CN110643605B

CN110643605B - 一种团头鲂MSTNa&b基因敲除的gRNA及其模板

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Publication number: CN110643605B
Application number: CN201910743693.6A
Authority: CN
Inventors: 邹曙明; 孙源; 郑国栋; 陈杰
Original assignee: Shanghai Ocean University
Current assignee: Shanghai Ocean University
Priority date: 2019-08-13
Filing date: 2019-08-13
Publication date: 2023-05-05
Anticipated expiration: 2039-08-13
Also published as: CN110643605A

Abstract

本发明公开一种基于CRISPR/Cas9系统的gRNA，CRISPR/Cas9系统的靶点序列是针对MSTNa的第一外显子和第三外显子的靶点序列，和/或针对MSTNb的第一外显子和第三外显子的靶点序列。本发明还公开了一种基于CRISPR/Cas9系统的gRNA模板，gRNA模板能够转录成前述gRNA。通过前述gRNA基因敲除后能提高团头鲂肌肉生产性能。

Description

一种团头鲂MSTNa&b基因敲除的gRNA及其模板

技术领域

本发明属于水产养殖领域，涉及CRISPR/Cas9技术在经济养殖鱼类团头鲂MSTNa&b基因敲除中的gRNA及其模板与应用。

背景技术

CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeatsand CRISPR associated 9)已经成为基因功能研究中强大高效的工具^[1]。目前的基因编辑手段主要是TALEN、ZFNs和CRISPR/Cas9 这三大类^[2]，CRISPR/Cas9系统因其基因编辑效率高、设计简单易行、省时省力等优势，现已成功应用于鼠^[3]、果蝇^[4]、斑马鱼^[5,6]、线虫^[7]和拟南芥^[8]等各种模式生物。CRISPR/Cas9是基于原核生物对外源的遗传物质而产生的免疫系统^[9]，在特定的guide RNA(gRNA)的引导下，CAS蛋白可以结合降解外源的DNA，从而来保护自己的基因组的完整性不受破坏。实验过程中，伴随着靶点DNA的断裂，随之会有同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)这两种修复机制运作^[10]。由于随机的缺失和插入，其中NHEJ修复会在断裂处形成移码突变从而敲除掉内源基因。而HR机制会在缺口处定点敲入进去事先准备好的外源基因^[11]。在过去5年间，随着CRISPR/Cas9基因编辑系统的广泛推广应用，大量研究已经证实只需要体外共注射gRNA和 Cas9mRNA^[12,13]或者CAS9蛋白^[14-16]，均可导致目标基因的破坏。 CRISPR系统是以RNA作为基因组定位工具,深得很多科研工作者的喜爱。

Myostatin(MSTN)即肌肉生长抑制素基因，1997年在小鼠中首次发现，亦称为GDF8，为TGF-β家族基因的成员^[17]，后来经研究发现GDF8对骨骼肌生长的负调控效应，故更名为Myostatin^[18]，MSTN 基因的作用机制是通过蛋白酶来酶切MSTN前体蛋白，形成以非共价结合的N端前肽和C端活性成熟肽，MSTN能够通过结合Smad蛋白调控Myogenin使成肌细胞停留在G0/G1和G2期，从而阻碍成肌细胞的分化和增生^[19,20]。然后相继又克隆到了MSTN基因从鸟类^[21]、牛、猪和其他哺乳动物中^[22,23]。

团头鲂(Megalobrama amblycephala)是我国重要的淡水养殖种类中草食性经济鱼类之一^[24]，具有不耐低氧的弊端^[25]，除此之外，也有一些生长相关的基因调控机制限制着鱼类的年产量^[18]。随着近年水产养殖中来近交衰退现象的出现^[26]，提高团头鲂的肌肉品质及生长效率也是良种选育工作的目标之一。

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发明内容

基于现有技术的不足，如何利用CRISPR/Cas9技术编辑经济养殖鱼类的MSTN基因，培育出生长性状更显著的新品系也是本发明研究的出发点。本研究首先对团头鲂MSTNa&b基因进行基本的生物信息学分析，然后通过CRISPR/Cas9基因敲除技术对团头鲂MSTNa&b基因进行编辑，对不同位置区域靶点的突变率的初步检测，筛选出了最高敲除效率靶点，本文的研究结果对肌肉品质更加显著的团头鲂新品系的选育意义较为深远。同时也为根据不同实验目的经济养殖鱼类合理的选用CRISPR/Cas9基因编辑技术提供了依据和借鉴。

