CN106929533B - Kars基因点突变小鼠模型的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供KARS基因点突变小鼠模型的构建方法及其应用,KARS基因点突变小鼠模型的构建方法包括如下步骤:步骤一:靶点构建,寻找与神经系统疾病相应的基因,并进行靶点设计;步骤二:设计Guide‑RNA/Cas9mRNA,并且制备成质粒,转录后显微注射到受精卵细胞质中;步骤三:Founder小鼠鉴定;步骤四:F1代小鼠鉴定。本发明的构建具有神经系统疾病的小鼠模型的方法及其应用,由于针对KARS基因的定点突变来进行,使得模型小鼠的疾病研究能够在与真实疾病的发生和发展更加接近的条件下进行,其研究的结果更具参考价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种KARS基因点突变小鼠模型的构建方法,本发明还涉及KARS基因点突变小鼠模型的应用,属于动物模型领域。
背景技术
认知是机体认识和获取知识的智能加工过程,涉及学习、记忆、语言、思维、精神、情感等一系列随意、心理和社会行为。认知障碍指与上述学习记忆以及思维判断有关的大脑高级智能加工过程出现异常,从而引起严重学习、记忆障碍,同时伴有失语或失用或失认或失行等改变的病理过程。
目前,认知障碍的小鼠模型主要采用血管性痴呆和阿尔兹海默病两种类型。血管性痴呆由于急慢性脑缺血缺氧,引起脑组织损伤,可导致脑功能减退,认知功能下降。其中,针对大动脉的主要模型构建方法有血管阻断法和血管栓塞法,微小血管损伤的模型有易卒中自发性高血压大鼠(SHRSP),伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病CADASIL动物模型(Notch3转基因鼠)等。阿尔兹海默病的模型常见的有:①通过局部毁损动物大脑胆碱能系统导致其记忆和认知功能障碍;②脑内注射β淀粉样蛋白局部模拟AD;③转基因动物模型如APP转基因模型、PS转基因模型、tau转基因模型等。然而,上述的动物模型并不十分成熟,用手术方式构建模型对动物打击较大,术中死亡率较高,术后也难以长期存活,不利于观察研究。AD的转基因模型仅能代表某些病理、生理,也很难充分再现阿尔兹海默病的复杂特性。如何找到一种更贴近自然发生方式的动物模型的构建方法,是当前对认知障碍进行研究亟待解决的问题。
发明内容
我们的研究发现,KARS基因的异常突变与认知障碍有关。构建KARS基因突变小鼠模型,可以帮助研究者深入了解KARS的其他生物学功能,为探索KARS功能与认知障碍的相关性提供有效的研究途径和方法,并由此提供其应用。通过CRISPR/Cas9方法构建一种新型的、稳定性高、重复性好的KARS基因突变小鼠模型,有望深入研究疾病的损伤机制,从而找到延缓认知障碍发生发展的新方法。
本发明的目的在于提供一种KARS基因点突变小鼠模型的构建方法以及KARS基因点突变小鼠模型的应用。
本发明采用了如下技术方案:
一种构建具有神经系统疾病的小鼠模型的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一:靶点构建
1)寻找KARS基因的CDS区,明确外显子部分,点位:R504H;
2)靶点设计;
步骤二:获取受精卵,并进行显微注射;
1)Guide-RNA,Cas9RNA转录;
2)纯化转录产物;
3)将Guide-RNA/Cas9 mRNA显微注射到受精卵细胞质中;
步骤三:将受注射过Guide-RNA/Cas9 mRNA的受精卵进行培养,然后进行胚胎移植;
步骤四:Founder小鼠鉴定:
提取出生的胚胎移植小鼠的DNA,进行PCR鉴定;
步骤五:F1代小鼠鉴定,将Founder小鼠与野生型小鼠交配,生出的小鼠为F1代,若F1代中有阳性小鼠出生,表明相关品系小鼠模型构建成功。
进一步,本发明的构建具有神经系统疾病的小鼠模型的方法,还可以具有这样的特征,还包括:步骤六:P532S位点突变的小鼠的构建。
进一步,本发明的构建具有神经系统疾病的小鼠模型的方法,还包括:步骤七:KARS R504H/P532S双位点复合杂合突变,将R504H纯合子突变小鼠与P532S杂交,得到杂合突变小鼠。
进一步,本发明的构建具有神经系统疾病的小鼠模型的方法,其特征在于,其中,与KARS基因的点位R504H相对应的sgRNA的DNA序列是:
ccccagGCACCGCTCCAAAGAGG,
GATCACTAATACGACTCACTATAGGCCAGGCACCGCTCCAAAGGTTTTAGAGCTAGAAAT。
进一步,本发明的构建具有神经系统疾病的小鼠模型的方法,其特征在于,其中,对Founder小鼠进行鉴定所用的鉴定引物是:
KARS-PCR-S:CAGGCATCCCAAAAGAACAA
KARS-PCR-A:GCTTAGGTAAAACACCAAGAAA。
进一步,本发明的构建具有神经系统疾病的小鼠模型的方法,其特征在于,其中,P532S的sgRNA的DNA序列如下:
