CN109797166A - 基于CRISPR-Cas9靶向基因组修饰技术构建Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于CRISPR‑Cas9靶向基因组修饰技术构建Egr2‑Luciferase‑KI‑HEK293细胞系的方法，将靶向Egr2基因的打靶载体与打靶供体共转HEK293细胞系，使携带荧光素酶报告基因的打靶载体在Egr2基因组下游目标位点处正确重组，重组基因受内源性Egr2基因启动子的调控，获得单一稳定的Egr2‑Luciferase‑KI‑HEK293细胞系，并验证Egr2‑Luciferase‑KI‑HEK293细胞系中Luciferase表达变化是否能真实反映内源性Egr2基因的相对表达量及表达变化。为毛发生长和中枢神经系统相关研究提供一种新的实验思路及解决方案。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和药理学领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas9 靶向基因组修饰技术构建Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系的新方法。
背景技术
早期生长反应蛋白2(Early growth response protein2，Egr-2)属于即刻早期基因家族，Egr2可与富含GC序列的靶基因启动子特异序列结合具有转录激活作用，为转录因子。Egr2属于一个小的蛋白质亚家族，该家族还包括早期生长反应基因1(EGR-1，又名krox-24、Zif268、NGFI-A和 TIS8)、早期生长反应基因3(EGR-3)和神经生长因子诱导的克隆C(nerve growth factor-induced clone C,NGFI-C)，这些蛋白可以与相似的DNA序列结合，但其作用的结构域不同。Egr2基因有4种转录本，编码2种亚型蛋白：转录本1～3编码亚型a，转录本4编码亚型b。Egr2基因结构在小鼠、鸡和人中都高度保守。Egr2基因编码的蛋白含有3个锌指结构：N-末端保守性较高；C-末端保守性较差；主要是以锌指结构与特异DNA序列结合，与该基因转录激活或抑制功能有关。
研究发现，Egr2是多条信号通路调节的靶蛋白，一般被激活后会参与调控某些下游基因的表达，进而影响细胞或个体的生理功能。Egr2是施旺细胞(Schwann cell)的标志因子，也是一个调节髓鞘化的重要因子。在后脑发育、肿瘤抑制、外周神经髓鞘形成及单核细胞命运决定中都发挥着重要作用。Egr2本身的表达又受到诸多上游信号通路如Wnt、FGF等信号通路的调节，进而影响下游基因表达。
头发是哺乳动物特有的专用表皮附属物。毛茸茸的大衣在温度调节中扮演着重要的角色，同时也起到伪装的作用。一些毛发，如胡须，已经演变为触觉器官，对动物行为很重要。在人类中，头发不那么重要，并且通常更多地被视为美容优势。毛囊提供了角质形成细胞的储库，它可以被募集到皮肤缺损的再上皮化。在胎儿期间，毛发从原始表皮发育而来。Egr2在毛囊分化中发挥重要作用，据研究报道，Egr2在毛基质中的表达会引起毛轴不同的分化特征。此外，Egr2在脂肪形成、施旺细胞及中枢神经系统的发育过程中也发挥重要作用。
CRISPR是广泛存在于细菌和古细菌基因组中的规律成簇间隔短回文重复序列。CRISPR/Cas9系统是由最简单的type ll CRISPR改造而来，该系统由单链的guide RNA和有核酸内切酶活性的Cas9蛋白构成。sgRNA将会引导编码的Cas蛋白(具有DNA核酸酶和解旋酶的活性)对靶基因DNA进行识别和特异性切割。所以通过人工设计具有引导作用的sgRNA(short guide RNA)，可以引导Cas9对宿主细胞DNA进行定点切割，然后通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)或同源重组(homologous recombination，HR)两种修复途径的机制进行修复，实现基因编辑。
目前，基于细胞转录激活检测的报告基因系统，是建立药物筛选模型的常用手段。传统检测基因表达调控的方法主要是通过RT-PCR、Western Blot 和将目标基因启动子克隆到携带报告基因的表达检测载体中等手段来实现。这些方法要么费时，繁琐，要么难以准确反映基因组上基因表达情况。
基因编辑技术的发展，使得我们可以利用CRISPR/Cas9技术建立一种基于细胞内源性基因表达改变的新型报告系统，使报告基因的表达直接受内源靶基因启动子调控，能够真实反映细胞内真实的转录水平。荧光素酶报告基因已成为基础研究中常用的细胞标记与示踪的方法，其具有方便快捷、安全直观的优点。但是到目前为止，尚没有针对Egr2的新型报告系统，也没有更多的关于Egr2转录调控调节和新药筛选的文献资料可以参考。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于，提供一种基于 CRISPR-Cas9靶向基因组修饰技术构建Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系的方法，该细胞系是一种针对内源性Egr2表达水平检测的报告系统。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种基于CRISPR-Cas9靶向基因组修饰技术构建 Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系的方法，其特征在于，将靶向Egr2基因的打靶载体与打靶供体共转HEK293细胞系，使携带荧光素酶报告基因的打靶载体在Egr2基因组下游目标位点处正确重组，重组基因受内源性Egr2基因启动子的调控，获得单一稳定的Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系，并验证Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系中Luciferase表达变化是否可以真实反映内源性Egr2基因的相对表达量及表达变化。
具体按下列步骤实施：
(1)靶向Egr2基因3′非编码区的sgRNA的设计、构建sgRNA打靶载体及活性检测：
在NCBI上查找Egr2基因的基因组序列，在其终止密码子下游选择四个 sgRNA结合位点并设计合成相应的sgRNA引物，将sgRNA引物退火后连入 pU6-sgRNA1.0，与携带Cas9的表达载体共转染HEK293细胞，转染72小时后，提取基因组DNA，对打靶区域进行PCR扩增，并利用T7E1法筛选最高切割活性的sgRNA；
(2)构建携带Cas9、sgRNA表达元件的真核表达载体：
将筛选获得的靶向Egr2基因的sgRNA表达元件、Cas9表达元件依次连入真核表达载体获得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA片段；
(3)构建靶向Egr2基因的打靶供体pUC19/Egr2-donor：
