CN113755498A - 靶向小鼠Ube3a基因的gRNA及构建AS疾病小鼠模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属分子生物学领域，具体公开了一组靶向小鼠Ube3a基因的gRNA及构建AS疾病小鼠模型的方法；本发明设计了特异性靶向Ube3a基因的2条gRNA，利用cas9蛋白将Ube3a基因的Exon6敲除，所敲区域序列为非3倍数，造成移码突变，且敲除区域包含该基因编码区的47.7%，从而达到将该基因敲除的目的，使用CRISPR/Cas9系统构建Ube3a基因敲除小鼠模型方法简单易行，周期短，拿到阳性小鼠的概率高，利用该小鼠模型可以充分研究该疾病的致病机理，并为进一步开发针对该疾病的治疗方式提供服务。
Description
技术领域
本发明属分子生物学领域，具体公开了一组靶向小鼠Ube3a基因的gRNA及构建AS疾病小鼠模型的方法。
背景技术
Angelman综合征(AS)又称天使综合征又被称之为快乐木偶综合征，是一种罕见的神经发育性遗传疾病，全球发病率约为1/15000。2018年，AS被收录于我国的《第一批罕见病目录》中。该症会导致发育障碍、神经系统障碍，有时还会导致癫痫。患者的预期寿命虽然跟常人一样，但不能治愈，目前主要的治疗手段包括使用抗癫痫药物、控制癫痫发作，对于孩子的运动和语言发育迟缓进行康复训练，这些天使综合征的患者通常无法生活自理，需要终生被照顾。
AS发病机制是由于来自母亲的第15号染色体的印迹基因Ube3a功能缺失导致的。Ube3a基因编码E3泛素蛋白连接酶，是泛素蛋白降解系统的一部分，该基因在1997年被发现与AS有关。目前已明确4种遗传机制可以导致AS，包括基因缺失、UBE3A突变、印迹中心缺陷和父源15号染色体存在单亲二体。其中缺失情况最常见，发生在母亲的Ube3a拷贝缺失，涉及染色体15q11.2-q13，占 AS病例的70％左右。其次是Ube3a突变，占病例的11％，突变导致基因表达受影响。第三是从母亲遗传的第15条染色体的印迹中心缺陷，导致基因功能异常，约占病例的6％。此外，父源15号染色体存在单亲二体(UPD)，病例有两个15 号染色体均来自父亲，由于来自父亲的UBE3A沉默或关闭，母亲的Ube3a缺失，大脑无法从Ube3a获得所需的信息，导致疾病发生。目前，虽然Ube3a基因突变对于AS的致病作用已经明确，但具体的分子机制尚需深入研究。所以，为了研究该疾病的发病机制以及开发有效的治疗方法，构建该疾病的实验模型对于疾病的研究不可或缺。目前小鼠模型是目前公认到的制备人类疾病模型及研究基因组功能最有效的疾病模型。但是还缺乏高效的建立AS疾病小鼠模型的方法。
发明内容
针对现有技术不足，本发明利用CRISPR/Cas9技术快速在小鼠体内将Ube3a 基因敲除，构建AS疾病模型。CRISPR/Cas9是一种由gRNA指导，利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术，其工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA) 通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物会引导Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA，通过人工设计crRNA和tracrRNA两种RNA，改造成具有引导作用的gRNA，从而引导Cas9蛋白对DNA的定点切割，并产生一个平末端的双链DNA缺口，进而启动DNA损伤修复机制，主要通过非同源末端连接(Non-homologous endjoining， NHEJ)或同源重组(Homologous recombination，HR)的方式将断裂上下游两端的序列连接起来。Cas9蛋白若要发挥作用需要靶位点下游的一个5’-NGG-3’基序，即PAM序列，基因特异的gRNA模板序列为位于PAM序列前，同时gRNA序列避免4个以上的T结尾，GC含量最佳为30％～70％。另外在选择gRNA时应考虑到其脱靶效应，全基因的脱靶效应需考虑脱靶位点的碱基错配数尽量不超过5个。基于以上考虑，我们共设计了2条针对Ube3a基因的gRNA，分别靶向Exon6的5’端和3’端。
本发明包括以下技术方案：
一组靶向小鼠Ube3a基因的gRNA，其特征在于，包括2条gRNA，其核酸序列分别为：