进一步,本发明的构建具有神经系统疾病的小鼠模型的方法,其特征在于:对P532S位点突变的小鼠进行鉴定的鉴定引物是:
KARS-PCR-S:CAGGCATCCCAAAAGAACAA,
KARS-PCR-A:GCTTAGGTAAAACACCAAGAAA。
本发明还提供上述任意一项所述的KARS基因点突变的小鼠在研究神经系统疾病中的应用。
进一步,上述的应用,还可以具有这样的特征,神经系统疾病为认知障碍。
发明的有益效果
本发明的构建具有神经系统疾病的小鼠模型的方法,由于采用KARS基因的定点突变来进行,使小鼠产生了基因组水平上的改变,小鼠出生后其疾病在自然规律下发生发展。使得模型小鼠的疾病研究能够在与真实疾病的发生和发展更加接近的条件下进行,其研究的结果更具参考价值。
附图说明
图1是KARS基因R504H位点突变的Founder小鼠基因测序图;
图2是R504H位点突变的F1代小鼠基因测序图;
图3是P532S位点突变的Founder小鼠基因测序图;
图4是P532S位点突变的F1代小鼠基因测序图;
图5是各小鼠模型进行定位航行试验的结果图;
图6是各小鼠模型进行空间探索试验的结果图。
具体实施方式
以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。
1、靶点构建:
利用CRISPR/Cas9 gene targeting技术,构建针对目的基因的gRNA,体外转录为mRNA,指导Cas9蛋白在特定位点剪切DNA双链。
(1)基因信息
Gene Bank Gene ID:85305
(2)设计构思
根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。找到该基因CDS区,即编码区,分析相应的基因组结构,明确CDS的外显子部分。按照基因本身的性质,选择候选的待敲除位点,确定待敲除位点。确定敲除位点后,选择23至250bp的外显子序列进行sgRNA序列的设计,最终选择off-target较少的作为点突变的靶点。
(3)靶点设计
KARS-R504H-sgRNA-S:ccccagGCACCGCTCCAAAGAGG
GATCACTAATACGACTCACTATAGGCCAGGCACCGCTCCAAAGGTTTTAGAGCTAGAAAT
KARS-R504H-120bp-oligo:CGC--CAC
ggtattgcattatgagagctctgaatattcatcctctgtggtctcgcgtccccagGCACCACTCCAAAGAGGGTCTCACGGAGCGCTTTGAGCTGTTTGTCATGAAGAAGGAGATATGCA
鉴定引物:
KARS-PCR-S:CAGGCATCCCAAAAGAACAA
KARS-PCR-A:GCTTAGGTAAAACACCAAGAAA
鉴定引物是对所有小鼠的该位点都可以使用来进行鉴定的,以需要突变的目的DNA为中心,在上下游各200bp-300bp的区间分别设计鉴定引物。
2、胚胎供体小鼠(C57BL/6)超排卵
PMSG(孕马血清促性腺激素)处理供体雌性小鼠,46小时后注射hCG(人绒毛膜促性腺激素),与雄性小鼠合笼交配,次日取受精卵进行显微注射。
3、显微注射及胚胎移植
guide-RNA和Cas9 mRNA体外转录:利用NotI位点将Cas9质粒线性化,使用mMESSAGESP6体外转录试剂盒(Life Technologies公司);guide-RNA模板使用Invitro转录T7试剂盒(Takara公司)进行体外转录。转录产物都使用MEGAclearTM Kit纯化。相关操作步骤详见相关产品说明书。
guide-RNA/Cas9 mRNA受精卵注射:注射样品配制成50:l体系。样品注射到受精卵胞质中,供体受精卵取自C57BL/6J小鼠品系。
4、Founder小鼠鉴定
胚胎移植的小鼠将在手术后19天左右出生,待小鼠出生约7天后剪尾(或脚趾)提取DNA并进行PCR鉴定。
点突变:
cgcgtccccagGCACCACTCCAAAGAGGGTCTCACGGAGCGCTTTG
mutant
测序图如图1所示。
5、F1小鼠鉴定
待雄性Founder小鼠到7周龄,雌性小鼠到4周龄,可分别与野生型异性小鼠交配,小鼠出生20天后PCR鉴定。若有阳性小鼠出生,则表示转基因已经整合到生殖细胞,标志品系构建成功。
点突变:
cgcgtccccagGCACCACTCCAAAGAGGGTCTCACGGAGCGCTTTG
mutant
测序图如图2所示。
三、KARS P532S点突变方案
1、靶点设计
KARS-P532S-sgRNA-S和KARS-P532S-sgRNA-2S可以分开使用,也可以一起使用,一起使用的切割效率更高一些。
KARS-P532S-120bp-oligo:CCC---TCC