靶向Egr2基因的打靶供体携带外源片段cDNA，包括 T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA片段，及其两端与断裂位点上下游分别具有相同序列的上、下游同源臂，该上、下游同源臂是长度约为1000bp的DNA片段。
以人源化细胞基因组为模板，PCR扩增上、下游同源臂。依次连入携带 T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA元件的表达载体的两端。
其中：上游同源臂序列如下：
accgcctcctcctccttattctggctgtgcaggagacctctaccaggacccttctgcgttc ctgtcagcagccaccacctccacctcttcctctctggcctacccaccacctccttcctatccatc ccccaagccagccacggacccaggtctcttcccaatgatcccagactatcctggattctttccat ctcagtgccagagagacctacatggtacagctggcccagaccgtaagccctttccctgcccactg gacaccctgcgggtgccccctccactcactccactctctacaatccgtaactttaccctgggggg ccccagtgctggggtgaccggaccaggggccagtggaggcagcgagggaccccggctgcctggta gcagctcagcagcagcagcagccgccgccgccgccgcctataacccacaccacctgccactgcgg cccattctgaggcctcgcaagtaccccaacagacccagcaagacgccggtgcacgagaggccctacccgtgcccagcagaaggctgcgaccggcggttctcccgctctgacgagctgacacggcacatcc gaatccacactgggcataagcccttccagtgtcggatctgcatgcgcaacttcagccgcagtgac cacctcaccacccatatccgcacccacaccggtgagaagcccttcgcctgtgactactgtggccg aaagtttgcccggagtgatgagaggaagcgccacaccaagatccacctgagacagaaagagcgga aaagcagtgccccctctgcatcggtgccagccccctctacagcctcctgctctgggggcgtgcag cctgggggtaccctgtgcagcagtaacagcagcagtcttggcggagggccgctcgccccttgctc ctctcggacccggacacct。
下游同源臂序列如下：
tttgctaccccacttccccttattttgacccatcacaggtttttgaccctggatgtcagag ttgatctaagacgttttctacaataggttgggagatgctgatcccttcaagtggggacagcaaaa agacaagcaaaactgatgtgcactttatggcttgggactgatttgggggacattgtacagtgagt gaagtatagcctttatgccacactctgtggccctaaaatggtgaatcagagcatatctagttgtc tcaacccttgaagcaatatgtattataaactcagagaacagaagtgcaatgtgatgggaggaaca tagcaatatctgctccttttcgagttgtttgagaaatgtaggctattttttcagtgtatatccac tcagattttgtgtatttttgatgtacactgttctctaaattctgaatctttgggaaaaaatgtaa agcatttatgatctcagaggttaacttatttaagggggatgtacatatattctctgaaactaggatgcatgcaattgtgttggaagtgtccttggtgccttgtgtgatgtagacaatgttacaaggtctg catgtaaatgggttgccttattatggagaaaaaaaatcactccctgagtttagtatggctgtata tttctgcctattaatatttggaattttttttagaaagtatatttttgtatgctttgttttgtgac ttaaaagtgttacctttgtagtcaaatttcagataagaatgtacataatgttaccggagctgatt tgtttggtcattagctcttaatagttgtgaaaaaataaatctattctaacgcaaaaccactaact gaagttcagataatggatggtttgtgactatagtgtaaataaatacttttcaacaatatttttgt tgcagaaatcatttctgaaatacttactgggtgggaattaaacagtcattcagtctctgtgggaa tattttttaaaaacagcactaagcaccagtga。
(4)Egr2-Luciferase细胞系的建立
将pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA片段与pUC19/Egr2-donor共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周左右，待细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，再对克隆化后的细胞进行PCR鉴定并测序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶供体在目标位点处正确重组，最终获得单一稳定Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系；
(5)克隆并构建Egr2基因的转录激活因子表达载体：
转录激活因子表达载体pUC19/CMV-AREB6，用于Egr2基因的转录激活实验研究；
(6)验证Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系中Luciferase表达变化是否可以真实反映内源性Egr2基因的相对表达量及表达变化：
使用所构建的Egr2基因的转录激活因子AREB6表达载体 pUC19/CMV-AREB6分别转染HEK293-Egr2-T2A-luciferase-KI细胞系和野生型HEK293细胞系，并对Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系中的 Luciferase活性及HEK293细胞系中Egr2分子的mRNA表达水平分别进行检测；通过对knock-in细胞系中Luciferase表达活性与HEK293细胞中的Egr2 mRNA表达水平及变化的比较，进一步验证Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系中的Luciferase活性是否可以准确反映Egr2分子的相对表达变化。
