CN111849978B - 一种基于Type I-F CRISPR/Cas的染色质成像方法和染色质成像系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于Type I‑F CRISPR/Cas系统的染色质成像系统。本发明首次研究显示隶属于Type I‑F CRISPR/Cas系统的Cascade复合物，如PaeCascade复合物，能有效用于染色质成像；同时，本发明对Type I‑F CRISPR/Cas系统进行了哺乳动物表达系统优化，使得其在哺乳动物细胞内具有高效的双链DNA结合活性，并将荧光分子融合表达至优化后的Cascade亚基上，成功构建了染色质成像系统。本发明使得Type I‑F CRISPR/Cas系统在哺乳动物细胞的染色质成像方面的应用成为可能，并为基于Type I‑F CRISPR/Cas系统的染色质成像提供了必要工具。

Description

一种基于Type I-F CRISPR/Cas的染色质成像方法和染色质 成像系统

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种基于Type I-F CRISPRCas的染色质成像方法和染色质成像系统及应用。

背景技术

在真核细胞中，基因组DNA以染色质的高级形式储存于细胞核的三维空间内，因此称“三维基因组”。三维基因组结构的异常与多种人类疾病的发生密切相关。基因组的三维结构是一个动态变化，且呈现单细胞异质性的结构。因此在活细胞状态下，采用单细胞分辨率来研究基因组三维结构的动态和功能尤为重要。三维基因组领域有非常多重要科学问题等待探索。例如，一个特定基因在细胞核内的位置由什么分子决定？在哪些情况下，基因或调控元件会从细胞核的一个位置移动到另外一个位置？这种空间位置上的变化，是由哪些蛋白分子介导？这个发生位移的时间点是有规律并受某种机制控制的吗？这背后的生物学意义是什么？这一系列问题同样适用于三维基因组结构概念范畴里的任何一个方面，例如染色质环，拓扑关联结构域，染色体区室或染色体疆域等不同三维结构的形成。

近年来，活细胞DNA标记技术，作为研究基因组不可或缺的实时成像工具，受到了极大地关注。将核酸酶失活的Cas9，简称dCas9,与荧光蛋白融合，经过系统改造优化后，可在人的活细胞中标记并实时追踪特异基因或特异调控元件在细胞核内的位置及动态变化。该技术可以在细胞分裂各个时期的多种细胞类型内进行基因组DNA特异标记，并能对目标元件进行长达十几个小时的动态观察，显示了该项技术可广泛性运用的前景。如马来西亚博特拉大学Mahdi Moradpours实验室在期刊Plant Biotechnology Journal上发表的题为“CRISPR/dCas9 Platforms in Plants:Strategies and Applications beyond GenomeEditing”的综述中记载了CRISPR/dCas9在植物活细胞染色质成像中的应用。

虽然基于CRISPR-Cas9的活细胞DNA成像技术在最近几年得到了很大的发展，但是大部分工作还是局限于标记带重复序列的DNA片段。不含重复序列的基因标记还是存在很大的挑战。技术难点主要体现在：为了富集足够强的高于背景的信号，不含重复DNA序列的基因标记需要表达26-36个sgRNA。然而不同sgRNA的活性差异很大，虽然有不少预测sgRNA活性的设计软件帮助我们筛选靶点，但是仍然无法用之准确判断sgRNA在细胞内的活性，其标记效率比较低。

在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，和单效应蛋白的CRISPR相对，I型(Type I)CRISPR系统由多效应蛋白组成，需要多亚基共同组装成为具有功能的CRISPR复合体(CRISPR-associated complex for antiviral defense，Cascade)执行功能。从亚基数量和排列等基因特征进行归类，I型CRISPR又可细分为8种亚型(I-A到I-G型，I-U型)。以目前研究最深入的大肠杆菌的I-E型CRISPR系统为例，该系统由5种效应蛋白和CRISPR RNA(crRNA)构成，其组装首先需要Cas6对crRNA进行加工，其后Cas5、6个Cas7、Cas8e和2个Cse2小亚基共同被招募形成具有共11个亚基的复合体。该复合体仅具有双链DNA(dsDNA)结合能力，需要与Cas3结合才能进行dsDNA切割。

和相对复杂的I-E型CRISPR相比，来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的I-F型CRISPR复合体(PaeCascade)结合dsDNA仅需4种效应蛋白(Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1和Cas6f)易用性存在一定的优势。研究指出PaeCascade可在体外和大肠杆菌中结合dsDNA(Chowdhury,S.,et al,Cell,2017)。在Cas3存在的情况下，PaeCascade复合体可招募Cas3在细菌内对满足PAM(protospacer abject motif)SEQ ID NO.5’-CC-3’要求的靶序列进行切割，实现靶基因编辑。

然而关于Type I-F CRISPR系统是否适用于染色质成像及相应的应用价值如何，尚未有任何的研究与报道，其能否可成为新一代的染色质成像工具，仍是未知。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有Type I-F CRISPR系统的应用局限，探究其是否适用于染色质成像，并开发适用于哺乳动物的基于Type I-F CRISPR/Cas系统的染色质成像新工具。

本发明的目的是提供Type I-F CRISPR/Cas系统在染色质成像方面的应用。

本发明另一目的是提供一种利用Type I-F CRISPR/Cas系统进行染色质成像的方法。

本发明再一目的是提供一种基于Type I-F CRISPR/Cas的染色质成像系统。

本发明再一目的是提供上述染色质成像系统的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明通过对PaeCascade序列进行哺乳动物表达系统优化，将荧光蛋白融合表达至PaeCascade上，进行了PaeCascade染色质成像系统的构建、优化和活性检测。使得PaeCascade系统在哺乳动物细胞的染色质成像工具开发成为可能。

