CN111388658B - 基于重组减毒李斯特菌的kras高表达癌症疫苗及其制备方法及其应用方法 - Google Patents
基于重组减毒李斯特菌的kras高表达癌症疫苗及其制备方法及其应用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗及其制备方法及其应用方法，癌症疫苗，为LmΔactA/plcB‑KRAS菌株的菌液；LmΔactA/plcB‑KRAS菌株是以减毒单增李斯特菌为载体，携带KRAS蛋白基因的基因重组菌；减毒单增李斯特菌为单增李斯特菌完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得；KRAS蛋白基因由KRAS蛋白氨基酸序列经过李斯特菌密码子优化后，在上游加入HindⅢ酶切位点，下游加入XhoⅠ酶切位点，通过合成获得的DNA序列；本发明以减毒单增李斯特菌作为载体，利用李斯特菌独特的能在宿主吞噬细胞胞内生长，是天然的T细胞免疫活化佐剂的特性，有效提高在肿瘤微环境中的特异性免疫应答，打破机体的免疫耐受，从而能够遏制肿瘤发展。
Description
技术领域
本发明涉及生物医疗领域，涉及基于重组减毒李斯特菌在制备KRAS高表达癌症治疗性疫苗中的应用。
背景技术
结直肠癌在全球范围内是第三常见癌症，占总癌症比例的10％，在2018年新诊断1.09百万病例，共造 成55.1万患者死亡。传统的手术，放化疗治疗效果有限，结直肠癌在美国五年生存率为65％。传统的手术 切除可以用于治疗早期的结直肠癌，50％的患者还是死于结直肠癌的远端转移。虽然放化疗和靶向治疗能够延长患者的生命，但只有15％的发生转移的结直肠癌患者能够活过5年。近年来伴随着对肿瘤免疫研究的 深入，基于调动患者自身的免疫系统来杀伤肿瘤的新型免疫疗法进入临床试验。肿瘤细胞在患者体内复制 增殖过程会持续积累基因突变，这些积累的突变能帮助肿瘤不受患者免疫系统控制的生长和转移。这些只表达在肿瘤细胞中的蛋白突变和患者自身正常的蛋白不同，具有更强的免疫原性，能够作为免疫治疗的抗 原肽段用于激活肿瘤特异性的T细胞，最终达到特异性杀伤肿瘤细胞的治疗效果。其中出现在20-30％结肠 癌中的KRAS G12D G12V突变肽段，是一个较理想免疫治疗的突变肽段。市场需要一种弥补了核酸类及蛋 白质多肽类疫苗免疫原性较低的缺点，减毒的李斯特菌保留了原始菌株能在胞内生长，完成抗原递呈的特 性的同时又具有更高的安全性的疫苗本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗， 所述重组减毒李斯特菌为重组减毒单增李斯特菌或重组减毒绵羊李斯特菌，两者分别以减毒单增李斯特菌 (Listeria monocytogenes，在下文中简称Lm)或减毒绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii，在下文中简称Li) 作为载体，利用李斯特菌独特的能在宿主吞噬细胞胞内生长，是天然的T细胞免疫活化佐剂的特性，有效 提高在肿瘤微环境中的特异性免疫应答，打破机体的免疫耐受，从而清除机体持续性病毒感染，达到清除病灶，遏制肿瘤发展的良好治疗效果。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗，为LmΔactA/plcB-KRAS菌株的菌液；所述 LmΔactA/plcB-KRAS菌株是以减毒单增李斯特菌为载体，携带KRAS蛋白基因的基因重组菌；
减毒单增李斯特菌为单增李斯特菌完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得；
KRAS蛋白基因由KRAS蛋白氨基酸序列经过李斯特菌密码子优化后，在上游加入HindⅢ酶切位点， 下游加入XhoⅠ酶切位点，通过合成获得的DNA序列，SEQ ID NO.1。
基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗，为LiΔactA/plcB-KRAS菌株的菌液； LiΔactA/plcB-KRAS菌株是以减毒绵羊李斯特菌为载体，携带KRAS蛋白基因的基因重组菌；
减毒绵羊李斯特菌为绵羊李斯特菌完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得；
KRAS蛋白基因由KRAS蛋白氨基酸序列经过李斯特菌密码子优化后，在上游加入HindⅢ酶切位点， 下游加入XhoⅠ酶切位点，通过合成获得的DNA序列，SEQ ID NO.1。
基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，制备重组减毒单增李斯特菌的步骤包括：
步骤一，合成KRAS基因片段；查询KRAS(G12D，G12V突变)氨基酸序列，然后根据李斯特菌偏 好密码子表进行密码子优化得到优化后的序列，再在其上游加入HindⅢ酶切位点(AAGCTT)，下游加入XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)，将设计好的序列通过合成直接获得；
步骤二，构建打靶质粒；用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切步骤一获得的KRAS基因片段，同时 用相同的限制性内切酶酶切质粒pCW203(专利CN103074361B)，经连接、转化等技术将KRAS基因 片段插入pCW203 HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，得到中间质粒pCW203-KRAS，如SEQ ID NO.2所示， 通过PCR验证、提质粒验证、酶切验证证实中间质粒的成功构建。切下步骤中间质粒pCW203-KRAS 的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间的片段插入重组质粒pCW180的BamHI酶切位点与XhoI酶 切位点之间，得到打靶质粒pCW180-KRAS；其中，所述重组质粒pCW180的基因序列为序列表中SEQ ID NO.3所示；
步骤三，制备感受态细胞LmΔactAplcB-lacZ；培养LmΔactAplcB-lacZ，定期测定A600，当A600＝0.4时， 加入盘尼西林G，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当A600＝0.7时，离心，洗涤，分装，保存，得到 LmΔactA/plcB-lacZ感受态细胞；
步骤四，利用打靶质粒对感受态细胞LmΔactAplcB-lacZ进行电转化；取打靶质粒电转至 LmΔactA/plcB-lacZ感受态细胞中，用电转仪电转后用培养液培养；将转化液涂布于红霉素BHI琼脂平板， 通过蓝白斑筛选出单个蓝色菌落，纯培养后进行质粒提取和PCR验证；
步骤五，将LmΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养、筛选验证；将携带打靶质粒的单增李斯 特菌，在42℃和30℃连续传代培养，利用同源重组杂交原理和基因打靶技术，将打靶质粒携带的目的片 段整合至李斯特菌中，利用蓝白斑及红霉素敏感性筛选出可疑菌株；然后进行PCR筛选和基因测序验证； 选出LmΔactA/plcB-KRAS菌株，制备菌液，得到疫苗。
前述的基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，重组质粒pCW180的制备方法如 下：
步骤a，将上游携带SpeⅠ、下游携带NotⅠ的Lm mpl基因插入质粒pCW154的SpeⅠ和NotⅠ酶切位 点之间，得到第一中间重组质粒pCW160，所述第一中间重组质粒pCW160的基因序列为序列表中SEQ ID NO.4所示；
步骤b，将上游携带XbaⅠ、下游携带NotⅠ的Lm orfBAldh基因插入第一中间重组质粒pCW160的 XbaⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到第二中间重组质粒pCW170，所述第二中间重组质粒pCW170的基因序 列为序列表中SEQ ID NO.5所示；
步骤c，用NotⅠ酶切质粒pCW154，得到两头为NotⅠ酶切位点的一段基因，插入第二中间重组质粒 pCW170的NotⅠ酶切位点，得到重组质粒pCW180。
前述的基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，电转仪的电转条件为：电压 ＝1500V，持续时间＝5ms，电转杯内径＝1mm。
前述的基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，步骤四中，PCR验证的具体方法 是：以煮沸法提取的细菌DNA基因组为模板，扩增目的条带KRAS，以上游引物KRAS-f和下游引物KRAS-r 进行PCR扩增；反应循环条件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，47℃30秒，72℃1分钟)×30个循环→72℃ 10分钟→4℃；电泳观察PCR结果，预期结果：KRAS片段约185bp；
上游引物KRAS-f：5’-AAGCTTTGACAGAATATAAAT-3’，如SEQ ID NO.7所示；
下游引物KRAS-r：5’-CTCGAGATGGTTTTGAATTAA-3’，如SEQ ID NO.8所示。
前述的基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，步骤五中，传代培养的具体方法 是：将已电转入打靶质粒的LmΔactAplcB-lacZ划线接种BEXI平板，42℃传代培养2～3代，每代培养时 间为48小时，挑取单个蓝色菌落接种到培养基，30℃，200rpm传代培养6代，每代培养时间为24小时；待传到培养基第3代开始，每代取40μl培养物加入360μl培养基中，多次连续1:10稀释直到稀释106倍， 分别涂布106倍稀释的菌液100μl于BEXI和BXI平板，30℃培养24小时；阳性菌落LmΔactAplcB-KRAS 在BXI平板上长成白色菌落，在BEXI平板上不生长。
前述的基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，步骤五中，PCR筛选的具体方法 是：用细菌基因组提取试剂盒提取LmΔactAplcB-KRAS的基因组DNA作为模板，进行以下三组基因片段 的扩增：抗红霉素基因、靶抗原基因KRAS以及actA基因，根据扩增结果对重组菌LmΔactAplcB-KRAS进 行鉴定；
抗红霉素基因Ery以上游引物Ery-f和下游引物Ery-r进行PCR扩增；反应循环条件为：94℃3分钟 →(94℃1分钟，60℃30s，72℃2分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结果，预期结 果：Ery基因片段约1471bp；上游引物Ery-f：5’-GATAAGTCGACGATTCACAAAAAATAG-3’，如SEQ ID NO.9所示；下游引物Ery-r：5’-AAAACTAGTCCCGGG GCGAATTG-3’，如SEQ ID NO.10所示；
Lm actA基因以上游引物Lm-actA-f和下游引物Lm-actA-r所示序列为引物进行PCR扩增；反应循环条 件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，50℃30s，72℃1分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察 PCR结果，预期结果：Lm actA基因片段约950bp；上游引物Lm-actA-f： 5’-GCTATAAATGAAGAGGCTTCAGG-3’，如SEQ ID NO.11所示；下游引物Lm-actA-r：5’- CTCTTAAATCAGCTAGGCGATC-3’，如SEQ ID NO.12所示。
基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，制备LiΔactA/plcB-KRAS菌株的步骤包 括：
步骤一，合成KRAS基因片段；查询KRAS(G12D，G12V突变)氨基酸序列，然后根据李斯特菌偏 好密码子表进行密码子优化得到优化后的序列，再在其上游加入HindⅢ酶切位点(AAGCTT)，下游加入XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)，将设计好的序列通过合成直接获得；
步骤二，构建打靶质粒；用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切步骤一获得的KRAS基因片段，同时 用相同的限制性内切酶酶切质粒pCW203，经连接、转化等技术将KRAS基因片段插入pCW203 HindⅢ和 XhoⅠ酶切位点，得到中间质粒pCW203-KRAS，如SEQ ID NO.2所示，通过PCR验证、提质粒验证、酶 切验证证实中间质粒的成功构建；切下步骤中间质粒pCW203-KRAS的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点 之间的片段插入重组质粒pCW154的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间，得到打靶质粒pCW154-KRAS， 如SEQ ID NO.13所示；
步骤三，制备感受态细胞LiΔactAplcB-lacZ；将LiΔactAplcB-lacZ利用含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培 养基进行培养，定期测定A600，当A600＝0.4时，加入盘尼西林G，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当 A600＝0.7时，离心，洗涤，分装，保存即可；
步骤四，利用打靶质粒对感受态细胞进行电转化；取打靶质粒电转至LiΔactAplcB-lacZ感受态细胞中， 电转完成后加入BHI肉汤培养2小时；转化液涂布于红霉素BHI琼脂平板，通过蓝白斑筛选出单个蓝色 菌落，纯培养后进行质粒提取和PCR验证；
步骤五，LiΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养、PCR筛选验证；将携带打靶质粒的绵羊李 斯特菌，在42℃和30℃连续传代，利用同源重组杂交原理和基因打靶技术，将打靶质粒携带的目的片段整合至李斯特菌中，利用蓝白斑及红霉素敏感性筛选出可疑菌株；然后进行PCR筛选和基因测序验证。
前述的基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，步骤四中的电转条件为：电压 ＝1500V，持续时间＝5ms，电转杯内径＝1mm。
前述的基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，步骤四中的PCR验证的具体方 法是：以煮沸法提取的细菌DNA基因组为模板，扩增目的条带KRAS，以SEQID NO.7和SEQ ID NO.8 所示序列为引物进行PCR扩增；反应循环条件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，47℃30秒，72℃1分钟) ×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结果，预期结果：KRAS片段约185bp；上游引物KRAS-f： 5’-AAGCTTTGACAGAATATAAAT-3’，如SEQ IDNO.7所示；下游引物KRAS-r：5’- CTCGAGATGGTTTTGAATTAA-3’，如SEQ ID NO.8所示。
前述的基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，步骤五中，连续传代的具体方法 是：将已电转入打靶质粒的LiΔactAplcB-lacZ划线接种BEXI平板，42℃传代培养，挑取单个蓝色菌落接 种BHI肉汤，30℃传代培养，待传到肉汤第3代开始，每代取培养物加入BHI稀释，分别涂布稀释菌液 100μl于BEXI和BXI平板，30℃培养24小时。
前述的基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，步骤五中，PCR筛选的具体方法 是：用细菌基因组提取试剂盒提取LiΔactAplcB-KRAS的基因组DNA作为模板，进行以下三组基因片段的 扩增：抗红霉素基因、靶抗原基因KRAS以及actA基因，根据扩增结果对重组菌LiΔactAplcB-KRAS进行 鉴定；
抗红霉素基因Ery以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示序列为引物进行PCR扩增；反应循环条件为： 94℃3分钟→(94℃1分钟，60℃30s，72℃2分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结 果，预期结果：Ery基因片段约1471bp；上游引物Ery-f：5’-GATAAGTCGACGATTCACAAAAAATAG-3’，如SEQ ID NO.9所示；下游引物Ery-r：5’-AAAACTAGTCCCGGG GCGAATTG-3’，如SEQ ID NO.10所 示；
Li actA基因以SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示序列为引物进行PCR扩增；反应循环条件为：94℃ 3分钟→(94℃1分钟，50℃30s，72℃1分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结果， 预期结果：Li actA基因片段约600bp；上游引物Li-actA-f：5’-GAAGCTAAAAGTGCAAATGTCCC-3’，如 SEQ ID NO.14所示；下游引物Li-actA-r：5’-ATTTCTTTAATACTGCGTTTGGGG-3’，如SEQ ID NO.15所 示。
