CN113564204B - 细胞色素p450酶人源化大鼠模型及其构建方法和应用 - Google Patents

细胞色素p450酶人源化大鼠模型及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于药物代谢研究的CYP酶人源化大鼠动物模型的构建方法及其应用。所述构建方法包括基因型鉴定，人源基因表达鉴定，人源基因功能验证。本发明首先利用CRISPR系统进行CYP酶人源化大鼠的构建，包括基因编辑靶点的选择、sgRNA与Cas9mRNA的体外合成与转录、同源重组模板构建、假孕母鼠的制备、单细胞胚胎的体外显微注射与移植、大鼠的繁殖，最后得到纯合子CYP基因人源化大鼠。然后对纯合子人源化大鼠从蛋白水平进行CYP酶表达检测，以及进行其代谢功能验证，以证明该CYP人源化大鼠构建成功。本发明构建的CYP1A2人源化大鼠具有和人更相似的代谢特征，消除了大鼠与人之间CYP1A2介导药物代谢的种属差异，为CYP介导的药物代谢研究提供了新的大鼠动物模型。

Description

细胞色素P450酶人源化大鼠模型及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及细胞色素P450酶人源化大鼠及其构建方法和应用。
背景技术
一种新药的上市通常经过漫长的过程，一般分为研究阶段和开发阶段，主要包括靶标确立，化合物活性筛选，先导化合物的优化，临床前研究及临床研究等过程。有统计显示临床研究中40％的药物因其药动学性质不佳而被迫中止研究。因此在早期化合物筛选阶段就对化合物代谢及药代动力学性质进行评估有利于减小后期研究的投入和失败的风险，其中基于细胞色素P450酶(CYP酶)的药物筛选及其相关的代谢研究在新药研发中占有重要地位。
细胞色素P450酶是一类含血红素的细胞色素超家族蛋白酶。因其还原性状态与一氧化碳复合物在450nm处有最大吸收而得名，是至今为止发现的最重要的药物代谢酶超家族，其中涉及药物代谢的主要为CYP1，CYP2，CYP3三个亚家族。CYP酶不仅代谢大部分的药物以及外来有害物质，致癌物等，也是参与体内胆固醇及固醇类激素代谢的重要酶类，在维持人体健康方面起着重要作用。因此CYP酶在药物代谢和药代动力学研究中占有重要地位。
由于伦理学的原因，大量新药的药效学与药物代谢情况都无法在人体上直接观察，而是借助于实验动物得到的数据推算人体的情况。大鼠作为药物代谢及药代动力学研究中应用广泛的啮齿类模式动物，相对于小鼠具有很大的优势，如体型大容易操作，血量多耐受性强，可得样本量多等。但是大鼠和人之间的CYP酶具有一定种属差异，使得大鼠上的研究结果难以直接类推到人。近年来，为了克服CYP酶在亚型组成、蛋白表达、催化活性以及底物特异性上的种属差异，建立一个能更好地评估药物代谢特征的模型，科学家在构建人源化动物模型上做出了很多努力。但是目前世界上并没有成熟的CYP人源化大鼠模型构建方法，CYP人源化大鼠动物模型也未见广泛应用。
CRISPR全称为Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic RepeatsRNA，即规律成簇间隔短回文重复RNA，是最近几年才发现的原核生物的调控RNA，包括多个短的重复序列，而Cas的全称为CRISPR-associated system，即CRISPR相关系统。CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有古生菌中的一种后天免疫系统，通过小片段RNA的介导对外源核酸分子进行切割，降解，以消灭外来的质体或噬菌体。由于其对脱氧核苷酸的干扰特性，被用作基因剪辑工具。经过Cas9蛋白的切割，目的基因会形成DNA分子的双链断裂(Double-strand breaks，DBS)，DBS一旦形成，真核细胞会启动修复程序，根据供体模板的不同，主要有易错非同源末端接合(error-prone non-homologous end joining,NHEJ)或高保真同源重组(high-fidelity homologous recombination)两种修复途径。当人为提供同源重组模板时，DSB的修复可能以外源提供的同源质粒为模板进行修复，从而将外源基因整合进其基因组。CRISPR/Cas9系统介导的人源化，不仅能避开胚胎干细胞培养的瓶颈，而且能提高靶向效率，降低模型构建成本，提升动物模型构建的成功率。
发明内容
本发明运用CRISPR/Cas9系统成功构建CYP人源化大鼠模型，并基于该系列人源化大鼠，可制备一系列用于体外研究基于CYP代谢的亚组织或亚细胞成分，包括但不限于肝脏切片、肝细胞、S9片段、肝微粒体、血浆血清等。同时，可以运用CYP人源化大鼠动物模型在体内研究基于CYP的药物代谢。
为了解决药物代谢酶CYP在大鼠和人之间的种属差异，为药物代谢研究提供全新的研究模型，本发明首次运用CRISPR/Cas9系统实现了人源CYP酶在大鼠体内的定点整合，并制备得到了特定CYP人源化的大鼠肝微粒体。本发明利用CRISPR/Cas系统经过靶点选择，sgRNA合成，胚胎显微注射，大鼠饲养与繁殖等步骤成功得到了特定CYP人源化大鼠，并通过肝脏提取，匀浆，差速离心等步骤得到特定CYP人源化大鼠肝微粒体溶液，可用于药物代谢相关研究。
