CN106148416B

CN106148416B - Cyp基因敲除大鼠的培育方法及其肝微粒体的制备方法

Info

Publication number: CN106148416B
Application number: CN201510131768.7A
Authority: CN
Inventors: 王昕�; 刘明耀; 李大力; 汤玉; 鲁健; 李咏梅
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2015-03-24
Filing date: 2015-03-24
Publication date: 2019-12-17
Anticipated expiration: 2035-03-24
Also published as: CN106148416A

Abstract

本发明提出一种Cyp基因敲除大鼠的培育方法及其肝微粒体的制备方法，所述Cyp基因敲除包括Cyp单基因敲除、Cyp多基因敲除。本发明方法中，首先利用CRISPR/Cas系统进行Cyp基因敲除大鼠的构建，包括敲除靶点的选择、sgRNA与Cas9mRNA的体外合成与转录、假孕母鼠的准备、单细胞胚胎的体外显微注射与移植、大鼠繁殖，最后得到纯合子Cyp基因敲除大鼠。进一步，提取所述Cyp基因敲除大鼠肝脏，经匀浆、差速离心，得到Cyp基因缺失大鼠肝微粒体。本发明还提出了Cyp基因敲除大鼠及其肝微粒体在药物代谢研究中的应用。

Description

Cyp基因敲除大鼠的培育方法及其肝微粒体的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种药物代谢细胞色素P450(CYP)酶缺失大鼠，即Cyp基因敲除大鼠的培育方法及其肝微粒体的制备方法。

背景技术

一种新药的上市通常经过漫长的过程，一般分为研究阶段和开发阶段，主要包括靶标确立，化合物活性筛选，先导化合物的优化，临床前研究及临床研究等过程。有统计显示临床研究中40％的药物因其药动学性质不佳而被迫终止研究。因此在早期化合物筛选阶段就对化合物代谢及药代动力学性质进行评估有利于减小后期研究的投入和失败的风险，其中基于细胞色素P450酶的药物筛选及其相关的代谢研究在新药研发中占有重要地位。

细胞色素P450酶(CYP酶)是一类含血红素的细胞色素超家族蛋白酶。因其还原性状态与一氧化碳复合物在450nm处有最大吸收而得名，是至今为止发现的最重要的药物代谢酶超家族，其中涉及药物代谢的主要为CYP1，CYP2，CYP3三个家族。CYP酶不仅代谢大部分的药物以及外来有害物质，致癌物等，也是参与体内胆固醇及固醇类激素代谢的重要酶类，在维持人体健康方面起着重要作用。因此CYP酶在药物代谢和药代动力学研究中占有重要地位。

由于伦理学的原因，大量新药的药效学与药物代谢情况都无法在人体上直接观察，而是借助于实验动物得到的数据推算人体的情况。而从上世纪90年代开始，利用基因敲除技术得到的Cyp基因敲除小鼠模型如Cyp1a2(1997),Cyp2e1(1996),Cyp2c9(2012),Cyp3a4(2007),Cyp2d6(2012)已构建成功并有部分应用，如观察药物在特定Cyp基因敲除条件下的代谢情况。但是大鼠作为药物代谢及药代动力学研究中应用广泛的啮齿类模式动物，相对于小鼠具有很大的优势，如体型大容易操作，血量多耐受性强，可得样本量多等。但是目前世界上并没有相应的基因敲除大鼠模型可用。

已有Cyp基因敲除小鼠模型的构建都是通过传统的基因敲除技术，即利用同源重组原理，将外源DNA片段与宿主基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而替代受体细胞基因组中的相应基因序列，整合入宿主细胞基因组中，从而达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的，该方法的关键技术是胚胎干细胞的获得、靶点设计、胚胎干细胞的筛选等。但是利用这种方法进行动物体内基因的敲除费时费力，花费较高，且敲除效率很低，还可能会发生不利突变等。而对于大鼠而言，由于胚胎干细胞难获得、难培养，因此基因敲除大鼠模型的构建与应用一直落后于小鼠模型。虽然技术的创新解决了大鼠模型构建的难题，但是到目前为止，世界上依然没有可用于药物代谢方面研究的Cyp基因敲除大鼠模型。

因此，本发明中首次将CRISPR/Cas系统用于构建Cyp基因敲除大鼠模型，然后再制备相应的CYP酶缺失的大鼠肝微粒体。CRISPR全称为Cluster Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats，即规律成簇间隔短回文重复，是细菌的天然免疫系统的组成部分，包括多个短的重复序列，而Cas的全称为CRISPR-associated system，即CRISPR相关系统。CRISPR/Cas系统参与到大多数细菌与所有古生菌的天然免疫活动中，通过小片段RNA的介导对外源核酸分子进行切割，降解，以消灭外来的质粒或噬菌体。由于其对脱氧核苷酸的干扰特性，被用作基因剪辑工具。到目前为止科学家已经发现了三种CRISPR/Cas系统存在，其中TypeⅡ系统主要分布于细菌中，该系统组分简单，核心蛋白原件为Cas9蛋白，Cas9蛋白与成熟的crRNA结合形成复合物即可对外源的核酸分子进行识别和切割，也是现在细胞和动物基因敲除研究中最常用的方法。经过Cas9蛋白的切割，目的基因会形成DNA分子的双链断裂(Double-strand breaks，DBS)，DBS一旦形成，真核细胞会启动修复程序，修复程序主要包括，易错非同源末端接合(error-prone non-homologous end joining,NHEJ)或高保真同源重组(high-fidelity homologous recombination)。当DBS通过NHEJ方式修复，切割位点可能会发生缺失(deletions)、替换(substitutions)或插入(insertions，indels)突变。本发明中就是利用NHEJ修复方式，使大鼠体内某一特定Cyp基因序列形成移码突变，从而使得无法正确转录，翻译，折叠形成完整有活性的蛋白质，这样就达到了在大鼠体内敲除某一Cyp基因的目的。

由于Cyp基因敲除大鼠模型涉及到大鼠的繁殖与养殖，等待大鼠成长花费时间较多，且每一窝出生的大鼠数目与基因型都不固定，所以利用该大鼠模型进行体内药物代谢研究时经常受到时间，大鼠数目以及大鼠年龄等的限制。考虑到上述体内实验的局限性，本发明将得到的Cyp基因敲除的成年大鼠处死，将肝脏取出，通过匀浆，差速离心等步骤分离提取出肝脏微粒体，即包含除该种CYP酶以外的药物代谢相关酶系的混悬液。将得到的微粒体溶液分装，置于-80℃冰箱中可长期保存(例如1年)，且催化活性稳定，完全可以满足体外药物代谢研究，大规模药物筛选的需求。

在药物代谢研究中，药物代谢途径的确定通常是通过化学抑制剂，抗体及纯酶确定产物的数量的变化来判断。这种筛选方法工作量浩大，且如果药物的代谢通路较多，就无法做出准确判断。另外，有研究表明，由于种属差异，大鼠CYP酶可能在表达，活性等方面都与人有一定差异，造成了化学抑制剂和抑制性抗体的选择性和特异性大大降低。因此上述研究中所选用的化学抑制剂对大鼠和人的抑制效果不尽相同，最后在大鼠体内得到的结果并不能很好的预测在人体内的情况。而Cyp基因敲除大鼠为某一CYP酶亚型完全失活，用此模型确定某一药物是否为该酶所代谢较之前更为简单，直接，准确。