gRNA1＝SEQ ID NO 1＝5’-TGGAAGCCATTCCATCAATGAGG-3’；
gRNA2＝SEQ ID NO 2＝5’-AAATTAGCCCCTTCTGTAGTTGG-3’。
进一步，一种小鼠Ube3a基因的基因敲除试剂盒，所述试剂盒中包括上述一组靶向小鼠Ube3a基因的gRNA。
进一步的，使用上述一组靶向小鼠Ube3a基因的gRNA构建AS疾病小鼠模型的方法，所述方法包括利用gRNA1、gRNA2将小鼠Ube3a基因敲除。。
进一步的，使用上述一组靶向小鼠Ube3a基因的gRNA构建AS疾病小鼠模型的方法，所述gRNA1、gRNA2靶向切割小鼠Ube3a基因的第6个外显子的5＇端和3＇端。
进一步的，使用上述一组靶向小鼠Ube3a基因的gRNA构建AS疾病小鼠模型的方法，所述gRNA1、gRNA2将Ube3a基因包含Exon6在内的的3913bp序列切除，包含Ube3a基因整个编码区的47.7％，达到在细胞内敲除该基因的目的。
进一步的，使用上述一组靶向小鼠Ube3a基因的gRNA构建AS疾病小鼠模型的方法，包括以下步骤：
1)将Cas9 mRNA以及针对Ube3a基因合成的gRNA1和gRNA2混合后注射到培养于M2培养基中具有双核清晰的受精卵的细胞核中；
2)注射后的受精卵培养在特定的培养基中，培养至3.5天后每15-20个囊胚移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为F0小鼠；
3)仔鼠出生后5天即剪鼠尾提取DNA进行PCR扩增鉴定并送测序，若有检测结果为阳性则表示小鼠基因敲除成功。
进一步的，使用上述一组靶向小鼠Ube3a基因的gRNA构建AS疾病小鼠模型的方法，所述步骤3中的测序引物为：
PCR测序引物＝SEQ ID NO 3＝5’-GAAAGAGAAAAAAAGAGGAGAAGTGG-3’。
进一步的，使用上述一组靶向小鼠Ube3a基因的gRNA构建AS疾病小鼠模型的方法，所述步骤3中PCR鉴定中的引物包括：
PCR Primers1,具体为
F1＝SEQ ID NO 4＝5'-TTGAACTTGGCTTGCCATGCTG-3'；
R1＝SEQ ID NO 5＝5'-TAGAGGGGTTCAGTTGAAAATGATC-3'。
进一步的，使用上述一组靶向小鼠Ube3a基因的gRNA构建AS疾病小鼠模型的方法，所述步骤3中PCR鉴定中的引物还包括；
PCR Primers2，具体为
F2＝SEQ ID NO 6＝5'-CTGAAAAGCCTTAAGACTGAGC-3'；
R1＝SEQ ID NO 5＝5'-TAGAGGGGTTCAGTTGAAAATGATC-3'。
进一步的，使用上述一组靶向小鼠Ube3a基因的gRNA构建AS疾病小鼠模型的方法获得的AS疾病模型小鼠。
本发明具有以下有益效果：
本发明设计了特异性靶向Ube3a基因的2条gRNA，利用cas9蛋白将Ube3a 基因的Exon6敲除，所敲区域序列为非3倍数，造成移码突变，且敲除区域包含该基因编码区的47.7％，从而达到将该基因敲除的目的。使用CRISPR/Cas9系统构建Ube3a基因敲除小鼠模型方法简单易行，周期短，拿到阳性小鼠的概率高，利用该小鼠模型可以充分研究该疾病的致病机理，并为进一步开发针对该疾病的治疗方式提供服务。
附图说明
附图1.Ube3a基因敲除小鼠的构建方案示意图；图中，图中深色区域表示敲除区域，实心矩形代表基因的外显子，gRNA region代表gRNA的剪切区域。 F1,R1代表用于小鼠鉴定的引物结合区域,R2代表测序引物的结合区域；
附图2.Ube3a基因敲除小鼠的鉴定策略；显示了用于鉴定小鼠的PCR引物的结合位点：使用引物Primers1(F1R1)：Targeted allele:578bp，Wildtype allele:4491bp；使用引物Primers2(F2R1)Product size:509bp、Homozygotes: 578bp、Heterozygotes:578bp/509bp、Wildtype allele:509bp；
附图3.Ube3a基因敲除小鼠的鉴定结果；利用PCR引物PCR Primers1进行PCR筛选，基因敲除后的扩增产物:578bp；野生型的扩增产物:4491bp。左图为DNA分子量标记，右图为PCR的鉴定产物图；PCR反应在25μL体系中扩增35个循环，Taq DNA聚合酶使用P112-01，使用的阴性对照为：Water(不加 DNA模板)和WT(400ng小鼠基因组DNA)；