本发明提出了一种CYP人源化大鼠模型的构建方法，所述方法包括：
(1)确定基因编辑的敲除靶点
利用CRISPR设计工具(在线设计工具
http://tools.genome-engineering.org)，选择CRISPR/Cas系统敲除靶点，即以NGG(N代表任意碱基)为结尾的18bp DNA序列为敲除靶点。选择的靶点最好靠近ATG，但是也要留有一定的切割距离，避免离ATG太近而把启动子切掉。
大鼠CYP人源化的靶点如下：
Cyp1a2靶点：
1、CTCCTGCAGTCGTACAGATGG(SEQ ID No.1)
2、CGCCATCTGTACGACTGCAGG(SEQ ID No.2)
3、TGCCACCAGAGAACTCCCAGG(SEQ ID No.3)
4、GAGTACCTGGGAGTTCTCTGG(SEQ ID No.4)
Cyp3a4靶点：
1、GCTCTCACACTGGAAACCTGG(SEQ ID No.5)
2、TGACTGCCAGGAGGACCCAGG(SEQ ID No.6)
3、CTCTCACACTGGAAACCTGGG(SEQ ID No.7)
4、TGGAAACCTGGGTCCTCCTGG(SEQ ID No.8)
(2)体外sgRNA模板的合成与转录
体外sgRNA模板的转录由T7启动子启动。首先以体外合成的带有T7启动子序列和靶点序列的60bp寡聚核苷酸链为模板，用高保真KOD酶进行PCR反应，得到sgRNA模板。
具体地，本发明采用大鼠受精卵中共注射sgRNA、Cas9 mRNA以及同源重组质粒的方式进行人源化。首先合成一段依次包含T7启动子序列、靶点序列和sgRNA 5’端序列的60bp寡聚核苷酸序列；然后通过重叠PCR的方式合成完整的sgRNA的模板序列，总长125bp；通过T7体外转录试剂盒用高保真KOD酶对该模板序列进行体外转录。本发明合成的相应的60bp的寡聚核苷酸序列如下：
Cyp1a2 sgRNA：
sgRNA1:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGCTCCTGCAGTCGTACAGAGTTTTAGAGCTAGAAAT(SEQ ID No.9)
sgRNA2:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGCGCCATCTGTACGACTGCGTTTTAGAGCTAGAAAT(SEQ ID No.10)
sgRNA3:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGTGCCACCAGAGAACTCCCGTTTTAGAGCTAGAAAT(SEQ ID No.11)
sgRNA4:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGGAGTACCTGGGAGTTCTCGTTTTAGAGCTAGAAAT(SEQ ID No.12)
Cyp3a4 sgRNA：
sgRNA1:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGGCTCTCACACTGGAAACCGTTTTAGAGCTAGAAAT(SEQ ID No.13)
sgRNA2:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGTGACTGCCAGGAGGACCCGTTTTAGAGCTAGAAAT(SEQ ID No.14)
sgRNA3:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGCTCTCACACTGGAAACCTGTTTTAGAGCTAGAAAT(SEQ ID No.15)
sgRNA4:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGTGGAAACCTGGGTCCTCCGTTTTAGAGCTAGAAAT(SEQ ID No.16)
用酚-氯仿提取法提取上述PCR产物，用T7转录试剂盒进行转录反应，然后用酚氯仿法提取转录得到的RNA，用RNA-free水溶解RNA。同样，sP6转录试剂盒以Cas9蛋白的cDNA为模板，转录得到Cas9蛋白的mRNA，然后用酚-氯仿抽提法提取转录得到的mRNA。将抽提的sgRNA与Cas9 mRNA置于-80℃保存备用。
(3)同源重组模板构建
以CYP1A2的人源化为例。本发明的目标是在大鼠Cyp1a2基因中插入人源的CYP1A2，以构建成大鼠Cyp1a2失活，同时能稳定表达人源CYP1A2的大鼠。在构建供体基因模板时，本发明在CRISPR/Cas9系统在Cyp1a2基因上的切口两侧的基因序列各取800bp作为左右同源臂，通过重叠PCR的方法，将左同源臂序列(LHA)、CYP1A2基因CDS序列、Flag标签序列、6X His序列以及右同源臂序列(RHA)依次连接起来，即能构成大鼠CYP1A2人源化的供体质粒。为便于大鼠人源基因表达的检测，本发明在人源CYP1A2 CDS序列后面串联了Flag序列和6X His序列作为标签序列。Flag和His序列片段较小，是成熟的标签序列，不会影响证人源基因的表达和功能，同时又让外源蛋白的检测免受内源蛋白的干扰。
