CN112961832A - 一种细胞株及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种细胞株及其制备方法和用途，所述细胞株基因组的安全港位点含有NFAT元件及其调控的报告基因，所述NFAT元件及NFAT元件调控的报告基因为NFAT‑RE‑Luciferase基因。本发明的细胞株中NFAT‑RE‑Luciferase基因定点整合在基因组，现有细胞株主要通过随机整合技术获得，因此本发明的细胞株具有显著的基因组稳定性，具有较现有随机整合细胞系更高的转录活性及更强的荧光水平，从而提高其检测的稳定性和灵敏度，本发明的细胞株也为生物学研究或药物活性检测提供了良好的平台和解决方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种细胞株及其制备方法和用途。
背景技术
生物技术药物通常具有大分子量和复杂的空间结构、对环境条件高度敏感的特点，由于其复杂性，生物药物评价的方法、质量控制与传统化学药物有很大不同，在一致性、稳定性、安全性方面具有一定的困难。荧光素酶报告基因系统在适当的调控元件控制下，利用信号转导的激活或失活来表征生物药物引发的细胞活性变化，具有稳定性高、准确性高、简单快捷的特点。因此，荧光素酶报告基因系统已成为生物药物质量控制中生物测定的重要替代方法。
传统方法将荧光素酶表达基因整合到具有特定的启动原件的载体上，再转染至细胞中，通过筛选获得稳定的细胞系，这种方法容易导致外源基因在细胞中丢失，成功率低，且因为信号通路的需要，必须再次转染其他质粒，过程复杂、耗时。为了提高含有报告基因的细胞株在生物学及药学领域的应用，亟需开发新型的基因组稳定的细胞株，不但具有基因型的传代稳定性，还应具有荧光素蛋白较高的表达效率，从而提高检测灵敏度和稳定性。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种细胞株及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种细胞株，所述细胞株基因组的安全港位点含有NFAT元件及其调控的报告基因。
本发明还提供所述细胞株的制备方法，所为采用Talen或CRISPR/cas9基因编辑方法，向宿主细胞基因组的安全港位点插入NFAT元件及其调控的报告基因。
本发明还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包括依次连接的gRNA识别的PAM序列，HAL序列，NFAT-RE-Luciferase序列，抗生素筛选序列，HAR序列，gRNA识别的PAM序列。
本发明还提供所述细胞株和/或核酸构建体在检测NFAT信号通路相关分子变化、药物筛选或药物质控中的用途。
本发明还提供一种用于检测NFAT信号通路相关分子变化的组合物，所述组合物包括细胞株。
本发明还提供一种检测NFAT信号通路相关分子变化的方法，所述方法包括以下步骤：将NFAT信号通路介导的基因整合入所述细胞株，培养所述细胞株，根据细胞株的荧光信号判断该NFAT信号通路介导的基因的生物学活性。
如上所述，本发明的细胞株及其制备方法和用途，具有以下有益效果：
(1)NFAT-RE-Luciferase序列定点整合在细胞株的基因组，现有细胞株主要通过随机整合技术获得，因此本发明的细胞株随着宿主细胞基因组的复制而扩增，具有显著的基因组稳定性，从而提高其检测的稳定性和灵敏度。本发明的含报告基因的细胞株也为生物学研究或药物活性检测提供了良好的平台和解决方法。
(2)由于NFAT-RE-Luciferase序列整合在基因组位点，当受到外源性信号刺激时，具有较现有随机整合细胞系更高的转录活性及更强的荧光水平，从而提高其检测的灵敏性。
(3)本发明的起始细胞是HEK293T细胞株，该细胞株公认具有较高转染效率，因此该细胞株可用于NFAT信号通路相关分子的转染，从而应用于其生物学活性的检测，例如VEGFR2分子。
(4)通过CRISPR-Cas9介导的定点整合技术构建NFAT-RE-Luciferase HEK293T细胞系，采用我们设计的同源臂序列HAL、HAR，具有较高的整合效率，较随机整合方法实验步骤简单，时间短，可推广应用于其他报告基因系统细胞株的构建，具有广泛的应用空间。
附图说明
图1显示为构建的gRNA-pX458质粒图谱
图2显示为T7E1编辑效率检测PCR扩增核酸电泳结果
图3显示为T7E1酶切PCR产物核酸电泳结果
图4显示为AAVS1位点上下游同源臂扩增核酸电泳结果
图5显示为AAVS1位点含同源臂的上下游同源臂核酸电泳结果
图6显示为构建的过度质粒pUC19-HAL/R质粒图谱结构
图7显示为扩增含同源臂的Luciferase表达调控序列核酸电泳结果
图8显示为扩增含同源臂的Puro表达调控序列核酸电泳结果
图9显示为构建的donor质粒pUC19-NFAT-RE-Luciferase-Puro质粒图谱结构
图10显示为293T细胞加入含不同浓度嘌呤霉素培养基72h后细胞活率和密度
图11显示为gRNA-pX458质粒和donor质粒共转染转染48h后GFP表达
图12显示为阳性单克隆细胞株junction PCR核酸电泳结果
图13显示为PMA作用8h后检测空白组和实验组中Luciferase活性
图14显示为不同浓度MK5046作用6h后检测瞬转表达BRS-3受体的NFAT-RE-Luciferase-Puro-293T细胞的Luciferase活性
具体实施方式
本发明提供一种细胞株，所述细胞株基因组的安全港位点含有NFAT元件及其调控的报告基因。
所述NFAT元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述NFAT元件调控的报告基因包括荧光素酶报告基因、氯霉素乙酰基转移酶报告基因、β半乳糖苷酶报告基因、分泌型碱性磷酸酶报告基因、荧光蛋白报告基因。所述荧光蛋白报告基因包括GFP、RFP等。
在一种实施方式中，所述NFAT元件及NFAT元件调控的报告基因为NFAT-RE-Luciferase，所述NFAT-RE-Luciferase的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述细胞株的起始细胞为哺乳动物细胞。起始细胞即作为构建本发明的细胞株的基础细胞，也可称为宿主细胞。所述宿主细胞选自选自本领域各种可适用的宿主细胞，只要不对本发明的发明目的产生限制即可。在一种实施方式中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。在一种实施方式中，具体的可适用的细胞为HEK 293T细胞。
