CN114931128A - hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体的制备方法和应用，依次包括设计gRNA位点—PCR扩增—gRNA的模板纯化—体外转录—gRNA纯化—显微注射—检测敲除效率—饲养至成鱼—与野生型交配—检测下一代胚胎是否携带突变位点—饲养成年后剪尾鉴定出杂合突变体—两杂合体交配得到纯合突变体的步骤。本发明首次运用CRISPR技术删除基因组中hoxaa基因簇长片段构建hoxaa基因簇缺失的斑马鱼突变体，其可用于与hoxaa基因簇相关疾病的动物模型研究hoxa基因在动物体生长发育的调节机制和基因缺失引起的相关疾病治疗。

Description

hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体的制备方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体的制备方法和应用。

背景技术

CRISPR/Cas技术是继ZFN及TALEN后近几年比较火热的基因编辑系统，基于其具有简单、高效、易操作等优势已经在全球多种模式生物中得到广泛应用。CRISPR/Cas系统是存在于古生物菌和细菌的一种获得性免疫系统，一早被发现仅需要两段RNA及Cas9一种核酸内切酶就可以对靶位点行使切割功能，由于其仅依赖传统的Watson-Crick方式识别20nt的核苷酸，很快被改良并应用到哺乳动物及人类细胞中并且实现了有效的切割，此后相继将CRISPR技术在小鼠、斑马鱼、果蝇、细菌等模式生物上进行应用并获得成功。

hox是编码含有同源框的一大类转录因子家族，在动物躯体形态构建中发挥重要作用。hox基因在进化过程中发生了全基因组的加倍，最先发现的果蝇中只含有一个hox基因簇，小鼠等四足动物中发生了两次全基因组的加倍，形成4个Hox基因簇，斑马鱼等大多数硬骨鱼发生了额外一次的基因组加倍，最终形成7～8个hox基因簇，斑马鱼中有7个hox基因簇，共48个基因成员。hox基因在染色体上成簇排列，不同的hox基因簇分布在不同的染色体上，每个hox基因簇由多个同源组基因组成。hox基因的表达遵循时间-空间共线性表达模式空间共线性是指：位于3’端的hox基因表达部位越靠近躯体前端，而位于5’端的基因则大多在躯体后端表达；时间共线性是指：3’端的hox基因比5’端的基因表达得要早。时间-空间共线性表达模式使得hox基因在躯体形态构建中按照一定的顺序发挥特定的功能。hoxa基因编码在肢体发育过程中起作用的重要的DNA结合转录因子，主要调节基因表达，进而调节形态发生和骨骼分化。在这些基因中，hoxa11和hoxa13被认为在从鱼类到四足动物的神秘进化过渡中发挥重要作用。

哺乳动物拥有39个hox基因，这些基因排列在四个线性簇中，每个簇有9至11个基因。hoxa基因家族编码包含DNA结合同源异型盒基序的蛋白质，并控制除后期发育事件之外的早期胚胎分割模式。hoxa基因家族与多种癌症类型相关，目前有研究表明hoxa基因家族与急性髓性白血病(AML)有关，影响细胞更新和白血病的发展。2005年，Tischfield报道人类hoxa1基因的纯合缺失会导致阿萨巴斯卡发育不良综合征(ABDS)，其特征表现为面部畸形、面部麻痹、颈动脉形成缺陷等。hoxa1基因的突变还会导致先天性人类hoxa1综合征的Bosley-Salih-Alomainy综合征(BSAS)，患者通常会出现以下症状：眼动、内耳空腔畸形、脑血管异常、心脏畸形、发育迟缓和自我认知障碍，还有部分患者会出现从单侧颈内动脉发育不良到双侧发育不全的脑血管畸形。在正常发育过程中，hoxa13在身体后部结构的形成中起着主导作用，特别是在肢体、肠道和泌尿生殖系统的发育中，也在肿瘤的发展和进展中发挥相关作用，并且hoxa13基因在癌变和肿瘤进展过程中的调节机制使其可以作为癌症诊断和治疗的生物标志物。