CGCTTTGAGCTGTTTGTCATGAAGAAGGAGATATGCAATGCCTATACTGAGCTGAATGACTCCGTGCGGCAGAGGCAGCTGTTTGAGGAGCAGGCCAAGgtgagtgagtgagtgagacta
以上序列中,下滑线显示的是与目的DNA结合的特异性序列,方框标注的是gRNA的PAM,为CAS9蛋白的切割识别位点。
鉴定引物:
KARS-PCR-S:CAGGCATCCCAAAAGAACAA
KARS-PCR-A:GCTTAGGTAAAACACCAAGAAA
2、Founder鉴定结果
GAGATATGCAATGCCTATACTGAGCTGAATGACTCCGTGCGGCAGAGGCAGCTGTTTGAGGAGCAGGCCA mutant
突变位点测序图如图3所示。
3、F1代鉴定结果
(1)点突变:
GAGATATGCAATGCCTATACTGAGCTGAATGACTCCGTGCGGCAGAGGCAGCTGTTTGAGGAGCAGGCCA mutant
测序图如图4所示。
四、KARS R504H/P532S双位点复合杂合突变
F1代小鼠鉴定后,选择相同基因型的雌雄小鼠合笼,传至F2代,根据孟德尔遗传定律,子代小鼠中有25%为纯合子小鼠。之后,将携带R504H点突变的纯合雌(或雄)鼠与携带P532S点突变的纯合雄(或雌)鼠交配,传至F2代,根据孟德尔遗传定律,子代小鼠中100%为复合杂合突变小鼠。
对上述实施方式中得到的三种小鼠模型,利用水迷宫检测法进行认知能力的评价:
本实施方式所用的水迷宫检测法包括定位航行和空间探索两个实验。结果如图5和图6以及表1和表2所示。由图5和图6以及表1和表2可以看出,与野生型小鼠相比较,KARS基因的R504H点突变、P532S点突变以及R504H/P532S杂合突变小鼠的认知能力均显著地降低。
表1:定位航行结果表
表2:空间探索结果表
本发明的关键点在于KARS基因突变与认知障碍的关系,本发明为研究者探索KARS基因在认知障碍中的相关作用机制提供有效途径,也为认知障碍相关疾病的研究提供新型、稳定的模型。
本发明的KARS基因突变的小鼠模型,可以应用于对认识障碍这种神经系统疾病的研究,更具体的,可以应用于对认知障碍与KARS基因之间的关系的研究。更进一步的,本发明的KARS基因突变的小鼠模型的应用,可以进一步扩展到对KARS基因与多种神经系统疾病之间的关系的研究。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海交通大学医学院附属新华医院
<120> KARS基因点突变小鼠模型的构建方法及其应用
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccccaggcac cgctccaaag agg 23
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gatcactaat acgactcact ataggccagg caccgctcca aaggttttag agctagaaat 60
<210> 3
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggtattgcat tatgagagct ctgaatattc atcctctgtg gtctcgcgtc cccaggcacc 60
actccaaaga gggtctcacg gagcgctttg agctgtttgt catgaagaag gagatatgca 120
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caggcatccc aaaagaacaa 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcttaggtaa aacaccaaga aa 22
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 6
cgcgtcccca ggcaccactc caaagagggt ctcacggagc gctttg 46
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 7
cgcgtcccca ggcaccactc caaagagggt ctcacggagc gctttg 46
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctgagctgaa tgaccccgtg cgg 23
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gatcactaat acgactcact atagggagct gaatgacccc gtggttttag agctagaaat 60