为了尝试解除MSTN在团头鲂肌肉生长中的抑制，从而选育生长性状更凸显的团头鲂新品系，本研究采用了CRISPR/Cas9技术分别对团头鲂MSTNa&b基因进行敲除。团头鲂MSTNa&b基因均具有保守性很强的TGF-β前肽结构域、RXXR蛋白酶水解位点、TGF-β或类TGF-β结构域及保守的半胱氨酸残基。本研究率先根据CRISPR/Cas9 系统中guide RNA(gRNA)的T7靶点的设计原则，分别在团头鲂 MSTNa(GenBankAcc.No.JQ065336.1)基因的成熟mRNA碱基序列 642(对应第一外显子，target 1)、1015(对应第三外显子，target 2)、1232(对应第三外显子，target 3)位点以及MSTNb(GenBankAcc.No. JQ065337.1)基因的成熟mRNA碱基序列466(对应第一外显子， target 1)、878(对应第三外显子，target 2)、1054(对应第三外显子， target 3)位点为起点设计靶点合成gRNA，将含有gRNA(100pg) 和Cas9蛋白(900pg)的1nl的混合液注射进1-2细胞期的团头鲂胚胎，各靶点注射的24hpf和48hpf的团头鲂胚胎的成活率统计结果显示均无显著差异(P＞0.05)，T7E1酶检测结果显示：MSTNa target1、 2、3对应的突变效率是5.1％、8.2％、10.0％，对应的突变类型数分别是5、4和12；MSTNb target1、2、3对应的突变效率是15.3％、14.7％、 26.0％，对应的突变类型数分别是2、3和5。本实验为后续进行的团头鲂F1代突变纯合子的产生和肌肉品质更加显著的团头鲂新品系的选育非常重要。同时本文的研究结果为根据不同实验目的经济养殖鱼类合理的选用CRISPR/Cas9基因编辑技术提供了依据和借鉴。

本发明第一方面提供了一种基于CRISPR/Cas9系统的gRNA，其特征在于：所述gRNA是选自针对团头鲂MSTNa基因和/或团头鲂 MSTNb基因的gRNA引物。

在一些实施方式中，所述MSTNa基因的GenBank登录号为： JQ065336.1或其同原序列；和/或

所述MSTNb基因的GenBank登录号为：JQ065337.1或其同原序列。

在一些实施方式中，所述CRISPR/Cas9系统的靶点序列是针对MSTNa的第一外显子和第三外显子的靶点序列，和/或针对MSTNb 的第一外显子和第三外显子的靶点序列。

在一些实施方式中，以团头鲂MSTNa基因的成熟mRNA碱基序列642、1015或1232位点，和/或以团头鲂MSTNb基因的成熟mRNA 碱基序列466、878、1054位点为起点设计靶点合成gRNA。

在一些实施方式中，所述gRNA包括依次上下游连接的gRNA 靶点序列和scaffold序列，所述gRNA靶点序列选自SEQ ID NO.12-17 所示的序列。

在一些实施方式中，所述scaffold序列为SEQ ID NO.4所示的序列。

本发明第一方面提供了一种基于CRISPR/Cas9系统的gRNA模板，所述gRNA模板能够转录成如本发明第一方面所述的gRNA。

在一些实施方式中，所述gRNA模板序列包括：依次连接的启动子序列-模板靶点序列-模板scaffold序列。

在一些实施方式中，所述启动子为T7启动子或SP6启动子。

在一些实施方式中，所述模板scaffold序列为SEQ ID NO.3所示的序列。

在一些实施方式中，所述模板靶点序列选自SEQ ID NO.5-10所示的序列。

本发明第三方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有如本发明第一方面所述的gRNA或如本发明第二方面所述的gRNA模板。

本发明第四方面提供了如本发明第一方面所述的gRNA，如本发明第二方面所述的gRNA模板，或如本发明第三方面所述的试剂盒在提高团头鲂肌肉生产性能的育种中的用途。

附图说明

图1为实验技术路线及拟采取的方法示意图。

图2为Cas9的靶点设计示意图。

图3为团头鲂MSTNa基因的各个靶点的具体位置标记。

图4为团头鲂MSTNb基因的各个靶点的具体位置标记。

图5为团头鲂MSTNa&b基因的靶点设计。

团头鲂MSTNa&b基因的靶点1设计在第一个外显子上，团头鲂 MSTNa&b基因的靶点2和3均设计在第三个外显子上。

图6为注射团头鲂MSTNa&b基因的各靶点的胚胎24hpf和 48hpf成活率统计。

图7为注射团头鲂MSTNa&b基因的各靶点的胚胎敲除效率 T7E1检测。

图8为注射团头鲂MSTNa&b基因的各靶点的胚胎敲除效率和突变类型数目统计。

图9为团头鲂MSTNb基因的敲除前后团头鲂的形态比较照片。

图10为PMD19-TVector结构示意图。

图11为基因敲除原理示意图。

具体实施方式

为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合附图详细介绍本发明的实施例。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。

1材料与方法

1.1实验用鱼、胚胎

本文所用的团头鲂雌雄亲鱼均来自上海海洋大学农业部团头鲂遗传育种中心。选取成熟度好、体型正常MSTNa&b基因均野生型纯合的亲本(30对)进行人工繁殖，实验用团头鲂的受精、孵化和养殖均在此进行，显微注射用胚胎为人工受精所得，受精卵置于室温下(25℃)人工培养孵化，胚胎发育过程中每隔2小时用同等温度、充分曝气的水换掉1/3，出膜后的幼苗先饲喂草履虫，而后转喂丰年虫，待小鱼可以平游正常摄食时放养到4m×6m×1.5m的水泥池进行分池养殖，正常饲喂，待团头鲂F0代3月龄时，剪取1.5-2.0mg尾鳍，使用碱裂解法提取DNA检测阳性率。本研究所用到的实验仪器汇总见表1，所涉及的实验试剂见表2。

