CN109321597A - 一种构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法 - Google Patents

一种构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109321597A
CN109321597A CN201811054884.3A CN201811054884A CN109321597A CN 109321597 A CN109321597 A CN 109321597A CN 201811054884 A CN201811054884 A CN 201811054884A CN 109321597 A CN109321597 A CN 109321597A
Authority
CN
China
Prior art keywords
arid5a
cell line
luciferase
hek293
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811054884.3A
Other languages
English (en)
Inventor
夏海滨
黎维康
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shaanxi Normal University
Original Assignee
Shaanxi Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shaanxi Normal University filed Critical Shaanxi Normal University
Priority to CN201811054884.3A priority Critical patent/CN109321597A/zh
Publication of CN109321597A publication Critical patent/CN109321597A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/10—Vectors comprising a non-peptidic targeting moiety

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种构建靶向ARID5A的KI‑T2A‑Luciferase细胞系的方法，该方法利用CRISPR/Cas9系统在基因组上ARID5A基因的3’端产生双链切口(DSBs)，在Cas9‑sgRNA组分中加入一个供体载体(Donor DNA)，该供体载体(Donor DNA)上带有靶向位点两端的同源序列，DSBs的修复会以供体载体(Donor DNA)为模板进行，进而将报告基因插入到ARID5A的3’端，获得单一稳定的HEK293‑ARID5A‑T2A‑luciferase‑KI细胞系。结果表明，该HEK293‑ARID5A‑T2A‑Luciferase细胞系内的Luciferase表达水平可以准确灵敏地反映该细胞系内ARID5A分子表达水平，有助于ARID5A基因功能研究及筛选影响ARID5A表达的上游转录因子或小分子化学药物，为与ARID5A相关的自身免疫过程及炎症反应调节的进一步研究提供了新的解决方案。

Description

一种构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域和药理学领域，涉及细胞系的构建，特别涉及一种构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法。
背景技术
ARID5A(AT-rich interaction domain 5A)是ARID蛋白家族中的一员，具有多种功能，在发育、组织特异性基因表达和细胞生长调节中起重要作用。其中，ARID5A作为RNA结合蛋白可以通过与选择性炎症相关mRNA(例如IL6，STAT3和TBX21)的3’UTR中的茎环结构结合从而抑制mRNA降解活性，提高IL6水平，参与炎症调节反应。研究表明，这一过程可能与自身免疫过程有关。
目前，基于细胞转录激活检测的报告基因系统，是建立药物筛选模型的常用手段。传统报告基因系统主要是通过将目标基因启动子克隆到携带报告基因的表达检测载体中来实现。但是由于基因组本身存在表观遗传学修饰，这一方法无法模拟基因组的真实状态，因此难以准确反映基因组上基因表达情况。
根据申请人所进行的资料检索，到目前为止，尚没有针对ARID5A的新型报告系统，也没有更多的关于ARID5A转录调控调节和新药筛选的文献资料可以参考。
所以，建立一种可以有效的对ARID5A基因的表达和调控进行监测的报告系统，不仅可以研究其转录水平的调控机制，也可以靶向筛选活性药物，这对于与炎症相关的疾病治疗有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法，所构建的该靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系，可通过Luciferase表达水平来反映ARID5A分子表达水平，用于对ARID5A产生调控作用的新药筛选。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法，其特征在于，按以下步骤进行：
1)在目的基因ARID5A的终止密码子下游设计并合成相应的sgRNA，室温退火后连入pU6-sgRNA1.0，筛选后获得sgRNA表达组件，并检测其打靶效率；
2)将检测过且打靶效率高的sgRNA表达组件与Cas9基因克隆至一个表达载体，获得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA；
3)构建靶向ARID5A基因的打靶载体pUC19/ARID5A-donor，该打靶载体pUC19/ARID5A-donor的结构为两部分，第一部分是与断裂位点上下游分别具有相同序列的上下游同源臂；第二部分是位于上下游同源臂之间的待重组入基因组靶位点的T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA DNA片段；
4)将pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA与
pUC19/ARID5A-donor共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周，待细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，再对克隆化后的细胞进行PCR鉴定并测序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶载体在目标位点处的正确重组，最终获得单一稳定的HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系。
根据本发明，步骤1)中所述的合成相应的sgRNA为针对ARID5A的终止密码子下游设计的sgRNA，其中：
sgRNA1序列为：GTGGGTGGGGCTGCCATTAG；
sgRNA2序列为：AAGCCTGAGTTGGTCTGCGT；
sgRNA3序列为：GGTGGTGGATGTAGATTTCT；
sgRNA4序列为：TTGAAATCACCGGAGGTGCC。
进一步地，步骤3)中所述的上下游同源臂的序列分别如下：
上游同源臂序列为：