所述安全港(Safe Habor)位点是一个经过验证能确保转入DNA片段，该位点是一个开放的染色体结构，能保证转入基因能被正常转录。另外很重要的一点是在该位点插入外源目的片段对细胞无已知的副作用。
在一种实施方式中，所述安全港位点选自AAVS1位点和H11位点。AAVS1位点位于人类基因组第19号染色体，H11位点位于人的22号染色体。
在一较佳实施例中，报告基因插入到AAVS1位点。
在一种实施方式中，报告基因插入到安全港位点的外显子或内含子位置。
由于NFAT-RE-Luciferase序列定点整合在所述细胞株的基因组，因此该细胞株随着宿主细胞基因组的复制而扩增，NFAT-RE-Luciferase不会因为传代而丢失，具有显著的基因组稳定性。
本发明还提供所述细胞株的制备方法，为采用Talen或CRISPR/cas9基因编辑方法，向宿主细胞基因组的安全港位点插入NFAT元件及其调控的报告基因。
具体的，所述制备方法包括如下步骤：将靶向质粒与报告基因质粒共转染宿主细胞，培养完成后筛选稳定表达报告基因的细胞株即得到细胞株；所述靶向质粒中包括能够靶向安全港位点的序列，所述报告基因质粒中含有NFAT元件调控的报告基因、且含有能够被靶向质粒识别的序列。
在使用CRISPR/cas9的实施方式中，所述制备方法具体包括如下步骤：
1)构建携带有Cas9蛋白的靶向质粒；
2)构建报告基因质粒，所述报告基因质粒中包括NFAT-RE-Luciferase序列、抗生素筛选序列、gRNA识别的PAM序列；
3)将靶向质粒与报告基因质粒共转染至宿主细胞；
4)用抗生素筛选，得到稳定表达报告基因的细胞株。
在一种实施方式中，所述靶向质粒和报告基因质粒的框架可选自本领域中的常用框架。例如，可选自pUC19、pX458等。
在一种实施方式中，所述靶向质粒包括靶向AAVS1位点的gRNA序列，所述gRNA序列如SEQ ID NO.5所示。
在一种实施方式中，所述靶向质粒包括核酸酶pSpCas9(BB)表达组件。
具体的，根据gRNA序列设计gRNA引物，通过磷酸化、退火配对后，连接到Bsb I酶切后的质粒，转染大肠杆菌，挑菌落鉴定正确后，扩增质粒备用。将质粒转染至HEK293T中，转染48h后，提取基因组，对靶点序列AAVS1位点进行PCR扩增，并通过T7E1酶进行编辑效率检测。
所述报告基因质粒为供体质粒(donor质粒)，所述供体质粒中还包括介导gRNA位点基因组定点整合的同源臂序列。
在一种实施方式中，介导gRNA位点基因组定点整合的上游同源臂(HAL)序列如SEQID NO.6所示，下游同源臂(HAR)序列如SEQ ID NO.7所示。
抗生素筛选序列中的抗生素包括嘌呤霉素、G418、潮霉素。抗生素筛选基因用于细胞池加压及单克隆细胞筛选。在一种实施方式中，所述嘌呤霉素筛选序列如SEQ ID NO.3所示。
在一种实施方式中，所述供体质粒以pUC19质粒为框架，依次插入gRNA识别的PAM序列，HAL序列，NFAT-RE-Luciferase序列，抗生素筛选序列，HAR序列，gRNA识别的PAM序列。在一种实施方式中，所述供体质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示。
在同源臂外侧包括gRNA识别的PAM序列，作为Cas9切割位点，使donor质粒线性化，可提高整合效率。
在一种实施方式中，所述gRNA识别的PAM序列如SEQ ID NO.4所示。
在一种实施方式中，步骤3)中宿主细胞为HEK293T细胞。
在一种实施方式中，转染36～60h后加入嘌呤霉素筛选。
在一种实施方式中，所述制备方法还包括在得到的稳定表达报告基因的细胞株中挑选单克隆细胞系。
在一种实施方式中，所述制备方法还包括对挑选的单克隆细胞系进行鉴定。鉴定的目的为确认供体质粒中NFAT-RE-Luciferase序列整合至基因组中AAVS1位点，获得单一稳定的NFAT-RE-Luciferase HEK293T细胞系。
本发明还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包括依次连接的gRNA识别的PAM序列，HAL序列，NFAT-RE-Luciferase序列，抗生素筛选序列，HAR序列，gRNA识别的PAM序列。
所述核酸构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示。
本发明还提供所述细胞株和/或核酸构建体在检测NFAT信号通路相关分子变化、药物筛选或药物质控中的用途。
本发明还提供一种用于检测NFAT信号通路相关分子变化的组合物，所述组合物包括细胞株。
所述组合物还包括适于细胞生存的载体。所述载体例如为培养基。
本发明还提供一种检测NFAT信号通路相关基因生物学活性的方法，所述方法包括以下步骤：将NFAT信号通路相关的基因整合入所述细胞株，根据细胞株的荧光信号判断该NFAT信号通路相关的基因的生物学活性。
将NFAT信号通路介导的基因整合入所述细胞株中的方法包括将含NFAT信号通路介导的基因的质粒转染或诱导进入细胞株。
通过荧光信号的强弱判断待验证的分子是否为NFAT信号通路相关分子或者待验证的分子的表达情况。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例采用CRISPR-Cas9介导的同源重组定点整合技术，将NFAT-RE-Luciferase基因整合到HEK293T的AAVS1位点，使NFAT转录元件及其调控的荧光素酶的序列定点整合至细胞基因组中，并筛选获得稳定的NFAT-RE-Luciferase HEK293T单克隆细胞系，其荧光素酶的表达受到NFAT信号通路的调控，从而能够应用于NFAT信号通路相关分子生物学活性的检测。
实施例1：设计靶向AAVS1位点的gRNA，构建gRNA-pX458质粒及检测编辑效率
通过文献检索，确认目前AAVS1位点常用的gRNA靶向序列，设计gRNA正向引物、反向引物分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。
引物磷酸化、配对：通过T4 PNK使引物磷酸化，梯度退火配对后，稀释200倍，作为连接模板。
制备线性化的载体pX458：向含有纯化的载体质粒pX458的试管中，加入限制性内切酶Bbs I，置于37度水浴中，酶切2h，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收线性载体。.
