CN110551759B

CN110551759B - 一种提高转基因细胞重组效率的组合物及方法

Info

Publication number: CN110551759B
Application number: CN201910705696.0A
Authority: CN
Inventors: 黎肖容
Original assignee: Guangzhou Saiye Baimu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Saiye Baimu Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2019-08-01
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2039-08-01
Also published as: CN109679953A; CN110551759A; CN109679953B

Abstract

本发明公开了一种提高转基因细胞重组效率的组合物及方法，通过使用含有SCR7、RS‑1或L755507的培养基处理转基因后的细胞，提高了转基因细胞的HDR效率。本发明的一些实例，通过使用特定的sgRNA组合，获得了更高的转基因效率，解决了二次注射会导致受精卵受损较为严重，出生率会下降比较严重而导致阳性繁殖数量不足的缺陷。

Description

一种提高转基因细胞重组效率的组合物及方法

技术领域

本发明涉及转基因领域，具体涉及一种提高转基因细胞重组效率的组合物及方法。

背景技术

动物模型，特别是转基因鼠模型，是进行各项生命科学研究的一个重要工具，应用范围广泛。

在众多的转基因动物中，点突变鼠由于其易于培养，成本相对较低，是常见的转基因动物模型。现有技术制备点突变鼠主要有3种方案：

一是传统ES打靶的方案，其缺点是：(1)需要复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大、耗时较长，且效率低；(2)不同品系的鼠需要不同的ES细胞，目前ES打靶做得比较多的都是常见的C57BL/6品系，其他的品系没看到有相关的报道。例如，点突变模型主要用于研究人类疾病，其经常需要用到特殊的品系，由于没有相关的ES细胞，所以无法采用ES打靶这项技术进行制备。

二是TALEN方案：其缺点是：(1)设计识别20个碱基序列的TALEN蛋白含有一千多个氨基酸，因而可能会引起机体的免疫反应，这将降低TALEN在细胞中的作用；(2)TALEN也存在脱靶的问题，这可能由于细胞中染色体的状态引起的，如TALEN技术对于处于异染色体结构中的基因序列没有效果；(3)TALEN技术是否可以胜任掺入大的片段？目前TALEN技术的应用主要集中在基因敲除方面，但是否适合大片段的基因插入还需进一步研究。最重要的是，目前较先进的ZFN/TALEN技术基于能特异性识别碱基核苷酸来构建基因打靶载体，但打靶载体的构建非常复杂，制备时间长，产生的细胞毒性大，且都不能真正做到同时完成基因组多位点的敲除。

三是CRISPR/Cas9方案。CRISPR/Cas9的方案包括两种，一种是野生型的hCas9,另一种是突变型的Cas9_D10A。野生型的hCas9的缺点：(1)容易造成脱靶效应；(2)对于一些重要基因的重要突变点容易造成致死。突变型的Cas9_D10A的缺点：两种不同的sgRNA对靶位点两侧序列分别进行识别，然后结合单切口Cas9核酸酶，对两条链分别进行剪切，从而提高了靶位点识别特异性，减少了脱靶效应,但由于单切口Cas9核酸酶效率比较低，导致 Cas9_D10A方案的阳性率比较低。

CRISPR/Cas9技术的基因编辑机制：CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割，造成DNA双链断裂(DSB,double strand break)。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括两种途径：一是低保真性的非同源末端连接途径(NHEJ，Non-homologous endjoining)，此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入(Indel)，从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的实现移码突变，从而制备基因敲除模式动物。CRISPR/Cas9技术的出现，使得无需再使用相应物种的ES细胞系就可以制备基因敲除模式生物，且已成功应用于小鼠、大鼠、猪、灵长类、果蝇等等。第二种DNA断裂修复途径为同源介导的修复(HR,homology-directed repair)，这种基于同源重组的修复机制保真性高，但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下，靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑，如：条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。