CAGCTGTTCACCTCCCAGAGAGTCCCCAGAGCCCCAAAGGGCTGACTGAGAACTCCAGGCACCGGCTGACCCCTCAGGAGGGATTGCAGGCCCCAGGTGGCAGCCTCAGAGAGGAGGCGCAGGCAGGCCCCTGCCCGGCAGCCCCCATCTTCAAGGGCTGCTTCTACACCCACCCCACCGAGGTGCTGAAGCCTGTCAGCCAGCACCCCAGGGACTTCTTCTCTAGACTTAAAGATGGGGTGCTATTGGGGCCTCCTGGCAAAGAGGGGCTGTCAGTGAAAGAGCCCCAGCTGGTGTGGGGCGGAGACGCTAACCGCCCTTCTGCGTTCCATAAAGGTGGCTCCAGAAAGGGCATCCTCTACCCCAAGCCCAAAGCCTGCTGGGTGTCCCCCATGGCCAAGGTCCCAGCCGAGAGCCCCACGCTCCCGCCCACCTTCCCCAGTAGCCCAGGCCTGGGCAGCAAGCGCAGCCTGGAGGAAGAGGGTGCTGCCCACAGTGGGAAGAGACTGCGGGCCGTGTCTCCCTTTCTTAAGGAGGCGGATGCCAAGAAGTGTGGGGCCAAACCTGCAGGGTCCGGCCTGGTCTCCTGCCTTCTGGGCCCAGCCCTGGGGCCTGTGCCCCCAGAGGCCTACAGGGGCACCATGCTGCACTGCCCGCTGAACTTCACTGGCACCCCGGGCCCCTTGAAGGGCCAGGCTGCACTCCCCTTCAGCCCCCTGGTCATCCCGGCCTTCCCGGCCCACTTCCTGGCCACCGCAGGCCCCTCGCCCATGGCCGCTGGCCTGATGCACTTCCCCCCAACGTCCTTCGACAGTGCCCTCCGCCACAGACTTTGCCCGGCCTCATCTGCCTGGCACGCACCACCAGTCACAACCTATGCAGCGCCCCACTTCTTCCACCTCAACACCAAGCTG；
下游同源臂序列为：
GCACCACTGGAACTTACCCTGGCCGCTGGGGCTGGGATGCTCATGAACTCCGGCCATGGGAAGGGCCCCCATAGGTTGCAGGTAGAGAGGCCAAGGCCGGGGATGGGCAGGGTCTTGCTTGCCCAAGGCTACCATCCACGATGACAGAACCCAGACCAGGGAACGTGCAGCATGCCTGGCACCAGGGAGTGGGTGGCCAGGCCAAAAGGGCACCCTATCCAGCCCCTGCCCCTGGCCACCTCCTTCAGGAGCAGCCTGTGGAGGAGAGCTCAGGCACCTTCCAAGCGAGGCCTGTGACGGGTGGAGGGGCAAAGAGTGGTGCTCCCTGCTGTTGAGAGCACTCAGGCTCTGCAGGGGCATCTCCCAACCTTCCACCTCTTTCCTTCTGAGAGATGCCAAGATGTCAGCCTGAGCACCTGGAGTGACCAGCCCTGAGCTCCGCACTGCCACATGCGCCCGTGTGCAGTCCATCTCTCCGAGCTGTGGAGGCTCAGTGGATGATAAAGAACGGGGAGGGGCTGGGTGCAGTGGCTAACACCTGTAATCCCAGCATTTTGGGAGGCCAAGGGGGGTGGATCACCTGAGGTCAGGAGTTTGTGACCAGCCTGGCCAAGATGGTGAAACTCCATCTGTACAAAAACTACAAAAATTAGCCAGGCATGGTGGCGGGCACCTGTAATCCCAGGTACTTGGGAGTCTGAGGCAGGAGAATCACTTGAACTCGGGAGGCAGAGGTTGCAGCGAGCCGAGACTGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACGAGCAAAACTCGGTCTCAAAAAAAAAAGAAGGGAGGAGCTGAGTTCTGCCCACCCTCCAGGCCCTGGGTGCTGGGCCACAGATCACTGGGGTCGGATCCCCTGCCTGGATAAAAGGGGAGGTGACCCTGTTGTGTGCAGGGTCCTGCCCAGCATGGGGCAGGGTGCCCTTCATCTACGAAGCAACATTGGCCTGGCCCTGGCACAAAGATGGGCAGGCGGCCCGTCAGCAGGACTTGAGGGCAGGCAGCTCAGCGCTGCGATCACGGCGCCCTCTGGAGGCCGATCTGAAGAA。
优选地，步骤4)中所述的HEK293细胞系为人胚肾细胞系HEK293。
所构建的HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系验证是否可以真实反映内源性ARID5A基因的相对表达量及表达变化的方法为：
1)克隆并构建ARID5A基因的转录激活因子RELA的表达载体pUC19/CMV-RELA，表达载体pUC19/CMV-RELA用于ARID5A基因的转录激活实验研究；
2)使用所构建的ARID5A基因的转录激活因子RELA的表达载体pUC19/CMV-RELA转染HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系和野生型HEK293细胞系，并对HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系中的Luciferase活性及HEK293细胞系中ARID5A分子的mRNA表达水平分别进行检测；通过对knock-in细胞系中Luciferase表达活性与HEK293细胞中的ARID5A mRNA表达水平及变化的比较，进一步验证HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系中的Luciferase活性是否可以准确反映ARID5A分子的相对表达变化。
本发明的构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法，利用CRISPR/Cas9技术，在基因组上ARID5A基因的3’端原位整合入T2A-Luciferase报告基因，所构建的HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系，既不影响ARID5A基因自身的表达，也不影响基因组其他位点基因的表达，而且能准确灵敏地反映细胞系内ARID5A分子表达水平，从而能够用于筛选对ARID5A具有转录调控作用的因子和药物。
附图说明
图1是携带sgRNA及Cas9的表达载体结构示意图。
图2是打靶Donor载体结构示意图。
图3是所构建的HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系的结构示意图。
图4是细胞正负筛选稳定后倒置荧光显微镜下观察结果图。
图5是对细胞经有限稀释法进行克隆化后每个克隆的Luciferase活性检测图。
图6是对有Luciferase活性的单克隆细胞PCR检测电泳图。
图7是对ARID5A-T2A-Luciferase细胞克隆化后所得9号克隆的PCR产物中整合型条带进行胶回收测序结果。
图8是转录激活因子RELA的表达载体pUC19/CMV-RELA转染HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系后Luciferase的检测结果。
图9是转录激活因子RELA的表达载体pUC19/CMV-RELA转染野生型HEK293细胞系后，ARID5A分子的mRNA表达水平的检测结果。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