构建gRNA-pX458质粒：将1μL稀释后的配对引物加入到50ng的线性化pX458载体中，再加入T4连接酶，25度孵育1h。将连接的产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中，经过氨苄抗生素筛选，挑选出单克隆，通过菌落PCR得到阳性结果的菌株，通过DNA测序进一步鉴定重组质粒。构建质粒图谱结果如图1，核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。
将gRNA-pX458质粒通过脂质体转染293T细胞，转染48小时后，提取基因组DNA，对AAVS1位点进行PCR扩增，电泳检测(见图2)并利用T7E1酶切风阀分gRNA的切割效率。设计T7E1编辑效率检测PCR正向扩增引物如SEQ ID NO.10所示，T7E1编辑效率检测扩增反向引物SEQ ID NO.11。
然后取500ng纯化的PCR产物，加入1μL的T7E1酶，37摄氏度孵育30分钟，进行琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果见图3，根据Image J软件计算灰度值，并计算编辑效率约12.20％。
实施例2：构建靶向AAVS1位点的donor质粒pUC19-NFAT-RE-Luciferase-Puro
该实例中，首先构建了含有AAVS1位点上下游同源臂的pUC19-HAL/R质粒作为中间过渡载体，通过上下游同源臂之间预留的酶切位点BstB I，Sal I，插入表达Luc，Puro及其调控序列，构建得到pUC19-NFAT-RE-Luciferase-Puro。
线性化pUC19载体：向含有纯化的载体质粒pUC19的试管中，加入限制性内切酶EcoR I与Hind III，置于37度水浴中，酶切2h，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收线性载体。
调取上下游同源臂序列：以HEK 293T细胞基因组为模板，PCR扩增AAVS1位点上游同源臂(HAL)，下游同源臂序列(HAR)。AAVS1位点上游同源臂HAL扩增正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示，AAVS1位点下游同源臂HAR扩增正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示。
将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(如图4)，胶回收约800bp大小产物，以此为模板，分别扩增含有pUC19载体同源臂的HAL同源臂片段和HAR同源臂片段，HAL同源臂片段扩增正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，HAR同源臂片段扩增正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示。
将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(如图5)，胶回收约800bp大小产物，以此为同源重组模板。采用同源重组的方法，将两个含有同源臂的片段HAR、HAL整合到线性化的载体pUC19上。载体与片段的用量按照(0.02×碱基对数)ng(0.03pM)的要求，使用多片段同源重组酶连接，37度反应30min，然后迅速冰浴。将同源重组的产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中，经过氨苄抗生素筛选，挑选出单克隆，通过菌落PCR得到阳性结果的菌株，通过DNA测序进一步鉴定重组质粒。构建质粒图谱如图6。
线性化pUC19--HAL/R载体：根据酶切位点BstB I与Sal I，线性化载体pUC19--HAL/R。
以质粒pGL4.30为模板，PCR扩增表达NFAT-RE-Luciferase及其调控序列含同源臂片段，设计的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21所示。
将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(如图7)，胶回收约2300bp大小产物，以此为同源重组模板。
PCR扩增表达Puro及其调控序列含同源臂片段，设计的正向和反向引物如SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.23所示。
将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(如图8)，胶回收约1400bp大小产物，以此为同源重组模板。
采用同源重组的方法，将两个含有同源臂的片段NFAT-RE-Luciferase、Puro整合到线性化的载体pUC19-HAL/R上。载体与片段的用量按照(0.02×碱基对数)ng(0.03pM)的要求，使用多片段同源重组酶连接，37度反应30min，然后迅速冰浴。将同源重组的产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中，经过氨苄抗生素筛选，挑选出单克隆，通过菌落PCR得到阳性结果的菌株，通过DNA测序进一步鉴定重组质粒。构建质粒图谱结果如图9，核苷酸序列如SEQID NO.29所示。
实施例3：优化HEK 293T细胞系适合的嘌呤霉素筛选浓度
将HEK 293T细胞铺板24孔板中，每孔100000个细胞，12h后，将正常培养基替换为含有不同浓度的嘌呤霉素培养基：0，1，2，4μg/mL。加压培养72h后，观察细胞形态，并检测细胞活率和密度(如图10)，选择杀死大部分细胞的最低浓度为最适浓度。
实施例4：NFAT-RE-Luciferase-Puro-293T细胞系的构建及鉴定
HEK 293T细胞铺板6孔板，每孔5×105个细胞，12h后，将质粒pUC19-NFAT-RE-Luciferase-Puro-293T(2.5μg)和gRNA-pX458(2.5μg)用脂质体共转染至HEK 293T细胞中，48h后，观察绿色荧光表达(如图11)，开始用含有2μg/mL嘌呤霉素培养基加压筛选，持续2周后，细胞池稳定，通过有限稀释法挑选出单克隆细胞，通过junction PCR筛选出阳性细胞(如图12)，5’junction PCR上游鉴定正向引物和反向引物设计分别如SEQ ID NO.24、SEQID NO.25，3’junction PCR上游鉴定正向引物和反向引物设计分别如SEQ ID NO.26、SEQID NO.27。
实施例5：验证NFAT-RE-Luciferase-Puro-293T细胞系中Luciferase中表达是否受到PMA调控
将构建的NFAT-RE-Luciferase-Puro-293T细胞系铺板96孔板中，12h后，去除原有培养基，空白组加入无血清培养基100μL，实验组加入100μL含不同浓度的PMA的无血清培养基，置于培养箱中孵育8h后，每孔加入荧光素酶检测试剂，避光孵育10min后，对比试验组和对照组的信号强度变化。结果如图13所示，在10ng/mL时，Luciferase活性开始显著增强，并随着PMA浓度提高，活性进一步提高。
实施例6：验证BRS-3受体介导的信号通路在NFAT-RE-Luciferase-Puro-293T细胞系中的作用
蛙皮素受体亚型-3(BRS-3)是一种G蛋白偶联受体，可结合蛙皮素样肽。当配体与BRS-3受体结合后，可引起磷脂酰肌醇-钙离子第二信使的活化，具有调节代谢率，葡萄糖代谢和高血压等作用。将构建的NFAT-RE-Luciferase-Puro-293T细胞系铺板6孔板中，12h后，将带有BRS-3编码基因的真核表达质粒转染至细胞中，再将转染24-48h后的细胞消化铺板于96孔板中，每孔细胞数为50000个。12h后，加入BRS-3受体的配体MK5046作为激活剂，浓度分别为：0.0128、0.064、0.32、1.6、8nM，阳性对照组加入10ng/mLPMA，6h后检测Luciferase活性，结果如图14所示，与空白组对比，阳性组信号显著提高，实验组加入MK5046后，信号同样显著提高，从0.0128nM-8nM均能够有效刺激NFAT信号通路，说明NFAT-RE-Luciferase-Puro-293T能够用于NFAT信号通路相关分子的活性检测，并能够达到较好的灵敏度。根据0.0128～8nM的数值，绘制曲线，计算MK5046的EC50约为0.18nM。目前BRS-3的激活主要采用钙流检测，本实验例的报告基因法与钙流法相比，操作简便，成本低，且能够进行高通量筛选，方法灵敏且可重复性强，具有显著的应用优势。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种细胞株及其制备方法和用途
<160> 29
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 60
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 90
<210> 2
<211> 2327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aataaaatat ctttattttc attacatctg tgtgttggtt ttttgtgtga atcgatagta 60
ctaacatacg ctctccatca aaacaaaacg aaacaaaaca aactagcaaa ataggctgtc 120
cccagtgcaa gtgcaggtgc cagaacattt ctctggccta actggccggt acctgagctc 180
gctagcggag gaaaaactgt ttcatacaga aggcgtggag gaaaaactgt ttcatacaga 240
aggcgtggag gaaaaactgt ttcatacaga aggcgtagat ctagactcta gagggtatat 300
aatggaagct cgaattccag cttggcattc cggtactgtt ggtaaaaagc ttggcaatcc 360
ggtactgttg gtaaagccac catggaagat gccaaaaaca ttaagaaggg cccagcgcca 420
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gccctggtgc ccggcaccat cgcctttacc gacgcacata tcgaggtgga cattacctac 540
gccgagtact tcgagatgag cgttcggctg gcagaagcta tgaagcgcta tgggctgaat 600
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ctgctgaaca gcatgggcat cagccagccc accgtcgtat tcgtgagcaa gaaagggctg 780
caaaagatcc tcaacgtgca aaagaagcta ccgatcatac aaaagatcat catcatggat 840
agcaagaccg actaccaggg cttccaaagc atgtacacct tcgtgacttc ccatttgcca 900
cccggcttca acgagtacga cttcgtgccc gagagcttcg accgggacaa aaccatcgcc 960
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ccaggcatcc gccagggcta cggcctgaca gaaacaacca gcgccattct gatcaccccc 1440
gaaggggacg acaagcctgg cgcagtaggc aaggtggtgc ccttcttcga ggctaaggtg 1500