Cas9蛋白含有HNH和RuvC两个带核酸酶活性的结构域，切割DNA时，HNH结构域切割与crRNA向导序列互补的DNA单链，而RuvC结构域则剪切非互补DNA单链，从而形成双链DNA断点。如果将RuvC结构域中一个天冬氨酸突变为丙氨酸(D10A)，则可以使RuvC 结构域失去核酸酶活性，导致突变的Cas9蛋白(Cas9_D10A)只能在双链DNA上产生单链缺口(nick)。这样，Cas9的内切酶活性就变为Cas9_D10A的切口酶活性(nickase)。为了在DNA 上切割产生双链DNA断点，就需要用Cas9_D10A和一对sgRNA分别在双链DNA的每条单链上切出单链缺口。而只被一个Cas9_D10A切割产生的单链缺口会被高保真性的碱基切除修复途径(baseexcision repair，BER)修复，不会在基因组DNA上造成突变。这时，双链DNA 断点的特异性就由两个sgRNA的识别位点共同决定，即在422×422(3.09×10²⁶)个碱基长度的随机DNA序列中才会发现一个同时被两个Cas9_D10A切割的位点。因此，通过用两个 Cas9_D10A产生两个单链DNA缺口以造成双链DNA断点的策略，可有效地提高CRISPR/Cas 系统的特异性，而且此方法并不降低双链DNA断点产生的效率。

CRISPR/Cas系统操作使用更为方法，效率更高，越来越成为点突变动物的常用方法。

纯合致死的转基因动物，如转基因鼠的构建过程中，一般采用受精卵的条件性点突变的方案构建的，构建的过程繁琐，构建难度也很高，阳性率很低，而且周期很长。具体的操作参见Marin T M,Keith K,Davies B,et al.Rapamycin reverses hypertrophiccardiomyopathy in a mouse model of LEOPARD syndrome-associated PTPN11mutation[J].Journal of Clinical Investigation,2011.。

HSP于1876年由seeligmrller首先报道，是一组以双下肢进行性肌张力增高和无力、剪刀步态为特征的具有明显遗传异质性的综合征。患病率为2/10万-10/10万。迄今，已有七十多个基因簇和56个致病基因被报道，涉及不同的细胞通路。

为找到遗传性痉挛性截瘫家系的致病基因，第四军医大学博士后杨颖通过联合采用全外显子组测序和基因芯片的homozygous mapping技术，将候选基因最终锁定到编码线粒体苯丙氨酰-tRNA合成酶(mtPheRS)的FARS2基因上，且c.424G>T(p.D142Y)变异位点符合遗传共分离规律。随后探讨了FARS2基因及其c.424G>T(p.D142Y)变异位点的致病性。体外构建了野生型hmtPheRS和突变型hmtPheRS-D142Y的基因表达载体，纯化了相应的蛋白质，测定了它们的氨基酸活化和氨基酰化活力。结果表明hmtPheRS-D142Y突变体的两种酶活力都远低于野生型，故推测c.424G>T(p.D142Y)突变减少了hmtPheRS催化线粒体苯丙氨酰-tRNAPhe 的生成的速度。研究人员在大鼠中枢神经系统的组织上进行了免疫组化实验，结果显示FARS2 在大鼠小脑的Purkinje细胞中高表达。有研究报道Purkinje细胞在神经退行性疾病中起重要作用，故mtPheRS有可能通过破坏Purkinje细胞的功能进而引起HSP的表型。

综上所述，研究人员推测编码mtPheRS的FARS2基因是HSP的一种新的致病基因，且c.424G>T(p.D142Y)变异位点是一可能的致病突变位点。此研究对于进一步揭示氨基酰-tRNA 合成酶调控神经退行性疾病的机制具有重要意义(参见Yang Y,Liu W,Fang Z,etal.A newly identified missense mutation in FARS2 causes autosomal-recessivespastic paraplegia[J].Human mutation,2016,37(2):165-169.)可见，获得健康的鼠Fars2基因c.424G>T(p.D142Y)鼠模型为 HSP疾病的研究提供一个很好的素材。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一种不足，提供一种提高转基因细胞重组效率的组合物及方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种提高转基因细胞重组效率的组合物，所述组合物为添加有SCR7、RS-1或L755507 的KSOM培养基，其中，SCR7在KSOM培养基中的终浓度为0.5～4.5μM，RS-1在KSOM培养基中的终浓度为3～9μM，L755507在KSOM培养基中的终浓度为2～7μM。