发明内容

本发明的主要目的在于提供hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体的制备方法，通过CRISPR技术构建hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体鱼系。

本发明的另一目的是提供通过上述制备方法得到的hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体作为动物模型的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体的制备方法，通过CRISPR技术构建hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体，依次包括设计gRNA位点—PCR扩增—gRNA的模板纯化—体外转录—gRNA纯化—显微注射—检测敲除效率—饲养至成鱼—与野生型交配—检测下一代胚胎是否携带突变位点—饲养成年后剪尾鉴定出杂合突变体—两杂合体交配得到纯合突变体的步骤，具体包括以下步骤：

(1)获取斑马鱼的hoxaa基因簇序列；

(2)在斑马鱼hoxa13a基因的第一个外显子上设计如SEQ ID NO:1所示的靶点gRNA序列，在hoxa1a基因的第一个外显子上设计如SEQ ID NO:2所示的靶点gRNA序列；

(3)设计并合成gRNA引物：hoxa13a基因的gRNA引物F1和R1，序列分别如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示；hoxa1a基因的gRNA引物F2和R2，序列分别如SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示；

(4)设计并合成hoxa13a和hoxa1a基因的检测引物：hoxa13a基因的检测引物F3和R3，序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；hoxa1a基因的检测引物F4和R4，序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；

(5)以gRNA骨架质粒为模板使用步骤(3)的gRNA引物进行PCR扩增反应，电泳检测PCR产物，纯化；

(6)在RNase-Free条件下将上述PCR纯化产物分别进行体外转录得到gRNA，转录体系中加入T7聚合酶和NTP，37℃反应1.5h，纯化；

(7)将步骤(6)纯化后的两种gRNA和Cas9蛋白混合后显微注射到斑马鱼单细胞期胚胎中，24h后取胚胎并提取DNA，用上述F3/R4这一对引物对敲除位点进行PCR扩增，电泳检测PCR产物，将敲除成功的小鱼饲养长大，作为F₀；

(8)待F₀斑马鱼性成熟后，与野生型的斑马鱼杂交得到一定概率的杂合子，取胚胎并提取DNA，用上述F3/R4这一对引物对敲除位点进行PCR扩增，电泳检测PCR产物并测序确认，将有突变的斑马鱼培养长大，作为F₁；

(9)待F₁斑马鱼性成熟后，将雌鱼和雄鱼的鱼尾切除进行尾鳍DNA提取，按照上述方法进行PCR扩增确认是否突变并测序确认，将有突变的雌雄斑马鱼配对，后代作为F₂；

(10)待F₂斑马鱼性成熟后，将F₂所有的鱼剪尾提取DNA，先用上述F3/R4这一对引物进行PCR检测，阳性结果的基因组用F3/R3或者F4/R4引物检测单个基因的完整性，阴性结果即纯合子，送公司测序确认，得到hoxaa基因簇缺失斑马鱼纯合突变体。

作为优选，步骤(5)中，PCR反应条件为：预变性94℃3min；变性94℃30s，退火65℃30s，延伸72℃30s进行35个循环，再72℃10min，最后保温在12℃。

作为优选，步骤(7)中，PCR反应条件为：预变性94℃3min；变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃40s进行35个循环，再72℃10min，最后保温在12℃。

作为优选，步骤(7)中，hoxa13a和hoxa1a基因的gRNA终浓度均为100ng/μL，Cas9蛋白的终浓度为800ng/μL。

作为优选，步骤(8)至(10)中，F₀斑马鱼、F₁斑马鱼和F₂斑马鱼性成熟的时间均为3-4个月。

本发明还提供hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体，通过上述任一所述hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体的制备方法得到，其中删除的hoxaa基因簇大小为56.6kb。

本发明还提供所述hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体在构建与hoxaa基因簇缺失相关疾病的动物模型和药物筛选中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