因此本发明提供了一下可应用方案：

Type I-F CRISPR/Cas系统在染色质成像方面或在制备染色质成像工具中的应用。所述Type I-F CRISPR/Cas系统包括Cas1,Cas3,Cas8f1(又名Csy1),Cas5f1(又名Csy2),Cas7f1(又名Csy3),Cas6f(又名Csy4)等蛋白亚基，以及由正向重复序列和间隔序列组成的CRISPR阵列。

所述的Type I-F CRISPR/Cas系统是来源于Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14的Cascade复合物，简称为PaeCascade。

基于此，本发明提供一种利用隶属于Type I-F CRISPR/Cas系统的PaeCascade复合物进行染色质成像的方法，该方法是：首先对PaeCascade复合物的Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1和Cas6f分别进行适应编辑对象的优化，然后将目标基因的靶向序列、优化后的Cas8f1、优化后的Cas5f1、优化后的Cas7f1、优化后的Cas6f以及荧光蛋白共同呈递至靶细胞。

具体而言所述方法是：首先对PaeCascade复合物的Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1和Cas6f分别进行适应编辑对象的优化，然后将目标基因的靶向序列、优化后的Cas8f1、优化后的Cas5f1、优化后的Cas7f1、优化后的Cas6f以任意组合插入表达载体(即将crRNA、Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1、Cas6f表达盒，或其融合蛋白，或共表达(如P2A或IRES)接头，以任意组合任意顺序，任意启动子驱动的任意载体组合)，得到重组质粒组合，再将荧光蛋白插入所述重组质粒组合中任一个重组质粒中，最后所得重组质粒共同转染细胞。

优化后的Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1、Cas6f分别记为hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1和hCas6f。

所述“以任意组合插入表达载体”包括但不限于以下组合方式：

(1)靶向序列、hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1、hCas6f全部插入在同一个表达载体中，所得重组质粒即构成染色质成像系统；

(2)靶向序列、hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1、hCas6f中任意四个组分插入在同一个表达载体中，余下一个组分插入在另一个表达载体中，构建成由2个重组质粒构成的染色质成像系统；

(3)靶向序列、hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1、hCas6f中任意三个组分插入在同一个表达载体中，余下两个组分插入在另一个表达载体中，构建成由2个重组质粒构成的染色质成像系统；

(4)靶向序列、hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1、hCas6f中任意三个组分插入在同一个表达载体中，余下两个组分各自分别插入在另外两个表达载体中，构建成由3个重组质粒构成的染色质成像系统；

(5)靶向序列、hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1、hCas6f中任意两个组分插入在同一个表达载体中，余下三个组分中的任意两个插入在另一个表达载体中，余下一个组分插入在第三个表达载体中，构建成由3个重组质粒构成的染色质成像系统；

(6)靶向序列、hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1、hCas6f中任意两个组分插入在同一个表达载体中，余下三个组分各自分别插入在另外三个表达载体中，构建成由4个重组质粒构成的染色质成像系统；

(7)靶向序列、hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1、hCas6f分别单独插入5个表达载体中，构建成由5个重组质粒构成的染色质成像系统。

因此，上述涉及到的融合质粒，具体是指由hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1、hCas6f中的任一种或任几种组合插入表达载体得到重组质粒，也在本发明的保护范围之内。

进一步优选地，还需将荧光蛋白分子插入任意一个重组质粒中。

基于此，一种由上述融合质粒组成的基于Type I-F CRISPR/Cas的染色质成像系统，也应在本发明的保护范围之内。

另外，作为一种可选择的实施方案，本发明以上述组合方式(5)为例，提供了一种利用隶属于Type I-F CRISPR/Cas系统的PaeCascade复合物进行染色质成像的方法及染色质成像系统，以及涉及到的优化效应蛋白及重组质粒。

具体展示如下：

一种利用隶属于Type I-F CRISPR/Cas系统的PaeCascade复合物进行染色质成像的方法，包括如下步骤：

(1)对PaeCascade复合物的Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1和Cas6f分别进行适应编辑对象的优化；

(2)选取目标基因中靶向序列，将靶向序列插入表达载体中构建crRNA靶向质粒；

(3)将优化后的Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1和Cas6f中任两个与启动子共同插入表达载体构建融合质粒I；

(4)将将优化后的Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1和Cas6f中任两个与启动子和荧光蛋白共同插入表达载体构建融合质粒IV；

(5)将上述crRNA靶向质粒和融合质粒I、融合质粒IV共同转染细胞。一种优化的PaeCascade效应蛋白，包括hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1和hCas6f。

所述hCas8f1的序列如SEQ ID NO.2所示，hCas5f1的序列如SEQ ID NO.3所示，hCas7f1的序列如SEQ ID NO.4所示，hCas6f的序列如SEQ ID NO.5所示。

一种融合质粒I，所述融合质粒I为：真核细胞表达载体-hCsy蛋白-启动子-hCsy蛋白；其中两个hCsy蛋白分别选自hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1或hCas6f且两个hCsy蛋白不同。

即所述融合质粒I可以为如下11种：

(1)真核细胞表达载体-hCas5f1-启动子-hCas8f1；

(2)真核细胞表达载体-hCas5f1-启动子-hCas7f1；

(3)真核细胞表达载体-hCas5f1-启动子-hCas6f；

(4)真核细胞表达载体-hCas8f1-启动子-hCas5f1；

(5)真核细胞表达载体-hCas8f1-启动子-hCas7f1；

(6)真核细胞表达载体-hCas8f1-启动子-hCas6f；

(7)真核细胞表达载体-hCas7f1-启动子-hCas8f1；

(8)真核细胞表达载体-hCas7f1-启动子-hCas5f1；

(9)真核细胞表达载体-hCas7f1-启动子-hCas6f；

(10)真核细胞表达载体-hCas6f-启动子-hCas8f1；

(10)真核细胞表达载体-hCas6f-启动子-hCas5f1；

(11)真核细胞表达载体-hCas6f-启动子-hCas7f1。

其中所述真核细胞表达载体如pCDNA3.1等。

所述启动子如PGK、EF1α，CMV，CBh等一般广泛性启动子。

优选地，所述融合质粒I为pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1。

或优选地，所述融合质粒I为pxCMV-hCas6f-PGK-hCas7f1。

优选地，所述融合质粒I的N端添加核定位信号(NLS)PKKKRKV。

最优选地，所述融合质粒pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1的序列如SEQ ID NO.7所示；