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccccgtgcgg cagaggcagc tgt 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acagctgcct ctgccgcacg ggg 23
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gatcactaat acgactcact ataggagctg cctctgccgc acggttttag agctagaaat 60
<210> 13
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cgctttgagc tgtttgtcat gaagaaggag atatgcaatg cctatactga gctgaatgac 60
tccgtgcggc agaggcagct gtttgaggag caggccaagg tgagtgagtg agtgagacta 120
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
caggcatccc aaaagaacaa 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gcttaggtaa aacaccaaga aa 22
<210> 16
<211> 70
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 16
gagatatgca atgcctatac tgagctgaat gactccgtgc ggcagaggca gctgtttgag 60
gagcaggcca 70
<210> 17
<211> 70
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 17
gagatatgca atgcctatac tgagctgaat gactccgtgc ggcagaggca gctgtttgag 60
gagcaggcca 70
Claims (5)
1.一种KARS基因点突变小鼠模型的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一:靶点构建
1)寻找KARS基因的CDS区,明确外显子部分,点位:R504H,KARS基因Gene Bank GeneID:85305,
2)靶点设计;
步骤二:获取受精卵,并进行显微注射
1)Guide-RNA,Cas9RNA转录,
2)纯化转录产物,
3)将Guide-RNA/Cas9 mRNA显微注射到受精卵细胞质中;
步骤三:将受注射过Guide-RNA/Cas9 mRNA的受精卵进行培养,然后进行胚胎移植;
步骤四:Founder小鼠鉴定
提取出生的胚胎移植小鼠的DNA,进行PCR鉴定;
步骤五:F1代小鼠鉴定
将Founder小鼠与野生型小鼠交配,生出的小鼠为F1代,若F1代中有阳性小鼠出生,表明相关小鼠模型构建成功;
步骤六:P532S位点突变的小鼠的建立;
步骤七:KARS R504H/P532S双位点复合杂合突变,
将R504H纯合子突变小鼠与P532S纯合子突变小鼠杂交,得到杂合突变小鼠。
2.如权利要求1所述的KARS基因点突变小鼠模型的构建方法,其特征在于,其中,
与KARS基因的点位R504H相对应的sgRNA的DNA序列是:
ccccagGCACCGCTCCAAAGAGG,
将野生型基因中CGC突变为CAC的模板DNA是:KARS-R504H-120bp-oligo:ggtattgcattatgagagctctgaatattcatcctctgtggtctcgcgtccccagGCACCACTCCAAAGAGGGTCTCACGGAGCGCTTTGAGCTGTTTGTCATGAAGAAGGAGATATGCA,其中下划线部分的三个碱基为突变位点。
3.如权利要求1所述的KARS基因点突变小鼠模型的构建方法,其特征在于,其中,
对Founder小鼠进行鉴定所用的鉴定引物是:
KARS-PCR-S:CAGGCATCCCAAAAGAACAA;
KARS-PCR-A:GCTTAGGTAAAACACCAAGAAA。
4.如权利要求1所述的KARS基因点突变小鼠模型的构建方法,其特征在于:
其中,P532S的sgRNA的DNA序列为:KARS-P532S-sgRNA-S:CTGAGCTGAATGACCCCGTGCGG,
和/或
KARS-P532S-sgRNA-2S:ACAGCTGCCTCTGCCGCACGGGG,
将野生型基因中CGC突变为CAC的模板DNA是
KARS-P532S-120bp-oligo:
CGCTTTGAGCTGTTTGTCATGAAGAAGGAGATATGCAATGCCTATACTGAGCTGAATGACTCCGTGCGGCAGAGGCAGCTGTTTGAGGAGCAGGCCAAGgtgagtgagtgagtgagacta,其中下划线部分的三个碱基为突变位点。