表1实验仪器

表2实验试剂

1.2实验设计

CRISPR/Cas9系统是由两部分构成：Cas9核酸酶+RNA (crRNA+tracrRNA)。在本发明中，Cas9核酸酶用NLS-Cas9-NLS 蛋白(GenCrisprNLS-Cas9-NLS Nuclease，Cat.No.Z03389)替代^[27]，这种两端均含有NLS核定位信号的Cas9蛋白是携带有酿脓链球菌的 Cas9基因片段的E.coli大肠杆菌的表达产物。它可以在guided-RNA 的引导下特异性的切割双链DNA片段，该蛋白的浓度一般为5,000 units/ml，保存温度为负20℃。现有技术中，RNA采用的是携带有20bp 左右靶点序列的guided-RNA(gRNA)，已知crRNA由spacer(20bp，与target完全配对)和后面的20多个碱基组成；后面的序列和 tracrRNA配对。为了简化操作，后来Doudna将两条RNA串在一起变成sgRNA(single guided RNA)，本发明采用的此类gRNA，详见原始文献“A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in AdaptiveBacterial Immunity”。tracrRNA被认为是稳定sgRNA高级结构供Cas9识别需要的，其中包含loop1，2，3和tetra loop。结合 Doudna和张峰实验室的最新研究，详见文献“CrystalStructure of Cas9in Complex with Guide RNA and Target DNA”，此外本发明采用了携带Amp⁺的PMD19-TVector骨架扩增了不同基因靶点的gRNA，而非传统的PX330骨架。CRISPR/Cas9系统是由两部分构成：Cas9 核酸酶+RNA(crRNA+tracrRNA)。其中，crRNA由spacer(20bp，与target完全配对)和后面的20多个碱基组成；后面的序列和 tracrRNA配对。而后经改造把两条RNA串在一起变成sgRNA(single guided RNA)，即后文中的gRNA,其简洁易懂的模式图如图11所示。

本实验以野生型纯合正常的团头鲂为亲本,父母本均选取成熟度好、体型优良的3龄鱼亲本进行人工繁殖。催产采用1000IU HCG与5μg LHRH-A2混合注射，注射剂量雄鱼较雌鱼减半。催产药物注射后，亲鱼暂养至圆形产卵池(直径约2m，深约1.2m)中，同时流水刺激，次日早上对亲鱼取卵、精进行人工干法授精。将含有针对MSTNa 或MSTNb的三种guided-RNA(gRNA)之一(100pg)和Cas9蛋白 (900pg)的1nl的混合液注射进1-2细胞期的团头鲂胚胎，受精卵置于培养皿中孵化，每隔4h换1次水直至出膜。鱼苗卵黄囊消失后且能够平游时，将鱼苗转移到4m×6m×1.5m的水泥池进行分池养殖的土池中养殖。同时分别独立建立团头鲂MSTNa&b6个不同靶点群体，以及对照群体。整个养殖周期投喂相同的配合饲料(蛋白含量33％)。待实验鱼长至3月龄，剪取2mg的尾鳍，提取团头鲂基因组 DNA，然后T7E1酶检测团头鲂F0代的靶点突变概率。基因敲除团头鲂(Ko)F0代的基因型总共有四种，即Ko(MSTNa^+/+)，Ko (MSTNa^+/-)，Ko(MSTNb^+/+)和Ko(MSTNa^+/-)。然后从F0代中筛选双肌型靶点杂合子的群体，即Ko(MSTNa^+/-)和Ko(MSTNb^+/-)，具体的筛选方法如下：我们分别对团头鲂MSTNa和MSTNb基因的各靶点设计引物，以团头鲂基因组的DNA为模板，以靶点两侧相应距离的primer为引物进行特异性扩增，先通过T7E1酶突变率检测初步判断，然后把PCR纯化产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，根据测序序列分析及其对应的峰值结果来判断靶点来判断靶点突变的类型，从而筛选出团头鲂MSTNa和MSTNb靶基因理想的突变群体，将靶点杂合群体F0代团头鲂转移至4m×6m×1.5m的水泥池精心饲养，并且以此同时建立同样饲养密度的对照组正常团头鲂。对2龄发育成熟的团头鲂进行雌核发育实验，Ko(MSTNa^+/-)靶点杂合群体F0代团头鲂可以产生Ko(MSTNa+)和Ko(MSTNa-)两种类型的配子，Ko(MSTNb^+/-)靶点杂合群体F0代团头鲂也可以产生 Ko(MSTNb+)和Ko(MSTNb-)两种类型的配子。为了获得雌核发育的团头鲂F1代，以紫外线灭活的草鱼精子激活团头鲂卵子,冷休克抑制第二极体排出的方法诱导出雌核发育的团头鲂，从而得到雌鱼遗传物质加倍的子代。即Ko(MSTNa^+/+)、Ko(MSTNa^-/-)、Ko(MSTNb^+/+) 和Ko(MSTNb^-/-)，同理可以从中筛选到双肌型F1代团头鲂，即Ko(MSTNa^-/-)和Ko(MSTNb^-/-)。雌核发育获得F1代，筛选出双肌型纯合子后代。在图1的技术路线中，此外我们会先后开展Tgf2介导转基因、群体体型测量、群体生长实验、基因克隆、Sothern杂交、原位杂交和肌纤维组织切片处理等相关实验。

