CN110250109B - 乙醛酸代谢异常相关疾病模型的构建方法、组合物及试剂盒和应用 - Google Patents

乙醛酸代谢异常相关疾病模型的构建方法、组合物及试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了乙醛酸代谢异常相关疾病模型的构建方法、组合物及试剂盒和应用，涉及生物技术领域。该构建方法包括对目标动物的Agxt基因进行编辑以使其编码的AGT蛋白具有D205N突变。该构建方法能够获得一种新的乙醛酸代谢异常相关疾病模型，该疾病模型具有基因突变与人类基因突变一致性高、高尿草酸出现时间早、自发形成的膀胱结石典型、经过单一诱石剂诱导后出现肾脏草酸钙钙质沉积的时间更短等特点，以该模型研究乙醛酸代谢异常相关疾病如Ⅰ型原发性高草酸尿症疾病或肾结石得到的结果更具有代表性、更可靠。

Description

乙醛酸代谢异常相关疾病模型的构建方法、组合物及试剂盒 和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种乙醛酸代谢异常相关疾病模型的构建方法、组合物及试剂盒和应用。
背景技术
Ⅰ型原发性高草酸尿症(Primary hyperoxaluria type 1,PH1)是由编码丙氨酸-乙醛酸转氨酶(Alanine-glyoxylate aminotransferase,AGT)的AGXT基因突变(大部分为点突变，现已发现超过170种突变类型)引起的罕见的常染色体隐性遗传病。AGXT基因突变导致肝脏AGT活性受损，该酶催化乙醛酸转化为甘氨酸的过程中断(图1)，导致肝内大量累积的乙醛酸被氧化成草酸并几乎全部由肾脏排出，形成高草酸尿症，进而引起尿石症，超过50％的PH1患者在青春期前进展为终末期肾病。PHl患者常有复发性肾结石(草酸钙结石沉积于肾盂、尿道)、肾钙质沉着症(草酸钙结石沉积于肾实质)、或者长时间肾结石、肾钙质沉着症后进展到ESRD。发病年龄通常在1～25岁之间。PHI受累者约10％在6个月之前就可出现症状，同时有其他的严重的疾病，他们通常不能发育成长，且伴有肾钙质沉着症、贫血、代谢性酸中毒。
PH1在欧洲及北美人群的患病率为1-3/100万，在中欧地区，每12万个新生婴儿中大约有1例为PHl。从美国、日本的登记资料来看，PHI型占儿科终末期肾脏病的1％-2％，在近亲结婚较多的国家更加流行。由于缺乏登记，中国的患病率至今未见报道。
此前，国际上仅有一种Ⅰ型原发性高草酸尿症的动物模型：即利用ES细胞打靶技术构建的Agxt基因缺失的PH1小鼠模型。该西班牙团队在胚胎干细胞克隆体中导入同源重组的模板，得到了Agxt基因第4号至第8号外显子之间大片段基因组缺失的胚胎干细胞，该基因组缺失区域被一段设计好的新霉素抗性的表达序列替代。继而将得到的胚胎干细胞导入母鼠子宫内，子代小鼠出生后经过PCR测序鉴定得到杂合子的Agxt+/-小鼠，该杂合子小鼠再经过交配得到子代纯合子Agxt-/-小鼠，至此得到Agxt基因缺失的PH1小鼠。经表型鉴定，该小鼠AGT表达缺失，体型与正常小鼠无异，肾脏经组织学切片观察基本正常，肾脏中仅有偶发的草酸钙结晶(60只中有5只观察到)。Agxt-/-小鼠在6个月大时出现24h尿草酸升高的尿液异常，其余尿液指标(尿电解质、尿酸、pH、白细胞、尿蛋白、尿胆素原、胆红素)无异常，另外Agxt-/-雄性小鼠中有半数长膀胱结石，雌性小鼠则无。
乙二醇能在体内代谢为乙醛酸，增加草酸合成的底物，诱发草酸钙结晶形成。因此，该团队在小鼠饮水中加入0.7％乙二醇进行诱导，能在3周的时间内将所有Agxt-/-小鼠都诱导出严重的肾脏草酸钙结晶，而正常小鼠在此条件下基本无肾脏病理变化，这也验证了该模型的病理表现—在适当的诱导下很容易形成肾钙质沉积。
总结来看，目前的PH1动物模型为Agxt基因缺失的小鼠模型，小鼠在疾病模拟以及体型方面都不是十分理想：一方面在于主要的病理指标尿草酸升高出现的时间较晚，6个月大时才出现升高(小鼠2个月左右即达到生理上的成年)，而临床PH1患者多为儿童，且有半数在青春期以前就出现肾脏功能损伤甚至肾衰竭的严重症状，很早就需要医疗手段的干预；另一方面在于小鼠的肝脏及肾脏代谢特点与人类有差异，较小的体型也不利于标本的重复取材和后续多种研究的开展。