一、本发明利用片段删除方法在斑马鱼中精确删除hoxaa基因簇获得hoxaa基因簇缺失突变体，hoxaa可稳定遗传，构建出可遗传的疾病模型为后续研究基因和基因簇的功能以及疾病机理提供基础材料。

二、利用利用CRISPR技术在hoxa13a和hoxa1a各设计特异性的靶位点使斑马鱼中hoxaa基因簇被敲除，又不影响其他基因，形成特异性hoxaa基因簇敲除的斑马鱼。

三、本发明运用CRISPR技术删除基因组中长片段序列，删除的hoxaa基因簇大小为56.6kb，跨越了几个基因，实现了多基因的删除。

四、本发明针对不同目的基因的靶点分别设计一对特异性引物，然后运用双外侧引物进行片段敲除检测和测序确认，成功构建hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体鱼系，可作为与hoxaa基因簇缺失相关疾病的动物模型，用于研究hoxaa基因在动物体生长发育的调节机制以及hoxaa基因缺失而引起的相关疾病治疗。

五、本发明通过CRISPR技术构建hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体，与传统的基因编辑技术相比具有毒性小、准确性高、效率高、成本低、易操作、成功周期短等特点，而且相对于传统遗传学操作方法，CRISPR/Cas9系统能对预编辑的目标序列进行剪切，具有很强的正选压力，不需要额外使用选择标记，避了传统操作方法中常遇到的可用选择标计已有限、引入抗生素标记产生生物安全隐患等。

附图说明

图1是实施例中利用CRISPR技术成功删除hoxaa基因簇：(A)利用CRISPR技术敲除hoxaa基因簇的模式图，在两端的两个基因上分别设计sgRNA和对应的检测引物，注射后检测各sgRNA的酶切效率；(B、C)hoxala和hoxa13a基因sgRNA酶切效率检测图和hoxaa片段敲除效率检测图，显示成功删除hoxaa基因簇；(D)hoxaa基因簇片段敲除检测胶图。

图2是实施例中hoxaa基因簇缺失纯合突变体的筛选结果：(A)hoxaa基因簇敲除F1基因型鉴定，用双外侧引物进行PCR检测，显示成功筛选到杂合子；(B、C)F2基因型鉴定显示成功筛选到纯合突变体；(D)hoxaa基因簇F2纯合子测序峰图。

图3是实施例中野生型WT和hoxaa基因簇缺失纯合突变体的斑马鱼胚胎原位杂交结果：(A，B)心室标记基因vmhc探针原位杂交结果；(C，D)心房标记基因amhc探针原位杂交结果；(E，F)心脏腔室标记基因nppa探针原位杂交结果；(G，H)心脏腔室标记基nppb探针原位杂交结果，发现斑马鱼hoxaa^-/-纯合突变体相较于野生型：突变体的nppa和nppb基因在房室间隔区域异位表达，而正常野生型的nppa和nppb基因仅在心房和心室表达，不在房室间隔表达，表明hoxaa突变影响心脏房室间隔的发育；比例尺：200um。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中所用的引物均由上海生工生物公司合成，所用的gRNA骨架质粒来自于文献：Chang N,Sun C,Gao L,Zhu D,Xu X,Zhu X,Xiong JW,Xi JJ.Genome editingwith RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos，Cell Res,2013,23(4):465-472，Cas9购自南京金斯瑞生物公司，PCR反应中的酶购自北京全式金生物公司，其余无机(NaOH，Tris-hCl等)及有机试剂(乙醇等)购自国药集团化学试剂有限公司，本发明中使用的斑马鱼为野生型斑马鱼AB品系来源于上海海洋大学水产与生命学院斑马鱼平台，斑马鱼的hoxaa基因簇序列在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上获取，靶点gRNA序列使用CHOPCHOP(http://chopchop.cbu.uib.no/)网站设计得到。