本实施例给出一种构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法，该方法利用CRISPR/Cas9系统在基因组上ARID5A基因的3’端产生双链切口(DSBs)，在Cas9-sgRNA组分中加入一个供体载体(Donor DNA)，该供体载体(Donor DNA)上带有靶向位点两端的同源序列，DSBs的修复会以供体载体(Donor DNA)为模板进行，进而将报告基因插入到ARID5A的3’端，获得单一稳定的HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系。
具体按以下步骤实施：
1)在目的基因ARID5A的终止密码子下游设计并合成相应的sgRNA，室温退火后连入pU6-sgRNA1.0，筛选后获得sgRNA表达组件，并检测其打靶效率；
2)将检测过且打靶效率高的sgRNA表达组件与Cas9基因克隆至一个表达载体，获得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA；
3)构建靶向ARID5A基因的打靶载体pUC19/ARID5A-donor，该打靶载体pUC19/ARID5A-donor结构为两部分，第一部分是与断裂位点上下游分别具有相同序列的上下游同源臂；第二部分是位于上下游同源臂之间的待重组入基因组靶位点的T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA DNA片段；
4)将pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA与pUC19/ARID5A-donor共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周左右，待细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，再对克隆化后的细胞进行PCR鉴定并测序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶载体在目标位点处的正确重组，最终获得单一稳定的HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系。
本实施例中，步骤1)中所述的合成相应的sgRNA为针对ARID5A的终止密码子下游设计的sgRNA，其中：
sgRNA1序列为：GTGGGTGGGGCTGCCATTAG；
sgRNA2序列为：AAGCCTGAGTTGGTCTGCGT；
sgRNA3序列为：GGTGGTGGATGTAGATTTCT；
sgRNA4序列为：TTGAAATCACCGGAGGTGCC。
步骤3)中所述的上下游同源臂的序列分别如下：
上游同源臂序列为：
CAGCTGTTCACCTCCCAGAGAGTCCCCAGAGCCCCAAAGGGCTGACTGAGAACTCCAGGCACCGGCTGACCCCTCAGGAGGGATTGCAGGCCCCAGGTGGCAGCCTCAGAGAGGAGGCGCAGGCAGGCCCCTGCCCGGCAGCCCCCATCTTCAAGGGCTGCTTCTACACCCACCCCACCGAGGTGCTGAAGCCTGTCAGCCAGCACCCCAGGGACTTCTTCTCTAGACTTAAAGATGGGGTGCTATTGGGGCCTCCTGGCAAAGAGGGGCTGTCAGTGAAAGAGCCCCAGCTGGTGTGGGGCGGAGACGCTAACCGCCCTTCTGCGTTCCATAAAGGTGGCTCCAGAAAGGGCATCCTCTACCCCAAGCCCAAAGCCTGCTGGGTGTCCCCCATGGCCAAGGTCCCAGCCGAGAGCCCCACGCTCCCGCCCACCTTCCCCAGTAGCCCAGGCCTGGGCAGCAAGCGCAGCCTGGAGGAAGAGGGTGCTGCCCACAGTGGGAAGAGACTGCGGGCCGTGTCTCCCTTTCTTAAGGAGGCGGATGCCAAGAAGTGTGGGGCCAAACCTGCAGGGTCCGGCCTGGTCTCCTGCCTTCTGGGCCCAGCCCTGGGGCCTGTGCCCCCAGAGGCCTACAGGGGCACCATGCTGCACTGCCCGCTGAACTTCACTGGCACCCCGGGCCCCTTGAAGGGCCAGGCTGCACTCCCCTTCAGCCCCCTGGTCATCCCGGCCTTCCCGGCCCACTTCCTGGCCACCGCAGGCCCCTCGCCCATGGCCGCTGGCCTGATGCACTTCCCCCCAACGTCCTTCGACAGTGCCCTCCGCCACAGACTTTGCCCGGCCTCATCTGCCTGGCACGCACCACCAGTCACAACCTATGCAGCGCCCCACTTCTTCCACCTCAACACCAAGCTG；
下游同源臂序列为：
GCACCACTGGAACTTACCCTGGCCGCTGGGGCTGGGATGCTCATGAACTCCGGCCATGGGAAGGGCCCCCATAGGTTGCAGGTAGAGAGGCCAAGGCCGGGGATGGGCAGGGTCTTGCTTGCCCAAGGCTACCATCCACGATGACAGAACCCAGACCAGGGAACGTGCAGCATGCCTGGCACCAGGGAGTGGGTGGCCAGGCCAAAAGGGCACCCTATCCAGCCCCTGCCCCTGGCCACCTCCTTCAGGAGCAGCCTGTGGAGGAGAGCTCAGGCACCTTCCAAGCGAGGCCTGTGACGGGTGGAGGGGCAAAGAGTGGTGCTCCCTGCTGTTGAGAGCACTCAGGCTCTGCAGGGGCATCTCCCAACCTTCCACCTCTTTCCTTCTGAGAGATGCCAAGATGTCAGCCTGAGCACCTGGAGTGACCAGCCCTGAGCTCCGCACTGCCACATGCGCCCGTGTGCAGTCCATCTCTCCGAGCTGTGGAGGCTCAGTGGATGATAAAGAACGGGGAGGGGCTGGGTGCAGTGGCTAACACCTGTAATCCCAGCATTTTGGGAGGCCAAGGGGGGTGGATCACCTGAGGTCAGGAGTTTGTGACCAGCCTGGCCAAGATGGTGAAACTCCATCTGTACAAAAACTACAAAAATTAGCCAGGCATGGTGGCGGGCACCTGTAATCCCAGGTACTTGGGAGTCTGAGGCAGGAGAATCACTTGAACTCGGGAGGCAGAGGTTGCAGCGAGCCGAGACTGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACGAGCAAAACTCGGTCTCAAAAAAAAAAGAAGGGAGGAGCTGAGTTCTGCCCACCCTCCAGGCCCTGGGTGCTGGGCCACAGATCACTGGGGTCGGATCCCCTGCCTGGATAAAAGGGGAGGTGACCCTGTTGTGTGCAGGGTCCTGCCCAGCATGGGGCAGGGTGCCCTTCATCTACGAAGCAACATTGGCCTGGCCCTGGCACAAAGATGGGCAGGCGGCCCGTCAGCAGGACTTGAGGGCAGGCAGCTCAGCGCTGCGATCACGGCGCCCTCTGGAGGCCGATCTGAAGAA。
所述的打靶Donor和Cas9-sgRNA表达载体共转染的细胞系为人胚肾细胞系HEK293。
