CN108866102B

CN108866102B - 一种Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型的构建方法

Info

Publication number: CN108866102B
Application number: CN201810635308.1A
Authority: CN
Inventors: 徐志刚; 杜海波; 王燕飞
Original assignee: Shenzhen Research Institute Of Shandong University; Shandong University
Current assignee: Shenzhen Research Institute Of Shandong University; Shandong University
Priority date: 2018-06-20
Filing date: 2018-06-20
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2038-06-20
Also published as: CN108866102A

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9技术的Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型的构建方法，步骤是(1)设计并选择合适的靶向小鼠Adgrv1基因的Guide RNA及修复模板DNA；(2)体外合成Cas9 mRNA、Guide RNA和修复模板DNA；(3)将Guide RNA、Cas9 mRNA和修复模板DNA等摩尔比共同配制成注射样品对受精卵注射；(4)对获得的F0代小鼠进行鉴定；(5)阳性F0代小鼠传代及F1代小鼠的获得与鉴定。本方法可以成功获得与人类中Y6244fsX1致病突变对应的Adgrv1基因Y6236fsX1突变小鼠模型，为研究人类中Y6244fsX1致病突变的相关因素和诊断治疗提供了基础。

Description

一种Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型的构建方法

技术领域

本发明属于利用基因修饰技术制作基因突变动物模型技术领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9技术的Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型的构建方法。

背景技术

CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Shot Palindromic repeats/CRISPR-associated)系统是原核生物中一种抵抗外源基因侵入的获得性免疫系统，在细菌和古生菌中CRISPR系统整合侵入宿主的噬菌体或者质粒DNA片段到CRISPR位点，然后通过相应的CRISPR RNAs(cr RNAs)引导Cas核酸内切酶对外源DNA序列进行切割，从而抵抗病毒或者噬菌体的入侵。CRISPR/Cas系统分为3种类型(TypeⅠ、TypeⅡ和TypeⅢ)，其中TypeⅡ系统因其简单、高效以及功能多样化等优点，自2013在哺乳动物细胞中成功实现基因编辑后，现已被广泛用于多种模式生物的基因组修饰技术应用中。Ⅱ型系统可以通过crRNA的引导利用单个Cas9核酸酶对DNA靶位点进行精确充分地切割。CRISPR/Cas9系统相关载体构建简单快速，便于操作，实验周期较短，且广泛适用于多个物种。在基因编辑的过程中，CRISPR/Cas9系统需要一段特殊的引导RNA，即sgRNA(single guide RNA)，sgRNA的序列选择限制性较小，只需要基因组序列中出现PAM(NGG)区即可。在sgRNA的引导下，Cas9蛋白可以对基因组实现定点切割，引起DNA双链断裂，继而引发细胞的自主修复，修复的过程可以是随机的片段缺失或插入，也可以利用特定的模板修复，从而实现对基因组的永久性修饰。

Usher综合征(Usher syndrome,USH)是一种能够引起视觉和听觉双重感官障碍的遗传性疾病，在目前已知的超过50种的视力下降合并听力受损的综合征中，以Usher综合征最为常见，该病的全球发病率为1/6000～1/10000。USH为常染色体隐性遗传病，其特征表现为视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)和感音神经性耳聋(sensorineuralhearing loss,SNHL)。USH在临床上分为3种类型，都存在因视网膜色素变性而引起的进行性视力下降，区别在于听力和前庭功能的变现各不相同。其中USH1型最为严重，临床表现有先天性耳聋、严重的听力损失，并因听力障碍导致的语言发育迟缓；此类患者还经常伴有前庭功能障碍，患儿学会独立行走的时间较同龄儿童晚。USH2型患者听力损失较轻，为中到重度耳聋，但前庭功能正常。USH3型以渐进性听力损失为特点，伴随不同程度的前庭功能失调。此外，部分Usher综合征患者还可能伴有智力衰退，嗅觉丧失，癫痫等神经系统病变。

ADGRV1是属于黏附受体亚家族(Adhesion receptor)的一种G蛋白偶联受体(GPCR)，是听纤毛踝连接(Ankle-link)的重要组成成分，在听纤毛形成过程中起到重要的作用。ADGRV1是目前已知最大的GPCR蛋白，其mRNA经可变剪切产生不同的蛋白亚型。人ADGRV1 Y6244fsX1突变引起USH2综合征，临床表现为先天性耳聋和渐进性色素性视网膜炎，严重影响患者日常交流与工作学习等。目前对于ADGRV1突变致聋机制尚不明确，因此也缺乏有效的治疗手段。在小鼠中模拟人ADGRV1 Y6244fsX1突变，构建Adgrv1基因Y6236fsX1突变小鼠模型，对ADGRV1突变致聋机制进行深入探讨，以及利用这一模型进行药物筛选，具有重要的临床意义。但检索发现目前虽有Adgrv1基因敲除小鼠，没有仿真模拟人相关耳聋突变的小鼠模型，因此建立一种构建Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型的方法意义重大。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于CRISPR/Cas9技术的Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型的构建方法。