关于Tgf2介导的转基因，其主要的步骤说明如下：参照团头鲂 MSTNa和MSTNb基因克隆的相关信息，筛选出团头鲂MSTNa和 MSTNb基因的编码框序列，进一步构建包含金鱼Tgf2转座子左臂 (220bp)、右臂(185bp)、斑马鱼Mylz2启动子和团头鲂MSTNa基因的ORF的供体质粒pTgf2-Mylz2-ttfMSTNa，于此同时构建包含金鱼Tgf2转座子左臂(220bp)、右臂(185bp)、斑马鱼Mylz2启动子和团头鲂MSTNb基因的ORF的供体质粒pTgf2-Mylz2-ttfMSTNb。通过显微注射方法，在体外合成的Tgf2转座酶5’加帽mRNA的介导下，获得转团头鲂MSTNa/b基因的转基因团头鲂。pTgf2-Mylz2-eGFP质粒保存于上海海洋大学农业部淡水水产种质资源实验室，该质粒包含金鱼Tgf2转座子左臂(220bp)、右臂(185bp)、斑马鱼肌球蛋白轻链启动子(Mylz2)和绿色荧光蛋白(eGFP)编码基因。对 pTgf2-Mylz2-eGFP质粒进行Bam HI、Cla I双酶切，酶切产物经1.2％琼脂糖凝胶，割胶回收目的片段，获得pTgf2-Mylz2质粒的双酶切产物。

实验方案：采取的研究方法或技术路线，参见图1所示：

1.3团头鲂MSTNa&b基因的Cas9/gRNA靶点设计和特异性验证

首先用Ensembl genome browser 92查询外显子、内含子以及 5’/3’-UTR(Untranslated Region)以及起始密码子的位置，用ZiFiT (http://zifit.partners.org/ZiFiT/Program_use.aspx)预测团头鲂MSTNa 和MSTNb基因的Cas9/gRNA的靶位点。同时使用NCBI Blast和靶点序列的PCR扩增送测(上海生工生物工程股份有限公司)来验证靶点在基因组的特异性。在靶位点周围运用软件PrimerPremier设计引物(靶点设计要求两侧的引物要距离靶点大于100bp，并且两个引物距离靶点的距离要相差100bp之上，这样方便检测酶切结果，并且 PCR扩增产物最好不要超过500bp)。我们分别对团头鲂MSTNa和 MSTNb基因的靶点设计引物，以团头鲂基因组的cDNA为模板，以靶点两侧相应距离的primer为引物进行特异性扩增，把PCR扩增产物送至上海生工公司测序，根据测序序列分析以及峰值结果来判断靶点是否可采用。要求实验用亲鱼材料对靶点序列为MSTNa和MSTNb 基因野生型纯合子。如果测序结果与预设结果不一致，显示实验鱼的靶点序列是杂合的，则需重新选择实验用亲鱼，父母本均选取成熟度好、体型优良的3龄鱼亲本进行人工繁殖，以求实验用亲鱼的必须是靶位点纯合的团头鲂，通过对实验用30对成熟度良好的团头鲂进行逐条剪鳍PCR检测，测序结果显示30对亲鱼靶位点纯合度为100％。

1.4CAS9蛋白和团头鲂MSTNa&b基因gRNA的合成

显微注射用的两端均带有NLS(Nuclear Localization Sequence) 序列的CAS9蛋白(货号：Z03389-50)购自南京金斯瑞生物科技有限公司，其中氨基端(N-terminus)的NLS(Nuclear localization sequence)为PKKKRKV，是一种来自SV40的T抗原的富含碱性氨基酸的短肽。羧基端(C-terminus)的NLS为KR[PAATKKAGQA] KKKK。羧基端的NLS为核质蛋白的核定位信号序列，该核质蛋白是常见的双信号的模型，简称双分型，典型的核定位信号分为单分型和双分型两大类，两簇固定的碱性氨基酸序列被一簇10个非保守氨基酸残基间隔(如方括号内所示)。之所以选择两端均含有NLS核定位信号的CAS9蛋白，是因为此种形式的信号肽可以协助亲核蛋白进入细胞核。

实验用PMD19-T-gRNA质粒购于中科院水生生物研究所，PCR 扩增酶为高保真酶(Biolabs，USA)，在各靶点的上游引物 (5`-TAATACGACTCACTATANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTT TAGAGCTAGAAATAGC-3`)和通用下游引物 (5`-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3`)作用下进行PCR扩增，然后用DNA Clean&Concentrator-5(Zymo Research，USA)纯化，紧接着用MAXIscriptT7kit(Ambion，USA)体外转录。所有的靶点均以GG开头并且其特定的PAM区序列为NGG。