在一些组合物的实例中，SCR7在KSOM培养基中的终浓度为1.5～4.5μM。

本发明的第二个方面，提供：

一种利用CRISPR-Cas9系统制备点突变动物的方法，包括：

1)将Cas9-D10A mRNA和Donor oligo序列的混合物直接注入单细胞受精卵的一细胞的胞浆内；

2)待受精卵发育成二细胞，把预混好的sgRNA混合物直接注入二细胞中；

3)注射后将二细胞期的受精卵放置在培养基内培养，其中，所述培养基为第一个方面所述的组合物；

4)将培养后的细胞移植到雌体内，产仔后得到点突变动物。

在一些制备点突变动物的实例中，所述的点突变鼠为Fars2基因点突变鼠，突变点为 D142Y，优选为GAC>TAC的单核苷酸突变。

在一些Fars2基因制备点突变鼠的实例中，所述Donor oligo1的序列为 AGTGGTCACCACCTGGCAGAACTTCGATAGCCTGCTAATCCCAGCTGACCACCCCAGCA GGAAGAAGGGGTACAACTATTACTTGAATCGGGGACACATGCTGAGAGCACACACATC AGCACATCAGTGGGACTTGCTGCATG。

在一些制备Fars2基因点突变鼠的实例中，所述sgRNA对的序列为：

sgRNA对1：

Pair1-g1-F：caccgTTGTCCCCCTTCTTCCTGCT

Pair1-g1-R：aaacAGCAGGAAGAAGGGGGACAAc

或sgRNA对2：

Pair1-g2-F：caccgGGACAACTATTACTTGAATC

Pair1-g2-R：aaacGATTCAAGTAATAGTTGTCCc。

在一些制备点突变动物或Fars2基因点突变鼠的实例中，所述Cas9-D10A mRNA和Donor oligo序列的混合物中，Cas9-D10A mRNA和Donor oligo序列的终浓度分别为40ng/μL～120 ng/μL；优选的，Cas9-D10A mRNA和Donor oligo序列的质量比为1：1。

在一些制备点突变动物或Fars2基因点突变鼠的实例中，所述sgRNA混合物中，sgRNA1 和sgRNA2的终浓度分别为20ng/μL～60ng/μL；优选的，sgRNA1和sgRNA2的质量比为1： 1。

在一些制备点突变动物或Fars2基因点突变鼠的实例中，将二细胞期的受精卵放置在培养基内培养的时间为12～48小时，优选为24小时。

在一些制备点突变动物或Fars2基因点突变鼠的实例中，所述鼠包括大鼠SD、LongEvans、 Wistar、F344；小鼠C57BL/6N、C57BL/6J、FVB。

在一些实例中，所述动物包括鼠、兔、犬、猴、猪。

本发明的有益效果是：

本发明的一些实例，可以有效提高细胞的重组效率。

本发明的一些实例，可以有效提高转基因动物的重组效率。

本发明的一些实例，可以有效构建得到FARS2模型。

本发明的一些实例，通过在受精卵的单细胞期和二细胞期分别进行显微注射，最终得到的动物只有杂合子和野生型，不会有纯合子，解决了纯合致死的问题。

本发明的一些实例，通过使用特定的sgRNA组合，获得了更高的转基因效率，解决了二次注射会导致受精卵受损较为严重，出生率会下降比较严重而导致阳性繁殖数量不足的缺陷。

附图说明

图1是Fars2基因打靶的策略图；

图2是含有目的条带的菌落PCR鉴定图，其中，其中，第一排从左至右依次为marker,1-1、 1-2、2-1、2-2、3-1、3-2、4-1、4-2、5-1、5-2、6-1、6-2、7-1、7-2、8-1、8-2；

