RU2761637C1 - Штамм клеток Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующих сайт-специфическую рекомбиназу Cre - Google Patents
Штамм клеток Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующих сайт-специфическую рекомбиназу Cre Download PDFInfo
- Publication number
- RU2761637C1 RU2761637C1 RU2020144117A RU2020144117A RU2761637C1 RU 2761637 C1 RU2761637 C1 RU 2761637C1 RU 2020144117 A RU2020144117 A RU 2020144117A RU 2020144117 A RU2020144117 A RU 2020144117A RU 2761637 C1 RU2761637 C1 RU 2761637C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cre
- protein
- nls
- recombinant
- 6his
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области генной инженерии и молекулярной биологии, в частности к рекомбинантной плазмиде pET32v11-Cre, обеспечивающей синтез рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre. Изобретение также раскрывает штамм клеток Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre и способ получения указанного белка 6His-S-NLS-Cre с помощью указанного штамма. Плазмида согласно изобретению обеспечивает синтез указанного рекомбинантного белка в клетках Escherichia coli за счет расположения гена рекомбиназы Cre в 3’-области относительно T7 промотора и lac оператора и в 5’-области относительно T7 терминатора и получена путем клонирования кДНК рекомбиназы Cre в вектор pET32v11, таким образом, чтобы кДНК рекомбиназы Cre с N-концевой NLS находилась в одной рамке считывания с 6-гистидиновым и S-эпитопами и аминокислотными последовательностями сайтов расщепления тромбина, энтерокиназы и протеазы TEV. Может быть использовано для продукции рекомбинантной сайт-специфической рекомбиназы Cre. Настоящее изобретение позволяет получить каталитически активную рекомбиназу Cre с высоким выходом. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 пр.
Description
Область техники настоящего изобретения
Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной биологии и представляет собой способ получения штамма генномодифицированного организма, продуцирующего каталитически активную рекомбиназу Cre.
Изобретение создано при финансовой поддержке Министерства Науки и Высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения №075-15-2019-1661 от 31.10.2019.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Система сайт-специфической рекомбинации Cre-LoxP из бактериофага P1, инфицирующего клетки E.coli, получила широкое распространение для геномной инженерии и генетического анализа модельных организмов, позволяя исследовать функции отдельных генов или регуляторных элементов в контексте организма (Branda and Dymecki, 2004; McLellan et al., 2017; Sauer, 1998). Система Cre-LoxP состоит из тирозиновой рекомбиназы Cre и сайтов рекомбинации длиной 34 п.н., называемых LoxP (Sternberg and Hamilton, 1981). Сайт LoxP дикого типа, ATAACTTCGTATAatgtatgcTATACGAAGTTAT, имеет сходную архитектуру с сайтом FRT и состоит из двух инвертированных повторов длиной 13 п.н. (показаны заглавным шрифтом), разделенных ассиметричным спейсером длиной 8 п.н. (показан строчным шрифтом). Нуклеотидная последовательность спейсера определяет ориентацию сайта LoxP в геноме или генетических конструкциях. В природе функция системы Cre-LoxP заключается в циркуляризации генома фага P1 в плазмиду, разделении физически сцепленных кольцевых плазмид и поддержании копийности таких плазмид в клетках E.coli (Austin et al., 1981; et al., 2004). В модельных системах, в зависимости от взаимной ориентации LoxP сайтов в геноме, в результате действия Cre может происходит вырезание, интеграция, инверсия или транслокация фрагментов ДНК.
Для манипуляций с геном клеток млекопитающих in vivo систему Cre-LoxP впервые использовали на модели клеток в культуре (Sauer and Henderson, 1988), и впоследствии на модели трансгенных мышей (Lakso et al., 1992; Orban et al., 1992). К 2017 году было опубликовано более 3000 работ с использованием системы Cre-LoxP (McLellan et al., 2017). Система Cre-LoxP часто используется для создания мышиных моделей кондиционного нокаута генов. В этом случае получают линию трансгенных мышей у которых один или несколько критически важных экзонов гена фланкированы сайтам LoxP (так называемые «floxed» линии мышей). Для индукции нокаута гена такую линию животных скрещивают с «драйверными» линиями трансгенных животных, которые экспрессируют рекомбиназу Cre под контролем убиквитарных, тканеспецифичных или индуцибельных промоторов. В результате действия Cre удаляется фланкированный LoxP сайтами фрагмент генома, что приводит к инактивации целевого гена (McLellan et al., 2017).
К настоящему времени получены и охарактеризованы более двух тысяч «драйверных» линий трансгенных мышей и множество «floxed» линий животных (McLellan et al., 2017). Кроме того, получены репортерные линии мышей, позволяющие оценить эффективность действия Cre по мониторингу экспрессии репортерных генов, таких как β-галактозидаза или Egfp. Многие из этих линий животных доступны для исследователей и депонированы в питомники, например, лабораторию Jackson, а информация о таких линиях мышей может быть найдена на веб-сайте https://mice.jax.org. Таким образом, вот уже почти 30 лет с момента первого применения на модели трансгенных мышей в 1992 году система Cre-LoxP остается крайне востребованной и актуальной для генетического анализа модельных животных, и прежде всего домовой мыши.
Система Cre-LoxP также используется в методе геномной инженерии RMCE (Recombinase Mediated Cassette Exchange, опосредованный-рекомбиназой обмен кассет), который изначально был разработан на основе системы сайт-специфической рекомбинации Flp-FRT (Schlake and Bode, 1994). Практическая возможность использования Cre-LoxP при RMCE основана на идентификации сайтов LoxP с мутированными спейсерными последовательностями, которые могут рекомбинировать только между собой, но не с сайтами LoxP c другими спейсерными последовательностями (Siegel et al., 2001). Как и в случае системы Flp-FRT, использование двух LoxP сайтов с различающимися спейсерами позволяет строго сохранять ориентацию фрагмента ДНК после рекомбинации, и тем самым осуществлять точную замену последовательности ДНК в геноме, фланкированной двумя сайтами LoxP с различными спейсерами, на внесенную в клетку последовательность ДНК, фланкированную такими же сайтами LoxP (Turan et al., 2011; Turan et al., 2013).
Кроме того, на основе системы Cre-LoxP была разработана технология, названная FLEX, применение которой базируется на инверсии фрагментов ДНК. В системе FLEX два репортерных гена фланкированы парами сайтов LoxP с различающимися спейсерами и ориентированы так, что один ген находится под контролем промотора и экспрессируется, а второй ген расположен в обратной ориентации ( et al.). В результате инверсии с использованием одной пары сайтов LoxP прекращается экспрессия первого гена и активируется экспрессия второго гена, после чего с использованием второй пары сайтов LoxP удаляется небольшой фрагмент экспрессионной кассеты. Такая система позволяет осуществлять эффективный мониторинг активности Cre на уровне единичных клеток ( et al.). Технология FLEX находит применение для анализа трансгенных животных. Например, получена линия мышей, несущая в локусе ROSA26 кассету FLEX с Egfp и субъединицей А дифтерийного токсина, которая позволяет за счет Cre-опосредованной рекомбинации активировать экспрессию токсина и тем самым элиминировать определенные популяции клеток в организме мыши (Plummer et al., 2017). Технология Cre-опосредованной рекомбинации с использованием стохастических комбинаций инверсии и удаления фрагментов ДНК была элегантным образом реализована в системе Brainbow для мечения нейронов головного мозга с помощью комбинаций флуоресцентных белков (Cai et al., 2013; Livet et al., 2007).