前述的基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的应用方法，为疫苗的初免-加强给药应用方 式；用于初免的疫苗有效成分为重组减毒单增李斯特菌，用于加强的疫苗有效成分为重组减毒绵羊李斯特 菌或重组减毒单增李斯特菌。
前述的基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的应用方法，疫苗的给药方式为首次注射和至 少两次加强注射，重组减毒单增李斯特菌与重组减毒绵羊李斯特菌依次交替注射。
本发明的有益之处在于：
1)针对性：诱导特异性针对高表达KRAS癌症的细胞因子，靶向治疗癌组织，不损伤正常细胞。
2)高效：疫苗菌株免疫活性高，诱导高效的细胞因子表达。李斯特菌株本身具有高效活化机体细胞 免疫功能的作用，因此携带抗原的重组菌株能激活多种抗肿瘤免疫机制，激活特异的肿瘤杀伤性T细胞， 打破免疫抑制重新激活有效的肿瘤杀伤机制；LmΔactAplcB-KRAS和LiΔactAplcB-KRAS能够诱导特异性 GP33细胞免疫应答；实验证明疫苗株对KRAS高表达肿瘤起到有效的控制和治疗作用；
3)安全：减毒菌株不会在体内长期存在，不会引起感染，在我们的临床前试验中表现了很好的耐受 性，并经其他类似临床试验证实了其安全性，且能跟其他肿瘤治疗手段很好的兼容，如鸡尾酒式免疫抑制 剂、外科手术、放疗和化疗。
附图说明
图1是本发明的Lm打靶重组质粒结构图谱，含有两段Lm同源基因(Lm mpl和LmorfBAldh)、氨苄 青霉素抗性基因(Amp)、红霉素抗性基因(Ery)、基因序列盒(genecassette)：包含启动子phly、HAepitope 基因、VSV-G epitope基因、GP33 epitope基因、GP61 epitope基因、KRAS基因；
图2是本发明的Li打靶重组质粒结构图谱，含有两段Li同源基因(Li mpl和LiorfBAldh)、氨苄青霉 素抗性基因(Amp)、红霉素抗性基因(Ery)、基因序列盒(genecassette)：包含启动子phly、HA epitope 基因、VSV-G epitope基因、GP33 epitope基因、GP61 epitope基因、KRAS基因；
图3是本发明的打靶质粒电转化李斯特菌后的PCR鉴定电泳结果图，即打靶质粒电转化 LmΔactAplcB-lacZ和LiΔactAplcB-lacZ后的PCR鉴定电泳结果图；1为LmΔactAplcB-lacZ电转后扩增的目 的片段KRAS，2为LiΔactAplcB-lacZ电转后扩增的目的片段KRAS，M为DNAladder；
图4是本发明的重组菌LmΔactAplcB-KRAS(A)和LiΔactAplcB-KRAS(B)的基因组中插入的外源基 因及前后基因结构示意图；
图5是本发明通过流式细胞术检测，菌株免疫小鼠后所诱导的细胞免疫应答结果图；A为接种了 LmΔactAplcB-KRAS小鼠脾细胞在GP33肽段刺激下，IFN-γ细胞因子的分泌水平；B为接种了 LiΔactAplcB-KRAS小鼠脾细胞在GP33肽段刺激下，IFN-γ细胞因子的分泌水平；
图6为在加强治疗时对模型小鼠使用同源或异源疫苗菌株，对肿瘤肺转移模型治疗效果的评价。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
基于重组减毒单增李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，制备LmΔactA/plcB-KRAS的步骤包 括：
步骤一，合成KRAS基因片段；
查询KRAS(G12D，G12V突变)氨基酸序列，然后根据李斯特菌偏好密码子表进行密码子优化得到 优化后的序列，再在其上游加入HindⅢ酶切位点(AAGCTT)，下游加入XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)， 将设计好的序列通过合成直接获得，得到SEQ ID NO.1： AGCTTTGACAGAATATAAATTAGTTGTTGTTGGTGCAGATGGTGTTGGTAAATCTGCATTAACAATTCAATTAATTCAAAACCATGGTGGTGGTGGTGGTACAGAATATAAATTAGTTGTTGTTGGTGCAGTTGGTGT TGGTAAATCTGCATTAACAATTCAATTAATTCAAAACCATCTCGAG；
步骤二，构建打靶质粒；
用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切步骤一获得的KRAS基因片段，同时用相同的限制性内切酶酶 切质粒pCW203(专利CN103074361B)，经连接、转化等技术将KRAS基因片段插入pCW203 HindⅢ和 XhoⅠ酶切位点，得到中间质粒pCW203-KRAS，如SEQ ID NO.2所示，通过PCR验证、提质粒验证、酶 切验证证实中间质粒的成功构建。切下步骤中间质粒pCW203-KRAS的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点 之间的片段插入重组质粒pCW180的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间，得到打靶质粒pCW180-KRAS； 其中，重组质粒pCW180的基因序列为序列表中SEQ ID NO.3所示。
重组质粒pCW180的制备方法如下：
步骤a，将上游携带SpeⅠ、下游携带NotⅠ的Lm mpl基因插入质粒pCW154的SpeⅠ和NotⅠ酶切位 点之间，得到第一中间重组质粒pCW160，所述第一中间重组质粒pCW160的基因序列为序列表中SEQ ID NO.4所示；
步骤b，将上游携带XbaⅠ、下游携带NotⅠ的Lm orfBAldh基因插入第一中间重组质粒pCW160的 XbaⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到第二中间重组质粒pCW170，所述第二中间重组质粒pCW170的基因序 列为序列表中SEQ ID NO.5所示；
步骤c，用NotⅠ酶切质粒pCW154，得到两头为NotⅠ酶切位点的一段基因，插入第二中间重组质粒 pCW170的NotⅠ酶切位点，得到重组质粒pCW180。
步骤三，制备感受态细胞LmΔactAplcB-lacZ；
接种LmΔactAplcB-lacZ于15ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基，37℃220rpm培养12～16小时； 将上述菌液转移至250ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基，定期测定A600，当A600＝0.4时，加入盘尼 西林G，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当A600＝0.7时，倒入50mL离心管，4℃10000rpm离心5分 钟，弃上清；以0.5mol/L冰冷蔗糖溶液反复洗涤沉淀，每次加入20ml 0.5mol/L蔗糖溶液，4℃10000rpm 离心10分钟，弃上清，洗涤3次；每管加0.5mol/L蔗糖的300μl重悬，按50μl/支分装预冷无菌EP管，-80℃ 保存；
感受态细胞LmΔactAplcB-lacZ制备方法如下：
步骤a，将上、下游分别带NotI酶切位点的lacZ基因片段(专利CN103074361B)插入第二中间重组 质粒pCW170的NotI酶切位点之间，得到一个打靶质粒pCW190，所述质粒pCW190的基因序列为序列表 中SEQ ID NO.6所示；
步骤b，将步骤a所得打靶质粒pCW190电转化Lm，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培 养，即得。
步骤四，利用打靶质粒对感受态细胞LmΔactAplcB-lacZ进行电转化；
将制备的感受态细胞从-80℃冰箱中取出置于冰盒中，待其完全融化后，取5μl打靶质粒按1/10的比 例用-20℃预冷枪头缓慢加至感受态细胞LmΔactAplcB-lacZ，同时作ddH2O阴性对照；温和混匀后，冰浴5 分钟，再全部转入电转杯，冰浴5分钟，于电转仪中进行电转；电转完成后，冰浴5分钟，用37℃预热的 枪头加入37℃预热的BHI肉汤750μl，混匀后全部转至EP管，摇床30℃，150rpm培养2小时；用无菌L 形玻棒将菌液全量涂布于含红霉素3μg/ml、X-gal 40μg/ml的BHI琼脂平板(以下简称BHI-Ery-X-gal，BEXI 平板)，30℃培养48～72小时后，阳性菌为蓝色菌落，于BEXI平板上进行纯培养，30℃培养24小时，进 行提质粒及PCR验证；电转仪的电转条件为：电压＝1500V，持续时间＝5ms，电转杯内径＝1mm。
提质粒的具体方法是：按照质粒提取试剂盒说明提取质粒(李斯特菌为革兰阳性菌，SolutionⅠ使用前 需加入溶菌酶，溶菌酶终浓度为20mg/L，加入含溶菌酶的SolutionⅠ后重悬细菌，37℃水浴45min)，最后 以30μl Elution Buffer洗脱后电泳；凝胶成像，观察有无条带以判断重组质粒导入是否成功，质粒大小为 8859bp；
PCR验证的具体方法是：以煮沸法提取的细菌DNA基因组为模板，扩增目的条带KRAS，以上游引 物KRAS-f和下游引物KRAS-r进行PCR扩增；反应循环条件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，47℃30 秒，72℃1分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结果，预期结果：KRAS片段约185bp。 上游引物KRAS-f：5’-AAGCTTTGACAGAATATAAAT-3’，如SEQ IDNO.7所示；下游引物KRAS-r： 5’-CTCGAGATGGTTTTGAATTAA-3’，如SEQ ID NO.8所示。
步骤五，将LmΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养、筛选验证；
将携带打靶质粒的单增李斯特菌，在42℃和30℃连续传代培养，利用同源重组杂交原理和基因打靶 技术，将打靶质粒携带的目的片段整合至李斯特菌中，利用蓝白斑及红霉素敏感性筛选出可疑菌株；然后 进行PCR筛选和基因测序验证；选出LmΔactA/plcB-KRAS菌株，制备菌液，得到疫苗。
传代培养的具体方法是：将已电转入打靶质粒的LmΔactAplcB-lacZ划线接种BEXI平板，42℃传代培 养2～3代，每代培养时间为48小时，挑取单个蓝色菌落接种到培养基，30℃，200rpm传代培养6代，每 代培养时间为24小时；待传到培养基第3代开始，每代取40μl培养物加入360μl培养基中，多次连续1:10 稀释直到稀释106倍，分别涂布106倍稀释的菌液100μl于BEXI和BXI平板，30℃培养24小时；阳性菌 落LmΔactAplcB-KRAS在BXI平板上长成白色菌落，在BEXI平板上不生长。
PCR筛选的具体方法是：用细菌基因组提取试剂盒提取LmΔactAplcB-KRAS的基因组DNA作为模板， 进行以下三组基因片段的扩增：抗红霉素基因、靶抗原基因KRAS以及actA基因，根据扩增结果对重组菌LmΔactAplcB-KRAS进行鉴定；
抗红霉素基因Ery以上游引物Ery-f和下游引物Ery-r进行PCR扩增；反应循环条件为：94℃3分钟 →(94℃1分钟，60℃30s，72℃2分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结果，预期结 果：Ery基因片段约1471bp；上游引物Ery-f：5’-GATAAGTCGACGATTCACAAAAAATAG-3’，如SEQ ID NO.9所示；下游引物Ery-r：5’-AAAACTAGTCCCGGG GCGAATTG-3’，如SEQ ID NO.10所示。
Lm actA基因以上游引物Lm-actA-f和下游引物Lm-actA-r所示序列为引物进行PCR扩增；反应循环条 件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，50℃30s，72℃1分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察 PCR结果，预期结果：Lm actA基因片段约950bp。上游引物Lm-actA-f： 5’-GCTATAAATGAAGAGGCTTCAGG-3’，如SEQ ID NO.11所示；下游引物Lm-actA-r：5’-CTCTTAAATCAGCTAGGCGATC-3’，如SEQ ID NO.12所示。
基因测序验证的具体方法是：经PCR鉴定正确的相应疫苗菌株，以基因组DNA作为模板，PCR扩增 靶抗原基因KRAS，对扩增产物测序验证，对测序正确的菌株进行菌种保存。
基于重组减毒绵羊李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，制备LiΔactA/plcB-KRAS菌株的步 骤包括：
步骤一，合成KRAS基因片段；查询KRAS(G12D，G12V突变)氨基酸序列，然后根据李斯特菌偏 好密码子表进行密码子优化得到优化后的序列，再在其上游加入HindⅢ酶切位点(AAGCTT)，下游加入 XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)，将设计好的序列通过合成直接获得；
步骤二，构建打靶质粒；用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切步骤一获得的KRAS基因片段，同时 用相同的限制性内切酶酶切质粒pCW203(专利CN103074361B)，经连接、转化等技术将KRAS基因片段 插入pCW203 HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，得到中间质粒pCW203-KRAS，如SEQ ID NO.2所示，通过PCR 验证、提质粒验证、酶切验证证实中间质粒的成功构建。切下步骤中间质粒pCW203-KRAS的BamHI酶 切位点与XhoI酶切位点之间的片段插入重组质粒pCW154的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间，得到 打靶质粒pCW154-KRAS，如SEQID NO.13所示；
步骤三，制备感受态细胞LiΔactAplcB-lacZ；将LiΔactAplcB-lacZ利用含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培 养基进行培养，定期测定A600，当A600＝0.4时，加入盘尼西林G，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当 A600＝0.7时，离心，洗涤，分装，保存即可；
步骤四，利用打靶质粒对感受态细胞进行电转化；取打靶质粒电转至LiΔactAplcB-lacZ感受态细胞中， 电转完成后加入BHI肉汤培养2小时；转化液涂布于红霉素BHI琼脂平板，通过蓝白斑筛选出单个蓝色 菌落，纯培养后进行质粒提取和PCR验证；
电转条件为：电压＝1500V，持续时间＝5ms，电转杯内径＝1mm。
PCR验证的具体方法是：以煮沸法提取的细菌DNA基因组为模板，扩增目的条带KRAS，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列为引物进行PCR扩增；反应循环条件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，47℃ 30秒，72℃1分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结果，预期结果：KRAS片段约185bp；
步骤五，LiΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养、筛选验证；将携带打靶质粒的绵羊李斯特 菌，在42℃和30℃连续传代，利用同源重组杂交原理和基因打靶技术，将打靶质粒携带的目的片段整合 至李斯特菌中，利用蓝白斑及红霉素敏感性筛选出可疑菌株；然后进行PCR筛选和基因测序验证。
连续传代的具体方法是：将已电转入打靶质粒的LiΔactAplcB-lacZ划线接种BEXI平板，42℃传代培 养，挑取单个蓝色菌落接种BHI肉汤，30℃传代培养，待传到肉汤第3代开始，每代取培养物加入BHI 稀释，分别涂布稀释菌液100μl于BEXI和BXI平板，30℃培养24小时。
PCR筛选的具体方法是：用细菌基因组提取试剂盒提取LiΔactAplcB-KRAS的基因组DNA作为模板， 进行以下三组基因片段的扩增：抗红霉素基因、靶抗原基因KRAS以及actA基因，根据扩增结果对重组菌LiΔactAplcB-KRAS进行鉴定；
抗红霉素基因Ery以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示序列为引物进行PCR扩增；反应循环条件为： 94℃3分钟→(94℃1分钟，60℃30s，72℃2分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结 果，预期结果：Ery基因片段约1471bp；
Li actA基因以SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示序列为引物进行PCR扩增；反应循环条件为：94℃ 3分钟→(94℃1分钟，50℃30s，72℃1分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结果， 预期结果：Li actA基因片段约600bp；上游引物Li-actA-f：5’-GAAGCTAAAAGTGCAAATGTCCC-3’，如 SEQ ID NO.14所示；下游引物Li-actA-r：5’-ATTTCTTTAATACTGCGTTTGGGG-3’，如SEQ ID NO.15所 示。
基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的应用方法采用疫苗的初免-加强给药应用方式；疫 苗的初免-加强给药应使用不同的重组减毒李斯特菌。用于初免的疫苗有效成分为重组减毒单增李斯特菌， 用于加强的疫苗有效成分为重组减毒绵羊李斯特菌或重组减毒单增李斯特菌。