此外，目前非基因缺陷的草酸钙结石动物模型的建立模式是：在诱石剂如乙二醇加氯化铵或乙二醇加1α(OH)维生素D3的作用下，诱导生成含草酸钙结石。乙二醇在体内代谢为草酸，从肾脏分泌排泄。1α(OH)维生素D3可促进肾小管上皮细胞对钙的吸收，长期应用1α(OH)维生素D3可使尿钙浓度升高，尿钙与草酸结合成为草酸钙，在肾组织内形成晶体，晶体逐渐生长、聚集形成结石。氯化铵可以酸化尿液，长期服用可造成肾小管功能障碍，许多研究表明肾小管损害利于晶体滞留和生长。这种单纯利用化合物进行诱导的结石动物模型，一方面无法模拟临床PH1患者中AGXT基因突变的病因特点，无法模拟PH1因AGXT基因突变引起的肝脏代谢异常及中间代谢通路的异常造成的高草酸尿及泌尿系统结石等病理表现；另一方面，过量诱石剂的使用会造成不可预估的对于其他器官的毒性影响，长诱导时间和高诱导剂量不可避免地会加重以上负面影响。
建立基因型和表现型都接近人类PH1的动物模型，不但可以深入了解尿结石的形成过程和机制及尿石成因的代谢问题，而且还可以帮助筛选抗结石的中西药物，特别是有利于基因治疗药物(修复缺陷的基因及通过基因层面进行永久干预)的研究与应用。
因此，亟需建立新的动物模型，这对于探讨尿结石的发病机制，预防和延缓结石形成，寻找防治尿结石症的药物等方面均有重要的意义。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种乙醛酸代谢异常相关疾病模型的构建方法、组合物及试剂盒和应用，该构建方法能够获得一种乙醛酸代谢异常相关疾病模型，乙醛酸代谢异常相关疾病为Ⅰ型原发性高草酸尿症或肾结石，该疾病模型具有基因突变与人类基因突变一致性高、高尿草酸出现时间早、经过单一诱石剂诱导后出现肾脏草酸钙钙质沉积的时间更短，能自发出现典型的膀胱结石等特点，以该模型研究Ⅰ型原发性高草酸尿症疾病得到的结果更具有代表性、更可靠。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种乙醛酸代谢异常相关疾病模型的构建方法，其包括：对目标动物的Agxt基因进行编辑以使其编码的AGT蛋白具有D205N突变。
优选地，所述构建方法还包括：
对经所述编辑的目标动物进行诱石剂诱导；
优选地，所述诱石剂选自乙二醇，更优选为0.8％-1.2％的乙二醇溶液。
本发明的构建方法可以得到AGT蛋白发生D205N点突变导致的乙醛酸代谢异常引起相关疾病的动物模型，如Ⅰ型原发性高草酸尿症疾病模型或肾结石动物模型，具有D205N点突变的Ⅰ型原发性高草酸尿症疾病模型或肾结石动物模型能够更早(例如在1个月大时)地显示出高尿草酸(而现有的模型需要在6个月大时才会出现高尿草酸)，这与临床Ⅰ型原发性高草酸尿症患者较早的发病年龄相符，为探索有效的治疗方法提供了理想的疾病模型，使得在未成年以前对其做疾病治疗的干预研究提供了先决条件。此外，使用诱石剂在短期时间(例如2周)内即可诱导出肾脏严重的草酸钙钙质肾积表型，在更短期如1周的时候便有了少量草酸钙沉积；而现有的肾结石模型需要经过至少3周时间且要联合不同的诱导剂一起诱导才能出现严重的肾脏草酸钙结晶。最后需要注意的是，本发明得到的Ⅰ型原发性高草酸尿症大鼠模型，在8个月大时能形成典型的膀胱结石(50％为二水草酸钙、40％为磷酸钙、10％为碳酸磷灰石)。
因此，由本发明的构建方法得到的Ⅰ型原发性高草酸尿症疾病模型或肾结石疾病模型，具有高尿草酸出现时间早、经过单一诱石剂诱导后出现肾脏草酸钙钙质沉积的时间更短、能自发形成膀胱结石。同上等特点，以该模型研究Ⅰ型原发性高草酸尿症疾病或肾结石疾病模型得到的结果更具有代表性、更可靠，这是一种新的较理想Ⅰ型原发性高草酸尿症疾病模型或肾结石疾病模型，适合用于到Ⅰ型原发性高草酸尿症疾病或肾结石的研究中，为该疾病的发病机制研究以及治疗药物筛选提供模型基础。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对所述目标动物的Agxt基因进行编辑；
优选地，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对所述目标动物的Agxt基因进行编辑具体包括：将组合物导入所述目标动物的受精卵中；
其中，所述组合物含有sgRNA和同源重组模板序列；所述同源重组模板序列用于指导Agxt基因发生突变以编码出具有D205N突变的AGT蛋白；