Появление технологии геномного редактирования с помощью системы CRISPR/Cas9 позволило существенно упростить и ускорить процесс получения трансгенных животных (Low et al., 2016; Singh et al., 2015), что позволяет эффективно получать как новые «драйверные» линии мышей с заданной тканеспецифичностью экспрессии рекомбиназы Cre, так и продуцировать линии животных, несущие в геноме сайты LoxP, для создания кондиционного нокаута гена или проведения RMCE. Это определяет важность пересмотра и оптимизации методов генетического анализа с использованием сайт-специфической рекомбинации. В настоящий момент, все более широкое применение находят технологии редактирования генома без использования ДНК (DNA free genome editing), что, прежде всего, подразумевает доставку в клетки систем редактирования генома в виде рибонуклеопротеинового комплекса белка Cas9 и гидовой РНК (РНП), а не в виде экспрессионных плазмид. Использование РНП более эффективно, снижает риск модификации нецелевых локусов генома и элиминирует возможность случайной интеграции плазмидной ДНК, кодирующей Cas9 и гидовые РНК, в нецелевой сайт генома (Metje-Sprink et al., 2019). Все эти преимущества присущи и использованию сайт-специфических рекомбиназ в виде белков. В частности, первое сообщение о применение рекомбинантного белка Cre для индукции сайт-специфической рекомбинации датируется 1993 годом (Baubonis and Sauer, 1993). Альтернативные способы доставки Cre в клетки млекопитающих подразумевают использование плазмид или мРНК, однако плазмидная ДНК может интегрировать в случайное место генома, что требует дополнительной проверки клеточной линии или модельного организма на предмет интеграции плазмиды. Использование мРНК сайт-специфических рекомбиназ достаточно эффективно (de Wit et al., 1998; Ponsaerts et al., 2004), однако при внесении мРНК требуется время для транскрипции и трансляции белка, что снижает эффективность рекомбинации и, в случае микроинъекций мРНК в зиготы, может способствовать формированию мозаицизма. Кроме того, для экспрессии Cre в соматических клетках организма можно использовать аденовирусы (Akagi et al., 1997). Однако, введение вируса экспериментальным животным может вызвать иммунный ответ, что неприемлемо при исследовании функции генов иммунной системы.
Кроме того, стандартная схема получения животных с кондиционным нокаутом подразумевает скрещивание линии животных, экспрессирующих рекомбиназу Cre, с линией животных, несущих фланкированный LoxP сайтами локус генома (McLellan et al., 2017). Это имеет ряд недостатков. Во-первых, многие линии животных, экспрессирующие Cre, были получены с помощью рандомного трансгенеза, и далеко не все такие линии были охарактеризованы на предмет идентификации сайтов интеграции трансгена и его копийности. Следовательно, в таком случае геном двойных трансгенов с кондиционным нокаутом целевого гена будет нести в одной из хромосом рандомно интегрированные фрагменты ДНК с экспрессионной кассетой для Cre, что может нарушать функции каких-либо генов или некодирующих РНК в месте интеграции трансгена. Помимо этого, имеется достаточно много свидетельств токсичности экспрессии Cre для клеток (McLellan et al., 2017). При получении двойных трансгенных животных в организме таких животных будет экспрессироваться Cre, конститутивно или определенных тканях и органах, что может вызвать токсический эффект, влияя на пролиферацию клеток или внутриклеточные сигнальные пути или за счет неспецифической модификации генома в местах криптических LoxP сайтов.
Таким образом, использование системы сайт-специфической рекомбинации Cre-LoxP является одним из важных экспериментальных подходов функциональной геномики как у млекопитающих, так и других модельных организмов, таких как Drosophila melanogaster (Gurumurthy et al., 2019; McLellan et al., 2017; Sauer, 1998). Учитывая широкое распространение систем сайт-специфической рекомбинации, в том числе Cre-LoxP, для манипуляций с геномами модельных организмов или клеточных линий, актуальным представляется разработка и применение подходов, основанных на использовании рекомбинантного белка Cre. Это позволит повысить эффективность геномной инженерии, расширить арсенал используемых методов, элиминировать риск нецелевой интеграции генетических конструкций для экспрессии Cre в геном клетки-реципиента и минимизировать Cre-ассоциированную токсичность.
Очистка белка Cre
Бактериальные системы экспрессии рекомбинантных белков являются наиболее доступными и эффективными. В природе рекомбиназа Cre кодируется геномом бактериофага P1, инфицирующего клетки E.coli. Это свойство позволяет эффективно продуцировать рекомбинантный белок Cre в клетках E.coli в каталитически активной форме без необходимости в оптимизации кодонного состава (Van Duyne, 2015).
Основные подходы к очистке рекомбинантного белка Cre из бактериальных систем экспрессии можно разделить на методы очистки Cre в нативном виде; методы аффинной очистки Cre, несущей соответствующие эпитопы; методы, комбинирующие аффинную очистку и хроматографические методы очистки нативного белка.
После открытия системы Cre-LoxP был разработан эффективный протокол очистки нативного рекомбинантного белка Cre из бактериальной системы экспрессии (Abremski and Hoess, 1984). В частности, Cre очищали с помощью хроматографии на фосфоцеллюлозной колонке (часто применявшуюся для очистки ДНК-модифицирующих ферментов (Lu and Erickson, 1997)) и гель-фильтрации на носителе Sephadex G-75, что позволяло получить белок с чистотой 98% (Abremski and Hoess, 1984). Данный протокол использовали и в последующих работах (Mack et al., 1992), однако, в этом случае Cre экспрессировали под контролем T7 промотора в штамме E.coli BL21 (DE3), который широко применяется для продукции рекомбинантных белков в настоящее время и был использован в данном изобретении.
Дальнейшая модификация методов очистки нативного белка Cre была описана в работе (Ghosh and Van Duyne, 2002). Cre очищали с помощью комбинации двухстадийной катионообменной хроматографии на колонках SP и Mono S и последующей гидроксиапатитной хроматографии (Ghosh and Van Duyne, 2002). В другой работе нативный белок Cre для последующей кристаллизации очищали с использованием трехстадийной хроматографии на фосфоцеллюлозной колонке P11, катионообменной колонке Mono S и гель-фильтрации на носителе Superdex 200 (Ennifar et al., 2003).
Альтернативные методы очистки Cre основаны на использовании различных аффинных эпитопов. Например, Cre экспрессировали в виде слитого белка с MBP (Maltose binding protein), что позволяло проводить очистку рекомбинантного белка с помощью аффинной хроматографии на амилозной колонке (Kolb and Siddell, 1996). В этой работе Cre модифицировали, добавляя NLS, эпитоп MBP отщепляли с помощью протеазы фактор Xa, а отщепленный белок MBP удаляли с помощью ионообменной хроматографии на колонке с Q-сефарозой. Важно отметить, что N-концевой MBP-эпитоп не влиял на каталитическую активность Cre (Kolb and Siddell, 1996). Данный метод очистки Cre впоследствии использовали для получения рекомбинантного белка, пригодного для микроинъекций в ооциты мыши (Luckow et al., 2009; Shmerling et al., 2005) или слитого с пептидами, обеспечивающими проникновение в клетки млекопитающих (Jo et al., 2001).