或所述融合质粒pxCMV-hCas6f-PGK-hCas7f1的序列如SEQ ID NO.8所示。

再一种融合质粒IV，所述融合质粒IV为：真核细胞表达载体-hCas7f1-荧光蛋白-启动子-hCas6f。

其中所述真核细胞表达载体如pCDNA3.1等。

所述荧光蛋白如mScarlett、GFP、YFP、mCherry等。

所述启动子如PGK、EF1α，CMV，CBh等一般广泛性启动子。

优选地，所述融合质粒IV为pxCMV-hCas7f1-mScarlett-PGK-hCas6f。

优选地，所述融合质粒IV中，融合质粒IV的N端添加核定位信号(NLS)PKKKRKV。

最优选地，所述融合质粒pxCMV-hCas7f1-mScarlett-PGK-hCas6f的序列如SEQ IDNO.9所示。

再一种融合质粒V，所述融合质粒V为在适于哺乳动物的表达载体中插入hCas6f-DR序列得到。

优选地，所述适于哺乳动物的表达载体包括pCDNA3.1等。

优选地，所述融合质粒V为pLenti-DR(hCas6f)-EV。其中，pLenti为骨架名称，可替换为任意真核表达载体。EV(empty vector)是指载体未连入识别任何靶向序列的序列，是可用来进行靶向序列克隆的空载体。DR(hCas6f)是指可被hCas6f识别的直接重复序列(简称DR序列)。

最优选地，所述融合质粒pLenti-DR(hCas6f)-EV的序列如SEQ ID NO.10所示。

基于上述优化的PaeCascade效应蛋白以及构建的多种融合质粒，本发明还提供基于Type I-F CRISPR/Cas的染色质成像系统。具体如下：

一种基于Type I-F CRISPR/Cas的染色质成像系统，包括以下三个组分：

(1)融合质粒I；

(2)融合质粒IV；

(3)融合质粒V。

另外，上述系统在制备染色质成像工具方面的应用，也应在本发明保护范围之内。

另外具体应用时，选取靶向序列或crRNA设计规则是：在目标基因上游寻找满足PAM-SEQ ID NO.6’-CC-3’特征的后32-56bp作为靶向序列。即crRNA的长度为32-56nt。

更优选地，是在目标基因上游100-200bp处寻找满足PAM-SEQ ID NO.6’-CC-3’特征的后32-56bp作为靶向序列。即优选地crRNA的长度为32-56nt。

更优选地，是在目标基因上游100-200bp处寻找满足PAM-SEQ ID NO.6’-CC-3’特征的后44-56bp作为靶向序列。即优选地crRNA的长度为44-56nt。

更优选地，是在目标基因上游100-200bp处寻找满足PAM-SEQ ID NO.6’-CC-3’特征的后48-56bp作为靶向序列。即优选地crRNA的长度为48-56nt。

最优选地，是在目标基因上游100-200bp处寻找满足PAM-SEQ ID NO.6’-CC-3’特征的后50-56bp作为靶向序列。即优选地crRNA的长度为50-56nt。

最后，作为一种可选择的具体实施方案，基于上述优化构建的染色质成像系统，进行染色质成像的方法包括如下步骤：

(1)选取目标基因中靶向序列，将靶向序列插入质粒pLenti-DR(hCas6f)-EV(SEQID NO.10)中构建得到crRNA靶向质粒；

(2)将上述crRNA靶向质粒、融合质粒I、融合质粒IV共同转染细胞。

优选地，步骤(1)中靶向序列选择或crRNA设计规则如上文所述。

优选地，步骤(2)中crRNA靶向质粒、融合质粒I、融合质粒IV以1:1:1摩尔比进行转染。

优选地，步骤(2)中细胞可用HEK293T细胞。

本发明具有以下有益效果：

本发明对PaeCascade系统进行了哺乳动物表达系统优化，使得其在哺乳动物细胞内具有双链DNA结合活性。同时将荧光蛋白融合表达至优化后的PaeCascade上，进行了PaeCascade染色质成像系统的构建、优化和活性检测。

本发明提供了一种新型的PaeCascade哺乳细胞染色质成像系统，使得PaeCascade系统在哺乳动物细胞的染色质成像方面的应用成为可能，为I型CRISPR基因成像工具的开发成为可能，并为基于PaeCascade的染色质成像提供了必要工具。

和现有基于dCas9的成像系统相比，本发明的PasCascade-mScarlett染色质成像系统可同时将6个分子的mScarlett荧光蛋白信号富集于染色质特定区域，单一个效应复合体即可增强染色质成像效果。

本发明利用的PaeCascade系统其crRNA识别靶序列需32个碱基，对比于已有Cas9的20个碱基配对的gRNA长度更长。由于其识别序列所需碱基更长，因此PaeCascade系统对序列识别的要求更严谨，会有更强的特异性。

附图说明

图1为PaeCascade-mScarlett对HEK293T端粒位点的显示成像。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

除非另有说明，本发明的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，这些在本领域的技能之内。参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR2:实用方法》(PCR 2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))、哈洛(Harlow)和拉内(Lane)编辑(1988)《抗体：实验室手册》(ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL)，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。