对于CYP1A2人源化同源重组模板构建，本发明所涉及的引物及实验条件见表一：
表一：CYP1A2人源化同源重组模板构建所涉及的引物及实验条件
对于CYP3A4人源化同源重组模板构建，本发明所涉及的引物及实验条件见表二：
表二：CYP3A4人源化同源重组模板构建所涉及的引物及实验条件
(4)sgRNA、Cas9 mRNA以及同源重组模板显微共注射
假孕母鼠的制备、单细胞胚胎的体外显微注射与移植、大鼠的繁殖。
首先对正常成年雌鼠进行超排卵处理，然后将该雌鼠与正常雄鼠合笼，使其正常交配受孕。然后将交配成功的雌鼠处死，取出受精卵，体外培养2小时。利用显微注射技术，将sgRNA、Cas9 mRNA以及同源重组模板共注射到受精卵细胞核中，其中sgRNA注射浓度为20～50ng/μL，Cas9 mRNA注射浓度为20～50ng/μL，同源重组模板的注射浓度为50～100ng/μL，其中，控制浓度比sgRAN1：sgRAN2：sgRAN3：sgRAN4＝(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)；控制浓度比总sgRNA：Cas9 mRNA：同源重组模板＝(1～2):(1～2):(1～2)。后培养数小时，通过形态观察判断受精卵的存活状态，将存活的受精卵移植入假孕雌鼠的输卵管中，让其自然着床，分裂并发育。
优选地，sgRNA注射浓度为40ng/μL，Cas9 mRNA注射浓度为40ng/μL，同源重组模板的注射浓度为80ng/μL，其中，控制浓度比sgRAN1：sgRAN2：sgRAN3：sgRAN4＝1：1：1：1；控制浓度比总sgRNA：Cas9 mRNA：同源重组模板＝1：1：2。
(5)F0代大鼠基因型鉴定及配种
待F0代幼鼠4～7天大时，剪其脚趾，提取基因组DNA，设计一对上下游引物分别落在左右同源臂上的引物对(随机引物，见表三、四)，以F0代小鼠基因组为模板，进行PCR扩增。如果能扩增出一条条带大小为WT带条大小加上外源整合基因条带大小的条带，说明该F0代子鼠中整合进了外源目的基因。否则，则说明外源基因未整合。然后鉴定整合的外源基因是否是定点整合。跨同源臂设计上下游引物对(定点引物，见表三、四)，以F0代小鼠基因组为模板，进行PCR扩增。如果能扩增出大小符合预期的特异性条带，则说明外源基因定点整合到大鼠基因组中，否则则说明外源基因没有定点整合，为随机整合。将F0代首建鼠与野生型大鼠杂交，产生F1代杂合子CYP人源化大鼠，将F1代杂合子自交，即可产生F2代纯合子CYP人源化大鼠动物模型。
对于CYP1A2人源化基因型鉴定，本发明所涉及的引物及实验条件见表三：
表三：CYP1A2人源化基因型鉴定所涉及的引物及实验条件
对于CYP3A4人源化基因型鉴定，本发明所涉及的引物及实验条件见表四：
表四：CYP3A4人源化基因型鉴定所涉及的引物及实验条件
(6)CYP人源化纯合子大鼠代谢能力评估。以CYP酶具有种属差异的底物、抑制剂、诱导剂为研究工具，评估以上物质在CYP人源化大鼠和野生型大鼠代谢或抑制诱导功能的差异，其中以人微粒体作为阳性对照。
本发明还提供了由上述构建方法得到的CYP人源化大鼠模型。
本发明还提供了所述CYP人源化大鼠模型在化合物活性筛选(药物筛选)、化合物代谢和/或药代动力学性质评估中的应用。具体地，本发明提供了所述CYP人源化大鼠模型在基于细胞色素P450酶(CYP酶)的药物筛选、药物代谢和/或药代动力学性质评估中的应用。
本发明还提供了一种sgRNA，所述sgRNA的序列如SEQ ID No.37-44所示；或，
所述125bp的sgRNA的模板序列如下：
其中，着重号(·)部分为T7启动子序列；序列N表示将被替换成靶点序列；其余部分为sgRNA骨架序列。
本发明还提供了所述sgRNA在建立CYP人源化大鼠模型中的应用。
本发明还提供了由所述方法获得的同源重组模板。
本发明还提供了所述同源重组模板在构建CYP人源化大鼠模型中的应用。
本发明还提供了由所述方法获得的大鼠CYP1A2人源化的供体质粒。
本发明还提供了所述大鼠CYP1A2人源化的供体质粒在构建CYP人源化大鼠模型中的应用。
本发明提供了一种用于药物代谢研究的CYP酶人源化大鼠动物模型的构建方法及其应用。所述构建方法包括基因型鉴定，人源基因表达鉴定，人源基因功能验证。本发明首先利用CRISPR/Cas9系统进行CYP酶人源化大鼠的构建，包括编辑靶点的选择、sgRNA与Cas9mRNA的体外合成与转录、同源重组模板构建、假孕母鼠的制备、单细胞胚胎的体外显微注射与移植、大鼠的繁殖，最后得到纯合子CYP基因人源化大鼠。然后对纯合子人源化大鼠从蛋白水平进行CYP酶表达检测，以及进行其代谢功能验证，以证明该CYP人源化大鼠构建成功。
本发明的有益效果在于，1、消除了大鼠与人之间CYP介导药物代谢的种属差异；2、为基于CYP的药物代谢研究提供了新的大鼠动物模型。
附图说明
图1同源重组质粒示意图(以CYP1A2为例)。