Еще один вариант аффинной очистки Cre был основан на использовании белковых элементов интеинов, которые способны обеспечить посттрансляционное отщепление эпитопов от целевого белка без использования протеаз. Cre экспрессировали под контролем T7 промотора в виде слитого белка с интеином из Saccharomyces cerevisiae (Sce VMA интеин) и хитин-связывающим доменом из Bacillus circulans, который обеспечивал аффинную очистку рекомбинантного белка с помощью хитиновой колонки (Cantor and Chong, 2001). Для активации интеин-зависимого отщепления Cre колонку со связанным белком обрабатывали дитиотреитолом (ДТТ). Данный метод позволял получить белок Cre без каких-либо эпитопов используя лишь одностадийную аффинную хроматографию.
Широкое применение для очистки Cre из клеток E.coli нашла металл-хелатная аффинная хроматография в силу своей относительной простоты и эффективности (Block et al., 2009). Для получения рекомбинантного белка Cre c помощью металл-хелатной аффинной хроматографии часто использовали систему экспрессии компании Novagen, плазмидные векторы серии pET или pTriEx и соответствующие бактериальные штаммы, несущие лизоген DE3 (D'Astolfo et al., 2015; Jo et al., 2001; Martin et al., 2002; Peitz et al., 2002). В другом варианте белок Cre c 6-ти гистидиновым эпитопом очищали, используя систему QIAexpressionist (Qiagen) (Santoro and Schultz, 2002).
Кроме того, в качестве аффинного эпитопа для очистки Cre использовали глутатион-S-трансферазу (GST) из организма Schistosoma japonicum, проводя очистку на глутатионовой сефарозе. В частности, получали GST-Cre с последующим протеолитическим отщеплением GST эпитопа с помощью тромбина (Will et al., 2002) или использовали белок без отщепления GST (Jo et al., 2001). Полученный таким образом белок эффективно проникал в клетки млекопитающих в культуре и вызвал сайт-специфическую рекомбинацию. В другой работе Cre продуцировали в бактериальной системе экспрессии в виде слитого с GST белка, что не влияло на способность Cre связываться с LoxP сайтами (Kalinichenko et al., 2017) и позволяло осуществлять специфическую очистку фрагментов ДНК, содержащих LoxP сайты.
Как было отмечено выше, в ряде работ использовали комбинацию аффинной очистки и хроматографических методов очистки нативного белка. Например, Cre с N-концевым 6-гистидиновым эпитопом экспрессировали в векторе pET28b (Novagen) и очищали с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии и последующей катионообменной хроматографии. Полученный таким образом белок кристаллизовали в комплексе с олигонуклеотидными субстратами (Martin et al., 2002).
Актуальность получения каталитически активной формы Cre из бактериальной системы экспрессии иллюстрируется коммерческим использованием таких белков. Например, полученный из E.coli рекомбинантный белок Cre, слитый с Tat-пептидом вируса ВИЧ, и способный проникать в клетки без использования специальных реагентов для трансфекции белков, в настоящий момент коммерчески доступен от компаний Merck (https://www.merckmillipore.com/RU/ru/product/TAT-CRE-Recombinase,MM_NF-SCR508?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F) и Excellgen (https://www.excellgen.com/stem-cell-reagents-c-13/cre-recombinase-tatcre-tatnlscre-htnc-htncre-p-52931.html).
Учитывая опубликованные ранее данные, получение рекомбинантного белка Cre в бактериальной системе экспрессии представляется наиболее оптимальным подходом. Описанный в данном изобретении белок Cre несет NLS и продуцируется слитым с N-концевыми 6-гистидиновым и S-эпитопами, которые при необходимости могут быть отщеплены с использованием TEV протеазы. Как показано на Фиг.6, рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre, несущий N-концевые эпитопы, активен in vitro, что соответствует данными из работы (Kolb and Siddell, 1996) об отсутствии влияние N-концевых эпитопов на активность Cre. Использованный в данном изобретении метод очистки Cre основан на комбинации металл-хелатной аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе и катионообменной хроматографии на колонке Mono S.
In vitro
анализ активности рекомбиназы Cre
Рекомбиназа Cre способна катализировать реакцию сайт-специфической рекомбинации in vitro. Тест на рекомбинацию с использованием в качестве субстрата кольцевой формы плазмидной ДНК, несущей сайты LoxP, впервые был реализован с использованием клеточного лизата E.coli, содержащего белок Cre (Abremski et al., 1983), а затем и с использованием очищенного рекомбинантного белка Cre (Abremski and Hoess, 1984). В качестве субстрата в реакции рекомбинации можно использовать кольцевую суперскрученную плазмидную ДНК, линейные фрагменты ДНК или кольцевые молекулы с никами (Abremski et al., 1983). Основные принципы проведения теста на рекомбинацию были описаны в работе Abremski и коллег (Abremski and Hoess, 1984). В частности, реакционный буфер для Cre включал 50 мМ Трис pH=7.5, 33 мМ NaCl, 5 мМ спермидин и 500 мкг/мл БСА, при этом спермидин в реакционном буфере может быть замен на 10 мМ MgCl2. Для прохождения реакции не требуется источников энергии, достаточно лишь солевого буфера и 10 мМ MgCl2 В качестве субстрата используется кольцевая плазмида, из которой в результате действия Cre формируются два кольцевых продукта реакции, которые для удобства детекции линеаризуются с помощью эндонуклеаз рестрикции и анализируются с помощью электрофореза в агарозном геле. Для терминации реакции смесь нагревают до +70°С для инактивации Cre.
Начиная с 1984 года in vitro тест для оценки активности рекомбинантного белка Cre применялся во множестве работ в разных форматах с некоторыми модификациями, наиболее часто протокол и состав реакционного буфера основывался на работе Abremski и коллег (Abremski and Hoess, 1984). Как правило, варьировали формат субстрата для реакции, используя кольцевые плазмиды, линеаризованные плазмиды, короткие синтетические двухцепочечные молекулы ДНК. Для количественной оценки реакции в некоторых случаях проводили радиоактивное мечение субстрата. В работе Kolb и коллег использовали два типа реакций: вырезание из кольцевой плазмиды фрагмента ДНК, фланкированного LoxP сайтами, и слияние двух кольцевых плазмид, несущих по одному LoxP сайту. Реакционный буфер включал 10 мМ Трис pH=7.5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2 и 1 мМ ДТТ (Kolb and Siddell, 1996).
В других работах в качестве субстрата использовали линеаризованную плазмиду, из которой под действием Cre вырезается фрагмент ДНК, и формируются укороченный линейный фрагмент и кольцевая молекула ДНК (Cantor and Chong, 2001; Ghosh and Van Duyne, 2002; Santoro and Schultz, 2002). Реакционная смесь содержала 20 мМ Трис pH=7.5, 300 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0.1% β-меркаптоэтанол и 0.5 нМ субстрата и 1000 нМ Cre (Santoro and Schultz, 2002). В других работах использовали 50 мМ Трис pH=7.5, 33 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2 (Cantor and Chong, 2001); 50 мМ Трис, pH=7.5, 50 мМ NaCl, 5 мМ спермина гидрохлорида, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ и 100 мкг/мл БСА или 50 мМ Трис pH 7.5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2 и 1 мМ ДТТ (Ghosh and Van Duyne, 2002). В другом варианте линейный субстрат для реакции in vitro получают с помощью ПЦР (Zhang et al., 2015).