发明内容

为了弥补CYP酶相关体外体内研究模型建立与应用中的缺陷，为药物代谢研究提供全新的研究模型，本发明在世界上首次实现了大鼠体内特定Cyp基因的敲除，并制备得到了特定CYP酶亚型缺失的大鼠肝微粒体。本发明利用CRISPR/Cas系统经过靶点选择，guideRNA合成，胚胎显微注射，大鼠饲养与繁殖等步骤成功得到了特定Cyp基因敲除大鼠，并通过肝脏提取，匀浆，差速离心等步骤得到特定CYP酶缺失的大鼠肝微粒体溶液，可用于药物代谢等方面的研究。

本发明提出了一种Cyp基因敲除大鼠的培育方法，其包括以下步骤：

1)利用CRISPR/Cas系统选择敲除靶点；

所述靶点包括：

如SEQ ID NO.1所示的Cyp2e1基因敲除靶点，AAGCAGATCTATAACAGT；或，如SEQ IDNO.2所示的Cyp3a1基因敲除靶点，CAAGAAACAGGGGATTCC；或，如SEQ ID NO.3所示的Cyp3a2基因敲除靶点，TAAGAAACAAGGAATTCC；

2)体外sgRNA模板的合成与转录；

所述sgRNA模板包含T7启动子序列和18bp靶点sgRNA序列，分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；

3)胚胎显微注射；

将sgRNA与Cas9mRNA共注射到受精卵胞浆中；

4)培育靶点敲除大鼠；

将由sgRNA与Cas9mRNA共注射的受精卵发育形成的F0代大鼠与野生型大鼠交配，得到F1代大鼠；再经F1代大鼠杂合子相互交配，得到纯合子突变型大鼠即所述靶点敲除大鼠。

所述方法中，Cyp基因敲除包括一个或多个Cyp基因的敲除；所述Cyp基因敲除大鼠包括Cyp单基因敲除大鼠、Cyp多基因敲除大鼠。

所述方法中，所述sgRNA注射浓度为20-40ng/μl；所述Cas9mRNA注射浓度为40-80ng/μl。优选地，所述sgRNA注射浓度为25ng/μl，所述Cas9mRNA注射浓度为50ng/μl。

本发明还提出了一种CYP酶缺失的大鼠肝微粒体的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)利用CRISPR/Cas系统选择敲除靶点；

所述靶点包括：

2)体外sgRNA模板的合成与转录；

3)胚胎显微注射；

将sgRNA与Cas9mRNA共注射到受精卵胞浆中；

4)培育靶点敲除大鼠；

将由sgRNA与Cas9mRNA共注射的受精卵发育形成的F0代大鼠与野生型大鼠交配，得到F1代大鼠；再经F1代大鼠杂合子相互交配，得到纯合子突变型大鼠，即所述靶点敲除大鼠；

5)提取所述靶点敲除大鼠的肝脏，经匀浆、差速离心，得CYP酶缺失大鼠肝微粒体。

所述方法中，Cyp基因敲除包括一个或多个Cyp基因的敲除；所述Cyp基因缺失大鼠肝微粒体包括单Cyp单基因缺失大鼠肝微粒体、Cyp多基因缺失大鼠肝微粒体。所述Cyp基因缺失大鼠肝微粒体是从Cy p单基因或多基因敲除大鼠中得到的。

所述方法中，所述sgRNA注射浓度为20-40ng/μl；优选地，所述sgRNA注射浓度为25ng/μl。所述Cas9mRNA注射浓度为40-80ng/μl；优选地，所述Cas9mRNA注射浓度为50ng/μl。

在具体实施方案中，Cyp基因敲除大鼠的培育方法如以下步骤1)～4)。CYP酶缺失大鼠肝微粒体的制备方法如以下步骤1)～5)。所述方法包括：

1)利用CRISPR设计工具(在线设计工具http://tools.genome-engineering.org)，选择CRISPR/Cas系统敲除靶点，即以NGG为结尾的18bp DNA序列。

2)体外sgRNA模板的合成与转录。体外sgRNA模板的转录由T7启动子启动。首先以体外合成的带有T7启动子序列和靶点序列的60bp寡聚核苷酸链为模板，用高保真KOD酶进行PCR反应，得到sgRNA模板。

用酚-氯仿提取法提取上述PCR产物，用T7转录试剂盒进行转录反应，然后用酚氯仿法提取转录得到的RNA，用RNA-free水溶解RNA。同样，用SP6转录试剂盒以Cas9蛋白的cDNA为模板，转录得到Cas9蛋白的mRNA，然后用酚-氯仿抽提法提取转录得到的mRNA。将抽提的sgRNA与Cas9mRNA置于-80℃保存备用。

3)sgRNA与Cas9mRNA显微共注射。首先对正常成年雌鼠进行超排卵处理，然后将该雌鼠与正常雄鼠合笼，使其正常交配受孕。然后将交配成功的雌鼠处死，取出受精卵，体外培养2小时。利用显微注射技术，将sgRNA与Cas9mRNA共注射到受精卵胞浆中，其中sgRNA注射浓度为25ng/μl，Cas9mRNA注射浓度为50ng/μl。后培养数小时，通过形态观察判断受精卵的存活状态，将存活的受精卵移植入假孕雌鼠的输卵管中，让其自然着床，分裂并发育。

4)F0代大鼠基因型鉴定及配种。待F0代幼鼠一周大时，剪其脚趾，提取基因组DNA，设计靶点上下游引物进行PCR反应，并比对每只大鼠PCR产物序列与野生型大鼠序列，判断是否有突变。将鉴定为突变型的大鼠和野生型大鼠交配，得到F1代。F1代大鼠杂合子相互交配可得到纯合子突变型大鼠。

5)待纯合子突变型大鼠体成熟，处死，取出肝脏，制备肝脏微粒体。

本发明还提出了一种Cyp单基因缺失大鼠肝微粒体或Cyp多基因缺失大鼠肝微粒体，是利用敲除单个或多个Cyp基因的大鼠制备得到的肝微粒体；所述肝微粒体中单个或多个CYP酶无法行使正常功能。

Cyp多基因缺失大鼠肝微粒体是指利用敲除多个Cyp基因的大鼠制备的肝微粒体。例如，该大鼠体内多个Cyp基因被敲除，功能丧失，与正常大鼠肝微粒体比较，利用此大鼠制备的肝微粒体中2个或2个以上特定CYP酶无法行使正常功能，而其他的成分与正常肝微粒体相同。

本发明还提出了一种多亚型Cyp基因敲除大鼠的培育方法。两个或两个以上单基因敲除大鼠相互交配繁育而成。将不同Cyp单基因敲除大鼠纯合子进行交配，得到的子代杂合子大鼠自交即可得到多亚型基因敲除大鼠。将两个或两个以上的Cyp单基因敲除大鼠相互合笼交配，产出双杂合子代F1代大鼠，再将子代同窝不同性别的双杂合子F1代大鼠进行自交，得子代F2代大鼠；所述子代F2代大鼠包括Cyp多基因敲除大鼠，即多亚型Cyp基因敲除大鼠。