根据本发明，所述的打靶载体携带 pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA片段，既含有核酸酶Cas9表达框也含有靶向Egr2的打靶效率高的sgRNA表达组件。
进一步地，所述的靶向Egr2基因的打靶供体携带外源片段cDNA，包括 T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA片段，及其两端与断裂位点上下游分别具有相同序列的上、下游同源臂，该上、下游同源臂是长度约为500到1000bp的DNA片段。
所述靶向Egr2的sgRNA其识别位点位于Egr2的终止密码子下游；其中：
sgRNA1序列为：5′tggggacccctggccaaga 3′；
sgRNA2序列为：5′ccctttcctgtccctctct 3′；
sgRNA3序列为：5′ggggaggctcagaaggagg 3′；
sgRNA4序列为：5′gtgagttgactatcaaccca 3′；
合成的相应sgRNA，室温退火后连入pU6-sgRNA1.0，筛选后获得sgRNA 表达组件，并检测其打靶效率。
本发明利用了CRISPR/Cas9技术，构建了Egr2-Luciferase-KI-HEK293 细胞系，该细胞系是一种检测细胞内源性Egr2基因表达水平新型荧光素酶报告系统，使报告基因的表达直接受内源靶基因启动子调控，经过转录激活因子AREB6对Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系的转录激活，结果表明， Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系内的Luciferase表达水平能够真实反映细胞内Egr2真实的表达水平。从而能够用于筛选对Egr2具有转录调控作用的因子和药物。为毛发生长和中枢神经系统相关研究提供一种新的实验思路及解决方案。同时，通过在靶基因下游整合入报告基因来检测靶基因表达的方法也可广泛应用于其它各种基因的相关研究。
附图说明
图1是所构建的Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系的结构示意图。
图2是结构示意图；
图3是携带sgRNAs载体质粒转染HEK293后，TSF区PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；
图4是携带sgRNAs载体质粒转染HEK293后，对TSF区PCR扩增产物 T7E1酶切琼脂糖凝胶电泳图；
图5是携带sgRNA及Cas9的表达载体结构示意图。
图6是打靶Donor载体结构示意图。
图7是对细胞经有限稀释法进行克隆化后每个克隆的Luciferase活性检测图。
图8a是对Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系克隆化后整合型条带测序鉴定时相关引物的位点标注等。
图8b是对Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系克隆化后clone9的PCR 产物中整合型条带上游接头进行胶回收测序结果。
图8c是对Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系克隆化后clone9的PCR 产物中整合型条带下游接头进行胶回收测序结果。
图9是转录激活因子AREB6表达载体pUC19/CMV-AREB6转染 Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系后Luciferase的检测结果。
图10是转录激活因子AREB6表达载体pUC19/CMV-GR转染野生型HEK293 细胞系后，AREB6分子的mRNA表达水平的检测结果。
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明。
具体实施方式
本实施例给出一种基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术构建 Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系的方法，并验证该细胞系的可靠性。
为了获得高切割活性的sgRNA，申请人构建了携带sgRNA表达框的打靶载体，与携带了Cas9的表达载体共转染，使Cas9和sgRNA同时进入细胞，分析筛选高切割活性的sgRNA。
为了实现荧光素酶报告基因在目标基因组上的靶向整合，申请人构建了同时携带上、下游同源臂、报告基因、正、负筛选基因和自剪切小肽的打靶供体。
为了测试报告系统的可靠性，申请人构建了一种转录激活因子AREB6。
基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术构建 Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系的方法，包括筛选靶向Egr2基因3′非编码区的sgRNA，构建携带靶向Egr2基因的sgRNA的打靶载体，构建携带 Cas9、靶向Egr2基因的sgRNA的打靶载体；构建携带上下游同源臂及外源DNA片段的打靶供体；将打靶载体与打靶供体共同导入HEK293细胞用正、负筛选基因筛选，将筛选稳定后的细胞进行克隆化，对克隆化后的细胞克隆进行测序鉴定，使用以报道的对目标基因有调控作用的转录因子等验证所建立的细胞系的稳定性。证明报告基因与目标基因的活性直接相关；证明该报告系统能够在上游转录因子及小分子活性药物筛选中发挥作用。
具体实施步骤为：
(1)靶向Egr2基因3′非编码区的sgRNA的设计、构建sgRNA打靶载体及活性检测：
在NCBI上查找Egr2基因的基因组序列，在其终止密码子下游选择四个 sgRNA结合位点并设计合成相应的sgRNA引物，将sgRNA引物退火后连入 pU6-sgRNA1.0，与携带Cas9的表达载体共转染HEK293细胞，转染72小时后，提取基因组DNA，对打靶区域进行PCR扩增，并利用T7E1法筛选最高切割活性的sgRNA；
(2)构建携带Cas9、sgRNA表达元件的真核表达载体：
将筛选获得的靶向Egr2基因的sgRNA表达元件、Cas9表达元件依次连入真核表达载体获得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA片段；
(3)构建靶向Egr2基因的打靶供体pUC19/Egr2-donor：
靶向Egr2基因的打靶供体携带外源片段cDNA，包括 T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA片段，及其两端与断裂位点上下游分别具有相同序列的上、下游同源臂，该上、下游同源臂是长度约为500到1000bp的DNA片段。
以人源化细胞基因组为模板，PCR扩增上、下游同源臂，依次连入携带 T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA元件的表达载体的两端。
(4)Egr2-Luciferase细胞系的建立
将pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA片段与pUC19/Egr2-donor共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周左右，待细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，再对克隆化后的细胞进行PCR鉴定并测序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶供体在目标位点处正确重组，最终获得单一稳定Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系；
(5)克隆并构建Egr2基因的转录激活因子表达载体：
转录激活因子表达载体pUC19/CMV-AREB6，用于Egr2基因的转录激活实验研究；
(6)验证Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系中Luciferase表达变化是否可以真实反映内源性Egr2基因的相对表达量及表达变化：
使用所构建的Egr2基因的转录激活因子AREB6表达载体 pUC19/CMV-AREB6分别转染HEK293-Egr2-T2A-luciferase-KI细胞系和野生型HEK293细胞系，并对Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系中的 Luciferase活性及HEK293细胞系中Egr2分子的mRNA表达水平分别进行检测；通过对knock-in细胞系中Luciferase表达活性与HEK293细胞中的Egr2 mRNA表达水平及变化的比较，进一步验证Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系中的Luciferase活性是否可以准确反映Egr2分子的相对表达变化。
以下是发明人给出的实施例，需要说明的是，这些实施例仅是本发明的优选的例子，本发明不限于这些实施例。
实施例1：靶向Egr2基因3′非编码区的sgRNA的设计、构建sgRNA打靶载体及活性检测
(1)在NCBI上查找Egr2基因的基因组序列，在其终止密码子下游选取一段序列作为打靶区(TSF)，长度约为700bp。
(2)使用线上sgRNA设计软件，如crispr-era、crisprscan.org、 mit.edu等，尽量在TSF区筛选在基因组上唯一的序列sgRNA，减少潜在脱靶位点。
本实施例设计了4个sgRNA，其中：
sgRNA1序列为：5′tggggacccctggccaaga 3′；
sgRNA2序列为：5′ccctttcctgtccctctct 3′；
sgRNA3序列为：5′ggggaggctcagaaggagg 3′；
sgRNA4序列为：5′gtgagttgactatcaaccca 3′。
分别在其5’加上ACCG得到正向寡核苷酸，获得其互补链，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸。
由西安擎科生物公司设计、合成的sgRNA寡核苷酸序列如下：
sgRNA1：
正向引物为：5'-ACCGTGGGGACCCCTGGCCAAGA-3'；
反向引物为：5'-AAACTCTTGGCCAGGGGTCCCCA-3'；
sgRNA2：
正向引物为：5'-ACCGAGAGAGGGACAGGAAAGGG-3'；
反向引物为：5'-AAACCCCTTTCCTGTCCCTCTCT-3'；
sgRNA3：
正向引物为：5'-ACCGGGGGAGGCTCAGAAGGAGG-3'；
反向引物为：5'-AAACCCTCCTTCTGAGCCTCCCC-3'；
sgRNA4：
正向引物为：5'-ACCGGTGAGTTGACTATCAACCCA-3'；
反向引物为：5'-AAACTGGGTTGATAGTCAACTCAC-3'。
将合成的正向和反向寡核苷酸，室温退火后连入pU6-sgRNA1.0，获得 sgRNA表达组件(图2)。
(3)sgRNA活性检测
将sgRNAs表达组件分别与携带Cas9的表达载体通过磷酸钙共沉淀转染 HEK293细胞，转染72小时后，提取基因组DNA，对打靶区域进行PCR扩增，电泳检测见图3并利用T7E1法分析每个sgRNA的切割效率，筛选最高切割活性的sgRNA；
T7E1 assay步骤如下：以提取的基因组DNA为模板，扩增靶向hEGR2 的四个sgRNA切割位点附近约700bp的DNA片段，引物序列如下：
hEGR2 KI TSF nest for：CACCTCACCACCCATATCCG；
hEGR2 KI TSF nest reverse：AAGGCACCAAGGACACTTCC；
hEGR2 KI TSF for：AGTTTGCCCGGAGTGATGAG；
hEGR2 KI TSF reverse：CCCAAATCAGTCCCAAGCCA。
将扩增得到的PCR产物进行变性退火，利用琼脂糖凝胶电泳回收纯化。然后取500ng纯化的PCR产物，0.5μl的T7E1酶，37摄氏度处理25分钟，进行琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果见图4。依据T7E1检测结果，选择sgRNA2 用于进一步研究。
实施例2：构建携带Cas9、sgRNA表达元件的真核表达载体
(1)将切割效率高的sgRNA表达载体和Cas9的表达载体分别用KpnⅠ和SpeⅠ酶切后，经质量浓度为0.9％的琼脂糖凝胶电泳回收后，将得到的片段与载体连接，经过酶切及测序鉴定获得阳性克隆。将获得的克隆命名为 pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA片段(如图5所示)。
实施例3：打靶供体pUC19-Egr2-Luciferase donor的构建
引物由西安擎科生物公司合成
上游同源臂PCR扩增外、内巢引物分别为：
EGR2 KI up arm nest for：TCCCGTCTCTGCACCTAGAA；
EGR2 KI up arm nest reverse：AGGGACAGGAAAGGGTGGTA；
EGR2 KI up arm ClaI for：CATCGATACCGCCTCCTCCTCCTTATT；
EGR2 KI up arm SpeI reverse：GACTAGTAGGTGTCCGGGTCCGAGA。
下游同源臂PCR扩增外、内巢引物分别为：
EGR2 KI down arm nest for：GATACACCAGCTCCCAAAGGT；
EGR2 KI down arm nest reverse：AGTCAAAACAACGCCTCCCC；
EGR2 KI down arm SalI for：CGTCGACTTTGCTACCCCACTTCCCCT；
EGR2 KI down arm BglII reverse：AAGATCTTCACTGGTGCTTAGTGCTGTTT。
以HEK293细胞基因组为模板，PCR扩增分别获得上、下游同源臂，其中：
上游同源臂序列如下：