Интересная модификация in vitro теста основана использование коротких двуцепочечных олигонуклеотидов, несущих LoxP сайты, в которых отсутствует одна фосфодиэфирная связь на разрезаемой цепи ДНК на 3'-стороне от отрезаемого фосфатного остатка (Ghosh and Van Duyne, 2002). В этом случае в результате действия Cre образуется стабильный комплекс Cre и субстрата.
Помимо этого, LoxP-Cre рекомбинация in vitro может быть эффективно использована для манипуляций с рекомбинантной ДНК: для манипуляций с геномом вируса простого герпеса (Gage et al., 1992), для получения рекомбинантных бакуловирусов (Peakman et al., 1992), для инверсии открытых рамок считывания в плазмидах системы рекомбинации FLEX, являясь эффективной альтернативой молекулярному клонированию (Xu and Zhu, 2018).
Рекомбинантный белок Cre коммерчески доступен от компании NEB под каталожным номером M0298 (https://international.neb.com/products/m0298-cre-recombinase#Product%20Information), а рекомендуемый реакционный буфер 50 мМ Трис-HCl pH=7.5, 33 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2 соответствует таковому из работы (Abremski and Hoess, 1984) и был использован в одной из недавних работ (Xu and Zhu, 2018). В данном изобретении для проведения реакции in vitro был использован реакционный буфер, в соответствии с данными из работы Abremski и коллег и рекомендациями компании NEB.
Использование белка Cre для геномной инженерии
Рекомбиназа Cre в виде белка применяется для геномной инженерии достаточно давно, что возможно благодаря достаточно простой и эффективной очистке рекомбинантного белка Cre (Ghosh and Van Duyne, 2002). Вначале было показано, что при липофекции белка Cre в клеточную линию млекопитающих происходит эффективная рекомбинация (интеграция или вырезания фрагмента ДНК) (Baubonis and Sauer, 1993). Оказалось что слитый белок MBP-Cre обладает такой же каталитической активностью in vitro как и нативный белок Cre, и способен эффективно индуцировать рекомбинацию при электропорации в клеточную линию млекопитающих (Kolb and Siddell, 1996).
В работе Araki и коллег была показана принципиальная возможность осуществления эффективной Cre-опосредованной рекомбинации в ооцитах мыши после микроинъекций кольцевой плазмидной ДНК, экспрессирующей Cre (Araki et al., 1995). Данный подход был эффективен и при микроинъекции мРНК Cre в ооциты мыши (de Wit et al., 1998). Несмотря на то, что авторы не обнаружили интеграции в геном плазмиды для экспрессии Cre (Araki et al., 1995), существует высокая вероятность интеграции даже плазмид в кольцевой форме. Поэтому для манипуляций с геномом зигот предпочтительно использовать мРНК или белок Cre. В частности, была показана Cre-опосредованная рекомбинация при реализации схемы RMCE при коинъекции кассеты для экспрессии Egfp и рекомбинантного белка MBP-Cre в ооциты, несущие «floxed» кассеты в локусе гена β-актина (Shmerling et al., 2005). Более, того инъецированные зиготы подсаживали псевдобеременным самкам получая потомков, несущих аллели с корректной заменой экспрессионных кассет. Однако в таких экспериментах эффективность замены кассет с помощью RMCE была достаточно низкая, порядка 0.3% (Shmerling et al., 2005). Важно отметить, что, в отличие от плазмид, длительно персистирующих в клетках, белок Cre находится в клетках транзиторно, что способствует сдвигу равновесия процесса RMCE в сторону интеграции кассет в геном, но не их вырезания. В другом примере микроинъекции белка MBP-Cre в ооциты мыши использовали для удаления маркерных генов устойчивости к антибиотикам, интегрированных в геном эмбриональных стволовых клеток в составе кассет для получения мышей с нокаутом генов CCR2 и CCR5 (Luckow et al., 2009).
Еще один вариант использования рекомбинантного белка Cre заключается в получении так называемых «клеточно-пермеабельных» вариантов Cre, которые проникают в клетки млекопитающих без использования реагентов для трансфекции или электропорации. Это достигается за счет слияния Cre c определенными аминокислотными последовательностями, опосредующими эффективное проникновение белка в клетку. Такие последовательности называют membrane translocation sequence, MTS; protein translocation sequence, PTS; protein transduction domain, PTD; cell-penetrating peptide, CPP. Впервые такой подход был описан с использованием рекомбинантного белка Cre с N-концевыми 6His эпитопом и NLS и C-концевой последовательностью MTS из белка FGF-4 (Jo et al., 2001). Белок 6His-NLS-Cre-MTS эффективно индуцировал рекомбинацию в модельных клеточных линиях. Более того, интраперитонеальное введение рекомбинантного белка 6His-NLS-Cre-MTS трансгенным мышам, несущим в локусе ROSA26 инактивированный репортерный ген β-галактозидазы, вызывало сайт-специфическую рекомбинацию и активировало экспрессию репортерного гена во всех тканях животного (Jo et al., 2001).
В работе Will и коллег использовали Cre, слитую с Tat-пептидом ВИЧ и PreS2-пептидом вируса HBV. Такие белки вызывали эффективную рекомбинацию в клеточной линии, несущей репортерную конструкцию в геноме (Will et al., 2002). Однако, как оказалось, белок Cre, слитый лишь с NLS из большого Т-антигена вируса SV40, а также нативный белок Cre тоже обладают способностью проникать в клетки и индуцировать рекомбинацию (Lin et al., 2004; Will et al., 2002). На клеточных культурах фибробластов и эмбриональных стволовых клетках мыши была подтверждена эффективность использования белка 6His-Tat-NLS-Cre, а также показана рекомбинация при использовании NLS-Cre, и обнаружено, что последовательность MTS из белка FGF-4 не является необходимой для проникновения Cre в клетку (Peitz et al., 2002). Данная технология находит применение для получения трансгенных свиней, свободных от маркерных генов, используемых для селекции корректно модифицированных фетальных фибробластов для последующего переноса ядер из соматических клеток (SCNT) (Kang et al., 2018). В этом случае использовали белок Cre, слитый с различными CPP/PTD (Tat пептид, R9 и CPP5), среди которых пептид CPP5 был наиболее эффективен (Kang et al., 2018).
Приведенные выше примеры иллюстрируют различные варианты использования рекомбинантного белка Cre для геномной инженерии в клеточных линиях, ооцитах мыши и взрослых трансгенных мышах. В совокупности, это указывает на целесообразность и важность получения рекомбинантного белка Cre, а также указывают на возможные варианты его применения.