附图4.Ube3a基因敲除小鼠的基因组测序结果,箭头指示处Ube3a基因被删除3913bp。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明中所述的适量，为本领域内普通技术人员根据国家技术规范和生产实际情况所决定的用量。本发明中所述的原料如无特殊说明，均为商业购得。
实施例
1.敲除方案设计
根据需求，查找Ube3a基因详细信息，选择基因敲除的区域尽可能包括基因的功能域部分，根据实际情况选择敲除区域，我们选择Ube3a基因敲除区域 Exon6共3913bp序列，包含Ube3a基因整个编码区的47.7％，如附图1所示：
2.gRNA序列设计
根据小鼠Ube3a基因的序列，设计并合成了2条针对该基因的gRNA序列，序列信息如下：
gRNA1＝SEQ ID NO 1＝5’-TGGAAGCCATTCCATCAATGAGG-3’；
gRNA2＝SEQ ID NO 2＝5’-AAATTAGCCCCTTCTGTAGTTGG-3’。
3.Cas9/gRNA的显微注射
选取4～6周龄SPF级雌性小鼠作为卵子供体，小鼠腹腔注射PMSG(孕马血清促性腺素)，48h后注射hCG(人血绒膜促性腺素)，随即与生殖能力正常的种公鼠进行交配，采集小鼠受精卵，消化洗涤之后置于37℃培养箱中待用。
将Cas9 mRNA与实验2中人工合成的gRNA混匀后通过显微注射至小鼠受精卵细胞核中，然后移植到代孕母鼠输卵管壶腹部中，代孕鼠每隔一周进行体重称量，初步判断是否怀孕，手术后19～21天仔鼠分娩，待仔鼠5天后剪尾编号并进行PCR检测。
4.Ube3a基因敲除小鼠的PCR鉴定
根据Ube3a基因敲除区域，我们分别在Exon6的5’端以及Exon6的3’端设计一对引物PCR Primers1,具体为
F1＝SEQ ID NO 4＝5'-TTGAACTTGGCTTGCCATGCTG-3'；
R1＝SEQ ID NO 5＝5'-TAGAGGGGTTCAGTTGAAAATGATC-3'。
我们对出生的F0小鼠进行PCR引物扩增并送测序，该引物在基因敲除小鼠中扩增的产物为578bp，在野生型小鼠中不能扩增出产物，鉴定结果及测序结果如附图3和4所示。测序引物为
PCR测序引物＝SEQ ID NO 3＝5’-GAAAGAGAAAAAAAGAGGAGAAGTGG-3’
将鉴定正确的阳性小鼠与野生型小鼠交配获得F1小鼠，小鼠出生14天后进行PCR扩增鉴定小鼠纯杂合，
鉴定引物PCR Primers2，具体为
F2＝SEQ ID NO 6＝5'-CTGAAAAGCCTTAAGACTGAGC-3'；
R1＝SEQ ID NO 5＝5'-TAGAGGGGTTCAGTTGAAAATGATC-3'。
如附图2所示，纯合小鼠扩增产物为578bp，杂合小鼠扩增产物为 578bp/509bp，野生型小鼠扩增产物为509bp。
小鼠PCR鉴定部位为鼠尾，对于鼠尾鉴定选择粗裂解的方法提取DNA。
PCR反应体系如下表1：
表1PCR反应体系：
| 组分 | 体积 |
| ddH2O | 9.0uL |
| F1(10um) | 1.0uL |
| R1(10um) | 1.0uL |
| Premix Taq | 12.5uL |
| DNA | 1.5uL |
| 总共 | 25uL |
PCR反应程序如下表2所示：
表2PCR反应程序：
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如附图3所示。
以上实验1-4表明：本发明设计了特异性靶向Ube3a基因的2条gRNA，利用cas9蛋白将Ube3a基因的Exon6敲除，所敲区域序列为非3倍数，造成移码突变，且敲除区域包含该基因编码区的47.7％，从而达到将该基因敲除的目的。使用CRISPR/Cas9系统构建Ube3a基因敲除小鼠模型方法简单易行，周期短，拿到阳性小鼠的概率高，利用该小鼠模型可以充分研究该疾病的致病机理，并为进一步开发针对该疾病的治疗方式提供服务。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依本发明权利要求书及发明内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 赛业（苏州）生物科技有限公司
<120> 靶向小鼠Ube3a基因的gRNA及构建AS疾病小鼠模型的方法
<130> 2021