优选地，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
sgRNA的序列如下：GTGGACTCGGTGGCATCATT。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述同源重组模板序列中的核心位置具有编码天门冬酰胺残基的密码子序列；
所述核心位置对应于Agxt基因编码AGT蛋白的第205位氨基酸的位置。
优选地，所述密码子序列为AAT或AAC；
优选地，所述ssODN的序列如SEQ ID NO.2所示；
ssODN的序列如下：
gtgctgcccccatactcatgattcctctaggtatcagtgcctactcctggtgaattcggtggcatccc tgggcggagtccctatctacatggaccaacaaggtaagagcatgccttagac。
ssODN的序列中的第46-75位(下划线)人源化序列，以此为同源重组模板，可以得到人源化的点突变疾病模型，模拟人类AGXT基因突变中的p.D205N位点突变，Agxt基因序列发生突变c.613G>A。以这样的疾病模型进行研究的所得的结果，才更具有代表性和说服力。
优选地，所述组合物还含有SpCas9。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述目标动物为大鼠。
相比小鼠疾病模型，大鼠具有血、尿样本充足、在体实验可操作性强(特别是手术操作)、大鼠肝脏代谢特征更接近人类的特点，大鼠寿命比小鼠长约1年，也使得研究中干预手段的持久性评估成为可能。研究Ⅰ型原发性高草酸尿症这样的肝细胞代谢异常疾病时，大鼠模型中获得结果显然更具有代表性、更可靠。本发明在国际上首次构建了大鼠Ⅰ型原发性高草酸尿症模型，具有显著意义。
此前国际上只有Agxt基因敲除的小鼠模型，没有Agxt基因点突变的模型，更没有序列人源化的点突变动物模型。以往因为体外大鼠胚胎干细胞(ES细胞)培养困难，传统胚胎干细胞打靶的方法无法对大鼠胚胎细胞进行基因编辑，以往基本哺乳动物基因编辑以小鼠为主。基因编辑工具CRISPR/Cas9等的出现，为在各种物种的细胞中定点编辑基因序列提供了有力的工具和手段。
但需要说明的是，也可以采用其他的技术构建出上述AGT蛋白发生D205N点突变的Ⅰ型原发性高草酸尿症疾病模型和肾结石疾病模型，例如TALEN或ZFN等技术。
第二方面，本发明提供了一种用于构建乙醛酸代谢异常相关疾病模型的组合物，所述乙醛酸代谢异常相关疾病为Ⅰ型原发性高草酸尿症或肾结石，其含有用于对目标动物的Agxt基因进行编辑以使其编码的AGT蛋白具有D205N突变的组分。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述组合物包括用于经所述编辑的目标动物进行诱导的诱石剂；
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述诱石剂选自乙二醇，更优选为0.8％-1.2％的乙二醇溶液。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述组分包括sgRNA和同源重组模板序列；所述同源重组模板序列用于指导Agxt基因发生突变以编码出具有D205N突变的AGT蛋白；
优选地，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述同源重组模板序列(ssODN)中的核心位置具有编码天门冬酰胺残基的密码子序列；
所述核心位置对应于Agxt基因编码AGT蛋白的第205位氨基酸的位置。
优选地，所述密码子序列为AAT或AAC；
优选地，所述同源重组模板序列的序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，所述组合物还含有SpCas9；
优选地，所述目标动物为大鼠。
采用该组合物可以方便、快速构建出Ⅰ型原发性高草酸尿症疾病模型或肾结石疾病模型，所构建的Ⅰ型原发性高草酸尿症疾病模型或肾结石疾病模型具有高尿草酸出现时间早、经过诱石剂诱导后出现肾脏草酸钙钙质沉积的时间更短等特点，以该模型研究Ⅰ型原发性高草酸尿症疾病得到的结果更具有代表性、更可靠。