具体地，由两个或两个以上Cyp单基因敲除大鼠相互交配繁育而成。以Cyp3a1/Cyp2e1双敲大鼠的繁育为例，取成年(8周以上)Cyp3a1敲除纯合子大鼠和Cyp2e1敲除纯合子大鼠(两种大鼠为不同性别)合笼，产出的子代F1代大鼠为双杂合，即对于每个基因型来说都是杂合子。将子代同窝不同性别的双杂合子大鼠进行自交，其子代F2代大鼠会有一定概率出现Cyp2e1和Cyp3a1双基因敲除纯合子大鼠。

本发明还提出了一种多基因缺失大鼠肝微粒体的制备方法。同单基因缺失大鼠肝微粒体制备方法相同。取成年多基因纯合子突变大鼠，脱颈处死，取出肝脏，清洗称重，剪碎匀浆，最后差速离心后沉淀重悬即得到。所述成年多基因纯合子突变大鼠为Cyp多基因敲除大鼠。

进一步地，本发明还可以进行多亚型Cyp基因敲除大鼠的繁育。由于不同亚家族的CYP酶的基因位于大鼠不同染色体上，因此，将不同Cyp基因敲除大鼠相互交配繁殖，即可得到Cyp双基因或多基因敲除大鼠，随后即可制备多基因缺失的大鼠肝脏微粒体，为多种CYP酶参与的药物代谢研究提供了多样化的体外模型。

本发明中，多亚型Cyp基因是指不同亚型的Cyp基因。CYP酶为一类蛋白质超家族，有许多成员，分为不同的家族(family)，如CYP1，CYP2，CYP3等。每个家族分为几个亚族(subfamily)，如CYP1家族分为CYP1A亚族，CYP1B亚族等。每个亚族中有一个或多个成员，即亚型(isoform)，如人体CYP1A亚族包含CYP1A1，CYP1A2两个亚型。

本发明还提出了Cyp基因敲除大鼠在药物代谢研究中的应用。所述Cyp基因敲除大鼠包括Cyp基因敲除大鼠、Cyp多基因敲除大鼠。

一方面，研究药物的代谢情况，即参与该药物是否由某种CYP酶代谢，进而研究某种特定的CYP酶对该药物代谢的重要程度。例如在研究某种药物是否由CYP2E1酶代谢时，可选取野生型大鼠和Cyp2e1敲除大鼠，同时对两种大鼠静脉注射或口服待测药物，检测不同时间点两种大鼠血药浓度，分析该药物的药代动力学参数，例如消除半衰期(T1/2)，药时曲线下面积(AUC)，清除率(CL)等。如果Cyp2e1敲除大鼠体内待测化合物的药时曲线下面积增加，消除半衰期增大，清除率减小等，则说明CYP2E1酶可能参与了待测化合物的代谢。另一方面，探究药物产生毒性的原理。许多药物本身并没有毒性，然而在体内代谢过程中产生的代谢产物会对机体产生毒性。因此利用Cyp基因敲除大鼠可判断该CYP酶是否介导了药物产生毒性，即是否由于该酶对药物的代谢导致了其代谢产物产生毒性。例如在研究CYP2E1是否介导了某种药物产生毒性，可选取野生型大鼠和Cyp2e1敲除大鼠，同时给待测药物，观察大鼠的致死情况，如果Cyp2e1基因的敲除大大降低了大鼠的致死率，则说明CYP2E1参与了待测药物的毒性发生，即毒性代谢产物主要由CYP2E1代谢产生。

本发明还提出了多亚型Cyp2e1基因敲除大鼠在药物代谢研究中的应用。如果通过不同亚型Cyp基因敲除大鼠的相互交配得到多亚型敲除大鼠，则可以结合单个Cyp敲除大鼠，同时研究不同亚型CYP酶对某种药物的代谢。例如通过单个Cyp敲除大鼠研究发现CYP2E1和CYP3A1都参与了待测化合物的代谢，但不知道两种酶代谢该药物所占的比例，则可利用Cyp2e1和Cyp3a1同时敲除的大鼠进一步研究。如果发现待测化合物几乎没有代谢，则说明该药物由这两种酶共同代谢，而如果发现还有相当一部分药物代谢，则说明两种酶在该药物代谢中占的比例较小。

本发明用于药物代谢研究的细胞色素P450酶(CYP酶)缺失的大鼠肝微粒体的制备方法，涉及CYP酶敲除大鼠的构建，基因型鉴定，功能性验证以及缺失型肝微粒体制备及体外活性检测等。在该发明中，首先利用CRISPR/Cas系统进行Cyp酶基因敲除大鼠的构建，包括敲除靶点的选择，sgRNA与Cas9mRNA的体外合成与转录，假孕母鼠的制备，单细胞胚胎的体外显微注射与移植，大鼠的繁殖，最后得到纯合子Cyp基因敲除大鼠；然后对纯合子敲除大鼠从mRNA水平，蛋白水平进行CYP酶表达检测，以及体内和体外功能验证，以证明该Cyp基因敲除大鼠构建成功；最后，将纯合子基因敲除大鼠脱颈处死，取出肝脏，加入Tris/KCl缓冲液，剪碎，通过组织匀浆，差速离心等步骤得到肝脏微粒体沉淀。将最后得到的沉淀用Tris/KCl缓冲液匀浆重悬，分装，-80℃保存备用。该微粒体中不包含所敲除的单个Cyp基因，因此称为CYP酶缺失的大鼠肝微粒体，该微粒体可用于药物代谢及毒理学研究。

本发明首次创新地提出，利用CRISPR/Cas系统构建Cyp基因敲除大鼠，并将敲除大鼠肝脏制成肝微粒体，其优点包括：

CRISPR/Cas系统是一种RNA介导的Cas9蛋白的DNA编辑工具，相对于长期以来应用的同源重组方法，CRISPR/Cas技术具有许多优势，如周期短，易于操作，成功率高，生殖系转移能力强以及简单经济等，在动物模型构建中的应用前景非常广阔。本发明利用该系统进行基因敲除大鼠模型的构建，能够高效快速的得到纯合子突变型大鼠，大大降低建模成本，缩短建模时间，并且得到的敲除大鼠种系稳定可遗传。

与小鼠相比，大鼠在药物代谢研究中的应用具有更多优势，例如体型大容易操作；血量多，可连续取样实现对待测药物药代动力学性质的准确分析。因此，基因敲除大鼠模型的应用比小鼠更加广阔和方便。

特定CYP酶缺失的大鼠肝微粒体是指肝微粒体中某种特定CYP酶完全失去活性。与现有体外模型如化学抑制剂抑制，抑制性抗体CYP酶活性，RNAi失活CYP酶等相比，该微粒体模型在药物代谢途径确定，候选药物毒性评估，药物相互作用预测等方面更为简便直接和准确。由于该种微粒体的某种CYP酶活性完全丧失，如果该酶参与了待测化合物的代谢，则检测不到待测化合物的代谢产物，说明该酶在待测化合物的代谢中起到关键作用。