Краткое описание изобретения
Данное изобретение решает задачу получения бактериального штамма, позволяющего эффективно продуцировать рекомбинантный белок Cre, слитый с 6-гистидиновым и S-эпитопами и последовательностью ядерной локализации из большого Т-антигена вируса SV40 (6His-S-NLS-Cre). Описан способ очистки белка 6His-S-NLS-Cre с помощью комбинации металл-хелатной аффинной и катионообменной хроматографии, позволяющий получить каталитически активную рекомбиназу Cre с выходом около 17 мкг с 1 мл культуры. Белок Cre может быть использован для геномной инженерии в модельных организмах и клеточных линиях, а также для манипуляций с рекомбинантной ДНК in vitro. В клетки млекопитающих возможна доставка Cre с помощью микроинъекций, электропорации или с использованием коммерчески доступных реагентов для трансфекции белков. Более того, возможно получение вариантов белка Cre, активно проникающих в клетки. Микроинъекции рекомбинантного белка Cre в эмбрионы модельных организмов, несущих в геноме сайты LoxP, можно использовать для интеграции фрагментов ДНК в целевое место генома, для удаления геномных последовательностей и получения кондиционного нокаута гена, для проведения RMCE. Доставку белка Cre можно рассматривать как альтернативу скрещиванию с «драйверными» линиями животных, экспрессирующими Cre. Применение белка Cre может повысить эффективность геномной инженерии, расширить арсенал используемых методов, элиминировать риск нецелевой интеграции генетических конструкций для экспрессии Cre в геном клетки-реципиента.
Осуществление/Раскрытие настоящего изобретения
Изобретение решает задачу получения бактериального штамма, эффективно продуцирующего рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre, представляющий собой сайт-специфическую рекомбиназу Cre, модифицированную путем добавления N-концевых 6-гистидинового и S-эпитопов, которые могут быть использованной для аффинной очистки рекомбинантного белка (Block et al., 2009; Raines et al., 2000). Продуцируемый в бактериальной системе рекомбинантный белок очищается с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии и катионообменной хроматографии. Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка содержит сайты расщепления для протеаз тромбина, энтеропептидазы (энтерокиназы) и TEV (протеаза вируса табачной мозаики). При необходимости, с помощью протеолитического расщепления удаляются 6-гистидиновый и S-эпитопы и получается белок Cre, несущий на N-конце лишь последовательность ядерной локализации (NLS) из большого Т-антигена вируса SV40 (Kalderon et al., 1984). Присутствие NLS важно для транслокации белка Cre в ядро и одновременно повышает сродство белка Cre к катионообменным носителям, что делает очистку данного белка более эффективной (более 90% чистоты, Фиг. 3). В другом техническом варианте очищают рекомбинантный белок без проведения протеолитического отщепления 6-гистидинового и S-эпитопов, что не влияет на функциональную активность рекомбиназы Cre.
Плазмидный вектор pET32v11-Cre получают с помощью методов генной инженерии путем амплификации кДНК рекомбиназы Cre и последующего клонирования в вектор pET32v11, таким образом, чтобы кДНК Cre с N-концевой NLS находилась в одной рамке считывания с 6-гистидиновым и S-эпитопами и аминокислотными последовательностями сайтов расщепления тромбина, энтерокиназы и протеазы TEV.
Штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующий рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre, получают путем трансформации компетентных клеток штамма Escherichia coli BL21(DE3) плазмидным вектором pET32v11-Cre. Штамм культивируют на селективной среде, содержащей антибиотик ампициллин в концентрации 50 мкг/мл, и хранят при -80°С в среде LB, содержащей 15% глицерина.
Для получения рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre клетки штамма-продуцента BL21(DE3)/pET32v11-Cre культивируют в богатой среде TB, индукцию синтеза рекомбинантного белка осуществляют в течение 16 часов при температуре +18°С путем внесения в среду индуктора ИПТГ (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид) до конечной концентрации 0.8 мМ. Суспензию клеток E.coli разрушают в буфере 30 мМ HEPES pH=7.4, 500 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 10 мМ имидазол, 0.1% NP-40, 5% глицерин, 1 мМ β-меркаптоэтанол, 1 мМ фенилметилсульфонил фторид, 1х кратный коктейль ингибиторов протеаз VII (Calbiochem) и очищают рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии на носителе Ni-NTA (Qiagen). Фракции с максимальной концентрацией Cre объединяют и очищают с помощью катионообменной хроматографии на носителе Mono S 5/50 (GE Healthcare). Очищенный белок диализуют против буфера (20 мМ ацетат натрия pH=5.0, 40 мМ NaCl, 2 мМ ДТТ) и хранят в аликвотах при -80°С. В других воплощениях метода рекомбинантный белок очищают с помощью метал-хелатной аффинной хроматографии, проводят протеолитическое отщепление N-концевых эпитопов с помощью протеазы TEV и далее очищают белок с помощью катионообменной хроматографии.
Идентичность очищенного белка подтверждают с помощью ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга.
Специфическую активность очищенного рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre проверяют с помощью in vitro теста на рекомбинацию, используя в качестве субстрата кольцевую плазмидную ДНК, несущую сайты LoxP.
Штамм клеток Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre депонирован в Биоресурсный Центр Всероссийской коллекции Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИГенетика под номером В-13908.
Краткое описание чертежей
На Фиг. 1 показана генетическая карта плазмидной конструкции pET32v11-Cre, кодирующей рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre. Показаны основные элементы плазмиды: Ampicillin resistance gene (bla) - ген устойчивости к ампициллину (β-лактамаза); lacI - ген lac репрессора из E.coli; ColE1/pBR322 origin - точка начала репликации; f1 origin - точка начала репликации из бактериофага f1; 6His-S-NLS-Cre - кодирующая последовательность рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre; lac operator - lac оператор; T7 promoter - T7 промотор; T7 terminator - T7 терминатор; His tag и S-tag - 6-ти гистидиновый и S-эпитопы; thrombin, enterokinase, TEV cleavage site - сайты расщепления соответствующими протеазами. Кроме того, показан ряд уникальных сайтов рестрикции (EcoRI, SalI, XhoI, PstI и т.д.).
На Фиг. 2 показаны результаты анализа с помощью ДСН-ПААГ в 12%-ом акриламидном геле фракций, элюированных с катионообменной колонки Mono S при очистке рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre. Номера фракций указаны сверху. Часть исходного клеточного лизата диализовали перед нанесением на колонку Mono S. Элюированные фракции для такого образца отмечены сверху «d». Дорожка «w» - образец объединенных фракций промывки и прошедшего через колонку лизата. Дорожка «inp» содержит образец из объединенных фракций клеточного лизата с белком Cre после металл-хелатной хроматографии перед проведением диализа. Mw - маркер молекулярного веса белков: PageRuler™ Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa (ThermoFisher Scientific). Молекулярный вес полос маркера указан слева от рисунка. Полоса, соответствующая белку 6His-S-NLS-Cre, показана стрелкой.
На Фиг. 3 показаны результаты анализа в 10%-ом акриламидном геле с помощью ДСН-ПААГ очищенного рекомбинантного белка 6-His-S-NLS-Cre (дорожки «0.85 мкг» и «1.7 мкг») и образцов лизатов клеток штамма E.coli BL21 (DE3)/pET32v11-Cre до индукции синтеза рекомбинантного белка (дорожка «0 ч») и после культивации клеток штамма в среде, содержащий индуктор синтеза белка ИПТГ в концентрации 1 мМ в течение 3 часов при +37°С (дорожка «3 ч»). Справа указано положение полос маркера молекулярного веса белков Precision Plus Dual Color Protein Standard, (#161-0374 Bio-Rad). Полоса, соответствующая белку 6His-S-NLS-Cre, показана стрелкой.