第三方面，本发明提供了一种乙醛酸代谢异常相关疾病模型的试剂盒，其包括有第二方面所述的组合物。
采用该试剂盒可以方便、快速构建出Ⅰ型原发性高草酸尿症疾病模型或肾结石疾病模型，所构建的Ⅰ型原发性高草酸尿症疾病模型或肾结石疾病模型具有高尿草酸出现时间早、经过诱石剂诱导后出现肾脏草酸钙钙质沉积的时间更短等特点，以该模型研究Ⅰ型原发性高草酸尿症疾病得到的结果更具有代表性、更可靠。
第四方面，本发明提供了由上述的乙醛酸代谢异常相关疾病模型的构建方法所得到的乙醛酸代谢异常相关疾病模型在乙醛酸代谢异常相关疾病研究中的应用，所述乙醛酸代谢异常相关疾病为Ⅰ型原发性高草酸尿症或肾结石。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述研究是以非疾病的诊断或治疗为目的。
采用本发明构建方法所构建的疾病模型用于到Ⅰ型原发性高草酸尿症或肾结石研究中，该疾病模型的表现更符合后贴近临床Ⅰ型原发性高草酸尿症的表现，以该疾病模型作为研究对象所获得结果显然更具有代表性、更可靠。
总之，由本发明构建方法得到的基因型和表现型都接近人类Ⅰ型原发性高草酸尿症疾病的动物模型，不但可以深入了解尿结石的形成过程和机制及尿石成因的代谢问题，而且还可以帮助筛选抗结石的中西药物，特别是有利于基因治疗药物(修复缺陷的基因及通过基因层面进行永久干预)的研究与应用。这对于探讨尿结石的发病机制，预防和延缓结石形成，寻找防治尿结石症的药物等方面均有重要的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为体内草酸代谢示意图。
图2为实施例1中利用CRISPR/Cas9构建PH1大鼠的设计示意图。
图3为对出生的大鼠基因型鉴定的结果。
图4为PH1大鼠基因功能及表型结果。
图5为PH1大鼠和野生型鼠的尿液电解质结果比较。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，针对大鼠Agxt基因的第5号外显子(第205位氨基酸附近)设计对应的sgRNA，并以ssODN为模板，利用同源重组原理用一段20bp长度的携带p.D205N位点突变的人源化序列替换大鼠原有序列，不改变氨基酸序列。利用CRISPR/Cas9构建PH1大鼠的设计策略见图2。
本实施例通过CRISPR/Cas9系统构建Agxt突变大鼠品系，操作如下：
(1)我们首先利用Cas9系统和一个精确设计的同源序列，在大鼠Agxt基因上引入一个特定的点突变，对应于人类第183位氨基酸残基天冬氨酸(大鼠Agxt中的205位)以及附近另外三个点突变(使得该区域的基因组序列与人类一致，不改变编码的氨基酸)(如图2所示)。Cas9组件(SpCas9和sgRNA:SEQ ID NO.1)和设计的ssODN供体模板(见表1-2，SEQ IDNO.2，ssODN的序列中的第46-75位人源化序列，以此为同源重组模板，可以得到人源化的点突变疾病模型，模拟人类AGXT基因突变中的p.D205N位点突变)共同注射到单细胞阶段的Sprague-Dawley(SD)大鼠胚胎，后将胚胎移植到代孕母鼠子宫中。
(2)待大鼠出生后，剪脚趾提取基因组，用PCR方法(引物序列见表1-1中的Agxt-on-F/R)经过基因型鉴定，发现产生了9个大鼠品系，包括1个部分人源化突变位点AgxtD205N和8个不同的移码突变(图3)。
表1-1为构建PH1大鼠模型及表型验证试验中使用的部分引物序列
Figure BDA0002114740610000101
Figure BDA0002114740610000111
表1-2构建PH1大鼠模型所用的单链核苷酸序列
Figure BDA0002114740610000112
选用同时携带突变位点AgxtD205N和部分人源化序列的F0代大鼠(图3中携带replaced human sequence的大鼠，图3中左侧：“X/数50”表示出生的50只子代里，有X只是此基因型，例如4/50，表示出生的50只子代里，有4只是此基因型)进行繁殖，同时将携带D205N突变和人源化序列的纯合子后代选作为本实施例的PH1大鼠。因此，我们在Sprague-Dawley遗传背景下建立了一种新的PH1大鼠品系。