在本发明中构建得到的Cyp基因敲除大鼠的基础上，还可以进行人源基因敲入的工作，用来制备Cyp人源化大鼠模型，该大鼠模型中鼠源CYP酶失活，人源CYP酶高表达，这种大鼠与人体更为相近，由该大鼠得到的肝微粒体与人肝微粒体更为相近，在药物代谢研究中可大大降低研究成本，实验结果更加可靠。

综上所述，本发明成功将大鼠体内某种特定同种型Cyp(isoform)基因敲除，使得在纯合子突变型大鼠体内该CYP酶完全失活。并且将这种基因敲除大鼠的肝脏取出制备成肝微粒体，可用于体外药物代谢，毒理学及药物筛选研究中。所制备的微粒体使用起来简单方便，得到的结果准确可靠，且可长期保存，性质稳定，可满足高通量或长期实验的需求。

在具体的实施方案中，通过测定大鼠血清中重要生理指标，证明Cyp基因敲除大鼠与野生型大鼠在生理状态方面没有显著差异，且敲除大鼠生殖情况正常，说明Cyp基因的敲除并不影响大鼠的生长发育及繁殖。

通过本发明得到的Cyp基因敲除大鼠与野生型大鼠相比，其CYP酶无论是在转录水平，蛋白水平还是在动物功能水平都有明显的缺失。在具体实施例中，RT-PCR实验和western blot实验都证明Cyp2e1基因敲除大鼠表达的缺失；CYP2E1探针底物氯唑沙宗体内药代动力学实验中，Cyp2e1基因敲除大鼠代谢氯唑沙宗的能力远远低于野生型大鼠，证明了CYP2E1酶功能的缺失。CYP3A1/2探针底物硝苯地平体内药代动力学实验中，Cyp3a1/2基因敲除大鼠代谢硝苯地平的能力也明显低于野生型大鼠，同样证明了CYP3A1/2酶功能的缺失。

通过特异性探针底物体外酶动力学分析证明本发明制备得到的Cyp2e1或Cyp3a1/2敲除大鼠肝微粒体体外酶活的缺失。在具体实施例中，Cyp2e1敲除大鼠肝微粒体中CYP2E1酶代谢氯唑沙宗的K_m值，V_max值以及固有清除率CL_int值都比野生型大鼠肝微粒体低。Cyp3a1/2敲除大鼠肝微粒体中CYP3A1/2酶动力学分析也有同样的结果。

进一步地，除了肝脏以外，小肠、肾脏甚至大脑等肝外器官对药物代谢也起着重要作用，因此，制备肝外器官微粒体如小肠微粒体，肾脏微粒体等也为CYP酶的功能及药物代谢研究提供有力的工具。

附图说明

图1表示Cyp2e1、Cyp3a1/2基因敲除大鼠F0代基因型鉴定结果。其中Cyp2e1基因敲除F0代大鼠共有11只，编号从左到右为1-11#。其中A图为提取每只大鼠基因组后经过PCR得到产物的琼脂糖凝胶结果，B图为图A中的PCR产物经过变性退火，T7内切酶37℃作用半小时后琼脂糖凝胶电泳结果。C图为提取每只大鼠基因组后经过PCR得到的Cyp3a1和Cyp3a2产物的琼脂糖凝胶结果。Cyp3a1/2基因敲除F0代大鼠共有14只，1-14#。图中从左到右依次为Cyp3a1敲除F0代1-14#大鼠基因PCR电泳结果，Cyp3a2敲除F0代1-14#大鼠基因PCR电泳结果。D图为图C中的PCR产物经过变性退火，T7内切酶37℃作用半小时后琼脂糖凝胶电泳结果。

图2表示Cyp2e1敲除F2代纯合子大鼠与野生型大鼠在mRNA和蛋白水平的差异。A图为CYP2E1mRNA水平表达差异，B图为CYP2E1蛋白水平差异。

图3表示Cyp2e1基因敲除大鼠与野生型大鼠体内氯唑沙宗药代动力学分析结果。其中A图为通过静脉给药Cyp2e1基因敲除大鼠与野生型大鼠体内氯唑沙宗药时曲线。B图为A图中两种大鼠氯唑沙宗药时曲线下面积的比较。C图为通过口服给药两种大鼠体内氯唑沙宗药时曲线。D图为C图中两种大鼠氯唑沙宗药时曲线下面积的比较。***P<0.001.

图4表示由Cyp2e1基因敲除大鼠和野生型大鼠分别制备的肝微粒体对氯唑沙宗代谢的体外酶动力学分析结果。

图5表示Cyp3a1/2基因敲除大鼠与野生型大鼠硝苯地平体内药动力学分析。其中A图为尾静脉注射硝苯地平时，硝苯地平在基因敲除大鼠和野生型大鼠体内的药时曲线。B图为A图中两种大鼠体内硝苯地平的药时曲线下面积的比较。**P<0.01.

图6表示野生型大鼠和Cyp3a1/2敲除大鼠对CYP3A特征性底物咪达唑仑体外代谢的动力学曲线。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1 靶点设计与guideRNA的合成

CRISPR/Cas基因敲除系统能识别基因组中与其引导RNA相对应的以NGG结尾的DNA序列，所以本发明选定的靶点是在大鼠目的基因中，NGG序列5’端的一段18bp的核苷酸序列；因为CRISPR/Cas系统进行基因敲除利用的是：DNA在非同源重组修复中的突变碱基的引入，从而引起突变位点后3’端序列的移码突变，而为了尽量多地使目的基因发生移码突变，所以本发明设计靶点的原则是尽量靠近基因全长的5’端；又因为本发明设计的靶点序列仅有18bp，在大鼠的基因组中可能存在相同或相近的序列，所以本发明设计出来的靶点会对其进行脱靶效应的在线预测，本发明选用的预测工具是：CasOT，http://eendb.zfgenetics.org/casot/。

综上，本发明设计的大鼠Cyp基因敲除的靶点如下：

Cyp2e1敲除靶点为AAGCAGATCTATAACAGT，其后序列为TGG，该靶点位于Cyp2e1基因第一个外显子上，距离起始密码子ATG 66bp；如SEQ ID NO.1所示；

Cyp3a1敲除靶点为CAAGAAACAGGGGATTCC，其后序列为TGG，该靶点位于Cyp3a1基因第二个外显子上，距离起始密码子98bp；如SEQ ID NO.2所示；

Cyp3a2敲除靶点为TAAGAAACAAGGAATTCC，其后序列为TGG，该靶点位于Cyp3a2基因第二个外显子上，距离起始密码子98bp；如SEQ ID NO.3所示。