На Фиг. 4 показаны результаты Вестерн-блот анализа очищенного рекомбинантного белка 6-His-S-NLS-Cre (дорожки «0.85 мкг» и «1.7 мкг») и образцов лизатов клеток штамма E.coli BL21 (DE3)/pET32v11-Cre до индукции синтеза рекомбинантного белка (дорожка «0 ч») и после культивации клеток штамма в среде, содержащий индуктор ИПТГ в концентрации 1 мМ в течение 3 часов при +37°С (дорожка «3 ч»). Для Вестерн-блот анализа использовали мышиные моноклональные антитела к 6-гистидиновому эпитопу (Sigma, #H1029, разведение 1:2000). Справа указано положение полос маркера молекулярного веса белков Precision Plus Dual Color Protein Standard, (#161-0374 Bio-Rad).
На Фиг. 5 показана схема проведения vitro теста на рекомбинацию с использованием модельной плазмиды pBl-Lox-PSMC-Lox-F3. В результате действия Cre из кольцевой плазмиды длиной 4743 п.н. (S) вырезается фрагмент ДНК, фланкированный двумя однонаправленными сайтами LoxP. В результате рекомбинации образуются два кольцевых продукта рекомбинации длиной 3183 (R1) и 1560 (R2) п.н. Под схемой приведены размеры линейный фрагментов ДНК, образующихся после обработки субстрата и продуктов реакции эндонуклеазой рестрикции EcoRI.
На Фиг. 6 показаны результаты in vitro теста на рекомбинацию с использованием модельной плазмиды pBl-Lox-PSMC-Lox-F3. Продукты реакции рекомбинации анализировали 1%-ом TAE-агарозном геле. Дорожка «Cre-» - субстрат инкубировали без добавления 6His-S-NLS-Cre; дорожка «Cre+» - субстрат инкубировали в присутствии 1 мкМ 6His-S-NLS-Cre. S - фрагменты ДНК, образующиеся при гидролизе субстрата эндонуклеазой рестрикции EcoRI. R1 и R2 - фрагменты ДНК, образующиеся при гидролизе продуктов реакции эндонуклеазой рестрикции EcoRI. Размеры продуктов реакции указаны слева. Размеры фрагментов маркера молекулярного веса ДНК (O'GeneRuler 1kb DNA Ladder, ThermoFisher Scientific), показаны справа.
Примеры осуществления настоящего изобретения
Пример 1.
Получение рекомбинантной плазмиды, кодирующей кДНК белка Cre, слитую с 6-гистидиновым и S-эпитопами
Для продукции белка Cre в бактериальной системе экспрессии с помощью методов генной инженерии получают рекомбинантную плазмидную конструкцию. Для этого кДНК рекомбиназы Cre амплифицируют с помощью ПЦР на матрице плазмиды pBluescriptSK II(+)-TERT-Surv-Cre-3DNMT1 (Bezborodova et al., 2018) с олигонуклеотидными праймерами 5-agaattcgagctccccaagaagaagaggaag-3 и 5-agtcgacctaatcgccatcttccag-3, содержащими сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции EcoRI и SalI, соответственно (выделены жирным шрифтом). Продукт амплификации анализируют с помощью электрофореза в 1%-ом агарозном геле, очищают из агарозного геля с помощью набора реагентов QiaexII (Qiagen) и клонируют в вектор pJET1 (ThermoFisher Scientific) получая вектор pJET1-Cre. Далее определяют полную нуклеотидную последовательность амплифицированного фрагмента с помощью секвенирования по Сэнгеру.
Далее, на основе вектора pET-32a(+) (Merck) получают модифицированный вектор pET32v11. Для этого, из вектора pGEX-6P1 (GE Healthcare) клонируют фрагмент NotI-XhoI, содержащий стоп-кодоны, в вектор pET-32a(+) по сайтам NotI-XhoI. В полученный вектор по сайтам NcoI-BamHI (выделены жирным шрифтом) клонируют фрагмент ДНК (5-ccatgggcagatctgaaaacctgtactttcagagcggatcc-3), содержащий сайт расщепления протеазой TEV. Далее, из полученного вектора удаляют NdeI-NdeI фрагмент, несущий кодирующую последовательность тиоредоксина, и получают вектор pET32v11 (SEQ ID NO 1).
В векторе pET32v11 сайт расщепления для протеазы TEV расположен таким образом, чтобы после очистки рекомбинантного белка с помощью металл-аффинной хроматографии используя протеазу TEV, при необходимости можно было отщепить N-концевой фрагмент очищенного белка, включающий 6-гистидиновый и S-эпитопы.
Далее EcoRI-SalI фрагмент, содержащий кДНК Cre, клонируют из вектора pJET1-Cre в плазмидный вектор pET32v11 по сайтам EcoRI-SalI таким образом, чтобы кДНК Cre находилась в одной рамке считывания с N-концевым 6-гистидиновым эпитопом. Полученную рекомбинантную плазмиду называют pET32v11-Cre.
Полученная плазмидная конструкция имеет размер 6648 п.н., (SEQ ID NO 2). Генетическая карта плазмиды pET32v11-Cre представлена на Фиг. 1. Слитый рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre, кодируемый данной плазмидой, имеет расчетный молекулярный вес 46.2 кДа и состоит из 411 аминокислотных остатков (SEQ ID NO 3).
Пример 2.
Процедура получения штамма бактерий
E.coli
BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующего рекомбинантный белок 6-His-S-NLS-Cre
Плазмидный вектор pET32v11-Cre трансформируют в штамм E.coli BL21 (DE3) с помощью стандартной методики трансформации бактерий (Titus, 1991) и высевают на LB агар (0.171 M NaCl, 1% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 1.5% агар), содержащий селективный антибиотик ампициллин в концентрации 50 мкг/мл и растят в течение 16 часов при температуре +37°С. Единичные колонии бактерий, выросших на селективной среде, пересевают штрихом на свежую селективную чашку, и растят в течение 16 часов при температуре +37°С. С чашки Петри бактериальной петлей берут единичную колонию бактерий и инокулируют 5 мл жидкой ростовой среды LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл и растят в течение 16 часов при температуре +37°С и постоянном перемешивании. 200 мкл ночной культуры переносят в 2 мл среды LB содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл и растят в течение 2 часов при температуре +37°С. Клетки E.coli осаждают центрифугированием, удаляют супернатант, осадок ресуспендируют в 500 мкл среды для заморозки (жидкая среда LB, содержащая 15% глицерина). Полученный штамм-продуцент хранят при температуре -80°С.
Пример 3.