(3)同时，我们检测了构建模型时SpCas9的脱靶效应。首先利用分析网站预测该sgRNA序列的脱靶位点(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)，选取评分最高的最有可能脱靶的7个位点进行深度测序(位点及测序引物见表1-1(Hitom-Agxt-OT1-7-F/R))，结果发现无明显脱靶效应(见表2)，证实了此技术的安全性和模型的可靠性。
表2为构建PH1大鼠过程中对于CRISPR/Cas9基因编辑器脱靶位点的深度测序分析结果
Figure BDA0002114740610000113
Figure BDA0002114740610000121
实验例1
AgxtD205N PH1大鼠品系的表征：
(1)Agxt的基因功能表征：
首先，我们检测了实施例1得到的纯合子AgxtD205N大鼠Agxt基因的表达。由于D205N突变影响mRNA稳定性，利用实时荧光定量PCR(引物序列见表1-1中的Agxt-qPCR-F/R)检测AgxtD205N大鼠肝组织中Agxt mRNA水平，发现其显著降低(图4-A)。与之一致的是，与野生型对照相比，在免疫蛋白印迹实验下，AgxtD205N大鼠的蛋白水平几乎不可见(图4-B、图4-C)，表明D205N突变极大地影响了实际的AGT水平和稳定性，这与人类中大部分点突变造成的影响高度相符。体外测定AGT活性发现，AgxtD205N大鼠的AGT活性显著低于同窝WT大鼠(图4-D)。
(2)PH1大鼠的尿液表征：
我们分析了尿液，记录24h尿量，利用离子色谱分析法检测尿液中的草酸浓度，将其换算成24h草酸量。发现早在4周大时，AgxtD205N品系大鼠的24h尿草酸量显著升高，是野生型大鼠的3倍左右(图4-E)。收集AgxtD205N大鼠和同窝野生型大鼠的随机尿，直接涂片，在光学显微镜下观察。我们在大多数AgxtD205N大鼠(90％，18/20只)中发现了特征性的四面体草酸钙晶体，同时对照组WT同窝出生大鼠很少有类似的草酸钙晶体(4％，1/25)(图4-F)。高尿草酸和典型草酸钙晶体证明，表明实施例1构建的AgxtD205N大鼠品系是PH1的成功模型。
在AgxtD205N突变鼠和野生型大鼠之间，用日立全自动生化分析仪检测以下尿液生化参数，未观察到可检测到的差异：Na、K、Ca、Cl、P(图5)，表明AgxtD205N大鼠中这些电解质离子的稳态未受到干扰。
(3)PH1大鼠的肾脏表征：
对AgxtD205N大鼠和野生型大鼠进行低剂量的短期乙二醇化学诱导，以进一步验证草酸代谢缺陷。在使用1％乙二醇自由饮水诱导2周后，取大鼠肾脏制作石蜡切片，并用Pizzolato’s染色显示草酸钙结晶，结果显示AgxtD205N大鼠表现出广泛的肾钙质沉着伴肾小管严重扩张，而野生型对照组在相同的两周内耐受良好(图4-G)。总之，这些数据表明PH1大鼠模型的成功产生，并表明D205N突变显著破坏AGT并引起一系列表型。
(4)其他表征：
在大鼠8个月大时，解剖膀胱均能观察到较大的膀胱结石(图4-H、图4I)，利用光谱分析法对结石进行成分分析，结果显示50％为二水草酸钙、40％为磷酸钙、10％为碳酸磷灰石。
综上本发明实施例首次利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对Agxt基因进行编辑，构建的AgxtD205N大鼠是世界上首个点突变的PH1模型，不仅模拟临床病人中p.D183N位点的突变，而且在不改变其余氨基酸序列的情况下，引入一段人源化基因序列，能很好的模拟临床的点突变序列特点。由于是人的DNA序列和相关突变，如果在动物模型中有效，今后有望使用同样的基因编辑序列和方案治疗带有同一突变的PH1病人。以上优势是国外之前报道的Agxt基因敲除小鼠无法比拟的。另一方面，该点突变PH1模型选用的是更接近人类肝脏代谢特性的大鼠作为疾病模型，在PH1疾病表型上本发明得到的点突变大鼠不仅具有“高尿草酸出现时间早”的独特优势，另外8个月大时都会长膀胱结石，在经过更短期的诱石剂诱导后具有同Agxt基因敲除小鼠类似，甚至更严重的肾脏草酸钙钙质沉积表现。该疾病模型具有广阔的应用领域，可以应用到Ⅰ型原发性高草酸尿症疾病的发病机制、相关治疗药物的筛选中。本发明为该疾病的发病机制研究以及治疗药物筛选提供了更较理想的模型基础。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海交通大学医学院附属新华医院