实施例2 sgRNA模板的合成与转录

为了在大鼠受精卵中实现更高效率的敲除靶基因，本发明采用大鼠受精卵中共注射sgRNA和Cas9mRNA。本发明首先合成一段包含T7启动子序列和靶点序列的60bp寡聚核苷酸序列；然后，通过重叠PCR的方式合成完整的sgRNA模板序列，总长130bp；通过T7体外转录试剂盒对该模板序列进行体外转录；经酚氯仿抽提后得到纯化的靶点与-sgRNA经重叠PCR连接后的共转录产物。本发明合成的相应的60bp的寡聚核苷酸序列如下：

Cyp2e1

GATCACTAATACGACTCACTATAGGAAGCAGATCTATAACAGTGTTTTAGAGCTAGAAAT(SEQ IDNO.4)

Cyp3a1

GATCACTAATACGACTCACTATAGGCAAGAAACAGGGGATTCCGTTTTAGAGCTAGAAAT(SEQ IDNO.5)

Cyp3a2

GATCACTAATACGACTCACTATAGGTAAGAAACAAGGAATTCCGTTTTAGAGCTAGAAAT(SEQ IDNO.6)

其中，划横线部分即为实施例1中设计的敲除靶点序列，分别为SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3。

实施例3 Cyp基因敲除大鼠基因型鉴定

本发明把假孕母鼠产出的子代大鼠定义为F0代，把F0代大鼠与野生型大鼠交配，产出的子代大鼠定义为F1代。经基因型鉴定，本发明挑选出F1代中具有单一位点缺失，且缺失碱基数为非三的整数倍的杂合子大鼠(即同一位点两个等位基因，一个是碱基缺失的，一个是正常的)进行自交，并定义其产生的后代为F2。由于F1代是杂合自交，所以F2代的基因型就可能是纯合野生型大鼠、纯合碱基缺失型大鼠以及杂合子大鼠，这样产生的三类大鼠具有更加接近的遗传背景和更小的个体差异，便于后续研究。

对于F0代的基因型的鉴定。首先，以敲除靶点为参照，设置产物两侧长度不对称的PCR引物(即靶点离PCR产物双链两端距离不等，并且这两段具有琼脂糖凝胶可分辨的碱基数差异)，经常规PCR获得长度为600-800bp的PCR产物。然后，将PCR产物经一特定程序退火，退火后的产物经可识别错配碱基的T7内切酶酶切。然后，将酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳中，出现两条或两条以上条带的基因组所对应的大鼠可能具有碱基缺失，再将其PCR产物连接到载体上进行测序，经序列比对鉴定出F0代大鼠的基因型。如图1所示，A图为Cyp2e1敲除F0代1-11#大鼠基因组PCR琼脂糖凝胶电泳结果，1#和4#PCR产物电泳结果为两条带，说明可能会有长片段缺失。B图为A图PCR产物经退火变性，T7内切酶处理半小时后琼脂糖电泳结果，结果显示三角形标志的大鼠Cyp2e1基因有一定碱基的缺失。C图为Cyp3a1/2敲除F0代1-14#大鼠基因组PCR琼脂糖凝胶电泳结果，其中Cyp3a1基因11#电泳结果为两条带，可能会有长片段的缺失。D图为C图中PCR产物经退火变性，T7内切酶处理半小时后琼脂糖电泳结果，结果显示方框标记的大鼠Cyp3a1/2基因有一定碱基的缺失。将显示有碱基缺失的大鼠基因PCR产物送样测序，确定碱基缺失数目。

所使用的基因型鉴定PCR引物如下：

Cyp2e1:

上游:GAGGTAAAGGCTCCAAGGTTC

下游:GGCACAGAATGATACCAGCAA

Cyp3a1:

上游:TAGCATTACCCTGGCACCT；

下游:GCCAAAGCCTGGATACACTC；

Cyp3a2:

上游:TAGAGGGAGAACACCGAGGAG；

下游:GGGTCCGATGTCTTAGGGTT。

对于F1代的基因型的鉴定。F1代是由F0代杂合子和野生型大鼠交配所生，其后代可能是野生型，也可能是不同缺失类型的杂合子。本发明采用的是和F0代鉴定类似的方法进行鉴定的。首先用T7内切酶酶切鉴定是否是碱基缺失型杂合子大鼠，然后再对碱基缺失的杂合子大鼠基因组的PCR产物进行测序，经过序列比对，确定其缺失碱基数目。

对于F2代的基因型的鉴定。F2代是由经纯化的、同基因型的F1杂合子大鼠进行交配所生，本发明需要鉴定出其中的纯合子野生型和纯合子碱基缺失型大鼠。本发明采用与鉴定F0、F1代大鼠基因型相同的引物对F2代大鼠的基因组进行PCR，并将其PCR产物直接送去测序，经过序列比对，对F2代大鼠进行基因型鉴定。

为了纯化基因敲除大鼠的基因型，可挑选F2代杂合子再进行自交得到纯合子突变型大鼠。

实施例4 Cyp基因敲除大鼠与野生型大鼠体内生理指标的检测

通过眼眶采血的方式收集体成熟(8周左右)F2代Cyp2e1基因敲除大鼠和野生型大鼠(各6只)的静脉血各1ml于1.5ml离心管中。低温静置30分钟，然后3000rpm离心10分钟，将上清转移至新的离心管中，冻存于-80℃冰箱中。一周之内，将血清样品送公司测定几项重要生理指标，检测敲除大鼠与野生型大鼠是否有显著性差异。检测的项目包括白蛋白，总胆红素，甘油三酯，葡萄糖，碱性磷酸酶，总蛋白，间接胆红素，总胆固醇，丙氨酸氨基转移酶，低密度脂蛋白胆固醇，球蛋白，直接胆红素，高密度脂蛋白胆固醇，天门冬氨酸氨基转移酶。结果表明除碱性磷酸酶稍有增加以外，其他的生理指标均无显著性差异，由此看来Cyp2e1基因的敲除对大鼠生理状态没有显著影响。而对于Cyp3a1/2基因敲除大鼠的生理指标检测，除总胆红素稍有增加以外，其他生理指标均无显著差异，由此看来Cyp3a1/2基因的敲除对大鼠生理状态没有显著影响。

实施例5 Cyp2e1基因敲除大鼠与野生型大鼠对探针底物氯唑沙宗(chlorzoxazone)体内药代动力学性质比较

其中，氯唑沙宗静脉给药体内药动学实验中，将F2代大鼠分为对照组和Cyp2e1基因敲除组，每组6只，周龄6-8周，体重250-300g。

首先，称取适量氯唑沙宗粉末，溶于生理盐水中，其中按每ml生理盐水3μl的比例加入10N氢氧化钠溶液，涡旋使氯唑沙宗粉末溶解。此时氯唑沙宗终浓度为0.5mg/ml，大鼠给药剂量为1mg/kg，给药体积为2ml/kg。

将野生型与基因敲除大鼠称重，按照上述给药剂量，用1ml注射器准确吸取相应体积的氯唑沙宗溶液，以尾静脉注射的方式对两组大鼠进行给药处理。分别在给药2分钟，5分钟，10分钟，20分钟，40分钟，60分钟，90分钟，120分钟，180分钟后进行眼眶采血收集静脉血，装入肝素处理过的离心管中，上下颠倒混匀，然后将采集的静脉血在8000rmp、4℃的条件下离心。将离心得到的上清即血浆转移到新的离心管中，放入-20°冰箱保存。保存时间不超过一周。