如图1所示，构建hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体鱼系：在hoxa1a的第一个外显子上设计特异的gRNA序列对hoxa1a进行敲除，在hoxa13a的第一个外显子上设计特异的gRNA序列对hoxa13a进行敲除，在斑马鱼单胚胎时期通过显微注射的方式同时注射两端特异的gRNA序列，将hoxa1a基因和hoxa13a基因之间的多个基因同时敲除，得到可稳定遗传的hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体鱼系，技术路线如下：利用CRISPR技术设计gRNA位点—PCR扩增—gRNA的模板纯化—体外转录—gRNA纯化—显微注射—检测敲除效率—饲养至成鱼—与野生型交配—检测下一代胚胎是否携带突变位点—饲养成年后剪尾鉴定出杂合突变体—两杂合体交配得到纯合突变体。

实施例1

本实施例通过CRISPR技术构建hoxaa基因簇敲除的斑马鱼突变体，其步骤如下：

(1)在hoxa13a基因的第一个外显子上设计gRNA序列为：

hoxa13a T1:5’-GGGCAATCACAACCAGTGGA-3’(SEQ ID NO:1)；

在hoxa1a基因的第一个外显子上设计gRNA序列为：

hoxa1a T1:5’-GGGCACTTTGTCAAGCACC-3’(SEQ ID NO:2)。

(2)设计并合成gRNA引物，其中，hoxa13a基因引物序列为：

F1：5’-TAATACGACTCACTATAGGGCAATCACAACCAGTGGAGTTTTA

GAGCTAGAAATAGC-3’(SEQ ID NO:3)；

R1：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’(SEQ ID NO:4)；

hoxa1a基因引物序列为：

F2：5’-TAATACGACTCACTATAGGGCACTTTGTCAAGCACCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(SEQID NO:5)；

R2：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’(SEQ ID NO:6)。

(3)分别以上述引物、gRNA质粒骨架为模板进行PCR反应，反应体系为：

PCR反应条件为：预变性94℃3min；变性94℃30s，退火65℃30s，延伸72℃30s进行35个循环，再72℃10min，最后保温在12℃；电泳检测PCR产物后，利用DNA纯化试剂盒进行纯化，用RNase-Free的水进行溶解洗脱。

(4)在RNase-Free条件下，分别将上述PCR纯化产物进行体外转录得到gRNA，转录体系为：

反应条件为：37℃反应1.5h，后加入DNase 1μL，37℃反应15min。体外转录后用LiCl沉淀法对gRNA进行纯化，具体方法为：向上述反应液中加入2.5μL的4M LiCl，再加入100μL的100％乙醇；放置-80℃冰箱孵育至少2小时(也可以过夜处理)；4℃、12000rpm、15min，弃上清；用预冷的70％乙醇洗两次，4℃、8000rpm、10min，弃上清，目的是为了去除杂质；超净台中室温通风晾干5min；最后加入15μL RNase-free水溶解，Nanodrop检测浓度和电泳检测。

(5)将前述纯化后的gRNA和Cas9蛋白混合后显微注射到单细胞期的斑马鱼胚胎中，注射时Cas9蛋白终浓度800ng/μL，gRNA终浓度100ng/μL，注射1nL。24h后取3组，5枚胚胎一组放入PCR小管中，利用碱裂法提取DNA：向每管中加入30μL 50mM NaOH溶液，95℃-10min后取出，在震荡仪上充分震碎组织后；继续95℃-10min；加入3μL 1M Tris-hCl(pH＝8)后震荡混匀离心10000rpm-5min。