如下述实施例中所用的细胞培养所需培养基、转染所需optimem购买与Thermo公司。血清购买自Excell公司。RNA提取试剂RNAiso和TB Green II反转录试剂、qPCR试剂盒购买TAKARA公司。Phusion DNA聚合酶、涉及的内切酶、T4连接酶购买自Thermo公司。PCRclean up和凝胶回收试剂盒均购买自Qiagen公司。

实施例1 PaeCascade的序列优化

PaeCascade序列来源于Pseudomonas aeruginosa的I-F型CRISPR复合体。Jennifer A.Doudna团队于2011年在《Proc Natl Acad Sci》发表的一篇题为“RNA-guidedcomplex from a bacterial immune system enhances target recognition throughseed sequence interactions”的文章，其中报导PaeCascade可在体外结合dsDNA序列。其来源菌种为Pseudomonas aeruginosa。

由于PaeCascade位点4个蛋白(Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1、Cas6f)所在序列为受原核多顺反子调控，为原核偏好密码子编码序列(SEQ ID NO.1)。因而，为促进PaeCascade在哺乳动物细胞的表达，应对其序列特征进行优化改造。改造原则有三：1)拆分出单个蛋白，每个进行哺乳动物密码子优化；2)去除意外的真核转录终止信号；3)加入真核核定位信号。

就每个序列而言，其序列优化以http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/软件进行处理，多余真核转录终止信号以http://dnafsminer.bic.nus.edu.sg/PolyA.html进行检索并排除，最后加入真核核定位信号，对优化前后序列进行表达量差异分析，从Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1、Cas6f原序列得到hCas8f1(SEQ ID NO.2)、hCas5f1(SEQ ID NO.3)、hCas7f1(SEQ ID NO.4)、hCas6f(SEQ ID NO.5)序列。

将mScarlett转录抑制因子融合表达至hCas7f1 C端，构建为hCas7f1-mScarlett(SEQ ID NO.6)元件。

实施例2构建重组质粒

1、构建重组质粒pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1(序列如SEQ ID NO.7所示)

通过AscI与MluI酶切位点和NotI与HindIII酶切位点分别连于改良的pxCMV质粒，将含NLS序列(PKKKRKV)的hCas8f1、hCas5f1连接并构建pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1质粒(SEQ ID NO.7)。

所用的改良pxCMV来源于px601质粒，其中在CMV启动子后加入AscI酶切位点，将PGK启动子、NotI酶切位点通过原KpnI和HindIII位点插入构建。

2、构建重组质粒pxCMV-hCas6f-PGK-hCas7f1(序列如SEQ ID NO.8所示)：

通过AscI与MluI酶切位点和NotI与HindIII酶切位点分别连于改良的pxCMV质粒，将含NLS序列(PKKKRKV)的hCas7f1、hCas6f连接并构建pxCMV-hCas6f-PGK-hCas7f1质粒(SEQ ID NO.8)。

所用的改良pxCMV来源于px601质粒，其中在CMV启动子后加入AscI酶切位点，将PGK启动子、NotI酶切位点通过原KpnI和HindIII位点插入构建。

3、构建重组质粒pxCMV-hCas7f1-mScarlett-PGK-hCas6f(序列如SEQ ID NO.9所示)：

通过AscI与MluI酶切位点和NotI与HindIII酶切位点分别连于改良的pxCMV质粒，将hCas7f1、hCas6f和荧光蛋白mScarlett连接并构建pxCMV-hCas7f1-mScarlett-PGK-hCas6f(序列如SEQ ID NO.9所示)。

所用的改良pxCMV来源于px601质粒，其中在CMV启动子后加入AscI酶切位点，将PGK启动子、NotI酶切位点通过原KpnI和HindIII位点插入构建。

4、构建重组质粒pLenti-DR(hCas6f)-EV(序列如SEQ ID NO.10所示)：

PaeCascade crRNA骨架(Direct Repeat，DR)序列来源于Pseudomonasaeruginosa内源CRISPR repeat序列。

其中通过BsmBI和EcoRI酶切位点将crRNA克隆序列插入至Lenti gRNA puro载体中。

Direct Repeat序列：gttcactgccgtataggcagctaagaaa

crRNA克隆序列：Ggttcactgccgtataggcagctaagaaa TGAGACGGCAGCCAGGGATCCTATCCGTCTCA gttcactgccgtataggcagctaagaaaTTTTTTTg

实施例1、2中序列用于以下系统的构建，序列来源为合成序列。

实施例3构建PaeCascade-mScarlett染色质成像系统

PaeCascade-KRAB转录抑制系统包括：

(1)pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1质粒(SEQ ID NO.7)，

(2)pxCMV-hCas7f1-mScarlett-PGK-hCas6f质粒(SEQ ID NO.9)，

(3)crRNA表达质粒为pLenti-DR(hCas6f)-EV(SEQ ID NO.10)。

实施例4PaeCascade-mScarlett成像指示哺乳动物内端粒位点

实验方法：在目标靶点(如端粒序列)处寻找满足PAM-SEQ ID NO.6’-CC-3’特征的后32bp作为靶向序列。通过BsmBI酶切的方法将靶向序列插入至pLenti-DR(hCas6f)-EV(SEQ ID NO.10)中，构建出crRNA靶向质粒。将crRNA靶向质粒和pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1质粒(SEQ ID NO.7)、pxCMV-hCas7f1-mScarlett-PGK-hCas6f质粒(SEQ ID NO.9)以1:1:1摩尔比转染至以电转染或其他转染试剂后转染方法转染至HEK293T细胞中。转染后以荧光显微镜进行成像拍照。