<120> 乙醛酸代谢异常相关疾病模型的构建方法、组合物及试剂盒和应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtggactcgg tggcatcatt 20
<210> 2
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtgctgcccc catactcatg attcctctag gtatcagtgc ctactcctgg tgaattcggt 60
ggcatccctg ggcggagtcc ctatctacat ggaccaacaa ggtaagagca tgccttagac 120

Claims (26)

1.一种乙醛酸代谢异常相关疾病模型的构建方法，所述乙醛酸代谢异常相关疾病为Ⅰ型原发性高草酸尿症或肾结石，其特征在于，其包括：对目标动物的Agxt基因进行编辑以使其编码的AGT蛋白具有D205N突变。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括：
对经所述编辑的目标动物进行诱石剂诱导。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述诱石剂为乙二醇。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述诱石剂为0.8%-1.2%的乙二醇溶液。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对所述目标动物的Agxt基因进行编辑。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对所述目标动物的Agxt基因进行编辑具体包括：将组合物导入所述目标动物的受精卵中；
其中，所述组合物含有sgRNA和同源重组模板序列；所述同源重组模板序列用于指导Agxt基因发生突变以编码出具有D205N突变的AGT蛋白。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述同源重组模板序列中的核心位置具有编码天门冬酰胺残基的密码子序列；
所述核心位置对应于Agxt基因编码AGT蛋白的第205位氨基酸的位置。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述密码子序列为AAT或AAC。
10.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述同源重组模板序列的序列如SEQID NO.2所示。
11.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述组合物还含有SpCas9。
12.根据权利要求1-11任一项所述的构建方法，其特征在于，所述目标动物为大鼠。
13.由权利要求1-12任一项所述的乙醛酸代谢异常相关疾病模型的构建方法所得到的乙醛酸代谢异常相关疾病模型在乙醛酸代谢异常研究中的应用，其特征在于，所述乙醛酸代谢异常相关疾病为Ⅰ型原发性高草酸尿症或肾结石。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述研究是以非疾病的诊断以及非疾病的治疗为目的。
15.一种用于构建乙醛酸代谢异常相关疾病模型的组合物，所述乙醛酸代谢异常相关疾病为Ⅰ型原发性高草酸尿症或肾结石，其特征在于，其含有用于对目标动物的Agxt基因进行编辑以使其编码的AGT蛋白具有D205N突变的组分。
16.根据权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括用于经所述编辑的目标动物进行诱导的诱石剂。
17.根据权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述诱石剂选自乙二醇。