PMD19-T-gRNA质粒中被上游引物和通用下游引物扩增的部分序列如下所示：

下划线的标识的序列为T7启动子序列，N(19-23)表示主靶点序列的长度19-23不等，斜体字标识的序列为gRNA scaffold。

>pMD19-T-gRNA质粒序列：2769bp。结构如图10所示。

其中，如第一个方框所示351-374bp为M13-47位点序列；如斜体字所示396-458bp为Multiple cloning site多克隆位点；如第二个方框所示432-508bp为插入的gRNA序列；如第三个方框所示561-584 bp RV-M；如第四个方框所示1709-2569bp AMP⁺。

1.4.1提取pMD19-T-gRNA scaffold质粒模板

用实验室预留的pMD19-T-gRNA scaffold载体为模板，均为 Amp⁺抗性，首先是实验用质粒的摇菌扩大培养：1、首先把质粒连接入DH5α感受态细胞中，将1μl的pMD19-T-gRNAscaffold质粒和100μl 的DH5α感受态细胞加入混合，冰上(﹣20摄氏度冰箱)放置30min， 42摄氏度加热45s，立刻放到冰上1min，加入890mlLB Amp^-的培养基，在37摄氏度下于摇床中振荡培养60min，2000rpm离心5min，然后700μl的上清弃去，把250μl的菌液在Amp⁺LB培养基中均匀涂板，放在37摄氏度的恒温培养箱中过夜。2、37摄氏度摇菌扩大培养，次日待菌落大小长势较适宜时，在超净工作台中挑菌扩大培养，首先先打开超净工作台，把需要使用的移液枪、枪头、挑菌棒等必需的实验用具放在其中，打开紫外灯以及吹风按键，紫外灯消毒灭菌半个小时，然后挑取光滑度、色泽、大小以及性状均一的菌落，在酒精灯下，用消毒灭菌过的牙签轻轻挑取单菌落放在EP管(1.5ml)中，加入AMP⁺LB培养基(50μl)，在摇床上扩大培养。及时观察菌落的扩增及整体的培养情况，待试管中有成股的云状形态物出现，表明菌体在大量的扩增繁殖，培养大约14个小时，用快速质粒小提试剂盒来提取pMD19-T-gRNAscaffold质粒。

用快速质粒小提试剂盒提取模板，分三个平行样提取，实验前先仔细阅读质粒小提的说明书，并需要注意一些注意事项，1、溶液P，在使用之前先加入RnaseA和Red混匀，放置于2-8℃保存。2、由于保存的条件不同，如果试剂P2和P5出现了浑浊，可在37摄氏度的水浴中或者恒温环境下加热2分钟即可。3、同时需要留意PWT的试剂配制，需要在漂洗前加入无水ethanol，加入无水乙醇的体积具体参照说明书。质粒浓度均在250ng/μl左右，在gRNA合成步骤体系中要求，用普通TAKARA酶要求gRNA的浓度为10ng/μl，用HF高保真酶要求gRNA的浓度为50ng/μl，为此只需要在实验之前把提取的质粒分别稀释到所需的浓度备用即可。

1.4.2扩增团头鲂MSTNa&b gRNA的引物设计

靶点的类型可分为两大类，一般是T7或SP6类型的，这就要求我们在设计启动子的时候需要参照靶点类型，决定合成的是含有T7 还是SP6启动子序列的引物。参照图2(以斑马鱼th基因的某个Cas9 靶点为例)，本发明表明上游引物 (5`-TAATACGACTCACTATANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTT TAGAGCTAGAAATAGC-3`)由三部分组成(前端T7promoter、中间由20个连续N替代的靶点序列和后端scaffold)。根据实验研究一般选取的是T7类型的启动子，其中本发明所用的T7promoter的碱基序列为：5`-TAATACGACTCACTATA-3`(SEQ ID NO.1)，也可以采用 SP6promoter(5`-ATTTAGGTGACACTATA-3`)(SEQ ID NO.2)。 scaffold的碱基序列为：5`-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3`， NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN是不同基因的靶点序列的代称，如 Cas9本身对20个碱基主位点(I类靶点碱基主位点是20个，II、III、 IV类靶点的主位点会有所调整，一般都在19-23之间)的序列并没有要求，由于需要通过体外转录制备gRNA，选择靶点时就需要符合体外转录启动子(T7或SP6)的要求。T7启动子要求转录起始位点的前两位为GG，并且第三位最好为G或A；SP6启动子则要求转录起始位点的前三位为GAA。其中Cas9靶点设计的通式为：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-NGG-3’，末端的NGG为PAM 区域，在合成gRNA的上游引物设计的时候，是不包含在内的，即待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列(NGG)。其次，gRNA 要与PAM上游的序列碱基互补配对。下游引物为通用引物： 5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’。各基因靶点的gRNA 的引物设计见表3。