A、同源重组模板示意图。B、同源重组模板在pEASY-Blunt载体中的结构示意图。e，外显子；LHA，左同源臂；hCYP1A2，人源CYP1A2 CDS序列；Flag，Flag标签序列；His，6x组氨酸序列；RHA，右同源臂。
图2 CYP1A2人源化大鼠基因型鉴定结果。
CYP1A2人源化F0代大鼠共出生10只，编号从左到右为1-10#。经琼脂糖凝胶电泳鉴定，F0-3#为整合有人源CYP1A2基因的子代。
CYP1A2人源化F1代大鼠共出生20只，编号从左到右为1-20#。经琼脂糖凝胶电泳鉴定，F1-1#、2#、7#、8#、17#、20#为整合有人源CYP1A2基因的杂合子代。
CYP1A2人源化F2代大鼠共出生15只，编号从左到右为1-15#。经琼脂糖凝胶电泳鉴定，F2-12#、13为整合有人源CYP1A2基因的纯合子代。
图2中，KI表示整合后的条带(3260bp)，WT表示野生型条带(2228bp)，H2O表示水作为空白对照样品。
图3 CYP3A4人源化大鼠基因型鉴定结果。
CYP3A4人源化F0代大鼠共出生9只，编号从左到右为1-9#。经琼脂糖凝胶电泳鉴定，F0-5#、9#为整合有人源CYP3A4基因的子代。KI表示整合后的条带(2110bp)，WT表示野生型条带，H2O表示水的空白对照样品。
CYP3A4人源化F1代大鼠共出生16只，编号从左到右为1-16#。经琼脂糖凝胶电泳鉴定，F1-3#、5#、6#、7#、8#、13#、16#为整合有人源CYP3A4基因的杂合子代。KI表示整合后的条带(3786bp)，WT表示野生型条带，H2O表示水作为空白对照样品。
CYP3A4人源化F2代大鼠共出18只，编号从左到右为1-18#。经琼脂糖凝胶电泳鉴定，F2-6#、9#为整合有人源CYP3A4基因的纯合子代。KI表示整合后的条带(3786bp)，WT表示野生型条带，H2O表示水作为空白对照样品。
图4 CYP1A2人源化大鼠中人源CYP1A2基因的表达。
本发明提取了CYP1A2人源化大鼠和野生型大鼠的肝脏蛋白，并用Western blot分析检测了两组大鼠肝脏中人源CYP1A2蛋白的表达情况。因市面上的抗体不能区分人源CYP1A2和鼠源CYP1A2，故本发明在人源CYP1A2蛋白C端融合表达了6x His序列作为标签序列。本发明检测6x His序列的表达以显示人源CYP1A2的蛋白表达情况。Western blot分析显示，人源CYP1A2蛋白在人源化大鼠肝脏中表达明显，而在野生型大鼠中未见表达。WT，野生型大鼠；KI，人源化大鼠。
图5呋喃茶碱选择性抑制人源CYP1A2酶活性。
呋喃茶碱对人源化CYP1A2肝微粒体和人肝微粒体(HLM)中非那西汀的代谢产生明显抑制，其抑制IC50分别是36.0μM和6.8μM，而对野生型大鼠肝微粒体中非那西汀的代谢不产生抑制作用。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1靶点设计
通过网站http://www.ensembl.org/index.html查看目的基因基因序列和剪接异构体。选择以NGG(N代表任意碱基)结尾的基因序列作为靶点，如果一个基因有多个剪接异构体，则选择几个异构体共有的表达外显子。如果第一个表达外显子过小(只有几十个bp)，则可以在下一个表达外显子上寻找靶点。CRISPR/Cas9基因敲除系统能识别基因组中与其引导RNA相对应的以NGG结尾的DNA序列，所以本发明选定的靶点是大鼠目的基因中，NGG序列5’端的一段18bp的核苷酸序列；因为CRISPR/Cas9系统进行基因敲除利用的是：DNA在非同源重组修复中的突变碱基的引入，从而引起突变位点后3’端序列的移码突变，因此，选择的靶点最好靠近ATG，但是也要留有一定的切割距离，避免离ATG太近而把启动密码子切掉。为增加靶向的效率，本发明针对每个基因设计4个靶位点。
对于CYP1A2的靶点，本发明中切割效率大于50％(5/10，由于未做切割情况检测，F0-4#、5#、6#、7#、10#无法判断是否发生切割，因此10只F0中至少有5只发生了切割)，整合效率为10％(1/10)。
对于CYP3A4的靶点，本发明中切割效率大于22％(2/9，由于未做切割情况检测，F0-1#、2#、3#、4#、6#、7#、8#无法判断是否发生切割，因此9只F0中至少有2只发生了切割)，整合效率为22％(2/9)。
综上，本发明设计的大鼠CYP人源化的靶点如下：
Cyp1a2靶点：
1、CTCCTGCAGTCGTACAGATGG
2、CGCCATCTGTACGACTGCAGG
3、TGCCACCAGAGAACTCCCAGG
4、GAGTACCTGGGAGTTCTCTGG
Cyp3a4靶点：
1、GCTCTCACACTGGAAACCTGG
2、TGACTGCCAGGAGGACCCAGG
3、CTCTCACACTGGAAACCTGGG
4、TGGAAACCTGGGTCCTCCTGG
实施例2 sgRNA模板的合成与转录