图3是g1-g8的PCR回收后产物的电泳图，其中，从左至右依次为marker，g1,g2,g3,g4, g5,g6,g7,g8；

图4是g1-g8的转录产物的电泳图，其中，第一排从左至右依次为g1,g2,g3,g4,g5,g6,g7, g8，marker；

图5是g1-g8的回收后产物的电泳图，其中，第一排从左至右依次为g1,g2,g3,g4,g5,g6, g7,g8,marker；

图6是Cas9-D10A mRNA的回收后产物的电泳图，其中，从左至右依次为Cas9-D10AmRNA,marker。

具体实施方式

本发明的第一个方面，提供：

本发明的第二个方面，提供：

一种利用CRISPR-Cas9系统制备点突变动物的方法，包括：

4)将培养后的细胞移植到雌体内，产仔后得到点突变动物。

在一些制备点突变鼠的实例中，所述的点突变鼠为Fars2基因点突变鼠，突变点为D142Y，优选为GAC>TAC的单核苷酸突变。基因打靶的策略如图1所示。

在一些制备Fars2基因点突变鼠的实例中，所述Donor oligo的序列为 AGTGGTCACCACCTGGCAGAACTTCGATAGCCTGCTAATCCCAGCTGACCACCCCAGCA GGAAGAAGGGGTACAACTATTACTTGAATCGGGGACACATGCTGAGAGCACACACATC AGCACATCAGTGGGACTTGCTGCATG。

sgRNA对1：

Pair1-g1-F：caccgTTGTCCCCCTTCTTCCTGCT

Pair1-g1-R：aaacAGCAGGAAGAAGGGGGACAAc

或sgRNA对2：

Pair1-g2-F：caccgGGACAACTATTACTTGAATC

Pair1-g2-R：aaacGATTCAAGTAATAGTTGTCCc。

在一些实例中，所述动物包括鼠、兔、犬、猴、猪。

本发明的一些实例，对鼠的品系没有特别的要求，现有的大鼠、小鼠均可以。在一些制备点突变鼠的实例中，所述鼠包括但不限于大鼠SD、LongEvans、Wistar、F344等品系；小鼠C57BL/6N、C57BL/6J、FVB等品系。

为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。

本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。

实施例1：利用CRISPR-Cas9系统制备Fars2基因点突变大鼠方法

具体操作包括：

1、sgRNA靶点设计

在NCBI的数据库中提取大鼠Fars2基因D142的上游和下游各50bp的序列，如下所示，设计靶标位点：

ACTTCGATAGCCTGCTAATCCCAGCTGACCACCCCAGCAGGAAGAAGGGGGACAA CTATTACTTGAATCGGGGACACATGCTGAGAGCACACACATCAGCACA(SEQ ID NO.：1)。

满足5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG-3'共有10个，因为该基因具有纯合致死性，设计gRNA采用特异性更高的突变型Cas9(Cas9_D10A)，减少脱靶导致的致死。Cas9_D10A 需要一对头对头的gRNAs才能识别和切割双链DNA，由于突变点为D142Y，如果设计的 gRNA对都不包含D142，重组之后，gRNA还会继续切割，将拿不到特定的阳性，考虑到这个问题，只能要包含D142的gRNA对，一共有4对，具体序列如下：

pair2-g1:TTGTCCCCCTTCTTCCTGCTGGG(SEQ ID NO.：2)

pair2-g2:GGACAACTATTACTTGAATCGGG(SEQ ID NO.：3)

pair1-g3:GTTGTCCCCCTTCTTCCTGCTGG(SEQ ID NO.：4)

pair1-g4:GGGACAACTATTACTTGAATCGG(SEQ ID NO.：5)

pair3-g5:TGTCCCCCTTCTTCCTGCTGGGG(SEQ ID NO.：6)

pair3-g6:GACAACTATTACTTGAATCGGGG(SEQ ID NO.：7)

pair4-g7:CCCCCTTCTTCCTGCTGGGGTGG(SEQ ID NO.：8)