18.根据权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述诱石剂选自0.8%-1.2%的乙二醇溶液。
19.根据权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述组分包括sgRNA和同源重组模板序列；所述同源重组模板序列用于指导Agxt基因发生突变以编码出具有D205N突变的AGT蛋白。
20.根据权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
21.根据权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述同源重组模板序列中的核心位置具有编码天门冬酰胺残基的密码子序列；
所述核心位置对应于Agxt基因编码AGT蛋白的第205位氨基酸的位置。
22.根据权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述密码子序列为AAT或AAC。
23.根据权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述同源重组模板序列的序列如SEQID NO.2所示。
24.根据权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有SpCas9。
25.根据权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述目标动物为大鼠。
26.一种用于构建乙醛酸代谢异常相关疾病模型的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求15-25任一项所述的组合物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2750811C (en) * 2009-01-30 2017-08-29 Amsterdam Molecular Therapeutics (Amt) Ip B.V. Alanine-glyoxylate aminotransferase therapeutics
CN103388006B (zh) * 2013-07-26 2015-10-28 华东师范大学 一种基因定点突变的构建方法
CN104593418A (zh) * 2015-02-06 2015-05-06 中国医学科学院医学实验动物研究所 一种人源化大鼠药物评价动物模型建立的方法
US20190153430A1 (en) * 2016-08-02 2019-05-23 Kyoto University Method for genome editing
CA3033788A1 (en) * 2016-08-17 2018-02-22 Factor Bioscience Inc. Nucleic acid products and methods of administration thereof
CN106929533B (zh) * 2017-03-10 2021-01-12 上海交通大学医学院附属新华医院 Kars基因点突变小鼠模型的构建方法及其应用
CN107789359A (zh) * 2017-10-13 2018-03-13 上海交通大学医学院附属新华医院 一种痛性糖尿病周围神经病变大鼠改良模型的构建方法
CN109022485B (zh) * 2018-08-16 2021-02-02 华东师范大学 一种视神经萎缩动物模型的构建方法、试剂盒和应用
CN109797166A (zh) * 2018-11-20 2019-05-24 陕西师范大学 基于CRISPR-Cas9靶向基因组修饰技术构建Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系方法
CN109486860B (zh) * 2018-12-04 2022-04-08 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 一种tigit人源化小鼠模型的构建方法及其应用

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