本发明采用大鼠受精卵中共注射sgRNA、Cas9 mRNA以及同源重组质粒的方式进行人源化。首先合成一段依次包含T7启动子序列、靶点序列和sgRNA5’端序列的60bp寡聚核苷酸序列；然后通过重叠PCR的方式合成完整的sgRNA的模板序列，总长125bp；通过T7体外转录试剂盒对该模板序列进行体外转录；经酚氯仿抽提后得到纯化的靶点sgRNA共转录产物。本发明合成的相应的60bp的寡聚核苷酸序列如下：
sgRNA完整序列如下：
着重号(·)部分为T7启动子序列；序列N表示将被替换成靶点序列；其余部分为sgRNA骨架序列。
具体地，sgRNA完整序列如下：
Cyp1a2 sgRNA：
sgRNA1:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGCTCCTGCAGTCGTACAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT(SEQ ID No.37)
sgRNA2:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGCGCCATCTGTACGACTGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT(SEQ ID No.38)
sgRNA3:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGTGCCACCAGAGAACTCCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT(SEQ ID No.39)
sgRNA4:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGGAGTACCTGGGAGTTCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT(SEQ ID No.40)
Cyp3a4 sgRNA：
sgRNA1:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGGCTCTCACACTGGAAACCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT(SEQ ID No.41)
sgRNA2:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGTGACTGCCAGGAGGACCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT(SEQ ID No.42)
sgRNA3:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGCTCTCACACTGGAAACCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT(SEQ ID No.43)
sgRNA4:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGTGGAAACCTGGGTCCTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT(SEQ ID No.44)
Cyp1a2 sgRNA：
sgRNA1:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGCTCCTGCAGTCGTACAGAGTTTTAGAGCTAGAAAT
sgRNA2:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGCGCCATCTGTACGACTGCGTTTTAGAGCTAGAAAT
sgRNA3:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGTGCCACCAGAGAACTCCCGTTTTAGAGCTAGAAAT
sgRNA4:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGGAGTACCTGGGAGTTCTCGTTTTAGAGCTAGAAAT
Cyp3a4 sgRNA：
sgRNA1:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGGCTCTCACACTGGAAACCGTTTTAGAGCTAGAAAT
sgRNA2:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGTGACTGCCAGGAGGACCCGTTTTAGAGCTAGAAAT
sgRNA3:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGCTCTCACACTGGAAACCTGTTTTAGAGCTAGAAAT
sgRNA4:
GATCACTAATACGACTCACTATAGGTGGAAACCTGGGTCCTCCGTTTTAGAGCTAGAAAT
其中划横线部分即为实施例1中设计的敲除靶点序列(不含NGG)。
实施例3同源重组质粒构建