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aaggacggct ggctgcacag cggcgacatc gcctactggg acgaggacga gcacttcttc 1680
atcgtggacc ggctgaagag cctgatcaaa tacaagggct accaggtagc cccagccgaa 1740
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accgagaagg agatcgtgga ctatgtggcc agccaggtta caaccgccaa gaagctgcgc 1920
ggtggtgttg tgttcgtgga cgaggtgcct aaaggactga ccggcaagtt ggacgcccgc 1980
aagatccgcg agattctcat taaggccaag aagggcggca agatcgccgt gaattctcac 2040
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<210> 3
<211> 1411
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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gccacatcga gcgggtcacc gagctgcaag aactcttcct cacgcgcgtc gggctcgaca 720
tcggcaaggt gtgggtcgcg gacgacggcg ccgcggtggc ggtctggacc acgccggaga 780
gcgtcgaagc gggggcggtg ttcgccgaga tcggcccgcg catggccgag ttgagcggtt 840
cccggctggc cgcgcagcaa cagatggaag gcctcctggc gccgcaccgg cccaaggagc 900
ccgcgtggtt cctggccacc gtcggcgtct cgcccgacca ccagggcaag ggtctgggca 960
gcgccgtcgt gctccccgga gtggaggcgg ccgagcgcgc cggggtgccc gccttcctgg 1020
agacctccgc gccccgcaac ctccccttct acgagcggct cggcttcacc gtcaccgccg 1080
acgtcgaggt gcccgaagga ccgcgcacct ggtgcatgac ccgcaagccc ggtgcctgac 1140
gcccgcccca cgacccgcag cgcccgaccg aaaggagcgc acgaccccat gcatcgatga 1200
tatcagatcc ccgggatgca gaaattgatg atctattaaa caataaagat gtccactaaa 1260
atggaagttt ttcctgtcat actttgttaa gaagggtgag aacagagtac ctacattttg 1320
aatggaagga ttggagcggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat 1380
ttcacaccgc atacgtcaaa gcaaccatag t 1411
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggggccacta gggacaggat tgg 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggggccacta gggacaggat 20
<210> 6
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcattctctc ccctgggcct gtgccgcttt ctgtctgcag cttgtggcct gggtcacctc 60
tacggctggc ccagatcctt ccctgccgcc tccttcaggt tccgtcttcc tccactccct 120
cttccccttg ctctctgctg tgttgctgcc caaggatgct ctttccggag cacttccttc 180
tcggcgctgc accacgtgat gtcctctgag cggatcctcc ccgtgtctgg gtcctctccg 240
ggcatctctc ctccctcacc caaccccatg ccgtcttcac tcgctgggtt cccttttcct 300
tctccttctg gggcctgtgc catctctcgt ttcttaggat ggccttctcc gacggatgtc 360
tcccttgcgt cccgcctccc cttcttgtag gcctgcatca tcaccgtttt tctggacaac 420
cccaaagtac cccgtctccc tggctttagc cacctctcca tcctcttgct ttctttgcct 480
ggacaccccg ttctcctgtg gattcgggtc acctctcact cctttcattt gggcagctcc 540
cctacccccc ttacctctct agtctgtgct agctcttcca gccccctgtc atggcatctt 600
ccaggggtcc gagagctcag ctagtcttct tcctccaacc cgggccccta tgtccacttc 660
aggacagcat gtttgctgcc tccagggatc ctgtgtcccc gagctgggac caccttatat 720
tcccagggcc ggttaatgtg gctctggttc tgggtacttt tatctgtccc ctccacccca 780
cagtggggc 789
<210> 7
<211> 837
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
actagggaca ggattggtga cagaaaagcc ccatccttag gcctcctcct tcctagtctc 60
ctgatattgg gtctaacccc cacctcctgt taggcagatt ccttatctgg tgacacaccc 120
ccatttcctg gagccatctc tctccttgcc agaacctcta aggtttgctt acgatggagc 180
cagagaggat cctgggaggg agagcttggc agggggtggg agggaagggg gggatgcgtg 240
acctgcccgg ttctcagtgg ccaccctgcg ctaccctctc ccagaacctg agctgctctg 300
acgcggctgt ctggtgcgtt tcactgatcc tggtgctgca gcttccttac acttcccaag 360
aggagaagca gtttggaaaa acaaaatcag aataagttgg tcctgagttc taactttggc 420
tcttcacctt tctagtcccc aatttatatt gttcctccgt gcgtcagttt tacctgtgag 480
ataaggccag tagccagccc cgtcctggca gggctgtggt gaggaggggg gtgtccgtgt 540
ggaaaactcc ctttgtgaga atggtgcgtc ctaggtgttc accaggtcgt ggccgcctct 600
actccctttc tctttctcca tccttctttc cttaaagagt ccccagtgct atctgggaca 660
tattcctccg cccagagcag ggtcccgctt ccctaaggcc ctgctctggg cttctgggtt 720
tgagtccttg gcaagcccag gagaggcgct caggcttccc tgtccccctt cctcgtccac 780
catctcatgc ccctggctct cctgcccctt ccctacaggg gttcctggct ctgctct 837
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caccggggcc actagggaca ggat 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccccggtgat ccctgtccta caaa 24
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggctccatcg taagcaaacc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttcgggtcac ctctcactcc 20
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcattctctc ccctgggcc 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gccccactgt ggggtggag 19
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
actagggaca ggattggtga cag 23
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agagcagagc caggaaccc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atgattacgc caagcttggg gccactaggg acaggattgg gcattctctc ccctgggcc 59
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agtcaataat caatgtcaac ttcgaagccc cactgtgggg tggag 45
<210> 18
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gttgacattg attattgact gtcgacacta gggacaggat tggtgacag 49
<210> 19
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgacggccag tgaattccca atcctgtccc tagtggcccc agagcagagc caggaaccc 59
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccccacagtg gggcttcgaa ggaggtattg gacaggccgc 40
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<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtagaatttc gaggtcgatt aattaaaact tgtttattgc agcttataat ggtta 55
<210> 22
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
taagctgcaa taaacaagtt ttaattaatc gacctcgaaa ttctaccggg 50
<210> 23
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
caccaatcct gtccctagtg tcgacactat ggttgctttg acgtatgcg 49