accgcctcctcctccttattctggctgtgcaggagacctctaccaggacccttctgcgttc ctgtcagcagccaccacctccacctcttcctctctggcctacccaccacctccttcctatccatc ccccaagccagccacggacccaggtctcttcccaatgatcccagactatcctggattctttccat ctcagtgccagagagacctacatggtacagctggcccagaccgtaagccctttccctgcccactg gacaccctgcgggtgccccctccactcactccactctctacaatccgtaactttaccctgggggg ccccagtgctggggtgaccggaccaggggccagtggaggcagcgagggaccccggctgcctggta gcagctcagcagcagcagcagccgccgccgccgccgcctataacccacaccacctgccactgcgg cccattctgaggcctcgcaagtaccccaacagacccagcaagacgccggtgcacgagaggccctacccgtgcccagcagaaggctgcgaccggcggttctcccgctctgacgagctgacacggcacatcc gaatccacactgggcataagcccttccagtgtcggatctgcatgcgcaacttcagccgcagtgac cacctcaccacccatatccgcacccacaccggtgagaagcccttcgcctgtgactactgtggccg aaagtttgcccggagtgatgagaggaagcgccacaccaagatccacctgagacagaaagagcgga aaagcagtgccccctctgcatcggtgccagccccctctacagcctcctgctctgggggcgtgcag cctgggggtaccctgtgcagcagtaacagcagcagtcttggcggagggccgctcgccccttgctc ctctcggacccggacacct。
下游同源臂序列如下：
tttgctaccccacttccccttattttgacccatcacaggtttttgaccctggatgtcagag ttgatctaagacgttttctacaataggttgggagatgctgatcccttcaagtggggacagcaaaa agacaagcaaaactgatgtgcactttatggcttgggactgatttgggggacattgtacagtgagt gaagtatagcctttatgccacactctgtggccctaaaatggtgaatcagagcatatctagttgtc tcaacccttgaagcaatatgtattataaactcagagaacagaagtgcaatgtgatgggaggaaca tagcaatatctgctccttttcgagttgtttgagaaatgtaggctattttttcagtgtatatccac tcagattttgtgtatttttgatgtacactgttctctaaattctgaatctttgggaaaaaatgtaa agcatttatgatctcagaggttaacttatttaagggggatgtacatatattctctgaaactaggatgcatgcaattgtgttggaagtgtccttggtgccttgtgtgatgtagacaatgttacaaggtctg catgtaaatgggttgccttattatggagaaaaaaaatcactccctgagtttagtatggctgtata tttctgcctattaatatttggaattttttttagaaagtatatttttgtatgctttgttttgtgac ttaaaagtgttacctttgtagtcaaatttcagataagaatgtacataatgttaccggagctgatt tgtttggtcattagctcttaatagttgtgaaaaaataaatctattctaacgcaaaaccactaact gaagttcagataatggatggtttgtgactatagtgtaaataaatacttttcaacaatatttttgt tgcagaaatcatttctgaaatacttactgggtgggaattaaacagtcattcagtctctgtgggaa tattttttaaaaacagcactaagcaccagtga。
将同源臂分别用相应的酶进行酶切处理，用ClaI和SpeI酶切回收上游同源臂片段，用SalI和BglII酶切回收下游同源臂片段，依次连入本实验室已有的pUC19/T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA载体的两端(其中，CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA为正筛元件， PGK-TK-T2A-mCherry-SV40pA为负筛元件)，获得打靶载体 pUC19-Egr2-Luciferase donor，该载体结构如图6所示。
实施例4：Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系的建立
将4μg的pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA片段与8μg的 pUC19-Egr2-Luciferase donor通过磷酸钙共沉淀转染HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0μg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加 10μg/mL的GCV筛选3周左右，待细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，挑选10-50个克隆，进行Luciferase活性检测(图7)。对其中Luciferase活性较高的克隆化细胞进行基因组提取，再对克隆化后的细胞进行PCR鉴定并测序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶供体在目标位点处正确重组(图8)，最终获得单一稳定的Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系。
实施例5：克隆并构建Egr2基因的转录激活因子表达载体
使用合成引物得到基因Egr2的转录激活因子AREB6，构建转录激活因子表达载体pUC19/CMV-AREB6，经过酶切及测序鉴定获得阳性克隆。将获得的克隆命名为pUC19/CMV-AREB6。
实施例6：验证Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系中Luciferase表达变化是否可以真实反映内源性Egr2基因的相对表达量及表达变化