本实施例以POT1为目标靶点，利用PaeCascade-mScarlett染色质成像系统进行哺乳动物内端粒位点的成像指示实验。具体操作如下：

将1μg含有靶向端粒位点靶向增强子位点的crRNA靶向质粒，以及1μg质粒pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1(SEQ ID NO.7)和1μg pxCMV-hCas7f1-mScarlett-PGK-hCas6f质粒(SEQ ID NO.9)以PEI转染方式转染HEK293T细胞。转染后48h以POT1指示端粒，以荧光显微镜拍摄PaeCascade-mScarlett在端粒的成像效果。其中以非靶向序列作为空白对照。

结果如图1，PaeCascade-mScarlett可和POT1有共定位，指示细胞中端粒序。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 一种基于Type I-F CRISPR/Cas的染色质成像方法和染色质成像系统

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3881

<212> DNA

<213> PaeCascade

<400> 1

atgacctctc ccctcccaac gcctacgtgg caggagcttc gccagttcat cgaatccttc 60

atccaggagc gcctccaggg caagctggac aaactccaac ccgacgaaga cgacaagcgc 120

cagacattgc tggccaccca ccggcgggag gcctggctgg ccgatgccgc ccggcgggtt 180

ggccagttgc agttggtgac ccacacgctc aagccgatcc atcccgacgc ccgcggcagc 240

aacctgcaca gcctgccgca agcacccggc caaccgggcc tcgccggttc ccatgagcta 300

ggtgacaggc tggtcagcga tgtggtgggc aatgccgcgg cgctggacgt attcaagttt 360

ctcagtctcc agtatcaggg taaaaatctt ctgaactggc tgacagaaga cagtgccgag 420

gcattacagg cgctgtccga taacgccgaa caggctcgcg aatggcggca agcgttcatc 480

ggcatcacga ccgtcaaagg cgctcccgcg tcccacagcc tggccaagca gttgtacttt 540

cccctgcccg gttccggcta ccacctgcta gcaccgctgt ttcccaccag tctggtgcat 600

cacgtccacg ctctgctccg cgaagcgcgc ttcggcgacg cggccaaggc ggcacgcgaa 660

gcgcgcagcc gccaggagtc atggccccac ggattcagcg agtaccccaa cctggcgatc 720

cagaagttcg gcggtaccaa gccgcagaac atcagtcagt tgaacaacga gcgccgtggc 780

gagaactggt tgctgccatc gcttccgccg aactggcaaa ggcagaatgt aaacgcgccg 840

atgcggcact cttcggtctt cgagcatgac ttcggaagaa ctcctgaagt atcccgccta 900

acccgtaccc tgcagcgttt tcttgccaag acagtccata acaacctcgc catccgccag 960

cggcgtgccc aattggtggc gcaaatctgc gacgaagccc tgcaatacgc cgcccgtctg 1020

cgcgaactgg agcccggctg gagcgcaacc cccgggtgcc aactgcatga cgcggagcag 1080

ctctggctcg atccgttgcg cgcacagacc gatgagacgt tcttgcagcg ccgactacga 1140

ggtgactggc ctgccgaggt cggaaatcgc ttcgccaact ggctgaaccg ggcggtcagc 1200

agcgacagtc agatactggg tagcccggaa gccgcccaat ggagccagga gctgagcaag 1260

gaactgacga tgttcaagga gatactcgaa gatgagcgtg actgatcccg aggcgctgct 1320

gttgctgcca cgcctgtcca tccagaacgc caacgccatt tccagcccct tgacctgggg 1380

tttcccttcg cccggcgctt tcaccggatt cgtccatgcc ttgcagcgtc gagtcggaat 1440

ctccctcgat atcgaactgg acggtgtcgg catcgtctgt caccgcttcg aagcgcagat 1500

atcgcaaccg gccggcaagc gcaccaaggt cttcaacctg acccgcaatc cgctgaaccg 1560

cgacggctcc accgcagcca tcgtcgaaga aggtcgcgcc catctggagg tcagtctgct 1620

gctcggagtg catggcgatg gtctggacga tcaccccgca caggaaatcg ccaggcaggt 1680

acaggagcag gctggcgcca tgcgcctcgc cggtggcagc atcctgccct ggtgcaatga 1740

gcgcttcccg gctccgaacg ccgaactgct gatgctgggt ggcagcgacg aacagcggcg 1800

caagaaccag cgccggctta cccgccgcct gctccccggc ttcgccctgg tgagtcgcga 1860

ggcgttgttg caacaacatc tggaaacctt gcgcaccacg ctccccgaag ccaccacgct 1920

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gatcccggct ggctacaacg ccctgtcacc cctgtacctc cccggcgaag tgcgaaatgc 2100

ccgtgataga gaaacaccgc tgcgcttcgt cgaaaacctc ttcggtctgg gcgaatggct 2160

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ggccggccgt gaccgtgcgc gagaagtccg tacgcggcac catctccaac cgcctcaaga 2460

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aaggccagaa gagcaagacc ctgtacagcg tacgcgatgc cgcggccatc cactcgcaga 3060

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ccatcgccgt ggagccctac ggctccgtca catcccaggg caaagcctat cgccagccca 3180

agcagaagct ggacttctat acgctgctcg acaactgggt actgcgcgac gaggcgcccg 3240

ccgtggagca acagcattat gtgatcgcca acctgatccg tggcggcgtg ttcggtgaag 3300

ccgaagagaa gtaagccatg gaccactacc tcgacattcg cttgcgaccg gacccggaat 3360

ttcccccggc gcaactcatg agcgtgctct tcggcaagct ccaccaggcc ctggtggcac 3420

agggcgggga caggatcggc gtgagcttcc ccgacctcga cgaaagccgc tcccggctgg 3480

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caccgtaccg tcaggtcagt cgggttcagg cgaaaagcaa tccggaacgc ctgcggcggc 3660

ggctcatgcg ccggcacgat ctgagtgagg aggaggctcg gaaacgcatt cccgatacgg 3720

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tccgtctctt catccgccac gggccgttgc aggtgacggc agaggaagga ggattcacct 3840