以CYP1A2的人源化为例。本实施例的目的是在大鼠Cyp1a2基因中插入人源的CYP1A2，以构建成大鼠Cyp1a2失活，同时能稳定表达人源CYP1A2的大鼠。在构建供体基因模板时，本发明在CRISPR/Cas9系统在Cyp1a2基因上的切口两侧的基因序列各取800bp作为左右同源臂，通过重叠PCR的方法，将左同源臂序列(LHA)、CYP1A2基因CDS序列、Flag标签序列、6X His序列以及右同源臂序列(RHA)依次连接起来，即能构成大鼠CYP1A2人源化的供体质粒。同源重组质粒示意图如图1所示(以CYP1A2为例)：
CYP3A4人源化同源重组质粒构建过程与方法与CYP1A2相似。
实施例4 CYP人源化大鼠基因型鉴定
在F0代小鼠出生4-7天内，剪取其脚趾，提取基因组DNA，并对其进行基因型鉴定。
(1)设计一对上下游引物分别落在左右同源臂上的引物对(随机引物，见表三、四)，以F0代小鼠基因组为模板，进行PCR扩增。如果能扩增出一条条带大小为WT条带大小加上外源整合基因条带大小的条带，说明该F0代子鼠中整合进了外源目的基因。否则，则说明外源基因未整合。然后鉴定整合的外源基因是否是定点整合。
(2)跨同源臂设计上下游引物对(定点引物，见表三、四)，以F0代小鼠基因组为模板，进行PCR扩增。如果能扩增出大小符合预期的特异性条带，则说明外源基因定点整合到大鼠基因组中，否则则说明外源基因没有定点整合，为随机整合。
对于F1代以后的子鼠，可以直接采用上述鉴定中第(1)步所使用的引物进行鉴定，如能扩增出特异的增大条带即说明外源基因定点整合。
以CYP1A2人源化大鼠构建为例：
CYP1A2人源化F0代大鼠共出生10只，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，F0-3#为整合有人源CYP1A2基因的子代。CYP1A2人源化F1代大鼠共出生20只，F1-1#、2#、7#、8#、17#、20#为整合有人源CYP1A2基因的杂合子代。CYP1A2人源化F2代大鼠共出生15只，F2-12#、13为整合有人源CYP1A2基因的纯合子代。该数据在基因层面证明CYP1A2人源化大鼠构建的成功。
以CYP3A4人源化大鼠构建为例CYP3A4人源化F0代大鼠共出生9只，F0-5#、9#为整合有人源CYP3A4基因的子代。CYP3A4人源化F1代大鼠共出生16只，F1-3#、5#、6#、7#、8#、13#、16#为整合有人源CYP3A4基因的杂合子代。CYP3A4人源化F2代大鼠共出18只，F2-6#、9#为整合有人源CYP3A4基因的纯合子代。该数据在基因层面证明CYP3A4人源化大鼠构建的成功。
CYP1A2和CYP3A4是CYP家族的不同亚型。以上两个亚型均为人体中参与药物代谢的主要亚型。CYP1A2为例，其属于CYP1家族，CYP1A亚家族中的CYP1A2亚型。同理，CYP3A4属于CYP3家族，CYP3A亚家族中的CYP3A4亚型。CYP1A2参与到约4％临床的药物的代谢，CYP3A4参与约50％临床药物的代谢。
实施例5 CYP人源化大鼠蛋白表达检测
取CYP人源化大鼠和野生型大鼠各三只，颈部脱臼处死，迅速打开腹腔，取出肝脏，置于PBS缓冲液中。用剪刀小心从其中一叶肝脏中剪下一小块，剪碎，加适量细胞裂解液RIPA(含PMSF和蛋白酶抑制剂)匀浆破碎，然后12000rpm离心10分钟，将上清转移至新的离心管中，用BCA法测定上清蛋白浓度。按测得的蛋白浓度，取适量上清液，加适量蛋白上样缓冲液，100℃处理10分钟，12000rpm离心5分钟。配10％蛋白分离胶，Western blot实验检测分析野生型和人源化大鼠肝脏中特定CYP蛋白的表达差异，每孔上样总蛋白30-50微克。以CYP1A2人源化为例，本发明的Western blot分析显示，人源CYP1A2蛋白在人源化大鼠肝脏中表达明显，而在野生型大鼠中未见表达。该数据说明，人源CYP1A2基因在人源化大鼠中正常表达，在蛋白表达层面证明了CYP1A2人源化大鼠构建的成功。
实施例6 CYP人源化大鼠功能体外检测
CYP酶代谢的底物、受抑制或诱导的程度具有一定的种属差异。本发明在体外体内对CYP人源化大鼠代谢相关表型进行分析和比较。以CYP1A2人源化大鼠为例，据报道呋喃茶碱能抑制人源CYP1A2的代谢活性，不能抑制鼠源CYP1A2代谢活性。为进一步验证人源化大鼠中表达的CYP1A2是否具有与人CYP1A2相同的功能，本发明以非那西汀作为探针底物，检测呋喃茶碱对非那西汀在人源化CYP1A2大鼠(hCYP1A2)和野生型大鼠肝微粒体(RLM)中的抑制效果。本发明以非那西汀(5μM)为探针底物，在CYP1A2人源化肝微粒体、人肝微粒体以及野生型大鼠肝微粒体中给以不同浓度(0μM～1000μM)的抑制剂呋喃茶碱与探针底物共孵育，孵育条件为37℃，20分钟。通过检测孵育后反应体系中的代谢产物生成量，计算出不同抑制剂浓度下的反应速率。对不同抑制剂浓度与对应的反应速率按米氏方程拟合，得出呋喃茶碱在CYP1A2人源化肝微粒体、人肝微粒体以及野生型大鼠肝微粒体中对非那西汀代谢抑制的IC50。