pair4-g8:GGGACAACTATTACTTGAATCGG(SEQ ID NO.：9)。

2、Donor oligo设计

以Fars2基因的D142为靶点，两端各70bp为同源臂，加粗标记的核苷酸为点突变位点，设计Donor oligo序列并合成：

Donor oligo 1：

3.构建可表达sgRNA的Cas9-D10A质粒

(1)在金维智生物科技有限公司合成8对特异性的sgRNA靶序列引物。

(2)取g1-g8的上下游引物(100μM)各5μL，Annealing Buffer for DNA Oligos(5X)(碧云天，货号：D0251)5μL，补水至255μL，混匀，PCR仪中37℃30min；95℃5min；0.1℃/s降温至25℃退火成双链，分别插入经Bsal酶切好的PX335-Bsal载体中(来自addgene，Plasmid #42335，PX335对应的是突变型的CAS9蛋白Cas9_D10A，对比野生型的hCas9,突变型的 Cas9_D10A具有更高的特异性，减少脱靶的可能，减少脱靶到其他重要基因导致致死的可能，提供存活率)，转化，LB固体培养基涂板。37℃过夜培养，之后做菌落PCR鉴定(图2)，将验证正确的克隆菌液，放入LB液体培养基过夜扩大培养，提取过夜培养的菌液质粒，质粒DNA测出浓度均大于为100ng/μL，经测序验证(金维智生物科技有限公司)插入片段大小正确，将正确的g1-g8质粒DNA用作扩增模板。

4.体外转录

(1)通过PCR扩增得到带有T7启动子序列的g1-g8，图3为g1-g8的PCR回收后产物的电泳图。用MEGAshortscript^TM Kit(Thermo，货号：AM1354)试剂盒体外转录g1-g19，图4 为g1-g8的转录产物的电泳图。用MEGAclear^TM Kit(Thermo，货号：AM1908)试剂盒回收g1-g19的转录产物，图5为g1-g8的回收后产物的电泳图。

(2)转录Cas9-D10A载体。使用MEGAshortscript^TM Kit(Thermo，货号：AM1354)试剂盒，将PX335-T7载体经NotI线性化后，在体外转录成Cas9-D10A mRNA。用MEGAclear^TM Kit(Thermo，货号：AM1908)试剂盒回收Cas9-D10A mRNA的转录产物，图6为Cas9-D10A mRNA的回收后产物的电泳图。

5.在斑马鱼体内验证以上4对gRNA的切割活性

(1)扩增包含gRNA的大鼠基因DNA片段1(DNA1)

Rat Fars2-DNA1-F:CTTGTGTGCTCTTTCCAGAGTTTGTG(SEQ ID NO.：11)

Rat Fars2-DNA1-R:CCATTTGCACAAATCCCTCACATAC(SEQ ID NO.：12)

产物长度:833bp

退火温度:60℃

(2)将构建出的Cas9-D10A mRNA，大鼠基因DNA片段1，Pair1-g1和Pair1-g2为一组，Cas9-D10A mRNA，大鼠基因DNA片段1，Pair2-g3和Pair2-g4为一组，Cas9-D10A mRNA，大鼠基因DNA片段1，Pair3-g5和Pair3-g6为一组，Cas9-D10A mRNA，大鼠基因DNA片段1，Pair4-g7和Pair4-g8为一组，共注射4组，分别显微注射到40枚斑马鱼受精卵中检测 g1-g8活性，(其中用量分别为cas9-D10A mRNA：100ng/μL，Pair1-g1：50ng/μL，Pair1-g2： 50ng/μL，包含所有gRNA的DNA片段1：100ng/μL)。

4组取分别取20个斑马鱼胚胎进行PCR鉴定，测序验证突变情况(金维智生物科技有限公司)，结果鱼卵中突变率如下表，结果显示Pair1(g1+g2)活性较高。

验证gRNA活性的PCR引物如下：

Rat Fars2-SPF1:GTTTGCTGTCCAAGGTGCTCCAG(SEQ ID NO.：13)

Rat Fars2-SPR1:AGTCTTATTACAGCAACACAAATGCCCTT(SEQ ID NO.：14)