疫苗的给药方式为首次注射和至少两次加强注射，重组减毒单增李斯特菌与重组减毒绵羊李斯特菌依 次交替注射。加强注射的次数根据患者需要确定。
需要说明的是：LmΔactA/plcB-KRAS菌株和LiΔactA/plcB-KRAS菌株是基因重组菌，且说明书已经详细 描述了基因重组的全部过程，任何公司或个人，按照说明书上的步骤均能培养出这样的菌株。
以下用实验验证本发明的有益效果；
按照以下实施例制备基因重组菌；
实施例1.疫苗菌LiΔactAplcB-KRAS的制备；
(1)KRAS基因片段合成；
从NCBI上查询KRAS(G12D，G12V突变)蛋白基因，然后根据李斯特菌密码子进行相应优化，并 在上游加入HindⅢ酶切位点，下游加入XhoⅠ酶切位点，最后通过合成直接获得DNA序列(以公司提供 克隆质粒pUC57-KRAS的形式获得)，(序列如序列表序列1所示)。
(2)构建打靶质粒；
①中间质粒pCW203-KRAS的构建
按照质粒说明书提取质粒pUC57-KRAS和pCW203，以30μL Elution Buffer洗脱。pUC57-KRAS和 pCW203用HindⅢ和XhoⅠ双酶切，酶切体系20μL：pUC57-KRAS或pCW203＜1μg，HindⅢ1μL，XhoⅠ1μL， 10×NEB Buffer 2μL，ddH2O将体系补足20μL。37℃水浴1h酶切质粒，载体片段需加0.5μL CIAP，37℃水浴 30min去磷酸化。将酶切混合物与6×Loading Buffer混合，电泳(1％琼脂糖，94V)并胶回收相应长度的片 段(pUC57-KRAS回收酶切后的小片段即KRAS基因片段，长度为185bp；pCW203回收酶切后的大片段即 载体片段，长度约>10Kb)，以30μL Elution Buffer洗脱。
分别取KRAS基因片段与载体片段按照连接体系：载体50ng，插入片段摩尔数：载体片段摩尔数＝5:1， T4 Ligase 1μL，10×Ligase Buffer 5μL，ddH2O将体系补足10μl，22℃连接1h。将连接产物按体积1:10与大肠 杆菌DH5α的感受态细胞轻柔混匀，冰浴30min，42℃热击45s，冰浴3min，加入预热的SOB肉汤500μL，混 匀后于37℃，180rpm培养1h，涂布于LA平板(LB-Amp平板：含100μg/mL Amp的LB平板)，37℃培养16-20h。
PCR筛选：以煮沸法提取的细菌DNA基因组为模板，扩增目的条带KRAS，上游引物KRAS-f：5’ -AAGCTTTGACAGAATATAAAT-3’，下游引物KRAS-r：5’-CTCGAGATGGTTTTGAATTAA-3’，反应 循环条件为：94℃3min→(94℃1min，47℃30s，72℃1min)×30个循环→72℃10min→4℃；电泳观察PCR 结果(电泳条件：1％琼脂糖凝胶；90V，上样量：5μl PCR产物)，预期结果：KRAS片段约185bp。
酶切验证：PCR筛选验证的阳性菌提取质粒，按照上述酶切体系以HindⅢ和XhoⅠ进行酶切，将酶切 混合物与6×Loading Buffer混合进行电泳(1％琼脂糖，94V)。
测序验证：提取PCR及酶切验证符合预期的质粒送测序公司测序。将测序验证后完全正确的携带阳性 质粒的大肠杆菌保存于-80℃。
②打靶质粒的构建；
提取质粒pCW154，以30μL Elution Buffer洗脱。将质粒pCW154及中间质粒pCW203-KRAS分别用 限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ按照实施例(2)①的体系混匀(将HindⅢ酶替换为BamHⅠ酶)，进行酶 切和去磷酸化，电泳后胶回收pCW203-KRAS酶切后的小片段即插入片段(244bp)及pCW154载体骨架 (酶切后长片段，长度约8606bp)。按照(2)①的体系混匀进行连接并转化入大肠杆菌DH5α，涂布于LA 平板，对长出的单个菌落进行PCR筛选、BamHⅠ和XhoⅠ双酶切验证以及测序验证，具体操作同(2)① (将HindⅢ酶替换为BamHⅠ酶)。将测序验证后携带阳性质粒的大肠杆菌保存于-80℃。打靶质粒的结构 图谱见图2。
(3)电转化用LiΔactAplcB-lacZ感受态细胞的制备；
接种LiΔactAplcB-lacZ于15ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基，37℃220rpm培养12～16h。将上 述菌液转移至250ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基，定期测定A600，当A600＝0.4时，加入盘尼西林G， 使其终浓度为12.5μg/ml继续培养。当A600＝0.7时，倒入50mL离心管，4℃10000rpm离心5min，弃上清。 以0.5mol/L冰冷蔗糖溶液反复洗涤沉淀，每次加入20ml 0.5mol/L蔗糖溶液，4℃10000rpm离心10min， 弃上清，洗涤3次。每管加0.5mol/L蔗糖的300μl重悬，按50μl/支分装预冷无菌EP管，-80℃保存。
(4)打靶质粒电转化LiΔactAplcB-lacZ；
将制备的感受态细胞从-80℃冰箱中取出置于冰盒中，待其完全融化后，取5μl打靶质粒按1/10的比 例用-20℃预冷枪头缓慢加至感受态细胞LiΔactAplcB-lacZ，同时作ddH2O阴性对照。温和混匀后，冰浴5min， 再全部转入电转杯，冰浴5min，于电转仪中进行电转(电转条件：电压＝1500V，持续时间＝5ms，电转杯 内径＝1mm)。电转完成后，冰浴5min，用37℃预热的枪头加入37℃预热的BHI肉汤750μl，混匀后全部 转至EP管，摇床30℃，150rpm培养2h。用无菌L形玻棒将菌液全量涂布于含红霉素3μg/ml、X-gal 40μg/ml 的BHI琼脂平板(以下简称BHI-Ery-X-gal，BEXI平板)，30℃培养48～72h后，阳性菌为蓝色菌落，于BEXI平板上进行纯培养，30℃培养24h，进行提质粒及PCR验证。
PCR验证：以煮沸法提取的细菌DNA基因组为模板，扩增目的条带KRAS，上游引物KRAS-f：5’ -AAGCTTTGACAGAATATAAAT-3’，下游引物KRAS-r：5’-CTCGAGATGGTTTTGAATTAA-3’，反应 循环条件为：94℃3min→(94℃1min，47℃30s，72℃1min)×30个循环→72℃10min→4℃；电泳观察 PCR结果(电泳条件：1％琼脂糖凝胶；90V，上样量：5μl PCR产物)，预期结果：KRAS片段约185bp，如图3所示。
按照质粒提取试剂盒说明提取质粒(李斯特菌为革兰阳性菌，SolutionⅠ使用前需加入溶菌酶，溶菌酶 终浓度为20mg/L，加入含溶菌酶的SolutionⅠ后重悬细菌，37℃水浴45min)，最后以30μl Elution Buffer 洗脱后电泳。凝胶成像，观察有无条带以判断重组质粒导入是否成功，质粒大小为8882bp。
(5)LiΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组及筛选；
①LiΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养；
将已电转入打靶质粒的LiΔactAplcB-lacZ划线接种BEXI板，42℃传代培养2-3代(每代培养时间为 48小时)，挑取单个蓝色菌落接种5ml BHI肉汤，30℃，200rpm传代培养6代(每代培养时间为24小时)。 待传到肉汤第3代开始，每代取40μl培养物加入360μl BHI作1:10稀释，连续稀释106倍，分别涂布106倍稀释的菌液100μl于BEXI和BXI(含X-gal 40μg/ml的BHI琼脂平板)平板，30℃培养24h。阳性菌落 LiΔactAplcB-KRAS在BXI平板上长成白色菌落，在BEXI平板上不生长。
②PCR鉴定LiΔactAplcB-KRAS；
细菌基因组提取试剂盒提取LiΔactAplcB-KRAS的基因组DNA作为模板，进行以下三组基因片段的扩 增：抗红霉素基因、靶抗原基因盒以及actA基因，根据扩增结果对重组菌LiΔactAplcB-KRAS进行鉴定。 LiΔactAplcB-KRAS扩增KRAS，其引物及反应条件见(2)①，扩增目的条带抗红霉素基因Ery，约1471bp， 引物Ery-f/r(f:5’-GATAAGTCGACGATTCACAAAAAATAG-3’，r:5’-AAAACTAGTCCCGGGGCGAATTG -3’)，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，60℃30s，72℃2min)×30个循环→72℃10min→4℃； Li actA基因，约600bp，引物Li-actA-f/r(f:5’-GAAGCTAAAAGTGCAAATGTC CC-3’,r:5’-ATTTCTTTAATACTGCGTTTGGGG-3’)，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，55℃30s，72℃1min)×30个循环→72℃ 10min→4℃；。经PCR鉴定，LiΔactAplcB-KRAS携带有KRAS融合基因，不携带抗红霉素基因，且actA基 因被剔除。鉴定结果与预期吻合，LiΔactAplcB-KRAS制备成功。
③基因测序验证；
PCR鉴定后以疫苗组基因组DNA作为模板，PCR扩增靶抗原基因KRAS，对扩增产物测序验证，对 测序正确的菌株进行菌种保存。最终获得的重组菌基因组插入的外源基因及插入位点前后的基因结构示意 图如图4所示。
(6)LiΔactAplcB-KRAS疫苗候选株LD50的测定；
将-80℃保存的LiΔactAplcB-KRAS菌株置37℃水浴融化后，分别取10μl接种于5ml BHI肉汤中，37℃ 200rpm培养过夜。第二日，取复苏一次的菌液40μl于20ml BHI肉汤中，37℃200rpm培养过夜二次复苏。
取17.5ml二次复苏的各菌液接种350ml BHI肉汤，于37℃200rpm摇床培养，培养至A600值为0.3～0.7 之间时，根据李斯特菌生长曲线，确定此时A600值所对应的菌量，并根据预计的细菌接种剂量进行浓缩或 是稀释处理：取一定量菌液离心，13000rpm 2min，用生理盐水重悬后，再次离心，再用生理盐水将菌液 重悬至染菌剂量，并置于冰上备用。
6～8周龄BALB/c雌鼠适应性喂养3d后，随机分为3组，每组6只，LiΔactAplcB-KRAS免疫组尾静脉 分别接种1010CFU/ml、2x109CFU/ml、2x108CFU/ml的菌液100μl；连续观察10天，统计小鼠死亡、存活 情况，绘制各剂量组生存曲线；利用改良寇式法计算LD50，并以0.1×LD50作为最适后续免疫剂量。
(7)LiΔactAplcB-KRAS免疫小鼠诱导的细胞免疫应答；
①C57BL/6雌鼠疫苗接种；
6～8周龄的C57BL/6雌鼠适应性喂养3d后，选取3只免疫LiΔactAplcB-KRAS疫苗，注射0.1×LD50的LiΔactAplcB-KRAS(注射剂量为2×107CFU/只)。
②流式细胞术检测分泌特异性IFN-γ细胞因子的CD4+和CD8+T淋巴细胞数量；
脾细胞悬液制备：颈椎脱臼处死小鼠，将小鼠用针固定四肢于解剖板，75％酒精喷至其毛湿润，无菌 操作取脾脏，放于装有1ml RPMI Medium 1640(含1％双抗)的5ml离心管中，置冰浴备用。加5ml RPMI Medium 1640(含1％双抗)于一灭菌平板，其中放一张无菌200目尼龙膜，用无菌眼科镊取脾脏放于尼龙 膜上，并用尼龙膜将脾脏包裹，用无菌研棒轻研脾脏至其泛白(脾细胞脱落后剩下的被膜及未剔除干净的 结缔组织)，用枪头将所有脾细胞悬液收集至灭菌15ml EP离心管。
红细胞裂解：将装有脾细胞悬液的离心管放入低温离心机中，1300rpm/min，4℃离心5min，弃去上清， 震荡离心管，使沉淀在离心管底部的细胞分散，向离心管中加入4ml经过滤除菌的红细胞裂解液，上下颠 倒离心管，使细胞与红细胞裂解液充分接触，静置5min后，立即加入4ml RPMI 1640Medium(含1％双 抗)终止裂红反应，1300rpm/min 4℃离心5min，弃去上清，震荡离心管，向离心管中加入5ml RPMI 1640Medium(含1％双抗)，上下颠倒离心管以洗去残余的红细胞裂解液，1300rpm/min，4℃离心5min，弃 去上清，震荡离心管，重复洗涤一次。震荡离心管后，向离心管中加入2ml RPMI 1640Medium(含10％ 胎牛血清)重悬，将离心管置于冰上，备用。
刺激物配制：1.gp33-41储备液：1mg的肽段中加入1ml DMSO，配制成1mg/ml的储备液，10μl/支分 装EP管，储存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；4.流式PMA储备液：0.1mg的PMA中加入1ml DMSO， 配制成0.1mg/ml的储配液，10μl/支分装EP管，储存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；5.流式Ionomycine 储备液：1mg的Ionomycine中加入1ml DMSO，配制成1mg/ml的储备液，10μl/支分装EP管，储存于-20℃ 冰箱中，避免反复冻融；6.流式阳性刺激混合液：吸取100μl RPMI 1640Medium(含10％胎牛血清)、 0.2μl Golgi Stop、0.2μl Ionomycine储备液和0.2μl PMA储备液于EP管，用枪头吹打混合均匀；7.流式实 验刺激混合液：吸取100μl RPMI 1640Medium(含10％胎牛血清)、0.2μl gp33-41储备液和0.2μl Golgi Stop于EP管中，用枪头吹打混合均匀。
刺激：每个样品同时做阴性对照(不刺激)和实验处理(GP33肽段)2个孔；各组随机选取2个样品 用阳性刺激物(PMA+Ionomycine)刺激作为阳性质控。于96孔板中，每孔加入50μl脾细胞悬液和50μl 相应刺激物，5％CO2培养箱37℃刺激5h。
表面抗体染色：刺激完毕后，将96孔板取出，4℃1300rpm/min离心5min，弃上清，将96孔板置于 漩涡震荡仪上震荡，使得沉淀于板底的细胞分散，于避光处将表面抗体Anti-Mouse CD8a PE、Anti-Mouse TCR beta PerCP-Cyanine5.5、Anti-Human/Mouse CD44FITC、Anti-Mouse IFN gamma APC用PBS(含体积浓度2％胎牛血清)在灭菌EP管中分别按照体积稀释为1:200。每孔加入50μl表面抗体混合液重悬，4℃ 避光孵育30min后，于避光向每孔细胞中加入150μl PBS(含体积浓度2％胎牛血清)终止孵育，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清，震荡96孔板，加200μl PBS(含2％胎牛血清)重悬，洗去残余抗体，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清，震荡96孔板。
破膜：每孔加入100μl Cytofix/Cytoperm重悬，4℃避光静置20min后避光加入100μl Buffer Perm/Wash 终止，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清，震荡96孔板，每孔加200μl Buffer Perm/Wash重悬洗涤， 1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清，震荡96孔板。
胞内抗体染色：于避光处用1×perm/wash buffer在灭菌EP管中将抗体Anti-Mouse IFN gamma APC按 1:200体积比稀释。每孔分别加入混合抗体50μl重悬，4℃避光孵育45min后，于避光向每孔细胞中加入 150μl 1×perm/wash buffer终止孵育，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清震荡96孔板，加200μl 1×perm/wash buffer重悬，洗去残余抗体，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清，每孔细胞加入200μl 2％ 多聚甲醛溶液重悬收集，4℃避光保存准备上机。
上机检测结果：用Research Beads进行Performance QC以校正光路和流路，去离子水为样品冲洗流式 仪约10min，至Threshold Rate在20evts/sec以下。调试上机参数，选取所使用的荧光，确定样品收取数 (106events)，用空白孔(不做任何处理的细胞)调节测试电压，使FSC A-FSC H散点图、FSC A-SSC A 散点图中细胞群与横坐标轴呈约45°夹角，每一种染料在峰状图中的出峰值(阴性峰峰值)均小于102； 测定样品并进一步调节电压，使分析某种荧光染料孵育的细胞时，该荧光染料的双峰峰值(阴性峰峰值、 阳性峰峰值)以102为界，其余荧光染料峰值小于102。
如图5B所示；为小鼠脾细胞IFN-γ细胞因子的分泌水平，可见相比未加GP33肽段组，LiΔactAplcB-KRAS 能够诱导特异性GP33细胞免疫应答。
实施例2：疫苗菌LmΔactAplcB-KRAS的制备
(1)KRAS基因片段合成；同实施例1(1)。
(2)构建打靶质粒；
①中间质粒pCW203-KRAS的构建同实施例1(2)①
②打靶质粒的构建
提取质粒pCW180，以30μL Elution Buffer洗脱。将质粒pCW180及中间质粒pCW203-KRAS分别用 限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ按照(2)①的体系混匀(将HindⅢ酶替换为BamHⅠ酶)，进行酶切和去 磷酸化，电泳后胶回收pCW203-KRAS酶切后的小片段即插入片段(244bp)及pCW180载体骨架(酶切后长片段，长度约8621bp)。按照(2)①的体系混匀进行连接并转化入大肠杆菌DH5α，涂布于LA平板， 对长出的单个菌落进行PCR筛选、BamHⅠ和XhoⅠ双酶切验证以及测序验证，具体操作同实施例(2)① (将HindⅢ酶替换为BamHⅠ酶)。将测序验证后携带阳性质粒的大肠杆菌保存于-80℃。打靶质粒的结构 图谱见图1。