在氯唑沙宗口服给药体内药动学实验中，将F2代大鼠分为对照组和Cyp2e1基因敲除组，每组6只，周龄6-8周，体重250g-300g。

首先，配制1％羧甲基纤维素钠溶液，称取适量氯唑沙宗粉末，加入羧甲基纤维素钠溶液配成1mg/ml的混悬液，超声10min使氯唑沙宗粉末均匀的分散在羧甲基纤维素钠溶液中。大鼠给药剂量为5mg/kg，给药体积为5ml/kg。

将野生型和敲除大鼠称重，按照上述给药剂量，用2ml注射器准确吸取相应体积的氯唑沙宗混悬液，以灌胃的方式对两组大鼠进行给药处理。分别在给药2分钟，5分钟，10分钟，15分钟，30分钟，45分钟，60分钟，120分钟，180分钟，240分钟，360分钟后进行眼眶采血收集静脉血，装入肝素处理过的离心管中，上下颠倒混匀，然后将采集的静脉血在8000rmp、4℃的条件下离心。将离心得到的上清即血浆转移到新的离心管中，放入-20°冰箱保存。保存时间不超过一周。

将上述所得血浆从-20°冰箱中取出，室温放置10分钟化冻，用移液器从每管中吸取100μl至新的离心管中。然后在每管中加800μl乙酸乙酯，在涡旋仪上涡旋3分钟进行萃取，14000rpm离心10分钟，准确吸取上层液体600μl置于氮吹仪下吹干。最后，剩余残渣用100μl流动相复溶，14000rpm离心20分钟，吸取80μl至样品瓶中，利用本实验室建立的氯唑沙宗的LC-MS/MS分析方法进行分析。

结果如图3所示，A为静脉注射给药方式下野生型大鼠和敲除大鼠体内氯唑沙宗药时曲线，横轴为取血时间点，纵轴为氯唑沙宗的血药浓度。B为由A图数据得到的两种大鼠氯唑沙宗药时曲线下面积的比较。图中显示Cyp2e1敲除大鼠代谢氯唑沙宗的能力明显弱于野生型大鼠，在180分钟时，野生型大鼠体内氯唑沙宗的血药浓度接近于定量下限，氯唑沙宗几乎被代谢完，而Cyp2e1敲除大鼠只被代谢2/3左右，还有1/3没有被代谢。而敲除大鼠0-3小时氯唑沙宗的药时曲线下面积远远大于野生型大鼠(P<0.0001,***)，说明敲除大鼠体内还有大量氯唑沙宗原药滞留体内，而野生型大鼠大部分已代谢。此结果很好的说明Cyp2e1敲除大鼠体内该酶功能的缺失。

同样，灌胃给药方式下，如C图氯唑沙宗药时曲线(横轴为取血时间点，纵轴为氯唑沙宗血药浓度)所示，Cyp2e1敲除大鼠代谢氯唑沙宗的能力明显低于野生型大鼠，最大血药浓度(C_max)为野生型大鼠的2倍左右，消除过程也比野生型大鼠慢，在给药后360分钟的时候野生型大鼠体内氯唑沙宗血药浓度接近定量下限，而敲除大鼠体内氯唑沙宗血药浓度为1500ng/ml，约为最大血药浓度的一半。同静脉给药方式一致，敲除大鼠氯唑沙宗0-6小时药时曲线下面积也远远大于野生型大鼠(P<0.0001,***)，也说明了Cyp2e1敲除大鼠中该酶功能的缺失。

实施例6 Cyp2e1基因敲除大鼠与野生型大鼠肝脏CYP2E1蛋白表达检测

取实施例2中的基因敲除大鼠和野生型大鼠各一只，颈部脱臼处死，迅速打开腹腔，取出肝脏，置于PBS缓冲液中。用剪刀小心从其中一叶肝脏中剪下一小块，剪碎，加适量细胞裂解液RIPA(含PMSF和蛋白酶抑制剂)匀浆破碎，然后12000rpm离心10分钟，将上清转移至新的离心管中，用BCA法测定上清蛋白浓度。按测得的蛋白浓度，取适量上清液，加适量蛋白上样缓冲液，100℃处理10分钟，12000rpm离心5分钟。配制分离胶浓度为10％的丙烯酰胺凝胶，Western blot实验检测野生型和敲除大鼠肝脏中CYP2E1蛋白的表达差异，每孔上样总蛋白50μg。

结果如图2B所示，western blot实验显示，以GAPDH为内参，野生型大鼠肝脏CYP2E1蛋白表达正常，而Cyp2e1敲除大鼠肝脏检测不到CYP2E1的表达，说明Cyp2e1敲除大鼠体内没有正常CYP2E1蛋白的表达。

实施例7 敲除大鼠与野生型大鼠肝脏中Cyp2e1转录水平表达检测

取实施例2中的敲除大鼠和野生型大鼠各一只，颈部脱臼处死，迅速打开腹腔，取出肝脏置于PBS缓冲液中。小心剪下一小块，加500μl Trizol，匀浆，提取大鼠肝脏总RNA。取1000ng RNA进行逆转录，以反转而得到的cDNA为模板，使用Cyp2e1cDNA上下游引物(F:GATCTATAACAGTTGGAACCTGCCCC；R:CAGGACCACGATGCGCCTTGAGCCA)进行PCR反应，配制2％琼脂糖凝胶对扩增产物进行鉴定，检测敲除大鼠和野生型大鼠中Cyp2e1mRNA水平表达的差异。

结果如图2A所示，将两种大鼠肝脏总RNA逆转录得到的cDNA为模板进行PCR反应，其产物进行琼脂糖电泳，该结果以actin为参照。野生型大鼠Cyp2e1mRNA表达正常，而Cyp2e1敲除大鼠检测不到mRNA表达，说明Cyp2e1敲除大鼠体内由于Cyp2e1基因的移码突变导致没有正常的mRNA转录。

实施例8 Cyp3a1/2基因敲除大鼠对CYP3A特征底物硝苯地平的药物代谢动力研究

硝苯地平是一个二氢吡啶类的钙离子通道阻断剂，临床上用于预防和治疗冠心病心绞痛。硝苯地平是CYP3A的一个经典底物，其在大鼠体内代谢的快慢常被研究者用来表示体内CYP3A的活性。本实施例建立了硝苯地平的LC-MS/MS检测方法和大鼠血浆提取方法，对野生型大鼠和Cyp3a1/2敲除大鼠同时进行尾静脉注射硝苯地平(0.2mg/kg)，设计取血点，并对大鼠血浆中的硝苯地平的浓度进行检测，得到药时曲线，并计算出相关的药代动力学参数。将野生型大鼠和Cyp3a1/2敲除大鼠所得到的药时曲线和药代动力学参数进行比较和统计学分析，便可以得出二者酶活性上的差异，进而验证敲除是否成功。