产物长度:550bp

退火温度:60℃

表1、gRNA引物对1～4的活性比较

名称	注射组分	胚胎数量	突变数量	突变率
					Pair1	g1+g2+DNA1+Cas9-D10A	20	7	35％
Pair2	g3+g4+DNA1+Cas9-D10A	20	4	20％
					Pair3	g5+g6+DNA1+Cas9-D10A	20	3	15％
Pair4	g7+g8+DNA1+Cas9-D10A	20	3	15％

突变位点附近的序列如下：

g1(gRNA1，斜体标记部分)+g2(gRNA2，下划线标记部分)这两个gRNA的PAM序列距离点突变的位置(斜体+下划线+加粗标记的序列)是比较近的，而且在体内验证切割效率是最高的，gRNA的切割位点是在PAM(小写标记部分)的倒数第三或第四位，点突变距离gRNA的切割位点越近，重组效果越好。

6、原核注射及胚胎移植

1)选3-4周龄发育良好的雌鼠(优选SD系大鼠)，腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)20IU，48小时后注射人绒毛促性腺激素(hCG)30IU；一般会优选用3到4周，体重约为80g的雌鼠作为超排鼠。

2)经过步骤1)的激素超排处理后的(优选SD系大鼠)雌鼠，与公鼠(优选SD系大鼠)按1:1合笼，次日清晨挑选检栓成功的雌鼠，从检栓成功的雌鼠得到单细胞受精卵；

3)选8周龄以上的正常SD雌鼠与输精管结扎过的SD公鼠按1:1合笼，次日选取检栓成功的雌鼠，即为假孕SD雌鼠；

4)将预混好的Cas9-D10A mRNA,Donor oligo 1的混合物利用显微注射方法直接注入单细胞受精卵的一细胞的胞浆内，通过调节半定量仪的注射时间和注射压力来调整合适的注射量，以溶液明显流入胞浆而不至于导致细胞死亡为止其中，Cas9-D10A mRNA，Donor oligo 1 的终浓度为50ng/μL，50ng/μL；等受精卵发育成二细胞，把经验证切割效率较高的sgRNA1 和sgRNA2的混合物利用显微注射方法直接注入二细胞中，其中，sgRNA1和sgRNA2的终浓度均是25ng/μL；注射后将受精卵放置在添加有不同添加物的KSOM培养基内培养24h左右，以提高Donor oligo同源重组的效率，同时设置一组将受精卵放置没有添加物的KSOM 培养基内培养24h左右作为对照组，移植到假孕SD雌鼠的输卵管内，待产仔后，用PCR方法鉴定阳性大鼠。

7、基因打靶大鼠的鉴定

A：待仔鼠长至1周龄剪取2mm左右鼠尾，蛋白酶K，55℃消化后酚仿抽提提取鼠尾基因组。以鼠尾基因组为模板，分别设计针对Fars2点突变位置的引物，序列如下，进行PCR 扩增，对获得的PCR产物进行测序，如测序结果打靶位点附近出现双峰的情况，则可能为打靶成功，则继续进一步鉴定。

针对Fars2点突变位置的引物：

Rat Fars2-SPF1:GTTTGCTGTCCAAGGTGCTCCAG

Rat Fars2-SPR1:AGTCTTATTACAGCAACACAAATGCCCTT

产物长度:550bp

退火温度:60℃

B：选择双峰的样品再次PCR，产物胶回收后TA克隆至T载体中，转化后挑取阳性克隆再次进行测序，如测序结果为D142Y(GAC>TAC)，则代表Fars2点突变大鼠构建成功。

实验结果：

根据上述实验操作，分别计算不同添加物对HDR(同源定向修复)效率，结果如表2所示：

表2、不同添加物对SD系大鼠HDR效率的影响

由上表可以看出，SCR7在KSOM培养基中的终浓度为1.5～4.5μM时同源重组效率最高，RS-1在KSOM培养基中的终浓度为3～9μM时同源重组效率最高，L755507在KSOM 培养基中的终浓度为2～7μM时同源重组效率最高。从添加物的提高同源重组的效率来看： Scr7>RS-1>L755507，其中Scr7的效果最优，最优的使用终浓度为1.5～4.5μM。