表3合成团头鲂MSTNa和MSTNb基因各靶点的gRNA引物

方框标注的是T7启动子的序列，加黑字体是靶点序列，下划线标注的是gRNA模板的一段scaffold序列。其中，序列名指靶点序列的名称。

表4体外转录产生的gRNA中靶点对应序列列表

1.4.3团头鲂MSTNa&b gRNA的扩增及体外转录纯化

我们对MSTNa&b的gRNA扩增设计引物，使用T7-target-scaffold 和tracr rev(表4中common reverse，下游通用引物)这一对引物，模板采取的是pMD19-gRNA scaffold质粒，使用高保真酶进行PCR 扩增反应。PCR结束之后，需要用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，120V，电泳25分钟左右，注意使用高保真酶的扩增产物电泳时，需要加入 loaddingbuffer,一般控制在1μl之下，加入loadding buffer过多会影响电泳结果。参照试剂盒的使用说明，使用DNA-clean up kit纯化试剂盒来纯化团头鲂MSTNa&b的gRNAPCR产物。

扩增结果如下所示：

5`-TAATACGACTCACTATAN(19-23)GTTTTAGAGCTAGAAAT AGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGT GGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT

体外转录模板中Scaffold部分的序列称SEQ ID NO.3。

5`-TAATACGACTCACTATA为T7启动子序列，是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。N(19-23)表示主靶点序列的长度19-23不等，这段目的序列要根据需要编辑的基因不同而设计，5`-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG CTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTT TTTTT为gRNA scaffold的具体序列信息。

使用T7In Vitro Transcription kit(mMESSAGEmMAC-HINE T7 Μltra kit,P/N:AM1345)试剂盒，体外将DNA转录成RNA，其反应体系如下表5：

表5转录反应体系

全部操作需要在低温无菌下进行，把加好的混合样品，放置在 37摄氏度的PCR仪中80分钟，取出加入1μlTURBO DNase,37℃下放置15分钟，这一步的操作主要是去除多余的DNA。

转录出的gRNA序列如下所示：

5`-N(19-23)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGG UGCUUUUUUU

gRNA序列中Scaffold部分的序列称SEQ ID NO.4。

同时采用LiCl/ethanol沉淀法来纯化体外转录产物，1、加入1.5μl 的7.5M的LiCl(2.5μl的4M/2μl的5M),以及100μl的100％的乙醇，用无菌的枪头混合均匀，转移到1,5ml的离心管中，放置在负80℃的冰箱中一个小时。2、4摄氏度下14000rpm离心15分钟，吸掉液体，保留白色沉淀(即gRNA)。3、加入350μl 70％ice-ethanol(用转录试剂盒的水来稀释)，用枪温柔吹打，洗涤gRNA，尽量不将沉淀吸起。4、4℃下离心15分钟(14000rpm)，将沉淀留在EP管的底部。 5、去除乙醇，重复3、4步骤，并静置使乙醇挥发干净，加入试剂盒里的10μlNuclease-freewater(无菌水需要提前预热一下)，吹打溶解 gRNA，涡旋混匀，微离。6、测合成的gRNA的浓度和OD值，一般OD值在2.0左右较好。7、2％的琼脂糖凝胶电泳，160V，15分钟检测gRNA的合成纯度和降解情况(注意做凝胶用的模具、电泳槽的清洁情况，务必清洗干净)。

1.5显微注射

显微注射装置由显微注射器(PV830Pneumatic PicoPump)和 SMZ-445体式显微镜(Nikon，日本)组成,装置由氮气气压驱动，将含有gRNA(100pg)和Cas9蛋白(900pg)的1nl的混合液注射进1-2 细胞期的团头鲂胚胎。每个靶点注射300枚左右的胚胎，预留不做任何处理的胚胎做空白对照，各实验均做三次重复。

1.6各靶点突变效率的评估检测

显微注射gRNA和Cas9蛋白的胚胎发育到48hpf，随机挑取5 枚注射的胚胎为一组，提取基因组DNA检测，一式三份。以各靶点提取的基因组DNA为模板，以表6的上下游引物PCR扩增，然后 PCR产物经过变性和等阶梯度降温打开异源双链DNA，使用T7 Endonuclease I酶(NEB，USA)37℃处理45分钟，酶切后的PCR 产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，突变率的评估方法来自先前的研究。PCR扩增产物链接到PMD19-T TA cloning vector(Takara，大连)，然后再转化到DH5α感受态细胞，送至上海生工生物工程股份有限公司测序分析。同时将F0饲养至适合剪尾鳍3月龄，同样方法逐条进行靶点突变类型的检测。

表6团头鲂MSTNa&b基因靶点检测引物设计

1.7突变阳性群体的生长指标的测定

对6月龄的团头鲂MSTNa&b靶点杂合突变的阳性群体，分别从各群体随机抽取30尾，测定了其体重、体长和体高这三个指标，进一步对其阳性和阴性个体的三个指标进行独立t检验，发现团头鲂 MSTNa&b靶点杂合突变的阳性个体的体重均比阴性个体的大。参见表7。