针对hoxa13a基因设计检测引物，序列如下：

F3:5’-TCAGCTTCTACAGGCGAAGA-3’(SEQ ID NO:7)；

R3:5’-TGGCATACTCCCGTTCAAGC-3’(SEQ ID NO:8)；

针对hoxa1a基因设计检测引物，序列如下：

F4:5’-TATCACTAGCGCCCGAACAC-3’(SEQ ID NO:9)；

R4:5’-TCACAGACGATTCCACGTCC-3’(SEQ ID NO:10)；

用F3/R3与F4/R4这两对引物对敲除位点进行PCR扩增，反应体系为：

PCR反应条件为：预变性94℃3min；变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃40s进行35个循环，再72℃10min，最后保温在12℃；后用电泳检测，对不同gRNA序列的效率进行统计：hoxa13a T1：74.26％；hoxa13a T2：73.17％；hoxa1a T1：58.68％；hoxa13a T1比hoxa13aT2效率略高，因此选择hoxa13a T1和hoxa1a T1作为靶点组合进行后续片段删除。

(6)将hoxa13a T1和hoxa1a T1纯化后的gRNA和Cas9蛋白混合后显微注射到单细胞期的斑马鱼胚胎中，注射时Cas9蛋白终浓度800ng/μL，gRNA终浓度100ng/μL，注射1nL。24h后取3组，5枚胚胎一组放入PCR小管中，利用碱裂法提取DNA：向每管中加入30μL50mMNaOh溶液，95℃-10min后取出，在震荡仪上充分震碎组织后；继续95℃-10min；加入3μL 1MTris-hCl(pH＝8)后震荡混匀离心10000rpm-5min。

用F3/R4这对引物对敲除位点进行PCR扩增，反应体系为：

PCR反应条件为：预变性94℃3min；变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃40s进行35个循环，再72℃10min，最后保温在12℃；后用电泳检测，将敲除成功的那批注射组小鱼饲养长大，作为F₀。

(7)3-4个月后F₀斑马鱼性成熟，将突变的斑马鱼与野生型的斑马鱼杂交，得到一定概率的杂合子，取胚胎按上述碱裂法进行DNA提取，并用F3/R4这对引物对敲除位点进行PCR扩增后，电泳检测，并送测序确认，将有突变的斑马鱼培养长大；作为F₁。

(8)3-4个月后F₁斑马鱼性成熟，对其剪尾鉴定每条鱼的基因型，利用步骤(6)双外侧引物PCR鉴定，其结果中有条带鱼，即为杂合子(hoxaa^+/-)，没条带鱼即为野生型(WT)(图2，A)，将突变的雌雄斑马鱼进行配对，将其后代养大作为F2。

(9)3-4个月后F₂斑马鱼性成熟，将F2的鱼进行剪尾鉴定基因型，同样通过步骤(6)双外侧引物PCR鉴定，其结果中有条带的为杂合子，没有条带的可能是野生型也可能是纯合子；接着做一个单位点检测，将F3/R4引物进行PCR检测的阳性结果，用F3/R3或者F4/R4引物检测单个基因的完整性，反应体系为：

PCR反应条件为：预变性94℃3min；变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃40s进行35个循环，再72℃10min，最后保温在12℃；电泳检测，其结果中没有条带的即纯合子突变体(图2，B、C)，送公司测序验证正确(图2，D)，成功筛选到hoxaa基因簇缺失纯合突变体。

(10)将实施例制备的hoxaa的纯合突变体自交得到纯合后代，使用心脏腔室分别特异性标记的vmhc、amhc、nppa、nppb四种探针进行原位杂交，发现斑马鱼hoxaa^-/-纯合突变体相较于野生型：突变体的nppa和nppb基因在房室间隔区域异位表达，而正常野生型的nppa和nppb基因仅在心房和心室表达，不在房室间隔表达(图3)，表明hoxaa突变影响心脏房室间隔的发育。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海海洋大学

<120> hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体的制备方法和应用

<141> 2022-06-30

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gggcaatcac aaccagtgga 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gggcactttg tcaagcacc 19

<210> 3

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

taatacgact cactataggg caatcacaac cagtggagtt ttagagctag aaatagc 57

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

aaaaaaagca ccgactcggt gccac 25

<210> 5

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

taatacgact cactataggg cactttgtca agcaccgttt tagagctaga aatagc 56

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

aaaaaaagca ccgactcggt gccac 25

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

tcagcttcta caggcgaaga 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

tggcatactc ccgttcaagc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

tatcactagc gcccgaacac 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

tcacagacga ttccacgtcc 20

Claims (8)