本实施例中，所构建的HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系验证是否可以真实反映内源性ARID5A基因的相对表达量及表达变化的方法为：
1)克隆并构建ARID5A基因的转录激活因子RELA的表达载体pUC19/CMV-RELA，该表达载体被用于ARID5A基因的转录激活实验研究；
2)使用所构建的ARID5A基因的转录激活因RELA的表达载体pUC19/CMV-RELA分别转染HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系和野生型HEK293细胞系，并对HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系中的Luciferase活性及HEK293细胞系中ARID5A分子的mRNA表达水平分别进行检测；通过对knock-in细胞系中Luciferase表达活性与HEK293细胞中的ARID5A mRNA表达水平及变化的比较，进一步验证HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系中的Luciferase活性是否可以准确反映ARID5A分子的相对表达变化。
本实施例给出的构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法，涉及两个关键载体构建，一个是表达sgRNA及Cas9的表达载体，另一种是包含上下游同源臂的打靶Donor载体。其中：
所提供的表达sgRNA及Cas9的表达载体是将sgRNA表达组件和Cas9基因克隆至同一个表达载体所构建。
所提供的打靶Donor载体，是将打靶断裂位点上游914bp和其下游1073bp的两段序列分别作为打靶载体的上下游同源臂，再将其与申请人实验室保存的T2A-Luciferase报告基因、正筛元件CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA及负筛元件PGK-TK-T2A-mCherry-SV40pA分别连接到pU19表达载体中所构建。
以下是发明人给出的具体实施例。
实施例1：靶向目的基因ARID5A的终止密码子下游sgRNA的设计、合成及载体构建
(1)选取ARID5A基因的终止密码子下游作为打靶区(TSF)，长度大约为1000bp；
(2)在TSF区找出所有NGG及其前12位碱基在NCBI进行Blast，筛选出与目标序列完全匹配并且唯一匹配的序列(若无符合要求的NGG，反向查找CCN)，减少潜在脱靶位点；
本实施例设计了4个sgRNA，其中：
sgRNA1序列为：GTGGGTGGGGCTGCCATTAG；
sgRNA2序列为：AAGCCTGAGTTGGTCTGCGT；
sgRNA3序列为：GGTGGTGGATGTAGATTTCT；
sgRNA4序列为：TTGAAATCACCGGAGGTGCC。
分别在其5’加上ACCG得到正向寡核苷酸，获得其互补链，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸。将合成的正向和反向寡核苷酸室温退火后连入pU6-sgRNA1.0，获得sgRNA表达组件。
实施例2：表达sgRNA组件与Cas9基因的载体构建
(1)通过T7E1检测后，筛选出打靶效率高的sgRNA表达载体；
(2)将打靶效率高的sgRNA表达载体和Cas9的表达载体分别用KpnⅠ和SpeⅠ酶切后，经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳回收后，将得到的片段与载体连接，经过酶切及测序鉴定获得阳性克隆。将获得的克隆命名为pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA(如图1所示)。
实施例3：靶向ARID5A基因的打靶载体pUC19/ARID5A-donor的构建
所构建的打靶载体包含打靶断裂位点上游914bp和其下游1073bp的两段序列作为打靶载体的上下游同源臂，其中：
上游同源臂序列为：
CAGCTGTTCACCTCCCAGAGAGTCCCCAGAGCCCCAAAGGGCTGACTGAGAACTCCAGGCACCGGCTGACCCCTCAGGAGGGATTGCAGGCCCCAGGTGGCAGCCTCAGAGAGGAGGCGCAGGCAGGCCCCTGCCCGGCAGCCCCCATCTTCAAGGGCTGCTTCTACACCCACCCCACCGAGGTGCTGAAGCCTGTCAGCCAGCACCCCAGGGACTTCTTCTCTAGACTTAAAGATGGGGTGCTATTGGGGCCTCCTGGCAAAGAGGGGCTGTCAGTGAAAGAGCCCCAGCTGGTGTGGGGCGGAGACGCTAACCGCCCTTCTGCGTTCCATAAAGGTGGCTCCAGAAAGGGCATCCTCTACCCCAAGCCCAAAGCCTGCTGGGTGTCCCCCATGGCCAAGGTCCCAGCCGAGAGCCCCACGCTCCCGCCCACCTTCCCCAGTAGCCCAGGCCTGGGCAGCAAGCGCAGCCTGGAGGAAGAGGGTGCTGCCCACAGTGGGAAGAGACTGCGGGCCGTGTCTCCCTTTCTTAAGGAGGCGGATGCCAAGAAGTGTGGGGCCAAACCTGCAGGGTCCGGCCTGGTCTCCTGCCTTCTGGGCCCAGCCCTGGGGCCTGTGCCCCCAGAGGCCTACAGGGGCACCATGCTGCACTGCCCGCTGAACTTCACTGGCACCCCGGGCCCCTTGAAGGGCCAGGCTGCACTCCCCTTCAGCCCCCTGGTCATCCCGGCCTTCCCGGCCCACTTCCTGGCCACCGCAGGCCCCTCGCCCATGGCCGCTGGCCTGATGCACTTCCCCCCAACGTCCTTCGACAGTGCCCTCCGCCACAGACTTTGCCCGGCCTCATCTGCCTGGCACGCACCACCAGTCACAACCTATGCAGCGCCCCACTTCTTCCACCTCAACACCAAGCTG；
下游同源臂序列为：
GCACCACTGGAACTTACCCTGGCCGCTGGGGCTGGGATGCTCATGAACTCCGGCCATGGGAAGGGCCCCCATAGGTTGCAGGTAGAGAGGCCAAGGCCGGGGATGGGCAGGGTCTTGCTTGCCCAAGGCTACCATCCACGATGACAGAACCCAGACCAGGGAACGTGCAGCATGCCTGGCACCAGGGAGTGGGTGGCCAGGCCAAAAGGGCACCCTATCCAGCCCCTGCCCCTGGCCACCTCCTTCAGGAGCAGCCTGTGGAGGAGAGCTCAGGCACCTTCCAAGCGAGGCCTGTGACGGGTGGAGGGGCAAAGAGTGGTGCTCCCTGCTGTTGAGAGCACTCAGGCTCTGCAGGGGCATCTCCCAACCTTCCACCTCTTTCCTTCTGAGAGATGCCAAGATGTCAGCCTGAGCACCTGGAGTGACCAGCCCTGAGCTCCGCACTGCCACATGCGCCCGTGTGCAGTCCATCTCTCCGAGCTGTGGAGGCTCAGTGGATGATAAAGAACGGGGAGGGGCTGGGTGCAGTGGCTAACACCTGTAATCCCAGCATTTTGGGAGGCCAAGGGGGGTGGATCACCTGAGGTCAGGAGTTTGTGACCAGCCTGGCCAAGATGGTGAAACTCCATCTGTACAAAAACTACAAAAATTAGCCAGGCATGGTGGCGGGCACCTGTAATCCCAGGTACTTGGGAGTCTGAGGCAGGAGAATCACTTGAACTCGGGAGGCAGAGGTTGCAGCGAGCCGAGACTGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACGAGCAAAACTCGGTCTCAAAAAAAAAAGAAGGGAGGAGCTGAGTTCTGCCCACCCTCCAGGCCCTGGGTGCTGGGCCACAGATCACTGGGGTCGGATCCCCTGCCTGGATAAAAGGGGAGGTGACCCTGTTGTGTGCAGGGTCCTGCCCAGCATGGGGCAGGGTGCCCTTCATCTACGAAGCAACATTGGCCTGGCCCTGGCACAAAGATGGGCAGGCGGCCCGTCAGCAGGACTTGAGGGCAGGCAGCTCAGCGCTGCGATCACGGCGCCCTCTGGAGGCCGATCTGAAGAA。