表7团头鲂MSTNa&b target3杂合突变的阳性个体群体生长测量统计

与此同时，本发明对1龄的团头鲂MSTNa&b target3杂合突变的阳性个体，各选取了3尾阳性个体和正常对照组实验鱼进行了肌纤维组织切片处理实验。切片前先测量各个样本鱼的体重、体高和体高等数据，并计算出体重/体长、体厚/体长的比值和纤维的平均面积。结果显示:实验组体重/体长、体厚/体长的比值和纤维的平均面积均高于对照组。具体的数据统计如表8，团头鲂MSTNb target3杂合突变的阳性个体身体横断切面以及肌纤维组织切片如图9所示。

表8团头鲂MSTNa&b target3杂合突变的阳性个体生长指标及纤维平均面积的统计

1.8数据统计分析

不同靶点各平行组的数据均采用单因素方差分析(ANOVA),使用GraphPadPrism5.0做图分析，显著值P<0.05。

2.结果

2.1团头鲂MSTNa&b基因的Cas9/gRNA靶点设计

本研究率先采取Cas9基因编辑技术对团头鲂MSTNa&b基因进行敲除，根据I类和II类T7靶点的设计原则，分别在MSTNa基因 (GenBank Acc.No.JQ065336.1)的成熟mRNA对应的碱基序列642、 1015、1232位点为起点(图3)以及MSTNb基因(GenBank Acc.No.JQ065337.1)的成熟mRNA对应的碱基序列466、878、1054位点为起点(图4)设计靶点。图3和图4的核酸序列是排除了内含子后的DNA序列一览图，对比参照其他鱼类的结果，分析可得团头鲂 MSTNa&b基因均含有三个外显子和两个内含子，以图3为例，前段小写的碱基序列表示5’-UTR，中间的大写的碱基序列为编码区，并且在各自的碱基上方分别标注了其对应的氨基酸，后半部分小写的序列为3’-UTR。如图5所示：团头鲂MSTNa&b基因的靶点1设计在第一个外显子上，团头鲂MSTNa&b基因的靶点2和3均设计在第三个外显子上。

2.3注射团头鲂MSTNa&b基因不同靶点的胚胎存活率分析

本研究将含有gRNA(100pg)和Cas9蛋白(900pg)的1nl的混合液注射进1-2细胞期的团头鲂胚胎，其中团头鲂MSTNa&b基因分别设有三个不同的靶点，每个靶点分别注射300枚左右的胚胎，分别在24hpf和48hpf统计各靶点的存活率，结果分析可知(图6A、B)，注射不同的团头鲂MSTNa靶点的胚胎，在各时期的存活率无显著差异(P＞0.05)，而注射不同的团头鲂MSTNb靶点的胚胎各时期也均无显著差异(P＞0.05)。

2.4注射团头鲂MSTNa&b基因不同靶点的突变效率分析

靶点设计和引物的设计均在ZIFIT(Zinc Finger Consortium)和 NCBI网址的指导下进行。我们分别把MSTNa&b基因不同靶点的 gRNA和Cas9蛋白注射到团头鲂1-2细胞期的胚胎内，每个靶点都是一式三份，同时也有未注射的空白对照。为了评估MSTNa&b基因各靶点的突变效率，在注射后48hpf提取基因组DNA，运用T7 Endonuclease I酶检测靶点突变率，其原理为靶点序列经过Cas9蛋白切割之后,缺乏修复模板,将主要以非同源重组的方式进行修复,或多或少的会插入或者删除一些碱基,因此将靶点序列PCR扩增后经过变性、退火，将形成错配。T7E1酶也成为错配酶，它可以识别错配的杂合双链并将之剪切。切割后的PCR产物跑凝胶电泳，通过比较切割条带个未切割条带的比例，即可反映出构建的各个靶点体系的突变率。并且测序分析确定靶点突变类型数目。如图8和图9T7E1酶检测结果显示：MSTNa target1、2、3对应的突变效率是5.1％、8.2％、 10.0％，对应的突变类型数分别是5(1种插入、3种缺失、1种转换)、 4(1种插入、2种缺失、1种转换)和12(2种插入、8种缺失、1种转换、1种颠换)；MSTNb target1、2、3对应的突变效率是15.3％、 14.7％、26.0％，对应的突变类型数分别是2(1种缺失、1种转换)、 3(1种缺失、2种转换)和5(1种插入、2种缺失，1种转换、1种颠换)(图7、图8A、B)。

3讨论

肌肉生长抑制素Myostatin(MSTN)基因为转化生长因子β超家族(TGF-β)的重要成员，该家族成员具有一些保守的结构特征。

本发明率先在草食性经济鱼类团头鲂中采用CRISPR/Cas9技术对MSTN基因进行基因编辑。本发明在经济养殖鱼类团头鲂 MSTNa&b基因敲除的探究，为后期更多的经济养殖鱼类的实验开展奠定了基础。同时本实验的研究结果为根据不同实验目的经济养殖鱼类合理的选用CRISPR/Cas9基因编辑技术提供了依据和借鉴。