5.如权利要求4所述的KARS基因点突变小鼠模型的构建方法,其特征在于:
对P532S位点突变的小鼠进行鉴定的鉴定引物是:
KARS-PCR-S:CAGGCATCCCAAAAGAACAA,
KARS-PCR-A:GCTTAGGTAAAACACCAAGAAA。
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CN108893495B (zh) * | 2018-06-20 | 2021-11-19 | 山东大学深圳研究院 | 一种Pdzd7基因突变动物模型的构建方法 |
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CN109266679A (zh) * | 2018-10-12 | 2019-01-25 | 中国医学科学院阜外医院 | 一种bmpr2基因突变大鼠的制备方法及应用 |
CN110250109B (zh) * | 2019-07-01 | 2021-09-24 | 上海交通大学医学院附属新华医院 | 乙醛酸代谢异常相关疾病模型的构建方法、组合物及试剂盒和应用 |
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5912140A (en) * | 1995-04-03 | 1999-06-15 | Cubist Pharmaceuticals, Inc. | Recombinant pneumocystis carinii aminoacyl tRNA synthetase genes, tester strains and assays |
AU2008360729A1 (en) * | 2008-08-18 | 2010-02-25 | Seoul National University Industry Foundation | Method for controlling cancer metastasis or cancer cell migration by modulating the cellular level of lysyl tRNA synthetase |
CN103388006A (zh) * | 2013-07-26 | 2013-11-13 | 华东师范大学 | 一种基因定点突变的构建方法 |
CN106148416A (zh) * | 2015-03-24 | 2016-11-23 | 华东师范大学 | Cyp基因敲除大鼠的培育方法及其肝微粒体的制备方法 |
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5912140A (en) * | 1995-04-03 | 1999-06-15 | Cubist Pharmaceuticals, Inc. | Recombinant pneumocystis carinii aminoacyl tRNA synthetase genes, tester strains and assays |
AU2008360729A1 (en) * | 2008-08-18 | 2010-02-25 | Seoul National University Industry Foundation | Method for controlling cancer metastasis or cancer cell migration by modulating the cellular level of lysyl tRNA synthetase |
CN103388006A (zh) * | 2013-07-26 | 2013-11-13 | 华东师范大学 | 一种基因定点突变的构建方法 |
CN106148416A (zh) * | 2015-03-24 | 2016-11-23 | 华东师范大学 | Cyp基因敲除大鼠的培育方法及其肝微粒体的制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Congenital visual impairment and progressive microcephaly due to lysyl‐transfer ribonucleic acid (RNA) synthetase (KARS) mutations: The expanding phenotype of aminoacyl‐transfer RNA synthetase mutations in human disease;Hugh J. McMillan等;《Journal of Child Neurology》;20140907;第2页左栏倒数第2段 * |
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