上游同源臂使用引物ARID5A up arm ClaⅠfor，序列为CATCGATTCCAGCTGTTCACCTCCCAGAG；ARID5A up arm SpeⅠreverse，序列为GACTAGTCAGCTTGGTGTTGAGGTGGA得到；
下游同源臂使用引物ARID5A down arm SalⅠfor，序列为
CGTCGACGCACCACTGGAACTTACCCT；ARID5A down arm BglⅡ
reverse序列A AGATCTTTCTTCAGATCGGCCTCCAG得到。
再将其与本实验室保存的T2A-Luciferase报告基因、正筛元件
CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA及负筛元件
PGK-TK-T2A-mCherry-SV40pA分别连接到pU19表达载体，将获得的载体命名为pUC19/ARID5A-donor(如图2所示)。
实施例4：对克隆化后的细胞系进行PCR测序
将实施例2和实例3得到的载体以质量比4μg：8μg配置，使用磷酸钙法共同转染HEK293细胞，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周，待细胞系稳定过后，用倒置荧光显微镜观察细胞eGFP的表达情况(图4，左图为白光图，右图为荧光图)，之后对细胞经有限稀释法进行克隆化后每个克隆的Luciferase活性检测(图5)，再对克隆化后的细胞进行PCR鉴定。
PCR鉴定涉及的引物为(引物在基因组上位置如图3箭头所示)：
ARID5A up arm detection for序列CCCAGGAACAGCACAGAACA；
ARID5A up arm detection reverse序列ACCATCGCCTTTACCGACG；
ARID5A down arm detection for序列CGTTTCGGTGATGACGGTGAA；
ARID5A down arm detection reverse序列TTGGCACAGATGCTAGAGCC。
PCR结果显示，克隆化后所得的高Luciferase活性阳性克隆存在打靶供体外源DNA片段(如图6所示)。
实施例5：TA克隆对克隆化后的细胞系进行测序
(1)分别将实例4获得的克隆9号的上下游整合片段纯化产物3μL与0.5μL pGEM-T连接并转化大肠杆菌1-T1感受态细胞；
(2)挑取单克隆用引物T7序列TAATACGACTCACTATAGGG、引物SP6序列ATTTAGGTGACACTATAG测序，测序结果表明携带荧光素酶报告基因的打靶载体在目标位点处的正确重组，最终获得单一稳定的HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系(如图7所示)。
实施例5：克隆并构建ARID5A基因的转录激活因子RELA表达载体
使用的引物为：
引物REL-A CDS XhoⅠfor，序列为：
ACTCGAGGGAGGTGGATCTTACCTGCCAGATACAGACGAT；
引物REL-A CDS XbaⅠreverse，序列为：
ATCTAG ATTACTGACTCAGCAGGGCT；
得到ARID5A基因的转录激活因子REL-A，并构建转录激活因子REL-A的表达载体，经过酶切及测序鉴定获得阳性克隆。将获得的克隆命名为pUC19/CMV-REL-A。
实施例6：验证所构建的细胞系中Luciferase表达变化是否可以真实反映内源性ARID5A基因的相对表达量及表达变化
克隆并构建ARID5A基因的转录激活因子RELA的表达载体pUC19/CMV-RELA，该表达载体被用于ARID5A基因的转录激活实验研究；使用所构建的ARID5A基因的转录激活因子RELA的表达载体pUC19/CMV-RELA分别转染所构建的knock-in细胞系和野生型HEK293细胞系，所构建的knock-in细胞系中的Luciferase活性检测(如图8所示)和HEK293细胞系中ARID5A分子的mRNA表达水平检测(如图9所示)显示，与对照组相比，实验组均有显著性增强，证实了所构建的knock-in细胞系中的Luciferase活性可以准确反映ARID5A分子的相对表达变化，所建立的细胞系命名为HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系。
核苷酸或氨基酸序列表
<110> 陕西师范大学
<120>一种构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法
<160>
<210> 1
<211> 20
<212> sgRNA1序列
<213> DNA
<220>
<400>
GTGGGTGGGGCTGCCATTAG
<210> 2
<211> 20
<212> sgRNA2序列
<213> DNA
<220>
<400>
AAGCCTGAGTTGGTCTGCGT
<210> 3
<211> 20
<212> sgRNA3序列
<213> DNA
<220>
<400>
GGTGGTGGATGTAGATTTCT
<210> 4
<211> 20
<212> sgRNA1序列
<213> DNA
<220>
<400>
TTGAAATCACCGGAGGTGCC
<210> 5
<211> 914
<212> 打靶断裂位点上游同源臂序列
<213> DNA
<220>
<400>
CAGCTGTTCACCTCCCAGAGAGTCCCCAGAGCCCCAAAGGGCTGACTGAGAACTCCAGGCACCGGCTGACCCCTCAGGAGGGATTGCAGGCCCCAGGTGGCAGCCTCAGAGAGGAGGCGCAGGCAGGCCCCTGCCCGGCAGCCCCCATCTTCAAGGGCTGCTTCTACACCCACCCCACCGAGGTGCTGAAGCCTGTCAGCCAGCACCCCAGGGACTTCTTCTCTAGACTTAAAGATGGGGTGCTATTGGGGCCTCCTGGCAAAGAGGGGCTGTCAGTGAAAGAGCCCCAGCTGGTGTGGGGCGGAGACGCTAACCGCCCTTCTGCGTTCCATAAAGGTGGCTCCAGAAAGGGCATCCTCTACCCCAAGCCCAAAGCCTGCTGGGTGTCCCCCATGGCCAAGGTCCCAGCCGAGAGCCCCACGCTCCCGCCCACCTTCCCCAGTAGCCCAGGCCTGGGCAGCAAGCGCAGCCTGGAGGAAGAGGGTGCTGCCCACAGTGGGAAGAGACTGCGGGCCGTGTCTCCCTTTCTTAAGGAGGCGGATGCCAAGAAGTGTGGGGCCAAACCTGCAGGGTCCGGCCTGGTCTCCTGCCTTCTGGGCCCAGCCCTGGGGCCTGTGCCCCCAGAGGCCTACAGGGGCACCATGCTGCACTGCCCGCTGAACTTCACTGGCACCCCGGGCCCCTTGAAGGGCCAGGCTGCACTCCCCTTCAGCCCCCTGGTCATCCCGGCCTTCCCGGCCCACTTCCTGGCCACCGCAGGCCCCTCGCCCATGGCCGCTGGCCTGATGCACTTCCCCCCAACGTCCTTCGACAGTGCCCTCCGCCACAGACTTTGCCCGGCCTCATCTGCCTGGCACGCACCACCAGTCACAACCTATGCAGCGCCCCACTTCTTCCACCTCAACACCAAGCTG