本发明所述基于CRISPR/Cas9技术的Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型的构建方法，步骤是：

(1)在小鼠Adgrv1基因89号外显子上6236位点Tyrosine附近设计合适的GuideRNA；其中引物Guide RNA target site1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，引物Guide RNAtarget site2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；设计合适的修复模板DNA以产生Y6236fsX1突变；其中修复模板DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)体外合成Guide RNA、Cas9 mRNA与修复模板DNA；

(3)将合成后的Guide RNA、Cas9 mRNA与修复模板DNA等摩尔比共同配制成100ul注射样品，并将样品注射到取自C57BL/6J母鼠受精卵的雄原核中，培养恢复后移植入假孕受体小鼠，等待获得的F0代小鼠；

(4)利用PCR反应体系对获得的F0代小鼠进行鉴定；

(5)将阳性F0代小鼠与野生型C57BL/6J交配获得F1代小鼠，筛选出的阳性F1代小鼠即为Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型小鼠。

上所述基于CRISPR/Cas9技术的Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型的构建方法中：步骤(2)所述Guide RNA、Cas9 mRNA及修复模板DNA体外合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

上述基于CRISPR/Cas9技术的Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型的构建方法中：步骤(4)所述PCR反应体系的引物为GPR98-test-F3和GPR98-test-R3；其中GPR98-test-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，GPR98-test-R3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明公开的基于CRISPR/Cas9技术的Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型的构建方法能够成功获得与人类中Y6244fsX1致病突变对应的Adgrv1基因Y6236fsX1突变小鼠模型。方法中涉及的设计并挑选合适的靶向小鼠Adgrv1基因的Guide RNA，难点在于寻找6236位Tyrosine附近合适的Guide RNA靶点以实现能够模拟人类Y6244fsX1突变的效果。本发明的构建方法为获得模拟人类Adgrv1基因Y6244fsX1致病突变的小鼠模型提供了便利，为研究人类中Y6244fsX1致病突变的相关因素和诊断治疗提供了基础。

附图说明

图1、Adgrv1基因Y6236fsX1突变小鼠构建策略图及基因鉴定引物设计。

图2、F0代阳性小鼠PCR产物测序图谱比对结果。

具体实施方式

如下实施例使用的Taq酶及PCR相关试剂购自TaKaRa公司。化学试剂主要购自Sigma和上海化学试剂公司。胶回收Kit，质粒抽提Kit购于Qiagen公司。修复模板DNA和RNA合成自生工生物工程(上海)股份有限公司。引物合成自英潍捷基(上海)贸易有限公司。

实施例1：基于CRISPR/Cas9技术构建Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型的构建方法通过以下步骤实现：

(1)靶向小鼠Adgrv1基因的Guide RNA及修复模板DNA的选择和设计

设计Adgrv1基因Y6236fsX1突变小鼠构建策略，如图1所示。

根据构建策略，在Adgrv1基因相应的位置设计合适的Guide RNA，并订购相应的修复模板DNA，其中Guide RNA target site1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Guide RNAtarget site2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，修复模板DNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，具体序列如下：

(2)体外合成Guide RNA、Cas9 mRNA和修复模板DNA

Guide RNA、Cas9 mRNA和修复模板DNA由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

(3)受精卵显微注射制备F0代小鼠

1)单细胞受精卵的获得

小鼠超排：第一天，为C57BL/6J小鼠腹腔注射马绒毛膜促性腺激素5IU/只，46-48小时后注射人绒毛膜促性腺激素，注射完人绒毛膜促性腺激素后将2只雌鼠与单放雄鼠1只合笼。第四天上午检栓，见栓的记为0.5天。