通过分析，本发明发现，呋喃茶碱对人源化CYP1A2肝微粒体和人肝微粒体(HLM)中非那西汀的代谢产生明显抑制，其抑制IC50分别是36.0μM和6.8μM，而对野生型大鼠肝微粒体中非那西汀的代谢不产生抑制作用。该数据说明CYP1A2人源化大鼠具有和人更相似的代谢特征，在蛋白功能的层面证明了模型构建的成功。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学
<120> 细胞色素P450酶人源化大鼠模型及其构建方法和应用
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tccttgaccc ctcagact 18
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agggagtgac aatggagc 18
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gatcactaat acgactcact ataggctcct gcagtcgtac agagttttag agctagaaat 60
agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120
ttttt 125
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gatcactaat acgactcact ataggcgcca tctgtacgac tgcgttttag agctagaaat 60
agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120
ttttt 125
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gatcactaat acgactcact ataggtgcca ccagagaact cccgttttag agctagaaat 60
agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120
ttttt 125
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gatcactaat acgactcact atagggagta cctgggagtt ctcgttttag agctagaaat 60
agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120
tttt 124
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gatcactaat acgactcact atagggctct cacactggaa accgttttag agctagaaat 60
agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120
ttttt 125
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gatcactaat acgactcact ataggtgact gccaggagga cccgttttag agctagaaat 60
agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120
ttttt 125
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gatcactaat acgactcact ataggctctc acactggaaa cctgttttag agctagaaat 60
agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120
ttttt 125
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gatcactaat acgactcact ataggtggaa acctgggtcc tccgttttag agctagaaat 60
agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120
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gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgctttt tt 82

Claims (9)

1.一种CYP人源化大鼠模型的构建方法，所述方法包括：
(1)确定大鼠CYP人源化敲除靶点
利用CRISPR设计工具，选择CRISPR/Cas9系统敲除靶点，即以NGG为结尾的18bp DNA序列为敲除靶点；其中，N代表任意碱基；
对于大鼠Cyp1a2人源化敲除靶点序列如SEQ ID No.1～4所示；
(2)体外sgRNA模板的合成与转录
体外sgRNA模板的转录由T7启动子启动；