参照上述原核注射及胚胎移植的操作，分别使用不同品系的鼠受精卵进行转基因操作，结果如下表所示：

表3、不同品系鼠对HDR效率的影响

从表3中的数据可以看出，本发明的方法对鼠的品系无要求，不同品系的鼠，其HDR效率没有显著区别，说明其具有很好的通用性。

SEQUENCE LISTING

<110> 赛业（广州）生物科技有限公司

<120> 一种提高转基因细胞重组效率的组合物及方法

<130>

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acttcgatag cctgctaatc ccagctgacc accccagcag gaagaagggg gacaactatt 60

acttgaatcg gggacacatg ctgagagcac acacatcagc aca 103

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttgtccccct tcttcctgct ggg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggacaactat tacttgaatc ggg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gttgtccccc ttcttcctgc tgg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gggacaacta ttacttgaat cgg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgtccccctt cttcctgctg ggg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gacaactatt acttgaatcg ggg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cccccttctt cctgctgggg tgg 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gggacaacta ttacttgaat cgg 23

<210> 10

<211> 143

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agtggtcacc acctggcaga acttcgatag cctgctaatc ccagctgacc accccagcag 60

gaagaagggg tacaactatt acttgaatcg gggacacatg ctgagagcac acacatcagc 120

acatcagtgg gacttgctgc atg 143

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cttgtgtgct ctttccagag tttgtg 26

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccatttgcac aaatccctca catac 25

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtttgctgtc caaggtgctc cag 23

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

agtcttatta cagcaacaca aatgccctt 29

<210> 15

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

acttcgatag cctgctaatc ccagctgacc accccagcag gaagaagggg gacaactatt 60

acttgaatcg gggacacatg ctgagagcac acacatcagc aca 103

Claims

1.一种利用CRISPR-Cas9系统制备点突变动物的方法，包括：

1)将Cas9-D10A mRNA和Donor oligo的混合物直接注入单细胞受精卵的一细胞的胞浆内；

3)注射后将二细胞期的受精卵放置在培养基内培养；

4)将培养后的细胞移植到雌体内，产仔后得到点突变动物；

其中，培养基为添加有SCR7的KSOM培养基，SCR7在KSOM培养基中的终浓度为1.5～4.5μM；

所述的点突变动物为Fars2基因点突变鼠，突变点为D142Y；所述Donor oligo的序列为AGTGGTCACCACCTGGCAGAACTTCGATAGCCTGCTAATCCCAGCTGACCACCCCAGCAGGAAGAAGGGGTACAACTATTACTTGAATCGGGGACACATGCTGAGAGCACACACATCAGCACATCAGTGGGACTTGCTGCATG；

所述sgRNA的序列为：

sgRNA1：

Pair1-g1-F：caccgTTGTCCCCCTTCTTCCTGCT

Pair1-g1-R：aaacAGCAGGAAGAAGGGGGACAAc

和sgRNA2：

Pair1-g2-F：caccgGGACAACTATTACTTGAATC

Pair1-g2-R：aaacGATTCAAGTAATAGTTGTCCc；

所述方法不用于疾病的诊断和治疗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变点为GAC＞TAC的单核苷酸突变。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Cas9-D10A mRNA和Donor oligo的混合物中，Cas9-D10A mRNA和Donor oligo的终浓度均为40ng/μL～120ng/μL。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Cas9-D10A mRNA和Donor oligo的质量比为1：1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述sgRNA混合物中，sgRNA1和sgRNA2的终浓度均为20ng/μL～60ng/μL。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述sgRNA1和sgRNA2的质量比为1：1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将二细胞期的受精卵放置在培养基内培养的时间为12～48小时。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述时间为24小时。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述动物为大鼠SD、LongEvans、Wistar、F344；小鼠C57BL/6N、C57BL/6J、FVB。