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<212> DNA
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cctgagtccg gaccactttg agctctactg 30
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gtttttcctc cgctagcgag ct 22
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tgcaagaact cttcctcacg cg 22
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<400> 27
cctgggatac cccgaagagt gagtttgcc 29
<210> 28
<211> 9290
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg gggccactag ggacaggatg ttttagagct agaaatagca agttaaaata 300
aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt tgttttagag 360
ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgtttttag cgcgtgcgcc aattctgcag 420
acaaatggct ctagaggtac ccgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc 480
gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 540
tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 600
gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attgtgccca 660
gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 720
taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc 780
acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg 840
gggggggggg cgcgcgccgg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggcgaggcg 900
gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag 960
gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgcg 1020
ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 1080
gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 1140
gctgagcaag aggtaagggt ttaagggatg gttggttggt ggggtattaa tgtttaatta 1200
cctggagcac ctgcctgaaa tcactttttt tcaggttgga ccggtgccac catggactat 1260
aaggaccacg acggagacta caaggatcat gatattgatt acaaagacga tgacgataag 1320
atggccccaa agaagaagcg gaaggtcggt atccacggag tcccagcagc cgacaagaag 1380
tacagcatcg gcctggacat cggcaccaac tctgtgggct gggccgtgat caccgacgag 1440
tacaaggtgc ccagcaagaa attcaaggtg ctgggcaaca ccgaccggca cagcatcaag 1500
aagaacctga tcggagccct gctgttcgac agcggcgaaa cagccgaggc cacccggctg 1560
aagagaaccg ccagaagaag atacaccaga cggaagaacc ggatctgcta tctgcaagag 1620
atcttcagca acgagatggc caaggtggac gacagcttct tccacagact ggaagagtcc 1680
ttcctggtgg aagaggataa gaagcacgag cggcacccca tcttcggcaa catcgtggac 1740
gaggtggcct accacgagaa gtaccccacc atctaccacc tgagaaagaa actggtggac 1800
agcaccgaca aggccgacct gcggctgatc tatctggccc tggcccacat gatcaagttc 1860
cggggccact tcctgatcga gggcgacctg aaccccgaca acagcgacgt ggacaagctg 1920
ttcatccagc tggtgcagac ctacaaccag ctgttcgagg aaaaccccat caacgccagc 1980
ggcgtggacg ccaaggccat cctgtctgcc agactgagca agagcagacg gctggaaaat 2040
ctgatcgccc agctgcccgg cgagaagaag aatggcctgt tcggaaacct gattgccctg 2100
agcctgggcc tgacccccaa cttcaagagc aacttcgacc tggccgagga tgccaaactg 2160
cagctgagca aggacaccta cgacgacgac ctggacaacc tgctggccca gatcggcgac 2220
cagtacgccg acctgtttct ggccgccaag aacctgtccg acgccatcct gctgagcgac 2280
atcctgagag tgaacaccga gatcaccaag gcccccctga gcgcctctat gatcaagaga 2340
tacgacgagc accaccagga cctgaccctg ctgaaagctc tcgtgcggca gcagctgcct 2400
gagaagtaca aagagatttt cttcgaccag agcaagaacg gctacgccgg ctacattgac 2460
ggcggagcca gccaggaaga gttctacaag ttcatcaagc ccatcctgga aaagatggac 2520
ggcaccgagg aactgctcgt gaagctgaac agagaggacc tgctgcggaa gcagcggacc 2580
ttcgacaacg gcagcatccc ccaccagatc cacctgggag agctgcacgc cattctgcgg 2640
cggcaggaag atttttaccc attcctgaag gacaaccggg aaaagatcga gaagatcctg 2700
accttccgca tcccctacta cgtgggccct ctggccaggg gaaacagcag attcgcctgg 2760
atgaccagaa agagcgagga aaccatcacc ccctggaact tcgaggaagt ggtggacaag 2820
ggcgcttccg cccagagctt catcgagcgg atgaccaact tcgataagaa cctgcccaac 2880
gagaaggtgc tgcccaagca cagcctgctg tacgagtact tcaccgtgta taacgagctg 2940
accaaagtga aatacgtgac cgagggaatg agaaagcccg ccttcctgag cggcgagcag 3000
aaaaaggcca tcgtggacct gctgttcaag accaaccgga aagtgaccgt gaagcagctg 3060
aaagaggact acttcaagaa aatcgagtgc ttcgactccg tggaaatctc cggcgtggaa 3120
gatcggttca acgcctccct gggcacatac cacgatctgc tgaaaattat caaggacaag 3180
gacttcctgg acaatgagga aaacgaggac attctggaag atatcgtgct gaccctgaca 3240
ctgtttgagg acagagagat gatcgaggaa cggctgaaaa cctatgccca cctgttcgac 3300
gacaaagtga tgaagcagct gaagcggcgg agatacaccg gctggggcag gctgagccgg 3360
aagctgatca acggcatccg ggacaagcag tccggcaaga caatcctgga tttcctgaag 3420
tccgacggct tcgccaacag aaacttcatg cagctgatcc acgacgacag cctgaccttt 3480
aaagaggaca tccagaaagc ccaggtgtcc ggccagggcg atagcctgca cgagcacatt 3540
gccaatctgg ccggcagccc cgccattaag aagggcatcc tgcagacagt gaaggtggtg 3600
gacgagctcg tgaaagtgat gggccggcac aagcccgaga acatcgtgat cgaaatggcc 3660
agagagaacc agaccaccca gaagggacag aagaacagcc gcgagagaat gaagcggatc 3720
gaagagggca tcaaagagct gggcagccag atcctgaaag aacaccccgt ggaaaacacc 3780
cagctgcaga acgagaagct gtacctgtac tacctgcaga atgggcggga tatgtacgtg 3840
gaccaggaac tggacatcaa ccggctgtcc gactacgatg tggaccatat cgtgcctcag 3900
agctttctga aggacgactc catcgacaac aaggtgctga ccagaagcga caagaaccgg 3960
ggcaagagcg acaacgtgcc ctccgaagag gtcgtgaaga agatgaagaa ctactggcgg 4020
cagctgctga acgccaagct gattacccag agaaagttcg acaatctgac caaggccgag 4080
agaggcggcc tgagcgaact ggataaggcc ggcttcatca agagacagct ggtggaaacc 4140
cggcagatca caaagcacgt ggcacagatc ctggactccc ggatgaacac taagtacgac 4200
gagaatgaca agctgatccg ggaagtgaaa gtgatcaccc tgaagtccaa gctggtgtcc 4260
gatttccgga aggatttcca gttttacaaa gtgcgcgaga tcaacaacta ccaccacgcc 4320
cacgacgcct acctgaacgc cgtcgtggga accgccctga tcaaaaagta ccctaagctg 4380