首先以体外合成的带有T7启动子序列和靶点序列的60bp寡聚核苷酸链为模板，用高保真KOD酶进行PCR反应，得到sgRNA模板；
所述体外sgRNA模板的合成与转录具体包括：首先合成一段依次包含T7启动子序列、靶点序列和sgRNA 5’端序列的60bp寡聚核苷酸序列；然后通过重叠PCR的方式合成完整的sgRNA的模板序列，总长125bp；通过T7体外转录试剂盒用高保真KOD酶对该模板序列进行体外转录，得到sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4；
其中，所述60bp寡聚核苷酸序列如SEQ ID No.9～12所示；所述125bp的sgRNA的模板序列如SEQ ID No.37～40所示；
(3)同源重组模板构建
对于CYP1A2人源化；
在大鼠Cyp1a2基因中插入人源的CYP1A2，以构建成大鼠Cyp1a2失活，同时能稳定表达人源CYP1A2的大鼠；在构建供体基因模板时，在CRISPR/Cas9系统在Cyp1a2基因上的切口两侧的基因序列各取800bp作为左右同源臂，通过重叠PCR的方法，将左同源臂序列LHA、CYP1A2基因CDS序列、Flag标签序列、6X His序列以及右同源臂序列RHA依次连接起来，即能构成大鼠CYP1A2人源化的供体质粒；
对于CYP1A2人源化同源重组模板构建，其中所涉及的引物及实验条件见表一；
表一：CYP1A2人源化同源重组模板构建所涉及的引物及实验条件
；
(4)sgRNA、Cas9 mRNA以及同源重组模板显微共注射
首先对正常成年雌鼠进行超排卵处理，然后将该雌鼠与正常雄鼠合笼，使其正常交配受孕；然后将交配成功的雌鼠处死，取出受精卵，体外培养；利用显微注射技术，将sgRNA、Cas9 mRNA以及同源重组模板共注射到受精卵细胞核中，然后培养数小时，通过形态观察判断受精卵的存活状态，将存活的受精卵移植入假孕雌鼠的输卵管中，让其自然着床，分裂并发育；
(5)F0代大鼠基因型鉴定及配种
待F0代幼鼠4～7天大时，提取基因组DNA，设计一对上下游引物分别落在左右同源臂上的引物对，以F0代大鼠基因组为模板，进行PCR扩增；如果能扩增出一条条带大小为WT条带大小加上外源整合基因条带大小的条带，说明该F0代子鼠中整合进了外源目的基因；否则，则说明外源基因未整合；然后鉴定整合的外源基因是否是定点整合；跨同源臂设计上下游引物对，以F0代大鼠基因组为模板，进行PCR扩增；如果能扩增出大小符合预期的特异性条带，则说明外源基因定点整合到大鼠基因组中，否则说明外源基因没有定点整合，为随机整合；将F0代首建鼠与野生型大鼠杂交，产生F1代杂合子CYP人源化大鼠，将F1代杂合子自交，即可产生F2代纯合子CYP人源化大鼠动物模型。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，用酚-氯仿提取法提取所述PCR产物，用T7转录试剂盒进行转录反应，然后用酚氯仿法提取转录得到的RNA，用RNA-free水溶解RNA；同样，用sP6转录试剂盒以Cas9蛋白的cDNA为模板，转录得到Cas9蛋白的mRNA，然后用酚-氯仿抽提法提取转录得到的mRNA；将抽提的sgRNA与Cas9 mRNA置于-80℃保存备用。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述sgRNA注射浓度为20～50ng/μL，Cas9 mRNA注射浓度为20～50ng/μL，同源重组模板的注射浓度为50～100ng/μL，其中，控制浓度比sgRNA1：sgRNA2：sgRNA3：sgRNA4＝(1～2)：(1～2)：(1～2)：(1～2)；控制浓度比总sgRNA：Cas9 mRNA：同源重组模板＝(1～2)：(1～2)：(1～2)。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述sgRNA注射浓度为40ng/μL，Cas9 mRNA注射浓度为40ng/μL，同源重组模板的注射浓度为80ng/μL，其中，控制浓度比sgRNA1：sgRNA2：sgRNA3：sgRNA4＝1：1：1：1；控制浓度比总sgRNA：Cas9 mRNA：同源重组模板＝1：1：2。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，对于CYP1A2人源化基因型鉴定，其中所涉及的引物及实验条件见表三；
表三：CYP1A2人源化基因型鉴定所涉及的引物及实验条件
。
6.如权利要求1～5之任一项所述方法构建得到的CYP人源化大鼠模型在化合物活性筛选和/或化合物代谢性质评估中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述化合物代谢性质评估为药代动力学性质评估。
8.如权利要求1～5之任一项所述方法构建得到的CYP人源化大鼠模型在基于细胞色素P450酶的药物筛选和/或药物代谢性质评估中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物代谢性质评估为药代动力学性质评估。
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