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<210> 2

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<212> DNA

<213> hCas8f1

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cgccagttca tcgaatcctt catccaggag cgcctccagg gcaagctgga caaactccaa 120

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catcccgacg cccgcggcag caacctgcac agcctgccgc aagcacccgg ccaaccgggc 300

ctcgccggtt cccatgagct aggtgacagg ctggtcagcg atgtggtggg caatgccgcg 360

gcgctggacg tattcaagtt tctcagtctc cagtatcagg gtaaaaatct tctgaactgg 420

ctgacagaag acagtgccga ggcattacag gcgctgtccg ataacgccga acaggctcgc 480

gaatggcggc aagcgttcat cggcatcacg accgtcaaag gcgctcccgc gtcccacagc 540

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caactgcatg acgcggagca gctctggctc gatccgttgc gcgcacagac cgatgagacg 1140

ttcttgcagc gccgactacg aggtgactgg cctgccgagg tcggaaatcg cttcgccaac 1200

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<212> DNA

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atgcctaaga agaagagaaa agtgagcgtg actgatcccg aggcgctgct gttgctgcca 60

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gccggcaagc gcaccaaggt cttcaacctg acccgcaatc cgctgaaccg cgacggctcc 300

accgcagcca tcgtcgaaga aggtcgcgcc catctggagg tcagtctgct gctcggagtg 360

catggcgatg gtctggacga tcaccccgca caggaaatcg ccaggcaggt acaggagcag 420

gctggcgcca tgcgcctcgc cggtggcagc atcctgccct ggtgcaatga gcgcttcccg 480

gctccgaacg ccgaactgct gatgctgggt ggcagcgacg aacagcggcg caagaaccag 540

cgccggctta cccgccgcct gctccccggc ttcgccctgg tgagtcgcga ggcgttgttg 600

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gctcgcgcct ggcgcttcga cgccctggcc atcggcttgc gcgacttcaa ggccgacgcc 600

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ctgatcctcg acaaaggcga caagaaaggc cagaagagca agaccctgta cagcgtacgc 780

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<212> DNA

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aagtaa 726

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<212> DNA

<213> hCas7f1-mScarlett

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atgccgaaga agaagaggaa agtttccaat gcatccaagc caatactgag caccgcttcc 60

gtcctcgcct tcgaacgtaa gctcgaccct tccgacgccc ttatgagcgc tggcgcctgg 120

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atccgtggcg gcgtgttcgg tgaagccgaa gagaagacgc gtatggtgag caagggcgag 1080

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gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag 1200

ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc ttctcctggg acatcctgtc ccctcagttc 1260

atgtacggct ccagggcctt catcaagcac cccgccgaca tccccgacta ctataagcag 1320

tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc gtgatgaact tcgaggacgg cggcgccgtg 1380

accgtgaccc aggacacctc cctggaggac ggcaccctga tctacaaggt gaagctccgc 1440

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tccaccgagc ggttgtaccc cgaggacggc gtgctgaagg gcgacattaa gatggccctg 1560

cgcctgaagg acggcggccg ctacctggcg gacttcaaga ccacctacaa ggccaagaag 1620

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gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 540

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tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 660

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attcgtccat gccttgcagc gtcgagtcgg aatctccctc gatatcgaac tggacggtgt 960

cggcatcgtc tgtcaccgct tcgaagcgca gatatcgcaa ccggccggca agcgcaccaa 1020

ggtcttcaac ctgacccgca atccgctgaa ccgcgacggc tccaccgcag ccatcgtcga 1080

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cgccggtggc agcatcctgc cctggtgcaa tgagcgcttc ccggctccga acgccgaact 1260

gctgatgctg ggtggcagcg acgaacagcg gcgcaagaac cagcgccggc ttacccgccg 1320

cctgctcccc ggcttcgccc tggtgagtcg cgaggcgttg ttgcaacaac atctggaaac 1380

cttgcgcacc acgctccccg aagccaccac gctcgatgca ctgctcgatc tttgtcgaat 1440

caacttcgag cctcctgcaa cctcgtccga agaagaagca tcgccgcccg atgcagcctg 1500

gcaagtgcgc gacaagcccg gctggctggt gccgatcccg gctggctaca acgccctgtc 1560

acccctgtac ctccccggcg aagtgcgaaa tgcccgtgat agagaaacac cgctgcgctt 1620

cgtcgaaaac ctcttcggtc tgggcgaatg gctcagcccc catcgcgtcg ccgcgttatc 1680

ggacctgctt tggtatcacc acgccgagcc tgacaaaggg ctctaccgct ggagcacacc 1740

ccgtttcgtc gaacacgcca tcgcaggatc ctacccatac gatgttccag attacgctta 1800

cccatacgat gttccagatt acgcttaccc atacgatgtt ccagattacg cttaagaatt 1860

cctagagctc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc 1920

ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa 1980

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gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gagaatagca ggcatgctgg ggaggtaccg 2100

ggtaggggag gcgcttttcc caaggcagtc tggagcatgc gctttagcag ccccgctggg 2160

cacttggcgc tacacaagtg gcctctggcc tcgcacacat tccacatcca ccggtaggcg 2220

ccaaccggct ccgttctttg gtggcccctt cgcgccacct tctactcctc ccctagtcag 2280

gaagttcccc cccgccccgc agctcgcgtc gtgcaggacg tgacaaatgg aagtagcacg 2340

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cggaggcccg gcattctgca cgcttcaaaa gcgcacgtct gccgcgctgt tctcctcttc 2580