gaaagcgagt tcgtgtacgg cgactacaag gtgtacgacg tgcggaagat gatcgccaag 4440
agcgagcagg aaatcggcaa ggctaccgcc aagtacttct tctacagcaa catcatgaac 4500
tttttcaaga ccgagattac cctggccaac ggcgagatcc ggaagcggcc tctgatcgag 4560
acaaacggcg aaaccgggga gatcgtgtgg gataagggcc gggattttgc caccgtgcgg 4620
aaagtgctga gcatgcccca agtgaatatc gtgaaaaaga ccgaggtgca gacaggcggc 4680
ttcagcaaag agtctatcct gcccaagagg aacagcgata agctgatcgc cagaaagaag 4740
gactgggacc ctaagaagta cggcggcttc gacagcccca ccgtggccta ttctgtgctg 4800
gtggtggcca aagtggaaaa gggcaagtcc aagaaactga agagtgtgaa agagctgctg 4860
gggatcacca tcatggaaag aagcagcttc gagaagaatc ccatcgactt tctggaagcc 4920
aagggctaca aagaagtgaa aaaggacctg atcatcaagc tgcctaagta ctccctgttc 4980
gagctggaaa acggccggaa gagaatgctg gcctctgccg gcgaactgca gaagggaaac 5040
gaactggccc tgccctccaa atatgtgaac ttcctgtacc tggccagcca ctatgagaag 5100
ctgaagggct cccccgagga taatgagcag aaacagctgt ttgtggaaca gcacaagcac 5160
tacctggacg agatcatcga gcagatcagc gagttctcca agagagtgat cctggccgac 5220
gctaatctgg acaaagtgct gtccgcctac aacaagcacc gggataagcc catcagagag 5280
caggccgaga atatcatcca cctgtttacc ctgaccaatc tgggagcccc tgccgccttc 5340
aagtactttg acaccaccat cgaccggaag aggtacacca gcaccaaaga ggtgctggac 5400
gccaccctga tccaccagag catcaccggc ctgtacgaga cacggatcga cctgtctcag 5460
ctgggaggcg acaaaaggcc ggcggccacg aaaaaggccg gccaggcaaa aaagaaaaag 5520
gaattcggca gtggagaggg cagaggaagt ctgctaacat gcggtgacgt cgaggagaat 5580
cctggcccag tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 5640
ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 5700
acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 5760
cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 5820
atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 5880
atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 5940
accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 6000
gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag 6060
aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 6120
ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 6180
aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac 6240
atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac 6300
aaggaattct aactagagct cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat 6360
ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc 6420
tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg 6480
ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agagaatagc aggcatgctg 6540
gggagcggcc gcaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct 6600
cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct 6660
cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc aggggcgcct gatgcggtat tttctcctta 6720
cgcatctgtg cggtatttca caccgcatac gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag 6780
cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag 6840
cgccttagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt 6900
tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca 6960
cctcgacccc aaaaaacttg atttgggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata 7020
gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca 7080
aactggaaca acactcaact ctatctcggg ctattctttt gatttataag ggattttgcc 7140
gatttcggtc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa 7200
caaaatatta acgtttacaa ttttatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc 7260
atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 7320
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 7380
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt 7440
ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa 7500
tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat 7560
gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca 7620
acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca 7680
cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta 7740
catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt 7800
tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc 7860
cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc 7920
accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc 7980
cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa 8040
ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga 8100
accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat 8160
ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca 8220
attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc 8280
ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtggaagcc gcggtatcat 8340
tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag 8400
tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa 8460
gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca 8520
tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc 8580
ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc 8640
ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 8700
agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 8760
cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 8820
caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 8880
tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 8940
ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 9000
ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 9060
gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 9120
gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 9180
tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 9240
cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 9290
<210> 29
<211> 8110
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga 60
caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg 120
aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 180
tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt 240
acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga 300
ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 360
gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc 420
tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa 480
agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc actcattagg caccccaggc 540
tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 600
cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagcttggg gccactaggg acaggattgg 660
gcattctctc ccctgggcct gtgccgcttt ctgtctgcag cttgtggcct gggtcacctc 720
tacggctggc ccagatcctt ccctgccgcc tccttcaggt tccgtcttcc tccactccct 780
cttccccttg ctctctgctg tgttgctgcc caaggatgct ctttccggag cacttccttc 840
tcggcgctgc accacgtgat gtcctctgag cggatcctcc ccgtgtctgg gtcctctccg 900
ggcatctctc ctccctcacc caaccccatg ccgtcttcac tcgctgggtt cccttttcct 960
tctccttctg gggcctgtgc catctctcgt ttcttaggat ggccttctcc gacggatgtc 1020
tcccttgcgt cccgcctccc cttcttgtag gcctgcatca tcaccgtttt tctggacaac 1080
cccaaagtac cccgtctccc tggctttagc cacctctcca tcctcttgct ttctttgcct 1140
ggacaccccg ttctcctgtg gattcgggtc acctctcact cctttcattt gggcagctcc 1200
cctacccccc ttacctctct agtctgtgct agctcttcca gccccctgtc atggcatctt 1260
ccaggggtcc gagagctcag ctagtcttct tcctccaacc cgggccccta tgtccacttc 1320
aggacagcat gtttgctgcc tccagggatc ctgtgtcccc gagctgggac caccttatat 1380
tcccagggcc ggttaatgtg gctctggttc tgggtacttt tatctgtccc ctccacccca 1440
cagtggggct tcgaaggagg tattggacag gccgcaataa aatatcttta ttttcattac 1500
atctgtgtgt tggttttttg tgtgaatcga tagtactaac atacgctctc catcaaaaca 1560
aaacgaaaca aaacaaacta gcaaaatagg ctgtccccag tgcaagtgca ggtgccagaa 1620
catttctctg gcctaactgg ccggtacctg agctcgctag cggaggaaaa actgtttcat 1680
acagaaggcg tggaggaaaa actgtttcat acagaaggcg tggaggaaaa actgtttcat 1740
acagaaggcg tagatctaga ctctagaggg tatataatgg aagctcgaat tccagcttgg 1800
cattccggta ctgttggtaa aaagcttggc aatccggtac tgttggtaaa gccaccatgg 1860
aagatgccaa aaacattaag aagggcccag cgccattcta cccactcgaa gacgggaccg 1920
ccggcgagca gctgcacaaa gccatgaagc gctacgccct ggtgcccggc accatcgcct 1980
ttaccgacgc acatatcgag gtggacatta cctacgccga gtacttcgag atgagcgttc 2040
ggctggcaga agctatgaag cgctatgggc tgaatacaaa ccatcggatc gtggtgtgca 2100
gcgagaatag cttgcagttc ttcatgcccg tgttgggtgc cctgttcatc ggtgtggctg 2160
tggccccagc taacgacatc tacaacgagc gcgagctgct gaacagcatg ggcatcagcc 2220
agcccaccgt cgtattcgtg agcaagaaag ggctgcaaaa gatcctcaac gtgcaaaaga 2280
agctaccgat catacaaaag atcatcatca tggatagcaa gaccgactac cagggcttcc 2340
aaagcatgta caccttcgtg acttcccatt tgccacccgg cttcaacgag tacgacttcg 2400
tgcccgagag cttcgaccgg gacaaaacca tcgccctgat catgaacagt agtggcagta 2460
ccggattgcc caagggcgta gccctaccgc accgcaccgc ttgtgtccga ttcagtcatg 2520
cccgcgaccc catcttcggc aaccagatca tccccgacac cgctatcctc agcgtggtgc 2580
catttcacca cggcttcggc atgttcacca cgctgggcta cttgatctgc ggctttcggg 2640
tcgtgctcat gtaccgcttc gaggaggagc tattcttgcg cagcttgcaa gactataaga 2700
ttcaatctgc cctgctggtg cccacactat ttagcttctt cgctaagagc actctcatcg 2760
acaagtacga cctaagcaac ttgcacgaga tcgccagcgg cggggcgccg ctcagcaagg 2820
aggtaggtga ggccgtggcc aaacgcttcc acctaccagg catccgccag ggctacggcc 2880
tgacagaaac aaccagcgcc attctgatca cccccgaagg ggacgacaag cctggcgcag 2940
taggcaaggt ggtgcccttc ttcgaggcta aggtggtgga cttggacacc ggtaagacac 3000
tgggtgtgaa ccagcgcggc gagctgtgcg tccgtggccc catgatcatg agcggctacg 3060
ttaacaaccc cgaggctaca aacgctctca tcgacaagga cggctggctg cacagcggcg 3120
acatcgccta ctgggacgag gacgagcact tcttcatcgt ggaccggctg aagagcctga 3180
tcaaatacaa gggctaccag gtagccccag ccgaactgga gagcatcctg ctgcaacacc 3240
ccaacatctt cgacgccggg gtcgccggcc tgcccgacga cgatgccggc gagctgcccg 3300
ccgcagtcgt cgtgctggaa cacggtaaaa ccatgaccga gaaggagatc gtggactatg 3360
tggccagcca ggttacaacc gccaagaagc tgcgcggtgg tgttgtgttc gtggacgagg 3420
tgcctaaagg actgaccggc aagttggacg cccgcaagat ccgcgagatt ctcattaagg 3480
ccaagaaggg cggcaagatc gccgtgaatt ctcacggctt ccctcccgag gtggaggagc 3540
aggccgccgg caccctgccc atgagctgcg cccaggagag cggcatggat agacaccctg 3600
ctgcttgcgc cagcgccagg atcaacgtct aaggccgcga ctctagagtc ggggcggccg 3660
gccgcttcga gcagacatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat 3720
gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat 3780
tataagctgc aataaacaag ttttaattaa tcgacctcga aattctaccg ggtaggggag 3840
gcgcttttcc caaggcagtc tggagcatgc gctttagcag ccccgctggg cacttggcgc 3900
tacacaagtg gcctctggcc tcgcacacat tccacatcca ccggtaggcg ccaaccggct 3960
ccgttctttg gtggcccctt cgcgccacct tctactcctc ccctagtcag gaagttcccc 4020
cccgccccgc agctcgcgtc gtgcaggacg tgacaaatgg aagtagcacg tctcactagt 4080
ctcgtgcaga tggacagcac cgctgagcaa tggaagcggg taggcctttg gggcagcggc 4140
caatagcagc tttgctcctt cgctttctgg gctcagaggc tgggaagggg tgggtccggg 4200
ggcgggctca ggggcgggct caggggcggg gcgggcgccc gaaggtcctc cggaggcccg 4260
gcattctgca cgcttcaaaa gcgcacgtct gccgcgctgt tctcctcttc ctcatctccg 4320
ggcctttcga cctgcatcca tctagatctc gagcagctga agcttaccat gaccgagtac 4380
aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc 4440
gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag 4500
cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg 4560
tgggtcgcgg acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg 4620
ggggcggtgt tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc 4680
gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc 4740
ctggccaccg tcggcgtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg 4800
ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg 4860
ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg 4920
cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgacg cccgccccac 4980
gacccgcagc gcccgaccga aaggagcgca cgaccccatg catcgatgat atcagatccc 5040
cgggatgcag aaattgatga tctattaaac aataaagatg tccactaaaa tggaagtttt 5100
tcctgtcata ctttgttaag aagggtgaga acagagtacc tacattttga atggaaggat 5160
tggagcggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 5220
tacgtcaaag caaccatagt gtcgacacta gggacaggat tggtgacaga aaagccccat 5280
ccttaggcct cctccttcct agtctcctga tattgggtct aacccccacc tcctgttagg 5340
cagattcctt atctggtgac acacccccat ttcctggagc catctctctc cttgccagaa 5400
cctctaaggt ttgcttacga tggagccaga gaggatcctg ggagggagag cttggcaggg 5460
ggtgggaggg aaggggggga tgcgtgacct gcccggttct cagtggccac cctgcgctac 5520
cctctcccag aacctgagct gctctgacgc ggctgtctgg tgcgtttcac tgatcctggt 5580
gctgcagctt ccttacactt cccaagagga gaagcagttt ggaaaaacaa aatcagaata 5640
agttggtcct gagttctaac tttggctctt cacctttcta gtccccaatt tatattgttc 5700
ctccgtgcgt cagttttacc tgtgagataa ggccagtagc cagccccgtc ctggcagggc 5760
tgtggtgagg aggggggtgt ccgtgtggaa aactcccttt gtgagaatgg tgcgtcctag 5820
gtgttcacca ggtcgtggcc gcctctactc cctttctctt tctccatcct tctttcctta 5880
aagagtcccc agtgctatct gggacatatt cctccgccca gagcagggtc ccgcttccct 5940
aaggccctgc tctgggcttc tgggtttgag tccttggcaa gcccaggaga ggcgctcagg 6000
cttccctgtc ccccttcctc gtccaccatc tcatgcccct ggctctcctg ccccttccct 6060
acaggggttc ctggctctgc tctggggcca ctagggacag gattgggaat tcactggccg 6120
tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag 6180
cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc 6240
aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 6300
tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat 6360
agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc 6420
tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt 6480
tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat 6540
aggttaatgt catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg 6600
tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga 6660
gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac 6720
atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc 6780
cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca 6840
tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc 6900
caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg 6960
ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac 7020
cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca 7080
taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg 7140
agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac 7200
cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg 7260
caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat 7320
taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg 7380
ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg 7440
cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc 7500
aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc 7560
attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt 7620
tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 7680
aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 7740
gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 7800
cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 7860
gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 7920
agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 7980
ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 8040
cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 8100
acaccgaact 8110
Claims (10)
1.一种细胞株，其特征在于，所述细胞株基因组的安全港位点含有NFAT元件及其调控的报告基因。
2.根据权利要求1所述的细胞株，其特征在于，所述NFAT元件及NFAT元件调控的报告基因为NFAT-RE-Luciferase基因，所述NFAT-RE-Luciferase基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.根据权利要求1所述的细胞株，其特征在于，所述安全港位点选自AAVS1位点和H11位点。
4.根据权利要求1所述的细胞株，其特征在于，所述细胞株的起始细胞为哺乳动物细胞。
5.权利要求1-4任一所述细胞株的制备方法，其特征在于，为采用Talen或CRISPR/cas9基因编辑方法，向宿主细胞基因组的安全港位点插入NFAT元件及其调控的报告基因。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
1)构建携带有Cas9蛋白且能够靶向安全港位点的靶向质粒；
2)构建报告基因质粒，所述报告基因质粒中包括NFAT-RE-Luciferase序列、抗生素筛选序列、gRNA识别的PAM序列；
3)将靶向质粒与报告基因质粒共转染至宿主细胞；
4)用抗生素筛选，得到稳定表达报告基因的细胞株。
7.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包括依次连接的gRNA识别的PAM序列、HAL序列、NFAT-RE-Luciferase序列、抗生素筛选序列、HAR序列、gRNA识别的PAM序列。
8.权利要求1-4任一所述的细胞株在检测NFAT信号通路相关分子变化、药物筛选或药物质控中的用途。
9.一种用于检测NFAT信号通路相关分子变化的组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1-4任一所述的细胞株。
10.一种检测NFAT信号通路相关基因生物学活性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将待检测的NFAT信号通路相关的基因整合入权利要求1-4任一所述的细胞株，培养所述细胞株，根据细胞株的荧光信号判断该NFAT信号通路相关基因的生物学活性。
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| Publication Number | Publication Date |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210615 |
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