使用所构建的Egr2基因的转录激活因子AREB6表达载体 pUC19/CMV-AREB6分别转染Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系和野生型 HEK293细胞系，并对Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系中的Luciferase 活性(图9)及HEK293细胞系中Egr2分子的mRNA表达水平分别进行检测 (图10)；通过对knock-in细胞系中Luciferase表达活性与HEK293细胞中的Egr2mRNA表达水平及变化的比较，进一步验证 Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系中的Luciferase活性是否可以准确反映Egr2分子的相对表达变化。
核苷酸或氨基酸序列表
<110> 陕西师范大学
<120>基于CRISPR-Cas9靶向基因组修饰技术构建Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系方法
<160>
<210> 1
<211> 19
<212> sgRNA1序列
<213> DNA
<220>
<400>
5′tggggacccctggccaaga 3′
<210> 2
<211> 19
<212> sgRNA2序列
<213> DNA
<220>
<400>
5′ccctttcctgtccctctct 3′
<210> 3
<211> 19
<212> sgRNA3序列
<213> DNA
<220>
<400>
5′ggggaggctcagaaggagg 3′
<210> 4
<211> 20
<212> sgRNA4序列
<213> DNA
<220>
<400>
5′gtgagttgactatcaaccca 3′
<210> 5
<211> 23
<212> sgRNA1正向引物
<213> DNA
<220>
<400>
5 '-ACCGTGGGGACCCCTGGCCAAGA-3 '
<210> 6
<211> 23
<212> sgRNA1反向引物
<213> DNA
<220>
<400>
5 '-AAACTCTTGGCCAGGGGTCCCCA-3 '
<210> 7
<211> 23
<212> sgRNA2正向引物
<213> DNA
<220>
<400>
5 '-ACCGAGAGAGGGACAGGAAAGGG-3 '
<210> 8
<211> 23
<212> sgRNA2反向引物
<213> DNA
<220>
<400>
5 '-AAACCCCTTTCCTGTCCCTCTCT-3 '
<210> 9
<211> 23
<212> sgRNA3正向引物
<213> DNA
<220>
<400>
5 '-ACCGGGGGAGGCTCAGAAGGAGG-3 '
<210> 10
<211> 23
<212> sgRNA3反向引物
<213> DNA
<220>
<400>
5 '- AAACCCTCCTTCTGAGCCTCCCC-3 '
<210> 11
<211> 24
<212> sgRNA4正向引物
<213> DNA
<220>
<400>
5 '-ACCGGTGAGTTGACTATCAACCCA-3 '
<210> 12
<211> 24
<212> sgRNA4反向引物
<213> DNA
<220>
<400>
5 '-AAACTGGGTTGATAGTCAACTCAC-3 '
<210> 13
<211> 20
<212>引物hEGR2 KI TSF nest for
<213> DNA
<220>
<400>
CACCTCACCACCCATATCCG
<210> 14
<211> 20
<212>引物hEGR2 KI TSF nest reverse
<213> DNA
<220>
<400>
AAGGCACCAAGGACACTTCC
<210> 15
<211> 20
<212>引物hEGR2 KI TSF for
<213> DNA
<220>
<400>
AGTTTGCCCGGAGTGATGAG
<210> 16
<211> 20
<212>引物hEGR2 KI TSF reverse
<213> DNA
<220>
<400>
CCCAAATCAGTCCCAAGCCA
<210> 17
<211> 20
<212>上游同源臂 PCR扩增外、内巢引物EGR2 KI up arm nest for
<213> DNA
<220>
<400>
TCCCGTCTCTGCACCTAGAA
<210> 18
<211> 20
<212>上游同源臂 PCR扩增外、内巢引物EGR2 KI up arm nest reverse <213> DNA
<220>
<400>
AGGGACAGGAAAGGGTGGTA
<210> 19
<211> 27
<212>上游同源臂 PCR扩增外、内巢引物EGR2 KI up arm ClaI for
<220>
<400>
CATCGATACCGCCTCCTCCTCCTTATT
<210> 20
<211> 25
<212>上游同源臂 PCR扩增外、内巢引物EGR2 KI up arm SpeI reverse <220>
<400>
GACTAGTAGGTGTCCGGGTCCGAGA
<210> 21
<211> 21
<212>下游同源臂 PCR 扩增外、内巢引物EGR2 KI down arm nest for
<220>
<400>
GATACACCAGCTCCCAAAGGT
<210> 22
<211> 20
<212>下游同源臂 PCR 扩增外、内巢引物EGR2 KI down arm nest reverse
<220>
<400>
AGTCAAAACAACGCCTCCCC
<210> 23
<211> 27
<212>下游同源臂 PCR 扩增外、内巢引物EGR2 KI down arm SalI for
<220>
<400>
CGTCGACTTTGCTACCCCACTTCCCCT
<210> 24
<211> 29
<212>下游同源臂 PCR 扩增外、内巢引物EGR2 KI down arm BglII reverse
<220>
<400>
AAGATCTTCACTGGTGCTTAGTGCTGTTT
<210> 25
<211> 925
<212>上游同源臂序列
<220>
<400>