1.hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，通过CRISPR技术构建，依次包括设计gRNA位点—PCR扩增—gRNA的模板纯化—体外转录—gRNA纯化—显微注射—检测敲除效率—饲养至成鱼—与野生型交配—检测下一代胚胎是否携带突变位点—饲养成年后剪尾鉴定出杂合突变体—两杂合体交配得到纯合突变体的步骤，具体包括以下步骤：

(1)获取斑马鱼的hoxaa基因簇序列；

(2)在斑马鱼hoxa13a基因的第一个外显子上设计如SEQ ID NO:1所示的靶点gRNA序列，在hoxa1a基因的第一个外显子上设计如SEQ ID NO:2所示的靶点gRNA序列；

(3)设计并合成hoxa13a基因的gRNA引物F1和R1以及hoxa1a基因的gRNA引物F2和R2，序列分别如SEQ ID NO:3-6所示；

(4)设计并合成hoxa13a基因的检测引物F3和R3以及hoxa1a基因的检测引物F4和R4，序列分别如SEQ ID NO:7-10所示；

(5)以gRNA骨架质粒为模板使用步骤(3)的gRNA引物进行PCR扩增反应，电泳检测PCR产物，纯化；

(6)在RNase-Free条件下将上述PCR纯化产物分别进行体外转录得到gRNA，转录体系中加入T7聚合酶和NTP，37℃反应1.5h，纯化；

(7)将步骤(6)纯化后的两种gRNA和Cas9蛋白混合后显微注射到斑马鱼单细胞期胚胎中，24h后取胚胎并提取DNA，用上述F3/R4这一对引物对敲除位点进行PCR扩增，电泳检测PCR产物，将敲除成功的小鱼饲养长大，作为F₀；

(8)待F₀斑马鱼性成熟后，与野生型的斑马鱼杂交得到一定概率的杂合子，取胚胎并提取DNA，用上述F3/R4这一对引物对敲除位点进行PCR扩增，电泳检测PCR产物并测序确认，将有突变的斑马鱼培养长大，作为F₁；

(9)待F₁斑马鱼性成熟后，将雌鱼和雄鱼的鱼尾切除进行尾鳍DNA提取，按照上述方法进行PCR扩增确认是否突变并测序确认，将有突变的雌雄斑马鱼配对，取后代鱼卵进行检测，先用上述F3/R4这一对引物进行PCR检测，阳性结果的基因组用F3/R3或者F4/R4引物检测单个基因的完整性，阴性结果即纯合子，将其后代养大，作为F₂；

(10)待F₂斑马鱼性成熟后，将F₂所有的鱼剪尾提取DNA，按上述方法检测得到hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体。

2.根据权利要求1所述hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，PCR反应条件为：预变性94℃3min；变性94℃30s，退火65℃30s，延伸72℃30s进行35个循环，再72℃10min，最后保温在12℃。

3.根据权利要求1所述hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，PCR反应条件为：预变性94℃3min；变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃40s进行35个循环，再72℃10min，最后保温在12℃。

4.根据权利要求1所述hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，hoxa13a和hoxa1a基因的gRNA终浓度均为100ng/μL，Cas9蛋白的终浓度为800ng/μL，注射量为1nL。

5.根据权利要求1所述hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，F₀斑马鱼、F₁斑马鱼和F₂斑马鱼性成熟的时间均为3-4个月。

6.hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体，通过权利要求1至5任一项所述hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体的制备方法得到。

7.根据权利要求6所述的hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体，其特征在于，所述hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体中删除的hoxaa基因簇大小为56.6kb。

8.权利要求6或7所述的hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体在构建与hoxaa基因簇缺失相关疾病的动物模型和药物筛选中的应用。

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