获取受精卵：将见栓0.5天后的小鼠脱颈处死，取出输卵管，在解剖镜下小心取出成团的卵子并用透明质酸酶消化，挑取形态饱满且胞质均匀的胚胎放置于M16培养液中培养。

2)显微注射受精卵

将挑选后的受精卵转移入M2条带中依次排列(30-50枚左右)。提前将Guide RNA、Cas9 mRNA及修复模板DNA等摩尔比共同配制成100ul注射样品，待注射管刺入受精卵后匀速将样品注入，见到胞质松散后迅速退针。注射结束后，将受精卵移入M16培养液中，并于37℃、5％二氧化碳培养箱中恢复0.5-1小时。将注射后的受精卵移植到E0.5天假孕小鼠体内。

移植后大约19-21天生出F0代小鼠。

(4)利用PCR反应体系对获得的F0代小鼠进行鉴定

1)F₀代小鼠基因组制备

F₀代小鼠出生14天剪取鼠尾0.3cm，加400μl裂解液及40μl蛋白酶K(10mg/ml)，56℃消化过夜。离心取上清，两倍体积无水乙醇沉淀，75％乙醇洗涤，稍晾干后溶解于100μl纯水中，50℃烘箱助溶1小时。

2)F₀代小鼠基因型鉴定

以制取的F₀代小鼠基因组为模板使用TaKaRa Lataq扩增鉴定片段，引物为GPR98-test-F3和GPR98-test-R3，如图1所示，可扩增出0.8kb条带。其中，GPR98-test-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，GPR98-test-R3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

GPR98-test-F3：5′-ATCATAGCAATCTGCGTGTGACTCTGA-3′

GPR98-test-R3：5′-ACACTTTGGCAATGTTAGTTGCTTCTGA-3′

反应条件为94℃5min变性后，94℃40s，60℃30s，72℃1min，进行34个循环，72℃延伸2min，PCR体系参见TaKaRa说明书。

1％琼脂糖凝胶电泳后割胶回收0.8kb条带，分别连接pGEM-T载体(Promega)，转化，每个平板挑取6个单克隆测序鉴定，引物为GPR98-test-F3。测序结果显示有19bp碱基缺失，如图2所示。

阳性F0代小鼠在8周龄左右性成熟后和野生型C57BL/6J回交进行配繁，得到F1代小鼠。同F0代相似，待小鼠出生14天后，剪尾进行PCR鉴定，得到5只F1代杂合子。

筛选出的阳性F1代小鼠即为Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型小鼠。

序列表

<110> 山东大学

<120> 一种Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型的构建方法

<141> 2018-6-9

<160> 5

<170> PatentIn Version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 小鼠

<222>（1）…（20）

<223> Guide RNA target site1的核苷酸序列

<400> 1

ttcttctgga ggttatggcc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 小鼠

<222>（1）…（20）

<223> Guide RNA target site2的核苷酸序列

<400> 2

tcatcggcta tcagggaccc 20

<210> 3

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 小鼠

<222>（1）…（98）

<223> 修复模板DNA的核苷酸序列

<400> 3

tttgaagaca agtccccaga atggtgcctc attcccttct tctggaggtt agccgatgaa 60

gagtcccagg agtttgatga cctgatattt gcattaaa 98

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 小鼠

<222>（1）…（27）

<223> 引物GPR98-test-F3的核苷酸序列

<400> 4

atcatagcaa tctgcgtgtg actctga 27

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 小鼠

<222>（1）…（28）

<223> 引物GPR98-test-R3的核苷酸序列

<400> 5

acactttggc aatgttagtt gcttctga 28

Claims

1.一种基于CRISPR/Cas9技术的Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型的构建方法，步骤是：

(1)设计合适的Guide RNA；设计合适的修复模板DNA以产生Y6236fsX1突变；

(2)体外合成Guide RNA、Cas9 mRNA和修复模板DNA；

(3)将Guide RNA、Cas9 mRNA与修复模板DNA等摩尔比共同配制成100μl注射样品，并将样品注射到取自C57BL/6J母鼠受精卵的雄原核中，培养恢复后移植入假孕受体小鼠，等待获得的F0代小鼠；

(4)利用PCR反应体系对获得的F0代小鼠进行鉴定；

(5)将阳性F0代小鼠与野生型C57BL/6J交配获得F1代小鼠，筛选出的阳性F1代小鼠即为Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型小鼠；

其特征在于：

步骤(1)所述设计合适的Guide RNA的策略是：在小鼠Adgrv1基因89号外显子上6236位点Tyrosine附近设计Guide RNA；其中Guide RNA target site1的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，Guide RNA target site2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；设计合适的修复模板DNA的策略是：修复模板DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

步骤(4)所述PCR反应体系的引物为GPR98-test-F3和GPR98-test-R3；其中GPR98-test-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，GPR98-test-R3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。