(3)电转化用LmΔactAplcB-lacZ感受态细胞的制备；此步同实施例1(3)，其中LiΔactAplcB-lacZ换为 LmΔactAplcB-lacZ。
(4)打靶质粒电转化LmΔactAplcB-lacZ；此步同实施例1(4)，其中，打靶质粒换为pCW180-KRAS，质 粒大小为8859bp，LiΔactAplcB-lacZ换为LmΔactAplcB-lacZ。电转后细菌PCR验证结果见参照图3。
(5)LmΔactAplcB-lacZ同源重组及筛选；
①LmΔactAplcB-lacZ同源重组杂交培养
此步同实施例1(5)①，其中LiΔactAplcB-lacZ换为LmΔactAplcB-lacZ。
②PCR鉴定LmΔactAplcB-KRAS
此步同实施例1(5)②。
细菌基因组提取试剂盒提取LmΔactAplcB-KRAS的基因组DNA作为模板，进行以下三组基因片段的 扩增：抗红霉素基因、靶抗原基因盒以及actA基因，根据扩增结果对重组菌LmΔactAplcB-KRAS进行鉴定。 LmΔactAplcB-KRAS扩增KRAS，其引物及反应条件见实施例(2)①，扩增目的条带抗红霉素基因Ery， 约1471bp，引物Ery-f/r(f:5’-GATAAGTCGACGATTCACAAAAAATAG-3’，r: 5’-AAAACTAGTCCCGGGGCGAATTG-3’)，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，60℃30s，72℃2min) ×30个循环→72℃10min→4℃；扩增LmactA基因，约950bp，引物Lm-actA-f/r(f: 5’-GCTATAAATGAAGAGGCTTCAGG-3’，r:5’-CTCTTAAATCAGCTAGGCGATC-3’)，反应循环条件为： 94℃3min→(94℃1min，50℃30s，72℃1min)×30个循环→72℃10min→4℃。经PCR鉴定， LmΔactAplcB-KRAS携带有KRAS融合基因，不携带抗红霉素基因，且actA基因被剔除。鉴定结果与预期 吻合，LmΔactAplcB-KRAS制备成功。
③基因测序验证；此步同实施例1(5)③。
(6)LmΔactAplcB-KRAS疫苗候选株LD50的测定；此步同实施例1(6)。其中LmΔactAplcB-KRAS免疫组 尾静脉分别接种1.0×108CFU/只、2×107CFU/只和2×106CFU/只。
(7)LmΔactAplcB-KRAS免疫小鼠诱导的细胞免疫应答；此步同实施例1(7)。其中接种了LmΔactAplcB-KRAS (2×106CFU/只)，小鼠脾细胞在GP33肽段刺激下，IFN-γ细胞因子的分泌水平为图5A所示。
需要说明的是：疫苗菌LiΔactAplcB-KRAS和疫苗菌LmΔactAplcB-KRAS是基因重组菌，且说明书已 经详细描述了基因重组的全部过程，任何公司或个人，按照说明书上的步骤均能培养出这样的菌株。
实验二：疫苗菌株对KRAS高表达肿瘤治疗效果评价；
疫苗菌株对KRAS高表达癌治疗效果评价
(1)CT26-KRAS肿瘤细胞培养及肿瘤模型的建立
用含10％胎牛血清、1％青霉素、链霉素的RPMI1640 Medium在37℃5％CO2培养箱内培养 CT26-KRAS细胞，待其密度达到80％左右，用Hank’s液润洗细胞2～3次后，胰酶消化并用PBS重悬计 数，将细胞配制成浓度为5×106/ml的细胞悬液，6～8周龄的BALB/c雌鼠尾静脉注射100μl细胞悬液， 建立小鼠肺转移肿瘤模型，观察生存率。
(2)对建模小鼠进行同源，异源初免-加强免疫治疗比较。
实验设立阴性对照组：注射生理盐水(NS)；治疗组：治疗组1：首次注射LmΔactAplcB-KRAS，第一 次加强注射LiΔactAplcB-KRAS，第二次加强注射LmΔactAplcB-KRAS，第三次加强注射LiΔactAplcB-KRAS； 治疗组2：首次注射LmΔactAplcB-KRAS，第一次加强注射LmΔactAplcB-KRAS，第二次加强注射 LmΔactAplcB-KRAS，第三次加强注射LmΔactAplcB-KRAS。
造模小鼠随机分为3组，每组6只。CT26-KRAS将细胞配制成浓度为5×105/ml的细胞悬液，尾静脉 注射100μl细胞悬液，分别于细胞注射后第3天进行第一次免疫治疗，按实施例1(7)①配制菌液，各菌 株尾静脉接种100μl，NS对照组尾静脉接种等体积NS。第10天进行第二次加强免疫治疗，方法和剂量同 第一次免疫治疗。第17天进行第二次加强免疫治疗，方法和剂量同第一次免疫治疗。第24天进行第三次 加强免疫治疗，方法和剂量同第一次免疫治疗。每天观察生存状况。结果如图6所示在加强治疗时对模型 小鼠使用同源或异源疫苗菌株，对肿瘤肺转移模型治疗效果的评价。可见异源治疗组1(在110天有66％ 的生存率)比同源治疗组2(在110天有33％的生存率)及生理盐水对照组小鼠生存率显著更高。实验制 备疫苗株对KRAS高表达肿瘤起到有效的控制和治疗作用。
本发明的诱导特异性针对高表达KRAS癌症的细胞因子，靶向治疗癌组织，不损伤正常细胞；疫苗菌 株免疫活性高，诱导高效的细胞因子表达。李斯特菌株本身具有高效活化机体细胞免疫功能的作用，因此 携带抗原的重组菌株能激活多种抗肿瘤免疫机制，激活特异的肿瘤杀伤性T细胞，打破免疫抑制重新激活 有效的肿瘤杀伤机制；LmΔactAplcB-KRAS能够诱导特异性GP33细胞免疫应答；实验证明疫苗株对KRAS 高表达肿瘤起到有效的控制和治疗作用；减毒菌株不会在体内长期存在，不会引起感染，在我们的临床前试验中表现了很好的耐受性，并经其他类似临床试验证实了其安全性，且能跟其他肿瘤治疗手段很好的兼 容，如鸡尾酒式免疫抑制剂、外科手术、放疗和化疗。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不 以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围 内。
序列表
<110> 嘉晨西海（杭州）生物技术有限公司
<120> 基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗及其制备方法及其应用方法
<141> 2020-03-18
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 185
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
aagctttgac agaatataaa ttagttgttg ttggtgcaga tggtgttggt aaatctgcat 60
taacaattca attaattcaa aaccatggtg gtggtggtgg tacagaatat aaattagttg 120
ttgttggtgc agttggtgtt ggtaaatctg cattaacaat tcaattaatt caaaaccatc 180
tcgag 185
<210> 2
<211> 13232
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tgcggccgcc agtgtgatgg atatctgcag aattaattcg gctttctaga gtgactttta 60
tgttgaggca ttaacatttg ttaacgacga taaagggaca gcaggactag aataaagcta 120
taaagcaagc atataatatt gcgtttcatc tttagaagcg aatttcgcca atattataat 180
tatcaaaaga gaggggtggc aaacggtatt tggcattatt aggttaaaaa atgtagaagg 240
agagtgaaac ccatgaaaaa aataatgcta gtttttatta cacttatatt agttagtcta 300
ccaattgcgc aacaaactga agcaaaggat gcatcggatc catatccata tgatgttcca 360
gattatgcat cattgaattc aatgagaagt gaaagaccac aagctttgac agaatataaa 420
ttagttgttg ttggtgcaga tggtgttggt aaatctgcat taacaattca attaattcaa 480
aaccatggtg gtggtggtgg tacagaatat aaattagttg ttgttggtgc agttggtgtt 540
ggtaaatctg cattaacaat tcaattaatt caaaaccatc tcgagtatac agatattgaa 600
atgaatagat taggaaaatg ataagtcgac gattcacaaa aaataggcac acgaaaaaca 660
agttaaggga tgcagtttat gcatccctta acttacttat taaataattt atagctattg 720
acaagagata agaattgttc aaagctaata ttgtttaaat cgtcaattcc tgcatgtttt 780
aaggaattgt taaattgatt ttttgtaaat attttcttgt attctttgtt aacccatttc 840
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aatctgataa gtgagctatt cactttaggt ttaggatgaa aatattctct tggaaccata 960
cttaatatag aaatatcaac ttctgccatt aaaagtaatg ccaatgagcg ttttgtattt 1020
aataatcttt tagcaaaccc gtattccacg attaaataaa tctcattagc tatactatca 1080
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gccttgcgaa cggcccccga agaaatttcg aagtccagcc ccaatatctt tcataaagtt 2340
aacgccagtg atgacttcgc cgaaaacgat ttttttatat tcgataattt gtttgccttc 2400
aatatttggt gaagttgtta caatcatgag ttatccctac agtttttctt ttatcatacc 2460
tcttagtact ttttctagtc aaaggatatc cggttatttc gtacgatttc gcgctttttc 2520
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cccgactgat ttcgcggctt ccatcgcttt ttcgtgcaaa tcgtctttgt aaattccaca 2640
agtgataata aaaccgttca ttgaatagcg ggttctattg gtttctgttt gcagcgtttc 2700
tttcgcgcgt tgaagtaatg tctctgcttc aggcaaattg ttaatatgtt cgctgtaaat 2760
ctgccagccc atggatttag ttaaatcata atcactttca atccatgttt tggcgaaaag 2820
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tgctagcaaa ccgagataaa tcaagtcact attatttgat tcaatcagtt ttacggcgag 3000
ttcgtgattt tttgtcagtt tttctcggcg gatgattttc tttaaatcac caatttttag 3060
tccgtaaaga tctaatgaat ccggacaacc gtgattacga aaaattttga tcgtattggg 3120
gttttctaag gcttgtagct cggtgtcaag ttggtcaaaa gtaatcatac gcgtcactcc 3180
tctcgaataa agtaagtata acaaaaaaag catgcgaagg cgcatgcttt aggatttaag 3240
aatattagtc tatttgtttc attgcgtcgt ctagctagaa ttaattcttg aagacgaaag 3300
ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg 3360
tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata 3420
cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga 3480
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ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat 3600
cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag 3660
agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc 3720
gcggtattat cccgtgttga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 3780
cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca 3840
gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt 3900
ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat 3960
gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt 4020
gacaccacga tgcctgcagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 4080
cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 4140
ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 4200
gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc 4260
gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 4320
gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 4380
ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 4440
gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 4500
gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 4560
caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 4620
ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 4680
tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 4740
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 4800
tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 4860
cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 4920
gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 4980
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 5040
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 5100
agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 5160
tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 5220
tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 5280
gaggaagcgg aagagcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca 5340
caccgcatat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat 5400
acactccgct atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg 5460
ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg 5520
tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc 5580
tgcggtaaag ctcatcagcg tggtcgtgaa gcgattcaca gatgtctgcc tgttcatccg 5640
cgtccagctc gttgagtttc tccagaagcg ttaatgtctg gcttctgata aagcgggcca 5700
tgttaagggc ggttttttcc tgtttggtca cttgatgcct ccgtgtaagg gggaatttct 5760
gttcatgggg gtaatgatac cgatgaaacg agagaggatg ctcacgatac gggttactga 5820
tgatgaacat gcccggttac tggaacgttg tgagggtaaa caactggcgg tatggatgcg 5880
gcgggaccag agaaaaatca ctcagggtca atgccagcgc ttcgttaata cagatgtagg 5940
tgttccacag ggtagccagc agcatcctgc gatgcagatc cggaacataa tggtgcaggg 6000
cgctgacttc cgcgtttcca gactttacga aacacggaaa ccgaagacca ttcatgttgt 6060
tgctcaggtc gcagacgttt tgcagcagca gtcgcttcac gttcgctcgc gtatcggtga 6120
ttcattctgc taaccagtaa ggcaaccccg ccagcctagc cgggtcctca acgacaggag 6180
cacgatcatg cgcacccgtg gccaggaccc aacgctgccc gacgatgata agctgtcaaa 6240
catgagaatt aattcccgat tatgtctttt gcgcactcgg cttaaaccag ttttcgctgg 6300
tgcgaaaaaa gagtgtcttg tgacacctaa attcaaaatc tatcggtcag atttataccg 6360
atttgatttt atatattctt gaataacata cgccgagtta tcacataaaa gcgggaacca 6420
atcatcaaat ttaaacttca ttgcataatc cattaaactc ttaaattcta cgattccttg 6480
ttcatcaata aactcaatca tttctttaat taatttatat ctatctgttg ttgttttctt 6540
taataattca tcaacatcta caccgccata aactatcata tcttcttttt gatatttaaa 6600
tttattagga tcgtccatgt gaagcatata tctcacaaga cctttcacac ttcctgcaat 6660
ctgcggaata gtcgcattca attcttctgt tattattttt atctgttcat aagatttatt 6720
accctcatac atcactagaa tatgataatg ctcttttttc atcctacctt ctgtatcagt 6780
atccctatca tgtaatggag cactacaaat tgaatgtgta actcttttaa atactctaac 6840
cactcggctt tgctgattct ggatataaaa caaatgtcca attacgtcct cttgaatttt 6900
tcttgttttc agtttctttt attacatttt cgctcatgat ataataacgg tgctaataca 6960
cttaacaaaa tttagtcata gataggcagc atgccagtgc tgtctatctt tttttgttta 7020
aaatgcaccg tattcctcct ttgcatattt ttttattaga ataccggttg catctgattt 7080
gctaatatta tatttttctt tgattctatt taatatctca ttttcttctg ttgtaagtct 7140
taaagtaaca gcaacttttt tctcttcttt tctatctaca actatcactg tacctcccaa 7200
catctgtttt tttcacttta acataaaaaa caacctttta acattaaaaa cccaatattt 7260
atttatttgt ttggacaatg gacaatggac acctaggggg gaggtcgtag taccccccta 7320
tgttttctcc cctaaataac cccaaaaatc taagaaaaaa agacctcaaa aaggtcttta 7380
attaacatct caaatttcgc atttattcca atttcctttt tgcgtgtgat gcgctgcgtc 7440
cattaaaaat cctagagctt tgcaaccgaa agttaatagc tgtcgctact actttcgctt 7500
acgctctaag tatattttaa ggactgtcac acgcaaaaag ttttctcggc ataaaagtac 7560
ctctacatct ctaaatcgtc tgtacgctgt ttctcacgct ttctatcgat cccgcaagag 7620
gcccggcagt accggcataa ccaagcctat gcctacagca tccagggtga cggtgccgag 7680
gatgacgatg agcgcattgt tagatttcat acacggtgcc tgactgcgtt agcaatttaa 7740
ctgtgataaa ctaccgcatt aaagctagct ttaaggctaa atgccgaatg gttggcacct 7800
accgcattgg caaccgtggc agaagagggc gcatccgttt tggcgaaaaa gagtaaaacg 7860
gcgaggatga gtgcacagcc agagcccagc cagaaaacaa actgattatt gatggtgaac 7920
atgatgccga caatcgaggc acacagcgcc cagccaacac agccaaacat ccgcgcgcga 7980
ccaaattcga aattactgcg acggctgact ttctcaataa atgcctctac tgctggcgca 8040
ccggcgttaa aacaaaagcc tagataaata ccaccaacaa tcgatcctac taaaatgttg 8100
tattgtaaca gtggcccgaa gataaaaata aagaacggcg caaacatcac taacatgccg 8160
gtaataatcc acagcaggta tttgcgcagc ccgagtttgt cagaaagcag accaaacagc 8220
ggttggaata atagcgagaa cagagaaata gcggcaaaaa taatacccgt atcacttttg 8280
ctgatatggt tgatgtcatg tagccaaatc gggaaaaacg ggaagtaggc tcccatgata 8340
aaaaagtaaa agaaaaagaa taaaccgaac atccaaaagt ttgtgttttt taaatagtac 8400
ataatggatt tccttacgcg aaatacgggc agacatggcc tgcccggtta ttattatttt 8460
tgacaccaga ccaactggta atggtagcga ccggcgctca gctggaatta attccgccga 8520
tactgacggg ctccaggagt cgtcgccacc aatccccata tggaaaccgt cgatattcag 8580
ccatgtgcct tcttccgcgt gcagcagatg gcgatggctg gtttccatca gttgctgttg 8640
actgtagcgg ctgatgttga actggaagtc gccgcgccac tggtgtgggc cataattcaa 8700
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tgacaatggc agatcccagc ggtcaaaaca ggcggcagta aggcggtcgg gatagttttc 8820
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gccaatccgc gccggatgcg gtgtatcgct cgccacttca acatcaacgg taatcgccat 8940
ttgaccacta ccatcaatcc ggtaggtttt ccggctgata aataaggttt tcccctgatg 9000
ctgccacgcg tgagcggtcg taatcagcac cgcatcagca agtgtatctg ccgtgcactg 9060
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ctgatcgcgc agcggcgtca gcagttgttt tttatcgcca atccacatct gtgaaagaaa 9240
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catacagaac tggcgatcgt tcggcgtatc gccaaaatca ccgccgtaag ccgaccacgg 9780
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ctgtaaacgg ggatactgac gaaacgcctg ccagtattta gcgaaaccgc caagactgtt 9900
acccatcgcg tgggcgtatt cgcaaaggat cagcgggcgc gtctctccag gtagcgaaag 9960
ccattttttg atggaccatt tcggcacagc cgggaagggc tggtcttcat ccacgcgcgc 10020
gtacatcggg caaataatat cggtggccgt ggtgtcggct ccgccgcctt catactgcac 10080
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gcggttttct ccggcgcgta aaaatgcgct caggtcaaat tcagacggca aacgactgtc 11040
ctggccgtaa ccgacccagc gcccgttgca ccacagatga aacgccgagt taacgccatc 11100
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gtaacaaccc gtcggattct ccgtgggaac aaacggcgga ttgaccgtaa tgggataggt 11220
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aataccgttt gccacccctc tcttttgata attataatat tggcgaaatt cgcttctaaa 11640
gatgaaacgc aatattatat gcttgcttta tagctttatt ctagtcctgc tgtcccttta 11700
tcgtcgttaa caaatgttaa tgcctcaaca taaaagtcac tctagtacat ttttatctca 11760
tttttataat cctgatagag ataatactta tttgccgggt tttgctaatg cgaaaataac 11820
aggagcaaag tatttcaatc aatcggtgac tgattaccga gaagggaaat ttgacacagc 11880
gttttataaa ttaggcctag caatccatta ttatacggat attagtcaac ctatgcacgc 11940
caataatttt accgcaatat cataccctcc aggctaccac tgtgcatatg aaaattacgt 12000
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agaattttgg tctaaaaaaa caaatgaata acaatattta ggaatacatt cttatccact 12300
cgttagcggg tggatatatt ttatggggag gaagtaagcc aaatgtatat aaaagggagg 12360
ttaatctttt tctttgtagt gttagtaatc gcgttatgtt ccgtattaat attgcttata 12420
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tgtcttggaa gttgtgaaat aaaaaatact aatcaaaaaa tccatttctt ctccataaaa 12540
gagaatttgt ttgaggaaaa gggtgatata gctggaattt taaatgaaga cgaacaaaaa 12600
gttgctgata agtccatttt cattgttatt ttggatgatg aaaaagggat tgcgaacgaa 12660
gagtaaagcg gtttgttagg tagtcttgaa tagttaaaaa acaatatagg aggaacatct 12720
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gtcgcgtgtg gggataaaga agaaacgaaa acttacacac tttcccaaaa tggtgttgat 12840
tctaaattaa catacacata taagggagac aaagttacta aacaaacagc tgaaaataca 12900
atgtcatatg cttcgttagg tgtggcttca aaagaagacg ctgaaaaaat gcttaaagca 12960
acaagcgata aattccaagg tattgatggt ttaaaagaaa agattgaata taaagatgat 13020
aaagctattg aaacactaga agtagattac actaaaatct cttcggaaga tatgaacaaa 13080
atccctggta tgtcttcaaa tggtgatact tctaaaggga ttagcatgga ggaatctgca 13140
aaaatgctag aatcccaagg ctataaagaa gtttcaaaat aaatttgcaa taaaaaagaa 13200
gtatccgatt catttggata cttctttttt at 13232
<210> 3
<211> 9285
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gaattcccga ttatgtcttt tgcgcactcg gcttaaacca gttttcgctg gtgcgaaaaa 60
agagtgtctt gtgacaccta aattcaaaat ctatcggtca gatttatacc gatttgattt 120
tatatattct tgaataacat acgccgagtt atcacataaa agcgggaacc aatcatcaaa 180
tttaaacttc attgcataat ccattaaact cttaaattct acgattcctt gttcatcaat 240
aaactcaatc atttctttaa ttaatttata tctatctgtt gttgttttct ttaataattc 300
atcaacatct acaccgccat aaactatcat atcttctttt tgatatttaa atttattagg 360
atcgtccatg tgaagcatat atctcacaag acctttcaca cttcctgcaa tctgcggaat 420
agtcgcattc aattcttctg ttattatttt tatctgttca taagatttat taccctcata 480
catcactaga atatgataat gctctttttt catcctacct tctgtatcag tatccctatc 540
atgtaatgga gcactacaaa ttgaatgtgt aactctttta aatactctaa ccactcggct 600
ttgctgattc tggatataaa acaaatgtcc aattacgtcc tcttgaattt ttcttgtttt 660
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atttagtcat agataggcag catgccagtg ctgtctatct ttttttgttt aaaatgcacc 780
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atatttttct ttgattctat ttaatatctc attttcttct gttgtaagtc ttaaagtaac 900