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gggttggcca gttgcagttg gtgacccaca cgctcaagcc gatccatccc gacgcccgcg 2880

gcagcaacct gcacagcctg ccgcaagcac ccggccaacc gggcctcgcc ggttcccatg 2940

agctaggtga caggctggtc agcgatgtgg tgggcaatgc cgcggcgctg gacgtattca 3000

agtttctcag tctccagtat cagggtaaaa atcttctgaa ctggctgaca gaagacagtg 3060

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tcatcggcat cacgaccgtc aaaggcgctc ccgcgtccca cagcctggcc aagcagttgt 3180

actttcccct gcccggttcc ggctaccacc tgctagcacc gctgtttccc accagtctgg 3240

tgcatcacgt ccacgctctg ctccgcgaag cgcgcttcgg cgacgcggcc aaggcggcac 3300

gcgaagcgcg cagccgccag gagtcatggc cccacggatt cagcgagtac cccaacctgg 3360

cgatccagaa gttcggcggt accaagccgc agaacatcag tcagttgaac aacgagcgcc 3420

gtggcgagaa ctggttgctg ccatcgcttc cgccgaactg gcaaaggcag aatgtaaacg 3480

cgccgatgcg gcactcttcg gtcttcgagc atgacttcgg aagaactcct gaagtatccc 3540

gcctaacccg taccctgcag cgttttcttg ccaagacagt ccataacaac ctcgccatcc 3600

gccagcggcg tgcccaattg gtggcgcaaa tctgcgacga agccctgcaa tacgccgccc 3660

gtctgcgcga actggagccc ggctggagcg caacccccgg gtgccaactg catgacgcgg 3720

agcagctctg gctcgatccg ttgcgcgcac agaccgatga gacgttcttg cagcgccgac 3780

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tcagcagcga cagtcagata ctgggtagcc cggaagccgc ccaatggagc caggagctga 3900

gcaaggaact gacgatgttc aaggagatac tcgaagatga gcgtgaccaa gcttgcgact 3960

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agtaagggcc cgtgtaggct agtcgagcag acatgataag atacattgat gagtttggac 4080

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cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcctgcag 4320

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gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 5400

tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 5460

acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 5520

aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 5580

cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 5640

gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 5700

cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 5760

tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 5820

tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 5880

gaagccgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 5940

tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 6000

gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 6060

ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 6120

tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 6180

agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 6240

aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 6300

cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 6360

agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 6420

tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 6480

gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 6540

gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 6600

ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 6660

gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 6720

ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 6780

ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 6840

acatgt 6846

<210> 10

<211> 7350

<212> DNA

<213> pLenti-DR(hCas6f)-EV质粒

<400> 10

ttaatgtagt cttatgcaat actcttgtag tcttgcaaca tggtaacgat gagttagcaa 60

catgccttac aaggagagaa aaagcaccgt gcatgccgat tggtggaagt aaggtggtac 120

gatcgtgcct tattaggaag gcaacagacg ggtctgacat ggattggacg aaccactgaa 180

ttgccgcatt gcagagatat tgtatttaag tgcctagctc gatacataaa cgggtctctc 240

tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaag 300

cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct 360

ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag cagtggcgcc 420

cgaacaggga cttgaaagcg aaagggaaac cagaggagct ctctcgacgc aggactcggc 480

ttgctgaagc gcgcacggca agaggcgagg ggcggcgact ggtgagtacg ccaaaaattt 540

tgactagcgg aggctagaag gagagagatg ggtgcgagag cgtcagtatt aagcggggga 600

gaattagatc gcgatgggaa aaaattcggt taaggccagg gggaaagaaa aaatataaat 660

taaaacatat agtatgggca agcagggagc tagaacgatt cgcagttaat cctggcctgt 720

tagaaacatc agaaggctgt agacaaatac tgggacagct acaaccatcc cttcagacag 780

gatcagaaga acttagatca ttatataata cagtagcaac cctctattgt gtgcatcaaa 840

ggatagagat aaaagacacc aaggaagctt tagacaagat agaggaagag caaaacaaaa 900

gtaagaccac cgcacagcaa gcggccgctg atcttcagac ctggaggagg agatatgagg 960

gacaattgga gaagtgaatt atataaatat aaagtagtaa aaattgaacc attaggagta 1020

gcacccacca aggcaaagag aagagtggtg cagagagaaa aaagagcagt gggaatagga 1080

gctttgttcc ttgggttctt gggagcagca ggaagcacta tgggcgcagc gtcaatgacg 1140

ctgacggtac aggccagaca attattgtct ggtatagtgc agcagcagaa caatttgctg 1200

agggctattg aggcgcaaca gcatctgttg caactcacag tctggggcat caagcagctc 1260

caggcaagaa tcctggctgt ggaaagatac ctaaaggatc aacagctcct ggggatttgg 1320

ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact gctgtgcctt ggaatgctag ttggagtaat 1380

aaatctctgg aacagatttg gaatcacacg acctggatgg agtgggacag agaaattaac 1440

aattacacaa gcttaataca ctccttaatt gaagaatcgc aaaaccagca agaaaagaat 1500

gaacaagaat tattggaatt agataaatgg gcaagtttgt ggaattggtt taacataaca 1560

aattggctgt ggtatataaa attattcata atgatagtag gaggcttggt aggtttaaga 1620

atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc agggatattc accattatcg 1680

