 2015-04-02 2017-02-09 Alexander C. Flynn Compositions and methods for treatment of neurogenerative diseases

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110305896A (zh) * 2019-05-09 2019-10-08 中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院 一种斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Abnormal Behavior of Zebrafish Mutant in Dopamine Transporter Is Rescued by Clozapine;Guangliang Wang等;《iScience》;20190726;第325-327页 *
Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae;Rafael Godoy等;《Journal of Neurochemistry》;20150627;第249-260页 *
Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system;Jia Li等;《Cell Research》;20150407;第634页左栏第1-2段和右栏第1段 *
Transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein in dopaminergic neurons of the ventral diencephalon;Yanwei Xi等;《Developmental Dynamics》;20110919;第2539-2547页 *

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