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<400> 1
tggaagccat tccatcaatg agg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<400> 2
aaattagccc cttctgtagt tgg 23
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<400> 3
gaaagagaaa aaaagaggag aagtgg 26
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<400> 4
ttgaacttgg cttgccatgc tg 22
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<400> 5
tagaggggtt cagttgaaaa tgatc 25
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<400> 6
ctgaaaagcc ttaagactga gc 22
Claims (10)
1.一组靶向小鼠Ube3a基因的gRNA，其特征在于，包括2条gRNA，其核酸序列分别为：
gRNA1=SEQ ID NO 1=5’- TGGAAGCCATTCCATCAATGAGG -3’；
gRNA2=SEQ ID NO 2=5’- AAATTAGCCCCTTCTGTAGTTGG -3’。
2.一种小鼠Ube3a基因的基因敲除试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如权利要求1中的一组靶向小鼠Ube3a基因的gRNA。
3.使用如权利要求1所述的一组靶向小鼠Ube3a基因的gRNA构建AS疾病小鼠模型的方法，其特征在于，所述方法包括利用gRNA1、gRNA2将小鼠Ube3a基因敲除。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述gRNA1、gRNA2靶向切割小鼠Ube3a基因的第6个外显子的5＇端和3＇端。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述gRNA1、gRNA2将Ube3a基因包含Exon6在内的的3913bp序列切除，包含Ube3a基因整个编码区的47.7%，达到在细胞内敲除该基因的目的。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将Cas9 mRNA以及针对Ube3a基因合成的gRNA1和gRNA2混合后注射到培养于M2培养基中具有双核清晰的受精卵的细胞核中；
2）注射后的受精卵培养在特定的培养基中，培养至3.5天后每15-20个囊胚移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为F0小鼠；
3）仔鼠出生后5天即剪鼠尾提取DNA进行PCR扩增鉴定并送测序，若有检测结果为阳性则表示小鼠基因敲除成功。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中的测序引物为：
PCR测序引物=SEQ ID NO 3= 5’- GAAAGAGAAAAAAAGAGGAGAAGTGG -3’。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中PCR鉴定中的引物包括：
PCR Primers1,具体为
F1=SEQ ID NO 4=5'- TTGAACTTGGCTTGCCATGCTG -3'；
R1=SEQ ID NO 5=5'- TAGAGGGGTTCAGTTGAAAATGATC -3'。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中PCR鉴定中的引物还包括；
PCR Primers2，具体为
F2=SEQ ID NO 6=5'- CTGAAAAGCCTTAAGACTGAGC -3'；
R1=SEQ ID NO 5=5'- TAGAGGGGTTCAGTTGAAAATGATC -3'。
10.如权利要求3-9任一项所述的方法构建获得的AS疾病模型小鼠。
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