tttcagaccc acctcccaac cccgagggga cccagagagg gcctatttcc catgattcct 1740

tcatatttgc atatacgata caaggctgtt agagagataa ttagaattaa tttgactgta 1800

aacacaaaga tattagtaca aaatacgtga cgtagaaagt aataatttct tgggtagttt 1860

gcagttttaa aattatgttt taaaatggac tatcatatgc ttaccgtaac ttgaaagtat 1920

ttcgatttct tggctttata tatcttgtgg aaaggacgaa acaccggttc actgccgtat 1980

aggcagctaa gaaatgagac ggcagccagg gatcctatcc gtctcagttc actgccgtat 2040

aggcagctaa gaaaactttt tttgaattct agatcttgag acaaatggca gtattcatcc 2100

acaattttaa aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca 2160

taatagcaac agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa attcaaaatt 2220

ttcgggttta ttacagggac agcagagatc cactttggcg ccggctcgag tggctccggt 2280

gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc 2340

ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg 2400

tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc 2460

gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtgtcgtg acgcgggatc 2520

ctagcggcag cggcgccacc aacttcagcc tgctgaagca ggccggcgac gtggaggaga 2580

accccggccc catgaccgag tacaagccca cggtgcgcct cgccacccgc gacgacgtcc 2640

ccagggccgt acgcaccctc gccgccgcgt tcgccgacta ccccgccacg cgccacaccg 2700

tcgatccgga ccgccacatc gagcgggtca ccgagctgca agaactcttc ctcacgcgcg 2760

tcgggctcga catcggcaag gtgtgggtcg cggacgacgg cgcggccgtg gcggtctgga 2820

ccacgccgga gagcgtcgaa gcgggggcgg tgttcgccga gatcggcccg cgcatggccg 2880

agttgagcgg ttcccggctg gccgcgcagc aacagatgga aggcctcctg gcgccgcacc 2940

ggcccaagga gcccgcgtgg ttcctggcca ccgtcggagt ctcgcccgac caccagggca 3000

agggtctggg cagcgccgtc gtgctccccg gagtggaggc ggccgagcgc gccggggtgc 3060

ccgccttcct ggagacctcc gcgccccgca acctcccctt ctacgagcgg ctcggcttca 3120

ccgtcaccgc cgacgtcgag gtgcccgaag gaccgcgcac ctggtgcatg acccgcaagc 3180

ccggtgcctg aacgcgttaa gtcgacaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat 3240

tgactggtat tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc 3300

ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct 3360

ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca 3420

ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt 3480

ccgggacttt cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg 3540

cccgctgctg gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga 3600

aatcatcgtc ctttccttgg ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt 3660

ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc 3720

cggctctgcg gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt 3780

gggccgcctc cccgcgtcga ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg tagatcttag 3840

ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggctaatt cactcccaac gaagacaaga 3900

tctgcttttt gcttgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc 3960

tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt 4020

agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc 4080

agtgtggaaa atctctagca gtacgtatag tagttcatgt catcttatta ttcagtattt 4140

ataacttgca aagaaatgaa tatcagagag tgagaggaac ttgtttattg cagcttataa 4200

tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca 4260

ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctggc tctagctatc 4320

ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc 4380

catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta 4440

ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggga cgtacccaat tcgccctata 4500

gtgagtcgta ttacgcgcgc tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 4560

ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata 4620

gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggg 4680

acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg 4740

ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca 4800

cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta 4860

gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc 4920

catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg 4980

gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat 5040

aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta 5100

acgcgaattt taacaaaata ttaacgctta caatttaggt ggcacttttc ggggaaatgt 5160

gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag 5220

acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca 5280

tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc 5340

agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat 5400

cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 5460

aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg 5520

gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc 5580

agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat 5640

aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga 5700

gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc 5760

ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc 5820

aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt 5880

aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc 5940

tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc 6000

agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca 6060

ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca 6120

ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 6180

ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 6240

acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 6300

agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 6360

ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 6420

cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 6480

gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 6540

cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc 6600

gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 6660

caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 6720

aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 6780

tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 6840

gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 6900

ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt 6960

atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg 7020

cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg 7080

caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc 7140

cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc 7200

accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata 7260

acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagcgcgcaa ttaaccctca 7320

ctaaagggaa caaaagctgg agctgcaagc 7350

Claims (3)

1.一种利用隶属于Type I-F CRISPR/Cas系统的PaeCascade复合物进行染色质成像的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)对PaeCascade复合物的Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1和Cas6f分别进行适应编辑对象的优化，优化后的Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1、Cas6f分别记为hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1和hCas6f，hCas8f1的序列如SEQ ID NO.2所示，hCas5f1的序列如SEQ ID NO.3所示，hCas7f1的序列如SEQ ID NO.4所示，hCas6f的序列如SEQ ID NO.5所示；

(2)选取目标基因中靶向序列，将靶向序列插入表达载体中构建crRNA靶向质粒；所述靶向序列的选取或crRNAd的设计规则是：在目标基因上游寻找满足PAM-SEQ ID NO.6’-CC-3’特征的后32～56bp作为靶向序列，即crRNA的长度为50～56nt；

(3)将hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1和hCas6f中任两个与启动子共同插入表达载体构建融合质粒I；

(4)将hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1和hCas6f中任两个与启动子和荧光蛋白共同插入表达载体构建融合质粒IV；

(5)将上述crRNA靶向质粒和融合质粒I、融合质粒IV共同转染细胞。

2.一种基于Type I-F CRISPR/Cas的染色质成像系统，其特征在于，包括以下三个组分：

(1)融合质粒I，所述融合质粒I为核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1，或所述融合质粒I为核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的pxCMV-hCas6f-PGK-hCas7f1；

(2)融合质粒IV，所述融合质粒IV为核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的pxCMV-hCas7f1-mScarlett-PGK-hCas6f；

(3)融合质粒V，所述融合质粒V为核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的pLenti-DR(hCas6f)-EV。

3.权利要求2所述系统在制备染色质成像工具方面的应用。

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