<210> 6
<211> 1073
<212> 打靶断裂位点下游同源臂序列
<213> DNA
<220>
<400>
GCACCACTGGAACTTACCCTGGCCGCTGGGGCTGGGATGCTCATGAACTCCGGCCATGGGAAGGGCCCCCATAGGTTGCAGGTAGAGAGGCCAAGGCCGGGGATGGGCAGGGTCTTGCTTGCCCAAGGCTACCATCCACGATGACAGAACCCAGACCAGGGAACGTGCAGCATGCCTGGCACCAGGGAGTGGGTGGCCAGGCCAAAAGGGCACCCTATCCAGCCCCTGCCCCTGGCCACCTCCTTCAGGAGCAGCCTGTGGAGGAGAGCTCAGGCACCTTCCAAGCGAGGCCTGTGACGGGTGGAGGGGCAAAGAGTGGTGCTCCCTGCTGTTGAGAGCACTCAGGCTCTGCAGGGGCATCTCCCAACCTTCCACCTCTTTCCTTCTGAGAGATGCCAAGATGTCAGCCTGAGCACCTGGAGTGACCAGCCCTGAGCTCCGCACTGCCACATGCGCCCGTGTGCAGTCCATCTCTCCGAGCTGTGGAGGCTCAGTGGATGATAAAGAACGGGGAGGGGCTGGGTGCAGTGGCTAACACCTGTAATCCCAGCATTTTGGGAGGCCAAGGGGGGTGGATCACCTGAGGTCAGGAGTTTGTGACCAGCCTGGCCAAGATGGTGAAACTCCATCTGTACAAAAACTACAAAAATTAGCCAGGCATGGTGGCGGGCACCTGTAATCCCAGGTACTTGGGAGTCTGAGGCAGGAGAATCACTTGAACTCGGGAGGCAGAGGTTGCAGCGAGCCGAGACTGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACGAGCAAAACTCGGTCTCAAAAAAAAAAGAAGGGAGGAGCTGAGTTCTGCCCACCCTCCAGGCCCTGGGTGCTGGGCCACAGATCACTGGGGTCGGATCCCCTGCCTGGATAAAAGGGGAGGTGACCCTGTTGTGTGCAGGGTCCTGCCCAGCATGGGGCAGGGTGCCCTTCATCTACGAAGCAACATTGGCCTGGCCCTGGCACAAAGATGGGCAGGCGGCCCGTCAGCAGGACTTGAGGGCAGGCAGCTCAGCGCTGCGATCACGGCGCCCTCTGGAGGCCGATCTGAAGAA
<210> 7
<211> 29
<212> ARID5A up arm ClaⅠ for序列
<213> DNA
<220>
<400>
CATCGAT TCCAGCTGTTCACCTCCCAGAG
<210> 8
<211> 27
<212> ARID5A up arm SpeⅠ reverse序列
<213> DNA
<220>
<400>
GACTAGTCAGCTTGGTGTTGAGGTGGA
<210> 9
<211> 27
<212> ARID5A down arm SalⅠ for序列
<213> DNA
<220>
<400>
CGTCGACGCACCACTGGAACTTACCCT
<210> 10
<211> 27
<212> ARID5A down arm BglⅡ reverse序列
<213> DNA
<220>
<400>
A AGATCTTTCTTCAGATCGGCCTCCAG
<210> 11
<211> 20
<212> ARID5A up arm detection for序列
<213> DNA
<220>
<400>
CCCAGGAACAGCACAGAACA
<210> 12
<211> 19
<212> ARID5A up arm detection reverse序列
<213> DNA
<220>
<400>
ACCATCGCCTTTACCGACG
<210> 13
<211> 21
<212> ARID5A down arm detection for序列
<213> DNA
<220>
<400>
CGTTTCGGTGATGACGGTGAA
<210> 14
<211> 20
<212> ARID5A down arm detection reverse序列
<213> DNA
<220>
<400>
TTGGCACAGATGCTAGAGCC
<210> 15
<211> 20
<212>引物T7序列
<213> DNA
<220>
<400>
TAATACGACTCACTATAGGG
<210> 16
<211> 18
<212>引物SP6序列
<213> DNA
<220>
<400>
ATTTAGGTGACACTATAG
<210> 17
<211> 40
<212>引物REL-A CDS XhoⅠ for序列
<213> DNA
<220>
<400>
ACTCGAGGGAGGTGGATCTTACCTGCCAGATACAGACGAT
<210> 18
<211> 26
<212>引物REL-A CDS XbaⅠreverse序列
<213> DNA
<220>
<400>
ATCTAG ATTACTGACTCAGCAGGGCT

Claims (5)

1.一种构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法，其特征在于，按以下步骤实施：
1)在目的基因ARID5A的终止密码子下游设计并合成相应的sgRNA，室温退火后连入pU6-sgRNA1.0，筛选后获得sgRNA表达组件，并检测其打靶效率；
2)将检测过且打靶效率高的sgRNA表达组件与Cas9基因克隆至一个表达载体，获得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA；
3)构建靶向ARID5A基因的打靶载体pUC19/ARID5A-donor，该打靶载体pUC19/ARID5A-donor的结构为两部分，第一部分是与断裂位点上下游分别具有相同序列的上下游同源臂；第二部分是位于上下游同源臂之间的待重组入基因组靶位点的T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA DNA片段；
4)将pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA与pUC19/ARID5A-donor共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周，待细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，再对克隆化后的细胞进行PCR鉴定并测序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶载体在目标位点处的正确重组，最终获得单一稳定的HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的合成相应的sgRNA为针对ARID5A的终止密码子下游设计的sgRNA，其中：