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ttttcacttt aacataaaaa acaacctttt aacattaaaa acccaatatt tatttatttg 1020
tttggacaat ggacaatgga cacctagggg ggaggtcgta gtacccccct atgttttctc 1080
ccctaaataa ccccaaaaat ctaagaaaaa aagacctcaa aaaggtcttt aattaacatc 1140
tcaaatttcg catttattcc aatttccttt ttgcgtgtga tgcgctgcgt ccattaaaaa 1200
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gtatatttta aggactgtca cacgcaaaaa gttttctcgg cataaaagta cctctacatc 1320
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aaataattat acttttgttt atctttgtgt gatattcttg atttttttct acttaatctg 1800
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cttttagcaa acccgtattc cacgattaaa taaatctcat tagctatact atcaagaaca 1980
attttgcgta ttatatccgt acttatgtta taaggtatat taccatatat tttataggat 2040
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ttagtataat tatagcacga gctctgataa atatgaacat gatgagtgat cgttaaattt 2520
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aaagatttat atggtgaaga tgcttctaaa aaagttgctg aagcttggga agcggtagga 3600
gttaactgag cggccgccag tgtgatggat atctgcagaa ttaattcggc tttctagagt 3660
gacttttatg ttgaggcatt aacatttgtt aacgacgata aagggacagc aggactagaa 3720
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gtagaaggag agtgaaaccc atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag 3900
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attcaatgag aagtgaaaga ccacaagctt tgttggggaa gtgcttgacc gcgtgctgtt 4080
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gagtttcagc ggaacaatgg ggtcgtctcc tcgagggatt aaatggacca gatatttata 4680
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ctgtaccaga tgcagtgacc attagcattc cgttatcagc tccaagcact tcataatcaa 4860
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tatttgtttc attgcgtcgt tctagaactt ttttaagtgt atctgcggag tttttcattt 8820
gttctttttc tttgtcattt aagttcattt caacaatatg gcgaacgcct tgacggttaa 8880
cgactgctgg tgcacctata taaatatcgt tcataccgta atggccatct aaataaacag 8940
aaagtggcaa aatcgcattt tcgttattta gaattgcttt tgtaatacga gcaagagctg 9000
cagcaacgcc gtagaatgta gcgccttttt tattaataat ttcataagct gcatcacgaa 9060
cacttacgaa aatagtatcc attgcacctt gttcatcttc gctaatccat tcagtaattg 9120
gaaggccgcc gacagttgtg tggctccatg ctgggaattc ttgaagacga aagggcctcg 9180
tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg 9240
gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa 9300
atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 9360
agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 9420
ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 9480
gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 9540
gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 9600
tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 9660
acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 9720
aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 9780
cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 9840
gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 9900
cgatgcctgc agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 9960
tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 10020
tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 10080
ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 10140
tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 10200
gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 10260
ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 10320
tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 10380
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 10440
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 10500
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt 10560
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 10620
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 10680
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 10740
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 10800
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 10860
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 10920
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 10980
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 11040
acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 11100
gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 11160
cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 11220
tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc 11280
gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc 11340
gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg 11400
gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agctgcggta 11460
aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct gcctgttcat ccgcgtccag 11520
ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg ataaagcggg ccatgttaag 11580
ggcggttttt tcctgtttgg tcacttgatg cctccgtgta agggggaatt tctgttcatg 11640
ggggtaatga taccgatgaa acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa 11700
catgcccggt tactggaacg ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac 11760
cagagaaaaa tcactcaggg tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca 11820
cagggtagcc agcagcatcc tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac 11880
ttccgcgttt ccagacttta cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag 11940
gtcgcagacg ttttgcagca gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc 12000
tgctaaccag taaggcaacc ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc 12060
atgcgcaccc gtggccagga cccaacgctg cccgacgatg ataagctgtc aaacatga 12118
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
aagctttgac agaatataaa t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ctcgagatgg ttttgaatta a 21
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gataagtcga cgattcacaa aaaatag 27
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
aaaactagtc ccggggcgaa ttg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
gctataaatg aagaggcttc agg 23
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
ctcttaaatc agctaggcga tc 22
<210> 13
<211> 8882
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gaattcccga ttatgtcttt tgcgcactcg gcttaaacca gttttcgctg gtgcgaaaaa 60
agagtgtctt gtgacaccta aattcaaaat ctatcggtca gatttatacc gatttgattt 120
tatatattct tgaataacat acgccgagtt atcacataaa agcgggaacc aatcatcaaa 180
tttaaacttc attgcataat ccattaaact cttaaattct acgattcctt gttcatcaat 240
aaactcaatc atttctttaa ttaatttata tctatctgtt gttgttttct ttaataattc 300
atcaacatct acaccgccat aaactatcat atcttctttt tgatatttaa atttattagg 360
atcgtccatg tgaagcatat atctcacaag acctttcaca cttcctgcaa tctgcggaat 420
agtcgcattc aattcttctg ttattatttt tatctgttca taagatttat taccctcata 480
catcactaga atatgataat gctctttttt catcctacct tctgtatcag tatccctatc 540
atgtaatgga gcactacaaa ttgaatgtgt aactctttta aatactctaa ccactcggct 600
ttgctgattc tggatataaa acaaatgtcc aattacgtcc tcttgaattt ttcttgtttt 660
cagtttcttt tattacattt tcgctcatga tataataacg gtgctaatac acttaacaaa 720
atttagtcat agataggcag catgccagtg ctgtctatct ttttttgttt aaaatgcacc 780
gtattcctcc tttgcatatt tttttattag aataccggtt gcatctgatt tgctaatatt 840
atatttttct ttgattctat ttaatatctc attttcttct gttgtaagtc ttaaagtaac 900
agcaactttt ttctcttctt ttctatctac aactatcact gtacctccca acatctgttt 960
ttttcacttt aacataaaaa acaacctttt aacattaaaa acccaatatt tatttatttg 1020
tttggacaat ggacaatgga cacctagggg ggaggtcgta gtacccccct atgttttctc 1080
ccctaaataa ccccaaaaat ctaagaaaaa aagacctcaa aaaggtcttt aattaacatc 1140
tcaaatttcg catttattcc aatttccttt ttgcgtgtga tgcgctgcgt ccattaaaaa 1200
tcctagagct ttgcaaccga aagttaatag ctgtcgctac tactttcgct tacgctctaa 1260
gtatatttta aggactgtca cacgcaaaaa gttttctcgg cataaaagta cctctacatc 1320
tctaaatcgt ctgtacgctg tttctcacgc tttctatcga tcccgcaaga ggcccggcag 1380
taccggcata accaagccta tgcctacagc atccagggtg acggtgccga ggatgacgat 1440
gagcgcattg ttagatttca tacacggtgc ctgactgcgt tagcaattta actgtgataa 1500
actaccgcat taaagcttgt cgacgattca caaaaaatag gcacacgaaa aacaagttaa 1560
gggatgcagt ttatgcatcc cttaacttac ttattaaata atttatagct attgacaaga 1620