accgcctcctcctccttattctggctgtgcaggagacctctaccaggacccttctgcgttcctgtcagcagccaccacctccacctcttcctctctggcctacccaccacctccttcctatccatcccccaagccagccacggacccaggtctcttcccaatgatcccagactatcctggattctttccatctcagtgccagagagacctacatggtacagctggcccagaccgtaagccctttccctgcccactggacaccctgcgggtgccccctccactcactccactctctacaatccgtaactttaccctggggggccccagtgctggggtgaccggaccaggggccagtggaggcagcgagggaccccggctgcctggtagcagctcagcagcagcagcagccgccgccgccgccgcctataacccacaccacctgccactgcggcccattctgaggcctcgcaagtaccccaacagacccagcaagacgccggtgcacgagaggccctacccgtgcccagcagaaggctgcgaccggcggttctcccgctctgacgagctgacacggcacatccgaatccacactgggcataagcccttccagtgtcggatctgcatgcgcaacttcagccgcagtgaccacctcaccacccatatccgcacccacaccggtgagaagcccttcgcctgtgactactgtggccgaaagtttgcccggagtgatgagaggaagcgccacaccaagatccacctgagacagaaagagcggaaaagcagtgccccctctgcatcggtgccagccccctctacagcctcctgctctgggggcgtgcagcctgggggtaccctgtgcagcagtaacagcagcagtcttggcggagggccgctcgccccttgctcctctcggacccggacacct
<210> 26
<211> 1003
<212>下游同源臂序列
<220>
<400>
tttgctaccccacttccccttattttgacccatcacaggtttttgaccctggatgtcagagttgatctaagacgttttctacaataggttgggagatgctgatcccttcaagtggggacagcaaaaagacaagcaaaactgatgtgcactttatggcttgggactgatttgggggacattgtacagtgagtgaagtatagcctttatgccacactctgtggccctaaaatggtgaatcagagcatatctagttgtctcaacccttgaagcaatatgtattataaactcagagaacagaagtgcaatgtgatgggaggaacatagcaatatctgctccttttcgagttgtttgagaaatgtaggctattttttcagtgtatatccactcagattttgtgtatttttgatgtacactgttctctaaattctgaatctttgggaaaaaatgtaaagcatttatgatctcagaggttaacttatttaagggggatgtacatatattctctgaaactaggatgcatgcaattgtgttggaagtgtccttggtgccttgtgtgatgtagacaatgttacaaggtctgcatgtaaatgggttgccttattatggagaaaaaaaatcactccctgagtttagtatggctgtatatttctgcctattaatatttggaattttttttagaaagtatatttttgtatgctttgttttgtgacttaaaagtgttacctttgtagtcaaatttcagataagaatgtacataatgttaccggagctgatttgtttggtcattagctcttaatagttgtgaaaaaataaatctattctaacgcaaaaccactaactgaagttcagataatggatggtttgtgactatagtgtaaataaatacttttcaacaatatttttgttgcagaaatcatttctgaaatacttactgggtgggaattaaacagtcattcagtctctgtgggaatattttttaaaaacagcactaagcaccagtga
Claims (8)
1.一种基于CRISPR-Cas9靶向基因组修饰技术构建Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系的方法，其特征在于，将靶向Egr2基因的打靶载体与打靶供体共转HEK293细胞系，使携带荧光素酶报告基因的打靶载体在Egr2基因组下游目标位点处正确重组，重组基因受内源性Egr2基因启动子的调控，获得单一稳定的Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系，并验证Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系中Luciferase表达变化是否可以真实反映内源性Egr2基因的相对表达量及表达变化。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具体按下列步骤实施：
(1)靶向Egr2基因3′非编码区的sgRNA的设计、构建sgRNA打靶载体及活性检测：
在NCBI上查找Egr2基因的基因组序列，在其终止密码子下游选择四个sgRNA结合位点并设计合成相应的sgRNA引物，将sgRNA引物退火后连入pU6-sgRNA1.0，与携带Cas9的表达载体共转染HEK293细胞，转染72小时后，提取基因组DNA，对打靶区域进行PCR扩增，并利用T7E1法筛选最高切割活性的sgRNA；
(2)构建携带Cas9、sgRNA表达元件的真核表达载体：
将筛选获得的靶向Egr2基因的sgRNA表达元件、Cas9表达元件依次连入真核表达载体获得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA片段；
(3)构建靶向Egr2基因的打靶供体pUC19/Egr2-donor：
以人源化细胞基因组为模板，PCR扩增上、下游同源臂，依次连入携带T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA元件的表达载体的两端；
(4)Egr2-Luciferase细胞系的建立：
将pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA片段与pUC19/Egr2-donor共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周左右，待细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，再对克隆化后的细胞进行PCR鉴定并测序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶供体在目标位点处正确重组，最终获得单一稳定Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系；
(5)克隆并构建Egr2基因的转录激活因子表达载体：
转录激活因子表达载体pUC19/CMV-AREB6，用于Egr2基因的转录激活实验研究；
(6)验证Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系中Luciferase表达变化是否可以真实反映内源性Egr2基因的相对表达量及表达变化：