本发明印证了MSTN基因对成肌细胞增殖和分化的抑制作用，氨基酸的突变导致蛋白质二硫键的形成受阻，从而重要的生物功能发生改变。本发明在团头鲂MSTNa&b基因的基因敲除靶点设计过程中，分别在基因的第一和第三外显子区域共设了3个靶点，实验团头鲂F0代敲除效率的检测结果对比表明：团头鲂MSTNa和MSTNb基因在第三外显子区域(接近938氨基酸位点)设计的靶点突变效率更高。

本研究对显微注射的团头鲂24hpf和48hpf的胚胎的成活率进行了统计分析，团头鲂MSTNa&b基因不同位置靶点的成活率无显著差异(P>0.05)，均类似于对照组的成活率。有关研究表明运用ZFNs、 TALENs和CRISPR/Cas9基因编辑技术，靶点突变效率的高低与靶点设计的位置相关，本研究中显微注射的团头鲂48hpf胚胎的突变率检测结果显示各靶点的突变效率和突变类型均不同，其中团头鲂 MSTNa targte3和MSTNb targte3突变效率分别为10％和26％，插入缺失突变类型分别为12和5。相对于MSTNa&b targte1和MSTNa&btargte2，MSTNa&b targte3占据很大的优势，该靶点的位置正处于团头鲂MSTNa&b基因极其保守的结构域，也是最接近938氨基酸位点，也处于也充分验证了靶点设计位置选择的重要性。本研究运用 CRISPR/Cas9技术对团头鲂MSTNa&b基因进行敲除，T7E1突变率检测显示各靶点的突变效率均低于80％，况且已经有研究表明当出现单一突变DNA的等位基因在退火时聚合现象时，T7E1酶是不能检测出这种突变，因此也就意味着由T7E1酶检测的突变效率将低于真实的突变效率。同时也需要更多的实验研究以优化实验条件，来探寻在经济养殖鱼类的最大的敲除效率。

团头鲂(Megalobrama amblycephala)成活率高、食性广、成本低、能在池塘中产卵繁殖等凸显的优点使其可以作为我国重要的淡水养殖种类。本研究通过CRISPR/Cas9基因敲除技术，在团头鲂 MSTNa&b基因保守的功能位点分别设计不同靶点，通过不同靶点突变效率和突变类型的检测，并且在第三外显子区域筛选到了 MSTNa&b基因最大突变效率和最多突变类型的靶点，本发明的研究结果对肌肉品质更加显著的团头鲂新品系的选育提供了新的思路和视角。同时也为根据不同实验目的经济养殖鱼类合理的选用 CRISPR/Cas9基因编辑技术提供了依据。

以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海海洋大学

<120> 一种团头鲂MSTNa&b基因敲除的gRNA及其模板

<141> 2019-08-13

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taatacgact cactata 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atttaggtga cactata 17

<210> 3

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgctttt ttt 83

<210> 4

<211> 83

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60

ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 83

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggcttgcggt tctgtggcca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggaaggactg caacccttcc 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggccttgtta acgatgtgac tgt 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggggtcgggc tctgtggcca 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gggcccaaag cgaatccgga 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gggtgtgggg atacttctgc 20

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaaaaaagca ccgactcggt gccac 25

<210> 12

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggcuugcggu ucuguggcca 20

<210> 13

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggaaggacug caacccuucc 20

<210> 14

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggccuuguua acgaugugac ugu 23

<210> 15

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggggucgggc ucuguggcca 20

<210> 16

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gggcccaaag cgaauccgga 20

<210> 17

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gggugugggg auacuucugc 20

Claims

1.一种基于CRISPR/Cas9系统的gRNA，所述gRNA是选自针对团头鲂MSTNa基因和/或团头鲂MSTNb基因的gRNA引物；

所述CRISPR/Cas9系统的靶点序列是针对MSTNa的第三外显子的靶点序列，和/或针对MSTNb的第三外显子的靶点序列；

所述gRNA包括依次上下游连接的gRNA靶点序列和scaffold序列，所述gRNA靶点序列选自SEQ ID NO.14或17所示的序列；

所述scaffold序列为SEQ ID NO.4所示的序列。

2.如权利要求1所述的gRNA，其特征在于：

所述MSTNa基因的GenBank登录号为：JQ065336.1；

所述MSTNb基因的GenBank登录号为：JQ065337.1。

3.一种基于CRISPR/Cas9系统的gRNA模板，所述gRNA模板能够转录成如权利要求1或2所述的gRNA；

所述gRNA模板的序列包括：依次连接的启动子序列-模板靶点序列-模板scaffold序列；

启动子为T7启动子或SP6启动子；

所述模板scaffold序列为SEQ ID NO.3所示的序列；

所述模板靶点序列选自SEQ ID NO.7或10所示的序列。

4.一种试剂盒，所述试剂盒中含有如权利要求1或2所述的gRNA或如权利要求3所述的gRNA模板。