gataagaatt gttcaaagct aatattgttt aaatcgtcaa ttcctgcatg ttttaaggaa 1680
ttgttaaatt gattttttgt aaatattttc ttgtattctt tgttaaccca tttcagaacg 1740
aaataattat acttttgttt atctttgtgt gatattcttg atttttttct acttaatctg 1800
ataagtgagc tattcacttt aggtttagga tgaaaatatt ctcttggaac catacttaat 1860
atagaaatat caacttctgc cattaaaagt aatgccaatg agcgttttgt atttaataat 1920
cttttagcaa acccgtattc cacgattaaa taaatctcat tagctatact atcaagaaca 1980
attttgcgta ttatatccgt acttatgtta taaggtatat taccatatat tttataggat 2040
tggtttttag gaaatttaaa ctgcaatata tccttgttta aaacttggaa attatcgtga 2100
tcaacaagtt tattttctgt agttttgcat aatttatggt ctatttcaat ggcagttacg 2160
aaattacacc tctttactaa ttcaagggta aaatggcctt ttcctgagcc gatttcaaag 2220
atattatcat gttcatttaa tcttatattt gtcattattt tatctatatt atgttttgaa 2280
gtaataaagt tttgactgtg ttttatattt ttctcgttca ttataaccct ctttaatttg 2340
gttatatgaa ttttgcttat taacgattca ttataaccac ttattttttg tttggttgat 2400
aatgaactgt gctgattaca aaaatactaa aaatgcccat attttttcct ccttataaaa 2460
ttagtataat tatagcacga gctctgataa atatgaacat gatgagtgat cgttaaattt 2520
atactgcaat cggatgcgat tattgaataa aagatatgag agatttatct aatttctttt 2580
ttcttgtaaa aaaagaaagt tcttaaaggt tttatagttt tggtcgtaga gcacacggtt 2640
taacgactta attacgaagt aaataagtct agtgtgttag actttatgaa atctttatac 2700
gtttatatat atttattatc cggaggtgta gcatgtctca ttcaattttg agggttgcca 2760
gagttaaagg atcaagtaat acaaacggga tacaaagaca taatcaaaga gagaataaaa 2820
actataataa taaagacata aatcatgagg aaacatataa aaattatgat ttgattaacg 2880
cacaaaatat aaagtataaa gataaaattg atgaaacgat tgatgagaat tattcaggga 2940
aacgtaaaat tcggtcagat gcaattcgcc ccgggactag tttcgttatg gcttaaattg 3000
caataacgct ttttgggatg gtcaggaaat tctttatgga gatggagata agaagaatta 3060
caaaccattt tcatgtgcaa aaaatatcgt cgctcatgaa ttaacgcatg ctgtcattca 3120
acactcagca ggtttagaat acgaagggca agcaggtgca ttaaatgaat cattcgcgga 3180
tgtctttagt tattttatta ctccagacaa ttggttaata ggtgaggatg tctgtttaca 3240
tggaatgaac agcaggagag taagaagttt aaaagaacca gataaataca accaagcggc 3300
acacatgaat gagtatgagt caatgccgat tacagaagaa tatgattggg gaggggttca 3360
tttcaatagc ggaataccta acaaagctgc ttataatacc atcacgaaag ttggtaggga 3420
acaggcagaa caactatatt ttcgagcatt aaagtattac ttaacgaaaa aatcccaatt 3480
tgtcgatgct aagaatgcgc ttcaacaggc ggcgagagac ttatacagcg aagaagtggc 3540
taaaaaagta ggagaagcat gggaagaagt tggcgttaga taagggatgt cctccaagcc 3600
aaattaacaa atgttaaaga aaagcggttt ctcccaatgc tattcttgaa gcaattcatg 3660
aattgttttc ctaaattagc taatagggag gttttaacaa gagtcaaaaa ctctaaacag 3720
cctgaattgt atactgttct tacgcaggta ttagagagcg gccaagggcg aattctgcag 3780
atatccatca cactggcggc cgccagtgtg atggatatct gcagaattaa ttcggctttc 3840
tagagtgact tttatgttga ggcattaaca tttgttaacg acgataaagg gacagcagga 3900
ctagaataaa gctataaagc aagcatataa tattgcgttt catctttaga agcgaatttc 3960
gccaatatta taattatcaa aagagagggg tggcaaacgg tatttggcat tattaggtta 4020
aaaaatgtag aaggagagtg aaacccatga aaaaaataat gctagttttt attacactta 4080
tattagttag tctaccaatt gcgcaacaaa ctgaagcaaa ggatgcatcg gatcttaaag 4140
ctgtttataa ttttgctact atgaaggatc catatccata tgatgttcca gattatgcat 4200
cattgaattc aatgagaagt gaaagaccac aagctttgac agaatataaa ttagttgttg 4260
ttggtgcaga tggtgttggt aaatctgcat taacaattca attaattcaa aaccatggtg 4320
gtggtggtgg tacagaatat aaattagttg ttgttggtgc agttggtgtt ggtaaatctg 4380
cattaacaat tcaattaatt caaaaccatc tcgagggatt aaatggacca gatatttata 4440
aaggagttta tcaatttaaa agtgttgaat ttgatgtcga gtatacagat attgaaatga 4500
atagattagg aaaatgataa gtcggcggcc gcacaaaaaa cggaaatcag ttagtaaaac 4560
tggtttccgt tttttattaa tagtcttgag cctcaataac aacagcagtg ccagatgctg 4620
taaccattaa cataccatta tccgctccaa gtacttcata atcgatatcc acaccaatta 4680
cggcatttgc tccgatatct ttggcgcgct gttccatctc tttaatagct tcctcacgtg 4740
cgttaattaa ctcgtcttca taaccttgtg atcgtccacc gaaaaagttt ctgaggccag 4800
ctccaatgtc tttcataaaa ttaacaccag taattacttc tccgaaaacg atttttttat 4860
attcgataat ttgcttgcct tcaatatttg gtgaggtagt tacaatcatt attaaatccc 4920
tccagttttc ttttatcata cctctaagtt gtttttttag tcaaaggata gctggttatt 4980
ttttacgggc gtgggctttt tcgatataag taatcgcatc tgggactttg caagcagttt 5040
ttcctaaatc tacatatact ttacctattg attctgctgc ttccaatgct tttgtgtaaa 5100
gttcctcttt ataaattccg caagcgatga tataactatt catagagtaa cgagttctgt 5160
tcgtttcaga ttgtaaagat tcttttgcga gttccagtaa ttcctcggct tcaggcaaag 5220
tcgcgatgtg ttctgtgaaa atttgccagc ccattgattt agttaaatca gcatcacttt 5280
taatccattt cctagcaaag gtgagtgcgt catcacgttt acttacaacg gaggctagcc 5340
caaaagttaa catcgtccaa gcatctcgaa aagctatatt ccatttctcg atttgtgaaa 5400
cagctacttt tttagggttc acggcaagta aaccaaggta aattaagtcg ctattattag 5460
actcgattaa ttggagtgct aattcgtgat ttttattcaa tttttcacgg cgaataattt 5520
tctttaaatc accaatcttt aatctctaga acttttttaa gtgtatctgc ggagtttttc 5580
atttgttctt tttctttgtc atttaagttc atttcaacaa tatggcgaac gccttgacgg 5640
ttaacgactg ctggtgcacc tatataaata tcgttcatac cgtaatggcc atctaaataa 5700
acagaaagtg gcaaaatcgc attttcgtta tttagaattg cttttgtaat acgagcaaga 5760
gctgcagcaa cgccgtagaa tgtagcgcct tttttattaa taatttcata agctgcatca 5820
cgaacactta cgaaaatagt atccattgca ccttgttcat cttcgctaat ccattcagta 5880
attggaaggc cgccgacagt tgtgtggctc catgctggga attcttgaag acgaaagggc 5940
ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca 6000
ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat 6060
tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa 6120
aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt 6180
tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag 6240
ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt 6300
tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg 6360
gtattatccc gtgttgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag 6420
aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta 6480
agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg 6540
acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta 6600
actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac 6660
accacgatgc ctgcagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt 6720
actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca 6780
cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag 6840
cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta 6900
gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag 6960
ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt 7020
tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 7080
aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 7140
gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 7200
acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 7260
tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag 7320
ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 7380
atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 7440
agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 7500
cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 7560
agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 7620
acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 7680
gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 7740
ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 7800
gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt 7860
gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 7920
gaagcggaag agcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac 7980
cgcatatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagtataca 8040
ctccgctatc gctacgtgac tgggtcatgg ctgcgccccg acacccgcca acacccgctg 8100
acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct 8160
ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg aggcagctgc 8220
ggtaaagctc atcagcgtgg tcgtgaagcg attcacagat gtctgcctgt tcatccgcgt 8280
ccagctcgtt gagtttctcc agaagcgtta atgtctggct tctgataaag cgggccatgt 8340
taagggcggt tttttcctgt ttggtcactt gatgcctccg tgtaaggggg aatttctgtt 8400
catgggggta atgataccga tgaaacgaga gaggatgctc acgatacggg ttactgatga 8460
tgaacatgcc cggttactgg aacgttgtga gggtaaacaa ctggcggtat ggatgcggcg 8520
ggaccagaga aaaatcactc agggtcaatg ccagcgcttc gttaatacag atgtaggtgt 8580