使用所构建的Egr2基因的转录激活因子AREB6表达载体pUC19/CMV-AREB6分别转染Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系和野生型HEK293细胞系，并对Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系中的Luciferase活性及HEK293细胞系中Egr2分子的mRNA表达水平分别进行检测；通过对knock-in细胞系中Luciferase表达活性与HEK293细胞中的Egr2mRNA表达水平及变化的比较，进一步验证Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系中的Luciferase活性是否可以准确反映Egr2分子的相对表达变化。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的打靶载体携带pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA片段，既含有核酸酶Cas9表达框也含有靶向Egr2的打靶效率高的sgRNA表达组件。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶向Egr2基因的打靶供体携带外源片段cDNA，包括T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA片段，及其两端与断裂位点上下游分别具有相同序列的上、下游同源臂，该上、下游同源臂是长度约为1000bp的DNA片段。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述靶向Egr2的sgRNA其识别位点位于Egr2的终止密码子下游；其中：
sgRNA1序列为：5′tggggacccctggccaaga 3′；
sgRNA2序列为：5′ccctttcctgtccctctct 3′；
sgRNA3序列为：5′ggggaggctcagaaggagg 3′；
sgRNA4序列为：5′gtgagttgactatcaaccca 3′。
合成的相应sgRNA，室温退火后连入pU6-sgRNA1.0，筛选后获得sgRNA表达组件，并检测其打靶效率。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述上游同源臂序列如下：
accgcctcctcctccttattctggctgtgcaggagacctctaccaggacccttctgcgttcctgtcagcagccaccacctccacctcttcctctctggcctacccaccacctccttcctatccatcccccaagccagccacggacccaggtctcttcccaatgatcccagactatcctggattctttccatctcagtgccagagagacctacatggtacagctggcccagaccgtaagccctttccctgcccactggacaccctgcgggtgccccctccactcactccactctctacaatccgtaactttaccctggggggccccagtgctggggtgaccggaccaggggccagtggaggcagcgagggaccccggctgcctggtagcagctcagcagcagcagcagccgccgccgccgccgcctataacccacaccacctgccactgcggcccattctgaggcctcgcaagtaccccaacagacccagcaagacgccggtgcacgagaggccctacccgtgcccagcagaaggctgcgaccggcggttctcccgctctgacgagctgacacggcacatccgaatccacactgggcataagcccttccagtgtcggatctgcatgcgcaacttcagccgcagtgaccacctcaccacccatatccgcacccacaccggtgagaagcccttcgcctgtgactactgtggccgaaagtttgcccggagtgatgagaggaagcgccacaccaagatccacctgagacagaaagagcggaaaagcagtgccccctctgcatcggtgccagccccctctacagcctcctgctctgggggcgtgcagcctgggggtaccctgtgcagcagtaacagcagcagtcttggcggagggccgctcgccccttgctcctctcggacccggacacct。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述下游同源臂序列如下：
tttgctaccccacttccccttattttgacccatcacaggtttttgaccctggatgtcagagttgatctaagacgttttctacaataggttgggagatgctgatcccttcaagtggggacagcaaaaagacaagcaaaactgatgtgcactttatggcttgggactgatttgggggacattgtacagtgagtgaagtatagcctttatgccacactctgtggccctaaaatggtgaatcagagcatatctagttgtctcaacccttgaagcaatatgtattataaactcagagaacagaagtgcaatgtgatgggaggaacatagcaatatctgctccttttcgagttgtttgagaaatgtaggctattttttcagtgtatatccactcagattttgtgtatttttgatgtacactgttctctaaattctgaatctttgggaaaaaatgtaaagcatttatgatctcagaggttaacttatttaagggggatgtacatatattctctgaaactaggatgcatgcaattgtgttggaagtgtccttggtgccttgtgtgatgtagacaatgttacaaggtctgcatgtaaatgggttgccttattatggagaaaaaaaatcactccctgagtttagtatggctgtatatttctgcctattaatatttggaattttttttagaaagtatatttttgtatgctttgttttgtgacttaaaagtgttacctttgtagtcaaatttcagataagaatgtacataatgttaccggagctgatttgtttggtcattagctcttaatagttgtgaaaaaataaatctattctaacgcaaaaccactaactgaagttcagataatggatggtttgtgactatagtgtaaataaatacttttcaacaatatttttgttgcagaaatcatttctgaaatacttactgggtgggaattaaacagtcattcagtctctgtgggaatattttttaaaaacagcactaagcaccagtga。
8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的HEK293细胞系为人胚肾细胞系HEK293，所述的Luciferase为荧光素酶。
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