Процедура получения рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre в бактериальной системе экспрессии
Клетки штамма E.coli BL21(DE3) трансформируют плазмидой pET32v11-Cre и высевают на чашку Петри с LB агаром, содержащим 0.5% глюкозу и 50 мкг/мл ампициллина. С чашки Петри смывают несколько колоний бактерий и ресуспендируют их в прогретой до +37°С среде Terrific Broth (TB; 17 мМ KH2PO4, 72 мМ K2HPO4, 5 мМ MgSO4, 1.2% триптон, 2.4% дрожжевой экстракт, 0.5% глицерин) и инокулируют две 2-х литровые колбы, содержащие по 500 мл жидкой среды TB и ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. Бактерии растят при постоянном перемешивании и температуре +37°С в течение 3-5 часов до достижения оптической плотности 0.4 при длине волны 600 нм. Далее колбы охлаждают до +18°С и индуцируют экспрессию рекомбинантного белка путем добавления ИПТГ до конечной концентрации 0.8 мМ, добавляют ампициллин до концентрации 50 мкг/мл и растят бактерии при температуре +18°С в течение 16 часов при постоянном перемешивании (220 оборотов/мин).
Клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин и температуре +4°С в течение 20 минут, супернатант удаляют, а осадок промывают с использованием 50 мл фосфатно-солевого буфера (0.01 М натрия фосфат, 0.138 М NaCl, 0.0027 M KCl, pH=7.4), предварительно охлажденного до +4°С, и затем клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин и температуре +4°С в течение 20 минут. Супернатант удаляют, клеточную массу замораживают в жидком азоте и хранят при -80°С до стадии очистки белка.
Суспензию бактериальных клеток медленно оттаивают на льду, ресуспендируют в 30 мл буфера для лизиса (30 мМ HEPES pH=7.4, 500 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 10 мМ имидазол, 0.1% NP-40, 5% глицерин, 1 мМ β-меркаптоэтанол, 1 мМ фенилметилсульфонил фторид, 1х кратный коктейль ингибиторов протеаз VII (Calbiochem) и разрушают с помощью гомогенизатора LV1 (Microfluidics).
Полученный лизат бактериальных клеток центрифугируют при 15000 об/мин и температуре +4°С в течение 60 минут, собирают осветленный лизат. Очистку белка проводят на хроматографе среднего давления Acta Pure (GE Healthcare). Осветленный лизат наносят на хроматографическую колонку, наполненную металл-хелатным аффинным носителем Ni-NTA agarose (Qiagen) объемом 5 мл, уравновешенную буфером для лизиса. Колонку промывают буфером (30 мМ HEPES pH=7.4, 500 мМ NaCl, 30 мМ имидазол, 0.1% NP-40, 1 мМ β-меркаптоэтанол). Связавшиеся с колонкой белки элюируют с помощью буфера (30 мМ HEPES pH=7.4, 500 мМ NaCl, 300 мМ имидазол, 1 мМ β-меркаптоэтанол). Собирают фракции с максимальным пиком поглощения при длине волны 280 нм.
Элюированные с Ni-NTA колонки фракции объединяют, разводят в два раза буфером (10 мМ NaKPO4 pH=6.8, 10 мМ β-меркаптоэтанол) и наносят на катионообменную колонку Mono S 5/50 (GE Healthcare), уравновешенную буфером (10 мМ NaKPO4 pH=6.8, 250 мМ NaCl, 10 мМ β-меркаптоэтанол). Колонку промывают буфером (10 мМ NaKPO4 pH=6.8, 250 мМ NaCl, 10 мМ β-меркаптоэтанол). Связавшиеся с колонкой белки элюируют с помощью градиента соли от 500 мМ NaCl до 850 мМ NaCl в буфере 10 мМ NaKPO4 pH=6.8, 10 мМ β-меркаптоэтанол. Собирают фракции объемом 1 мл. Фракции с максимальным пиком поглощения при длине волны 280 нм анализируют с помощью ДСН-ПААГ в 12%-ом акриламидном геле (Фиг. 2), как описано (Laemmli, 1970). Рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre эффективно элюируется с колонки при 700 мМ NaCl. Результат анализа фракций, собранных в процессе очистки рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre, приведен на Фиг. 2. Видно, что с Mono S колонки элюируется белок с молекулярным весом около 45 кДа, что соответствует ожидаемому. Фракции, сошедшие с колонки Mono S, и содержащие максимально чистый рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre, диализуют против буфера 20 мМ ацетат натрия pH=5.0, 40 мМ NaCl, 2 мМ ДТТ. Замораживают в жидком азоте в аликвотах и хранят при -80°С. Для проверки активности белка 6His-S-NLS-Cre размораживают аликвоту, проводят функциональный тест на рекомбинацию in vitro (Фиг. 5 и 6) и анализируют образец рекомбинантного белка с помощью ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга (Фиг. 3 и 4).
Пример 4.
Процедура определения идентичности и концентрации очищенного рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre
Концентрацию очищенного рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre определяют спектрофотометрически, измеряя поглощение образца белка при длине волны 280 нм по сравнению с буфером для диализа на спектрофотометре NanoDrop ND-8000 (ThermoFisher Scientific). Для расчета концентрации белка используют коэффициент молярной экстинкции для белка 6His-S-NLS-Cre, рассчитанный по его аминокислотной последовательности, и составляющий 50550. При этом 1 единица оптической плотности при длине волны 280 нм соответствует концентрации белка в 0.91 мг/мл.
Идентичность очищенного рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre определяют с помощью ДСН-ПААГ в 10% акриламидном геле и Вестерн-блоттинга. Готовят образцы лизатов бактериальных клеток штамма E.coli BL21 (DE3)/pET32v11-Cre до индукции синтеза рекомбинантного белка (0ч) и после культивации клеток штамма в среде, содержащий индуктор ИПТГ в концентрации 1 мМ в течение 3 часов при +37°С. Готовят образцы, содержащие 0.85 и 1.7 мкг очищенного белка 6His-S-NLS-Cre. Проводят электрофорез белков в 10%-ом акриламидном геле и окрашивают гель красителем Кумасси. На Фиг. 3 показано, что очищенный рекомбинантный белок 6-His-S-NLS-Cre (дорожки «0.85 мкг» и «1.7 мкг») мигрирует в геле на уровне между полосами маркера молекулярного веса 37 и 50 кДа, что близко к ожидаемому молекулярному весу белка 6His-S-NLS-Cre в 46.2 кДа. Чистота очищенного белка (дорожки «0.85 мкг» и «1.7 мкг») составляет более 90%. Детектируемое в геле количество белка 6-His-S-NLS-Cre и отсутствие в геле интенсивных полос низкого молекулярного веса, которые могли бы указывать на деградацию белка 6-His-S-NLS-Cre, указывают на стабильность полученного рекомбинантного белка при повторном замораживании и оттаивании.