tccacagggt agccagcagc atcctgcgat gcagatccgg aacataatgg tgcagggcgc 8640
tgacttccgc gtttccagac tttacgaaac acggaaaccg aagaccattc atgttgttgc 8700
tcaggtcgca gacgttttgc agcagcagtc gcttcacgtt cgctcgcgta tcggtgattc 8760
attctgctaa ccagtaaggc aaccccgcca gcctagccgg gtcctcaacg acaggagcac 8820
gatcatgcgc acccgtggcc aggacccaac gctgcccgac gatgataagc tgtcaaacat 8880
ga 8882
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
gaagctaaaa gtgcaaatgt ccc 23
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
atttctttaa tactgcgttt gggg 24
Claims (15)
1.基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗，其特征在于，为LmΔactA/plcB-KRAS菌株的菌液；所述LmΔactA/plcB-KRAS菌株是以减毒单增李斯特菌为载体，携带KRAS蛋白基因的基因重组菌；
所述减毒单增李斯特菌为单增李斯特菌完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得；
所述KRAS蛋白基因由KRAS蛋白氨基酸序列经过李斯特菌密码子优化后，在上游加入HindⅢ酶切位点，下游加入XhoⅠ酶切位点，通过合成获得的DNA序列，SEQ ID NO.1。
2.基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗，其特征在于，为LiΔactA/plcB-KRAS菌株的菌液；所述LiΔactA/plcB-KRAS菌株是以减毒绵羊李斯特菌为载体，携带KRAS蛋白基因的基因重组菌；
所述减毒绵羊李斯特菌为绵羊李斯特菌完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得；
所述KRAS蛋白基因由KRAS蛋白氨基酸序列经过李斯特菌密码子优化后，在上游加入HindⅢ酶切位点，下游加入XhoⅠ酶切位点，通过合成获得的DNA序列，SEQ ID NO.1。
3.基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，其特征在于，制备重组减毒单增李斯特菌的步骤包括：
步骤一，合成KRAS基因片段；
查询KRAS(G12D，G12V突变)氨基酸序列，然后根据李斯特菌偏好密码子表进行密码子优化得到优化后的序列，再在其上游加入HindⅢ酶切位点(AAGCTT)，下游加入XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)，将设计好的序列通过合成直接获得，SEQ ID NO.1；
步骤二，构建打靶质粒；
用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切步骤一获得的KRAS基因片段，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pCW203，经连接、转化技术将KRAS基因片段插入pCW203 HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，得到中间质粒pCW203-KRAS，如SEQ ID NO.2所示，通过PCR验证、提质粒验证、酶切验证证实中间质粒的成功构建，切下步骤中间质粒pCW203-KRAS的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间的片段插入重组质粒pCW180的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间，得到打靶质粒pCW180-KRAS；其中，所述重组质粒pCW180的基因序列为序列表中SEQ ID NO.3所示；
步骤三，制备感受态细胞LmΔactAplcB-lacZ；
培养LmΔactAplcB-lacZ，定期测定A600，当A600＝0.4时，加入盘尼西林G，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当A600＝0.7时，离心，洗涤，分装，保存，得到LmΔactA/plcB-lacZ感受态细胞；
步骤四，利用打靶质粒对感受态细胞LmΔactAplcB-lacZ进行电转化；
取打靶质粒电转至LmΔactA/plcB-lacZ感受态细胞中，用电转仪电转后用培养液培养；将转化液涂布于红霉素BHI琼脂平板，通过蓝白斑筛选出单个蓝色菌落，纯培养后进行质粒提取和PCR验证；
步骤五，将LmΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养、筛选验证；
将携带打靶质粒的单增李斯特菌，在42℃和30℃连续传代培养，利用同源重组杂交原理和基因打靶技术，将打靶质粒携带的目的片段整合至李斯特菌中，利用蓝白斑及红霉素敏感性筛选出可疑菌株；然后进行PCR筛选和基因测序验证；选出LmΔactA/plcB-KRAS菌株，制备菌液，得到疫苗。
4.根据权利要求3所述的基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，其特征在于，重组质粒pCW180的制备方法如下：
步骤a，将上游携带SpeⅠ、下游携带NotⅠ的Lm mpl基因插入质粒pCW154的SpeⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到第一中间重组质粒pCW160，所述第一中间重组质粒pCW160的基因序列为序列表中SEQ ID NO.4所示；
步骤b，将上游携带XbaⅠ、下游携带NotⅠ的Lm orfBAldh基因插入第一中间重组质粒pCW160的XbaⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到第二中间重组质粒pCW170，所述第二中间重组质粒pCW170的基因序列为序列表中SEQ ID NO.5所示；
步骤c，用NotⅠ酶切质粒pCW154，得到两头为NotⅠ酶切位点的一段基因，插入第二中间重组质粒pCW170的NotⅠ酶切位点，得到重组质粒pCW180。
5.根据权利要求3所述的基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，其特征在于，电转仪的电转条件为：电压＝1500V，持续时间＝5ms，电转杯内径＝1mm。
6.根据权利要求3所述的基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，其特征在于，步骤四中，PCR验证的具体方法是：以煮沸法提取的细菌DNA基因组为模板，扩增目的条带KRAS，以上游引物KRAS-f和下游引物KRAS-r进行PCR扩增；反应循环条件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，47℃30秒，72℃1分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结果，预期结果：KRAS片段185bp；
上游引物KRAS-f：5’-AAGCTTTGACAGAATATAAAT-3’，如SEQ ID NO.7所示；
下游引物KRAS-r：5’-CTCGAGATGGTTTTGAATTAA-3’，如SEQ ID NO.8所示。
7.根据权利要求3所述的基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，其特征在于，步骤五中，传代培养的具体方法是：将已电转入打靶质粒的LmΔactAplcB-lacZ划线接种BEXI平板，42℃传代培养2～3代，每代培养时间为48小时，挑取单个蓝色菌落接种到培养基，30℃，200rpm传代培养6代，每代培养时间为24小时；待传到培养基第3代开始，每代取40μl培养物加入360μl培养基中，多次连续1:10稀释直到稀释106倍，分别涂布106倍稀释的菌液100μl于BEXI和BXI平板，30℃培养24小时；阳性菌落LmΔactAplcB-KRAS在BXI平板上长成白色菌落，在BEXI平板上不生长。
8.根据权利要求3所述的基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，其特征在于，步骤五中，PCR筛选的具体方法是：用细菌基因组提取试剂盒提取LmΔactAplcB-KRAS的基因组DNA作为模板，进行以下三组基因片段的扩增：抗红霉素基因、靶抗原基因KRAS以及actA基因，根据扩增结果对重组菌LmΔactAplcB-KRAS进行鉴定；
抗红霉素基因Ery以上游引物Ery-f和下游引物Ery-r进行PCR扩增；反应循环条件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，60℃30s，72℃2分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结果，预期结果：Ery基因片段1471bp；
上游引物Ery-f：5’-GATAAGTCGACGATTCACAAAAAATAG-3’，如SEQ ID NO.9所示；
下游引物Ery-r：5’-AAAACTAGTCCCGGG GCGAATTG-3’，如SEQ ID NO.10所示；
Lm actA基因以上游引物Lm-actA-f和下游引物Lm-actA-r所示序列为引物进行PCR扩增；反应循环条件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，50℃30s，72℃1分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结果，预期结果：Lm actA基因片段950bp；
上游引物Lm-actA-f：5’-GCTATAAATGAAGAGGCTTCAGG-3’，如SEQ ID NO.11所示；下游引物Lm-actA-r：5’-CTCTTAAATCAGCTAGGCGATC-3’，如SEQ ID NO.12所示。
9.基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，其特征在于，制备
LiΔactA/plcB-KRAS菌株的步骤包括：
步骤一，合成KRAS基因片段；
查询KRAS(G12D，G12V突变)氨基酸序列，然后根据李斯特菌偏好密码子表进行密码子优化得到优化后的序列，再在其上游加入HindⅢ酶切位点(AAGCTT)，下游加入XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)，将设计好的序列通过合成直接获得，SEQ ID NO.1；
步骤二，构建打靶质粒；
用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切步骤一获得的KRAS基因片段，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pCW203，经连接、转化技术将KRAS基因片段插入pCW203 HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，得到中间质粒pCW203-KRAS，如SEQ ID NO.2所示，通过PCR验证、提质粒验证、酶切验证证实中间质粒的成功构建；切下步骤中间质粒pCW203-KRAS的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间的片段插入重组质粒pCW154的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间，得到打靶质粒pCW154-KRAS，如SEQ ID NO.13所示；
步骤三，制备感受态细胞LiΔactAplcB-lacZ；
将LiΔactAplcB-lacZ利用含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基进行培养，定期测定A600，当A600＝0.4时，加入盘尼西林G，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当A600＝0.7时，离心，洗涤，分装，保存即可；
步骤四，利用打靶质粒对感受态细胞进行电转化；
取打靶质粒电转至LiΔactAplcB-lacZ感受态细胞中，电转完成后加入BHI肉汤培养2小时；转化液涂布于红霉素BHI琼脂平板，通过蓝白斑筛选出单个蓝色菌落，纯培养后进行质粒提取和PCR验证；
步骤五，LiΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养、PCR筛选验证；
将携带打靶质粒的绵羊李斯特菌，在42℃和30℃连续传代，利用同源重组杂交原理和基因打靶技术，将打靶质粒携带的目的片段整合至李斯特菌中，利用蓝白斑及红霉素敏感性筛选出可疑菌株；然后进行PCR筛选和基因测序验证。
10.根据权利要求9所述的基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，其特征在于，步骤四中的电转条件为：电压＝1500V，持续时间＝5ms，电转杯内径＝1mm。
11.根据权利要求9所述的基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，其特征在于，步骤四中的PCR验证的具体方法是：以煮沸法提取的细菌DNA基因组为模板，扩增目的条带KRAS，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列为引物进行PCR扩增；反应循环条件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，47℃30秒，72℃1分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结果，预期结果：KRAS片段185bp；
上游引物KRAS-f：5’-AAGCTTTGACAGAATATAAAT-3’，如SEQ ID NO.7所示；
下游引物KRAS-r：5’-CTCGAGATGGTTTTGAATTAA-3’，如SEQ ID NO.8所示。
12.根据权利要求9所述的基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，其特征在于，步骤五中，连续传代的具体方法是：将已电转入打靶质粒的LiΔactAplcB-lacZ划线接种BEXI平板，42℃传代培养，挑取单个蓝色菌落接种BHI肉汤，30℃传代培养，待传到肉汤第3代开始，每代取培养物加入BHI稀释，分别涂布稀释菌液100μl于BEXI和BXI平板，30℃培养24小时。
13.根据权利要求9所述的基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，其特征在于，步骤五中，PCR筛选的具体方法是：用细菌基因组提取试剂盒提取LiΔactAplcB-KRAS的基因组DNA作为模板，进行以下三组基因片段的扩增：抗红霉素基因、靶抗原基因KRAS以及actA基因，根据扩增结果对重组菌LiΔactAplcB-KRAS进行鉴定；
抗红霉素基因Ery以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示序列为引物进行PCR扩增；反应循环条件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，60℃30s，72℃2分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结果，预期结果：Ery基因片段1471bp；
上游引物Ery-f：5’-GATAAGTCGACGATTCACAAAAAATAG-3’，如SEQ ID NO.9所示；
下游引物Ery-r：5’-AAAACTAGTCCCGGG GCGAATTG-3’，如SEQ ID NO.10所示；
Li actA基因以SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示序列为引物进行PCR扩增；反应循环条件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，50℃30s，72℃1分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结果，预期结果：Li actA基因片段600bp；
上游引物Li-actA-f：5’-GAAGCTAAAAGTGCAAATGTCCC-3’，如SEQ ID NO.14所示；下游引物Li-actA-r：5’-ATTTCTTTAATA CTGCGTTTGGGG-3’，如SEQ ID NO.15所示。
14.重组减毒李斯特菌在制备结肠癌或肺癌疫苗中的用途，其特征在于，所述重组减毒李斯特菌包括根据权利要求1中所定义的重组减毒单增李斯特菌和任选的根据权利要求2中所定义的重组减毒绵羊李斯特菌，并且所述疫苗采用初免-加强给药应用方式；用于初免的疫苗有效成分为所述重组减毒单增李斯特菌，用于加强的疫苗有效成分为所述重组减毒绵羊李斯特菌或所述重组减毒单增李斯特菌。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述重组减毒李斯特菌包括所述重组减毒单增李斯特菌和所述重组减毒绵羊李斯特菌，所述疫苗的给药方式为首次注射和至少两次加强注射，其中所述重组减毒单增李斯特菌与所述重组减毒绵羊李斯特菌依次交替注射。
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