其中，硝苯地平静脉给药体内动力学实验中，将F2代大鼠分为对照组和Cyp3a1/2敲除组，每组5只，周龄6-8周，体重250-300g。

首先，将硝苯地平用DMSO溶解，使其浓度为4mg/ml，然后按DMSO：聚乙二醇400(PEG400)：生理盐水＝5％：35％：65％的比例进行混合，使得静脉注射液中DMSO的含量控制在5％，PEG400的含量控制在35％，此时硝苯地平的终浓度为0.2mg/ml，大鼠的静脉给药剂量是0.2mg/kg。

然后，将野生型与基因敲除大鼠称重，按照上述给药剂量，用1ml注射器准确吸取相应体积的硝苯地平溶液，以尾静脉注射的方式对两组大鼠进行给药处理。分别在给药2分钟，5分钟，10分钟，20分钟，30分钟，45分钟，60分钟，90分钟，120分钟后进行眼眶采血收集静脉血，装入肝素处理过的离心管中，上下颠倒混匀，然后将采集的静脉血在4℃，5500×g的条件下离心。将离心得到的上清即血浆转移到新的离心管中，放入-20°冰箱保存。保存时间不超过一周。

通过分析，本发明发现，硝苯地平在野生型大鼠快于Cyp3a1/2敲除大鼠中的代谢，二者具有显著性差异。图5A是对野生型大鼠和Cyp3a1/2基因敲除大鼠同时进行尾静脉给药硝苯地平后，体内药物浓度随时间的变化曲线。横轴是时间，纵轴是大鼠血液中硝苯地平的浓度。从曲线上，我们可以直接看出，在Cyp3a1/2基因敲除大鼠体内的血药浓度明显高于野生型大鼠。同时，我们用WinNonlin软件对野生型大鼠和Cyp3a1/2基因敲除大鼠对硝苯地平的体内代谢数据进行了药代动力学分析，并得出一些药物代谢动力学参数，如表2所示，我们得到了野生型大鼠和Cyp3a1/2基因敲除大鼠对硝苯地平的体内代谢的半衰期(T_1/2)、0到120min的药时曲线下面积(AUC_0-T)、0到正无穷时的药时曲线下面积(AUC_inf)、表观分容积(V_d)、清除率(CL)以及平均滞留时间(MRT)。我们发现Cyp3a1/2基因的敲除，显著延长了硝苯地平在大鼠体内代谢的半衰期，基因敲除大鼠的T_1/2约是野生型大鼠的2倍。Cyp3a1/2基因的敲除，显著增加了硝苯地平在大鼠体内的血药浓度，基因敲除大鼠其药时曲线下面积约是野生型大鼠的2倍(如图5B所示)。Cyp3a1/2基因的敲除，显著降低了硝苯地平在大鼠体内的清除速率，基因敲除大鼠对硝苯地平的体内清除速率约是野生型大鼠的1/2。Cyp3a1/2基因的敲除，也显著增加了硝苯地平在大鼠体内的平均滞留时间。这些参数都说明，Cyp3a1/2敲除大鼠中CYP3A的酶活性明显低于野生型大鼠，从功能上说明敲除是成功的。

实施例9 Cyp基因敲除大鼠和野生型大鼠肝脏微粒体的制备与活性检测

取基因型明确的敲除大鼠和野生型大鼠，周龄8周，体重250-300g，用于制备大鼠肝脏微粒体。将上述大鼠颈部脱臼处死，剪开腹腔，迅速将肝脏剥离，置于冰上的生理盐水中清洗。用吸水纸吸干肝脏表面的水分，称重，按照1:1.5的比例加入Tris/KCl缓冲液(pH＝7.4)，分别用剪刀将肝脏剪碎，匀浆机匀浆。然后将匀浆转入50ml离心管中，各管配平，4℃，10500g离心30分钟。将离心后的上清液转入超速离心管中，配平，4℃，105000g(35000rpm)离心60min。最后将上清倒掉，沉淀即为肝脏微粒体。将沉淀小心刮出，转移到15ml离心管中，加适量Tris/KCl缓冲液，匀浆重悬，即得到肝微粒体溶液。将得到的肝微粒体溶液分装，测定其总蛋白含量，然后保存于-80℃冰箱备用。

对于Cyp2e1基因敲除大鼠肝微粒体，选用氯唑沙宗作为其探针底物用于体外酶动力学分析。氯唑沙宗(chlorzoxazone，CAS号95-25-0)是一种中枢性肌肉松弛剂，主要用于治疗各种急，慢性软组织疼痛，中枢神经病变引起的肌肉痉挛等病症。在药物代谢研究中氯唑沙宗作为CYP2E1酶的探针底物得到广泛性认可，体内及体外实验研究证明其在CYP2E1酶的催化下生成4-羟基氯唑沙宗，在人体内该产物为唯一的代谢产物，具有较强选择性和专属性。在本实验中，选用氯唑沙宗作为CYP2E1的底物，进行敲除大鼠和野生型大鼠体外肝微粒体孵育实验，检测两种肝微粒体中CYP2E1酶活性的差异。在肝微粒体孵育体系中(总体积500μl，缓冲体系0.05M Tris/KCl缓冲液，含5mM MgCl₂，pH＝7.4)，包含G6P 10mM，G6PDH0.4U/ml，微粒体蛋白1mg/ml，底物氯唑沙宗(10，25，50，100，200，400μM)。37℃预孵5分钟后，加入NADP(终浓度1mM)启动反应后孵育1小时。反应结束后，加入500μl冰乙腈终止反应，涡旋20秒，14000rpm离心20分钟沉淀蛋白。将上清转移至2ml离心管中，加入50μl内标非那西汀(phenacetin，500μg/ml)，500μl乙酸乙酯，37℃，1200rpm萃取30分钟。经13000rpm离心5分钟后，上层液体转移至尖嘴试管中，置于氮吹仪下吹干，剩余残渣用200ml流动相复溶，装入样品瓶中，利用本实验室建立的氯唑沙宗HPLC方法进行分析。所得数据经过计算分析，得到敲除大鼠和野生型大鼠肝微粒体重CYP2E1酶对氯唑沙宗的酶动力学曲线，经数据转化分析得到CYP2E1酶对氯唑沙宗的最大反应速率V_max，米氏常数K_m以及体外清除率(CL_int)。如图4氯唑沙宗酶动力学曲线所示，横轴为探针底物氯唑沙宗浓度，纵轴为肝微粒体代谢氯唑沙宗的反应速率。反应速率随着底物氯唑沙宗浓度的增加而增大，并逐渐有饱和的趋势。结果显示在浓度10-400μM的范围内，野生型大鼠和Cyp2e1敲除大鼠肝微粒体代谢速率随着氯唑沙宗浓度增加而增加，但Cyp2e1敲除大鼠对不同浓度氯唑沙宗代谢反应速率都小于野生型大鼠。通过对图4中氯唑沙宗动力学曲线进行数据转换分析，如表1所示，最大反应速率V_max敲除大鼠肝微粒体为0.89，小于野生型大鼠2.018，米氏常数K_m敲除大鼠330.5，也小于野生型大鼠418.7，同样，体外清除率CL_int敲除大鼠为2.7，也小于野生型大鼠4.8。这些结果与实施例5的氯唑沙宗体内药代动力学分析一致，说明Cyp2e1敲除大鼠体内该酶功能的缺失。