sgRNA1序列为：GTGGGTGGGGCTGCCATTAG；
sgRNA2序列为：AAGCCTGAGTTGGTCTGCGT；
sgRNA3序列为：GGTGGTGGATGTAGATTTCT；
sgRNA4序列为：TTGAAATCACCGGAGGTGCC。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的上下游同源臂序列分别如下：
上游同源臂序列为：
CAGCTGTTCACCTCCCAGAGAGTCCCCAGAGCCCCAAAGGGCTGACTGAGAACTCCAGGCACCGGCTGACCCCTCAGGAGGGATTGCAGGCCCCAGGTGGCAGCCTCAGAGAGGAGGCGCAGGCAGGCCCCTGCCCGGCAGCCCCCATCTTCAAGGGCTGCTTCTACACCCACCCCACCGAGGTGCTGAAGCCTGTCAGCCAGCACCCCAGGGACTTCTTCTCTAGACTTAAAGATGGGGTGCTATTGGGGCCTCCTGGCAAAGAGGGGCTGTCAGTGAAAGAGCCCCAGCTGGTGTGGGGCGGAGACGCTAACCGCCCTTCTGCGTTCCATAAAGGTGGCTCCAGAAAGGGCATCCTCTACCCCAAGCCCAAAGCCTGCTGGGTGTCCCCCATGGCCAAGGTCCCAGCCGAGAGCCCCACGCTCCCGCCCACCTTCCCCAGTAGCCCAGGCCTGGGCAGCAAGCGCAGCCTGGAGGAAGAGGGTGCTGCCCACAGTGGGAAGAGACTGCGGGCCGTGTCTCCCTTTCTTAAGGAGGCGGATGCCAAGAAGTGTGGGGCCAAACCTGCAGGGTCCGGCCTGGTCTCCTGCCTTCTGGGCCCAGCCCTGGGGCCTGTGCCCCCAGAGGCCTACAGGGGCACCATGCTGCACTGCCCGCTGAACTTCACTGGCACCCCGGGCCCCTTGAAGGGCCAGGCTGCACTCCCCTTCAGCCCCCTGGTCATCCCGGCCTTCCCGGCCCACTTCCTGGCCACCGCAGGCCCCTCGCCCATGGCCGCTGGCCTGATGCACTTCCCCCCAACGTCCTTCGACAGTGCCCTCCGCCACAGACTTTGCCCGGCCTCATCTGCCTGGCACGCACCACCAGTCACAACCTATGCAGCGCCCCACTTCTTCCACCTCAACACCAAGCTG；
下游同源臂序列为：
GCACCACTGGAACTTACCCTGGCCGCTGGGGCTGGGATGCTCATGAACTCCGGCCATGGGAAGGGCCCCCATAGGTTGCAGGTAGAGAGGCCAAGGCCGGGGATGGGCAGGGTCTTGCTTGCCCAAGGCTACCATCCACGATGACAGAACCCAGACCAGGGAACGTGCAGCATGCCTGGCACCAGGGAGTGGGTGGCCAGGCCAAAAGGGCACCCTATCCAGCCCCTGCCCCTGGCCACCTCCTTCAGGAGCAGCCTGTGGAGGAGAGCTCAGGCACCTTCCAAGCGAGGCCTGTGACGGGTGGAGGGGCAAAGAGTGGTGCTCCCTGCTGTTGAGAGCACTCAGGCTCTGCAGGGGCATCTCCCAACCTTCCACCTCTTTCCTTCTGAGAGATGCCAAGATGTCAGCCTGAGCACCTGGAGTGACCAGCCCTGAGCTCCGCACTGCCACATGCGCCCGTGTGCAGTCCATCTCTCCGAGCTGTGGAGGCTCAGTGGATGATAAAGAACGGGGAGGGGCTGGGTGCAGTGGCTAACACCTGTAATCCCAGCATTTTGGGAGGCCAAGGGGGGTGGATCACCTGAGGTCAGGAGTTTGTGACCAGCCTGGCCAAGATGGTGAAACTCCATCTGTACAAAAACTACAAAAATTAGCCAGGCATGGTGGCGGGCACCTGTAATCCCAGGTACTTGGGAGTCTGAGGCAGGAGAATCACTTGAACTCGGGAGGCAGAGGTTGCAGCGAGCCGAGACTGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACGAGCAAAACTCGGTCTCAAAAAAAAAAGAAGGGAGGAGCTGAGTTCTGCCCACCCTCCAGGCCCTGGGTGCTGGGCCACAGATCACTGGGGTCGGATCCCCTGCCTGGATAAAAGGGGAGGTGACCCTGTTGTGTGCAGGGTCCTGCCCAGCATGGGGCAGGGTGCCCTTCATCTACGAAGCAACATTGGCCTGGCCCTGGCACAAAGATGGGCAGGCGGCCCGTCAGCAGGACTTGAGGGCAGGCAGCTCAGCGCTGCGATCACGGCGCCCTCTGGAGGCCGATCTGAAGAA。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述的HEK293细胞系为人胚肾细胞系HEK293。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系验证是否可以真实反映内源性ARID5A基因的相对表达量及表达变化的方法为：
1)克隆并构建ARID5A基因的转录激活因子RELA的表达载体pUC19/CMV-RELA，该表达载体pUC19/CMV-RELA用于ARID5A基因的转录激活实验研究；
2)使用所构建的ARID5A基因的转录激活因子RELA的表达载体pUC19/CMV-RELA转染HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系和野生型HEK293细胞系，并对HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系中的Luciferase活性及HEK293细胞系中ARID5A分子的mRNA表达水平分别进行检测；通过对knock-in细胞系中Luciferase表达活性与HEK293细胞中的ARID5A mRNA表达水平及变化的比较，进一步验证HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系中的Luciferase活性是否可以准确反映ARID5A分子的相对表达变化。
CN201811054884.3A 2018-09-11 2018-09-11 一种构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法 Pending CN109321597A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811054884.3A CN109321597A (zh) 2018-09-11 2018-09-11 一种构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811054884.3A CN109321597A (zh) 2018-09-11 2018-09-11 一种构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109321597A true CN109321597A (zh) 2019-02-12

Family

ID=65264771

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811054884.3A Pending CN109321597A (zh) 2018-09-11 2018-09-11 一种构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109321597A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109797166A (zh) * 2018-11-20 2019-05-24 陕西师范大学 基于CRISPR-Cas9靶向基因组修饰技术构建Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系方法
CN112961832A (zh) * 2021-03-05 2021-06-15 上海交通大学 一种细胞株及其制备方法和用途
CN113924119A (zh) * 2019-05-31 2022-01-11 国立大学法人大阪大学 新型的消化器官癌治疗剂及其筛选方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104293833A (zh) * 2014-10-09 2015-01-21 西北农林科技大学 一种基于TALEN 介导的Sp110 巨噬细胞特异打靶载体及重组细胞
CN108359692A (zh) * 2018-01-19 2018-08-03 陕西师范大学 一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104293833A (zh) * 2014-10-09 2015-01-21 西北农林科技大学 一种基于TALEN 介导的Sp110 巨噬细胞特异打靶载体及重组细胞
CN108359692A (zh) * 2018-01-19 2018-08-03 陕西师范大学 一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KISHAN K. NYATI，ET AL: "TLR4-induced NF- B and MAPK signaling regulate the IL-6 mRNA stabilizing protein Arid5a", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109797166A (zh) * 2018-11-20 2019-05-24 陕西师范大学 基于CRISPR-Cas9靶向基因组修饰技术构建Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系方法
CN113924119A (zh) * 2019-05-31 2022-01-11 国立大学法人大阪大学 新型的消化器官癌治疗剂及其筛选方法
CN112961832A (zh) * 2021-03-05 2021-06-15 上海交通大学 一种细胞株及其制备方法和用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2994166C (en) Engineered crispr-cas9 compositions and methods of use
CN113286880A (zh) 调控基因组的方法和组合物
CN108559760A (zh) 基于CRISPR靶向基因组修饰技术建立荧光素酶knock-in细胞系的方法
CN108559732A (zh) 基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-luciferase细胞系的方法
US20180251789A1 (en) Multilayer genetic safety kill circuits based on single cas9 protein and multiple engineered grna in mammalian cells
CN109321597A (zh) 一种构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法
JP5258874B2 (ja) Ｒｎａ干渉タグ
EP4025691B1 (en) Novel, non-naturally occurring crispr-cas nucleases for genome editing
CN114438055B (zh) 新型的crispr酶和系统以及应用
E Tolmachov Building mosaics of therapeutic plasmid gene vectors
Zhan et al. Improving transgene expression and CRISPR‐Cas9 efficiency with molecular engineering‐based molecules
WO2015185691A9 (en) Low-leakage cellular biosensor system
Schlatter et al. Novel CNBP‐and La‐based translation control systems for mammalian cells
CN112592923A (zh) Ires序列、ires序列的应用和多顺反子表达载体
CN108034674B (zh) 一种快速建立基因敲除细胞株的重组载体及其方法
US20230113805A1 (en) CRISPR-Cas NUCLEASES FROM CPR-ENRICHED METAGENOME
JP2009189318A (ja) 組換え酵素を用いた遺伝子増幅方法
Léjard et al. Construction and validation of a novel dual reporter vector for studying mammalian bidirectional promoters
Mursi et al. The production of recombinant proteins from mammalian cells using RNA element
JP5246904B2 (ja) 外来遺伝子導入用ベクター及び外来遺伝子が導入されたベクターの製造方法
RU2364627C2 (ru) Экспрессионный вектор для синтеза белков в клетках млекопитающих
Buscà et al. N-terminal alanine-rich (NTAR) sequences drive precise start codon selection resulting in elevated translation of multiple proteins including ERK1/2
CN109295163B (zh) 一种通用长片段染色体步移的方法
KR20240099418A (ko) 세린 재조합효소
CN107034215B (zh) 一种cux1蛋白可结合dna片段及在cux1活性检测中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190212