对于Cyp3a1/2基因敲除大鼠肝微粒体，选取了CYP3A的探针底物咪达唑仑验证Cyp3a1/2缺失的大鼠肝微粒体代谢活性的缺失。咪达唑仑是一类具有抗焦虑、镇静、催眠作用的精神类药物。同时，它也是CYP3A的一个经典底物，是FDA指导原则中推荐使用的用于监测人体CYP3A活性的特征性底物。本实施例中，将制备得到的肝微粒体在体外对不同浓度的咪达唑仑进行代谢孵育。通过本发明建立的咪达唑仑及其代谢产物1-羟基咪达唑仑的LC-MS/MS分析方法将上述孵育样品进行分析，并用软件进行动力学曲线的拟合，从而求出咪达唑仑经CYP3A体外代谢的动力学参数米氏常数K_m和最大反应速率V_max。

其中，孵育体系(总体积200μl，缓冲体系0.05M Tris-KCl缓冲液，pH＝7.4)包含：G6P10mM，G6PDH 0.4U/ml，微粒体蛋白1mg/ml，咪达唑仑(25，50，75，100，200μM)。37℃预孵5min后，加入NADP⁺(终浓度1mM)启动反应后37℃孵育15min。200μl冰乙腈(含1000ng/ml内标地西泮)终止反应，涡旋3min，16900×g离心20min。取100μl上清到样品瓶中，进样分析。

如图6所示，我们采用Graph prism 5.0软件对Cyp3a1/2敲除大鼠和野生型大鼠微粒体体外对咪达唑仑代谢的数据进行米氏方程拟合，得到其代谢动力学曲线。该曲线表明在同一咪达唑仑浓度下，Cyp3a1/2基因敲除大鼠微粒体对咪达唑仑的代谢速率明显低于野生型大鼠。通过得到的米氏常数(K_m)和最大反应速率(V_max)，我们可以计算出Cyp3a1/2基因敲除大鼠微粒体和野生型大鼠微粒体对咪达唑仑代谢的体外清除率(CL_int)。数据显示，野生型大鼠微粒体对咪达唑仑代谢的体外清除率是Cyp3a1/2基因敲除大鼠微粒体的3.7倍。体外酶动力学实验显示Cyp3a1/2敲除大鼠中CYP3A的酶活性明显低于野生型大鼠，进一步验证了成功敲除大鼠Cyp3a1/2基因。

表1 Cyp2e1基因敲除大鼠与野生型大鼠肝微粒体代谢氯唑沙宗酶动力学参数

表2 硝苯地平在Cyp3a1/2敲除大鼠和野生型大鼠体内药代动力学参数

表3 Cyp3a1/2基因敲除大鼠与野生型大鼠肝微粒体代谢咪达唑仑的动力学参数

Claims

1.一种Cyp基因敲除大鼠的培育方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)利用CRISPR/Cas系统选择敲除靶点；

所述靶点包括：

如SEQ ID NO.1所示的Cyp2e1基因敲除靶点，AAGCAGATCTATAACAGT；

如SEQ ID NO.2所示的Cyp3a1基因敲除靶点，CAAGAAACAGGGGATTCC；

如SEQ ID NO.3所示的Cyp3a2基因敲除靶点，TAAGAAACAAGGAATTCC；

2)体外sgRNA模板的合成与转录；

所述sgRNA模板包含T7启动子序列和18bp靶点sgRNA序列，分别如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6所示；

3)胚胎显微注射；

将sgRNA与Cas9mRNA共注射到受精卵胞浆中；

4)培育靶点敲除大鼠；

将由sgRNA与Cas9mRNA共注射的受精卵发育形成的F0代大鼠与野生型大鼠交配，得到F1代大鼠；再经F1代大鼠杂合子相互交配，得到纯合子突变型大鼠，即所述Cyp基因敲除大鼠；

其中，所述sgRNA注射浓度为20-40ng/μl；所述Cas9mRNA注射浓度为40-80ng/μl；

所述Cyp基因敲除包括一个或多个Cyp基因的敲除；所述Cyp基因敲除大鼠包括Cyp单基因敲除大鼠、Cyp多基因敲除大鼠。

2.Cyp基因缺失大鼠肝微粒体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)利用CRISPR/Cas系统选择敲除靶点；

所述靶点包括：

如SEQ ID NO.1所示的Cyp2e1基因敲除靶点，AAGCAGATCTATAACAGT；

如SEQ ID NO.2所示的Cyp3a1基因敲除靶点，CAAGAAACAGGGGATTCC；

如SEQ ID NO.3所示的Cyp3a2基因敲除靶点，TAAGAAACAAGGAATTCC；

2)体外sgRNA模板的合成与转录；

3)胚胎显微注射；

将sgRNA与Cas9mRNA共注射到受精卵胞浆中；

4)培育靶点敲除大鼠；

5)提取所述Cyp基因敲除大鼠的肝脏，经匀浆、差速离心，得Cyp基因缺失大鼠肝微粒体；

所述Cyp基因敲除包括一个或多个Cyp基因的敲除；所述Cyp基因敲除大鼠包括Cyp单基因敲除大鼠、Cyp多基因敲除大鼠；所述Cyp基因缺失大鼠肝微粒体包括单Cyp单基因缺失大鼠肝微粒体、Cyp多基因缺失大鼠肝微粒体。

3.一种如权利要求2所述方法制备得到的Cyp单基因缺失大鼠肝微粒体或Cyp多基因缺失大鼠肝微粒体，其特征在于，所述肝微粒体中单个或多个CYP酶无法行使正常功能。

4.一种多亚型Cyp基因敲除大鼠的培育方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)利用CRISPR/Cas系统选择敲除靶点；

所述靶点包括：

如SEQ ID NO.1所示的Cyp2e1基因敲除靶点，AAGCAGATCTATAACAGT；

如SEQ ID NO.2所示的Cyp3a1基因敲除靶点，CAAGAAACAGGGGATTCC；

如SEQ ID NO.3所示的Cyp3a2基因敲除靶点，TAAGAAACAAGGAATTCC；

2)体外sgRNA模板的合成与转录；

3)胚胎显微注射；

将sgRNA与Cas9mRNA共注射到受精卵胞浆中；

4)培育靶点敲除大鼠；

将由sgRNA与Cas9mRNA共注射的受精卵发育形成的F0代两个Cyp单基因敲除大鼠合笼交配，产出双杂合子F1代大鼠，再将子代同窝不同性别的双杂合子F1代大鼠进行自交，得到子代F2代大鼠；所述子代F2代大鼠包括Cyp多基因敲除大鼠；

其中，所述sgRNA注射浓度为20-40ng/μl；所述Cas9mRNA注射浓度为40-80ng/μl。

5.如权利要求1所述方法得到的Cyp基因敲除大鼠在药物代谢研究中的应用，其特征在于，所述Cyp基因敲除大鼠包括Cyp单基因敲除大鼠或Cyp多基因敲除大鼠。