Для подтверждения идентичности очищенного белка проводят Вестерн-блот анализ. Проводят электрофоретическое разделение описанных выше образцов в 10%-ом акриламидном геле, переносят белки из геля на PVDF мембрану (Millipore) c помощью прибора для электропереноса SV20-SDB (Sigma). Мембрану блокируют в буфере TBS-T (50 мМ Трис-HCl pH=8.0, 138 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 0.05% Tween-20), содержащем 5% сухое обезжиренное молоко (TBS-T5%). Далее инкубируют мембрану в течение 16 часов при +4°С в буфере TBS-T5% с мышиными моноклональными антителами к 6-ти гистидиновому эпитопу (Sigma, #H1029) в разведении 1:2000. Мембрану три раза промывают в буфере TBS-T и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре со вторичными антителами против иммуноглобулинов мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена (GE Healthcare, #NA931V), в разведении 1:5000. Мембрану три раза промывают в буфере TBS-T, детектируют связавшиеся антитела с помощью набора реагентов Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore). Хемилюминесценцию детектируют с помощью системы гель-документации ChemiDoc XRS (Bio-Rad). На Фиг. 4 показан результат Вестерн-блот анализа. Видно, что с помощью антител к 6-ти гистидиновому эпитопу детектируются полосы с молекулярным весом немного ниже 50 кДа (дорожки «3 ч», «0.85 мкг» и «1.7 мкг»), что соответствует ожидаемому молекулярному весу белка 6His-S-NLS-Cre в 46.2 кДа. Важно отметить, что интенсивная иммунореактивная полоса ожидаемого молекулярного веса присутствует лишь в образце лизата клеток штамма E.coli BL21 (DE3)/pET32v11-Cre после индукции синтеза рекомбинантного белка (дорожка «3 ч»), но не в неидуцированном клеточном лизате (дорожка «0 ч»), в котором детектируется лишь слабая иммунореактивная полоса, которая отражает синтез белка в отсутствии индукции экспрессии за счет «подтекания» промотора lacUV5 в геноме E.coli, контролирующего экспрессию T7 РНК-полимеразы. Эти результаты подтверждают идентичность очищенного рекомбинантного белка. В дорожках «0.85 мкг» и «1.7 мкг» детектируются полосы с молекулярным весом менее 37 кДа, которые представляют собой либо продукты деградации очищенного белка, либо продукты преждевременной терминации синтеза белка в клетках E.coli. Интенсивность окрашивания этих полос обусловлена высокой концентрацией белка в анализированных образцах. Как видно, из Фиг. 3, интенсивность низкомолекулярных полос существенно слабее полосы в геле, соответствующей очищенному белку Cre, что указывает на стабильность белка 6His-S-NLS-Cre.
Пример 5.
In vitro
тест на сайт-специфическую рекомбинацию
Для проведения реакции рекомбинации in vitro в качестве субстрата используют плазмиду pBl-Lox-PSMC-Lox-F3 размером 4347 п.н. (SEQ ID NO 4), в которой нуклеотидная последовательность терминатора транскрипции из гена PSMC5 человека, фланкирована двумя однонаправленными сайтами LoxP. В результате действия рекомбиназы Cre из кольцевого плазмидного субстрата вырезается фрагмент ДНК с образованием двух кольцевых продуктов рекомбинации размером 3183 п.н. и 1560 п.н. (Фиг. 5). Продукты реакции и субстрат линеаризуют, используя эндонуклеазу рестрикции EcoRI и анализируют с помощью электрофореза в 1%-ом агарозном геле. При гидролизе субстрата эндонуклеазой рестрикции EcoRI образуются фрагменты ДНК длиной 4298, 313, 114 и 18 п.н., обозначены S на Фиг. 6, за исключением фрагмента длиной 18 п.н., который не детектируется в геле; при гидролизе продуктов реакции образуются фрагменты длиной 3051, 114 и 18 п.н. (R1) и 1560 п.н. (R2). Схема проведения in vitro теста на сайт-специфическую рекомбинацию показана на Фиг. 5.
Для проведения реакции рекомбинации готовят смесь объемом 40 мкл, содержащую 50 мМ Трис-HCl pH=7.5, 10 мМ MgCl2, 30 мМ NaCl, 1 мкг плазмидной ДНК, 1 мкМ 6-His-S-NLS-Cre. Реакцию инкубируют при +37°С в течение 30 минут. Далее, для инактивации рекомбиназы Cre реакцию инкубируют 10 мин при +70°С. После этого к реакции добавляют 5 мкл 10-ти кратного буфера “Orange” «ThermoFisher Scientific», 4 мкл воды и 1 мкл (10 ед. активности) эндонуклеазы рестрикции EcoRI «ThermoFisher Scientific»). Инкубируют реакцию при +37°С в течение 1 часа. Добавляют 1 мкл протеиназы K (20 мкг/мкл, «Sigma-Aldrich») и инкубируют реакцию 10 минут при +56°С для протеолиза Cre и высвобождения продуктов реакции. Анализируют продукты реакции в 1%-ом агарозном геле.
На Фиг. 6 показан результат теста на сайт-специфическую рекомбинацию. При инкубации плазмидной ДНК pBl-Lox-PSMC-Lox-F3 с рекомбинантным белком 6-His-S-NLS-Cre (образец Cre+) при +37°С образуются продукты реакции (R1 и R2) ожидаемого размера. При инкубации плазмиды без добавления белка детектируется лишь фрагменты исходного субстрата (S) длиной 4298, 313 и 114 п.н.. Так как фрагменты длиной 313 и 114 п.н. образуются при гидролизе, как субстрата, так и продуктов реакции, то именно появление продуктов реакции длиной 3051 п.н. (R1) и 1560 п.н. (R2) указывает на прохождение Cre-опосредованной рекомбинации.
Основные характеристики клеток (по данным паспорта штамма)
1. Родовое и видовое название штамма-хозяина (реципиента): Escherichia coli
2. Номер или наименование штамма: BL21(DE3)/pET32v11-Cre
3. Способ получения штамма: получен трансформацией.
4. Область применения штамма: получение рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre
5. Продукт, синтезируемый штаммом: белок 6His-S-NLS-Cre
6. Активность (продуктивность) штамма, а также другие производственные показатели: 17 мкг белка на 1 мл среды
7. Способ определения активности штамма с указанием метода: in vitro тест на рекомбинацию
8. Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма: среда LB + 15% глицерина в ампулах на -80°С
9. Способ, условия и состав сред для размножения штамма: среда LB, содержащая 50 мкг/мл ампициллина
10. Группа уровня риска штамма: I
11. Генетические особенности штамма:
а. Генотип штамма хозяина (мутации, делеции, инверсии, наличие плазмид или профагов, устойчивость (чувствительность) к антибиотикам, фагам и т.д., прочие генетические особенности): генотип штамма генотип штамма BL21 (DE3): F- ompT gal dcm lon hsdS B (r B - m B -) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB +]K-12(λS)
б. Описание рекомбинантной плазмиды
Название плазмиды: pET32v11-Cre
Размер плазмиды pET32v11-Cre: 6648 пар нуклеотидов
Полная нуклеотидная последовательность плазмиды: SEQ ID NO: 2.
в. Сведения о векторе, на основе которого сконструирована плазмида:
Название вектора; pET-32a(+)
Происхождение вектора и его основных генетических элементов;
Вектор pET-32a(+) содержит:
- ген устойчивости к ампициллину (β-лактамаза)
- ген lac репрессора (lacI) из E.coli
- точку начала репликации из плазмид ColE1/pBR322 из E.coli.
- точку начала репликации из бактериофага f1
- ген rop из E.coli, кодирующий белок, регулирующий копийность плазмиды
- кодирующую последовательность гена тиоредоксина trxA из E.coli
г. Сведения о клонированной ДНК
Видовая принадлежность донорного организма: Escherichia virus P1
Общие сведения о клонированном фрагменте, размер и включенные в его состав гены; плазмида содержит кДНК гена Cre длиной 1026 п.н., кодируемого геномом бактериофага P1 (Genebank Acc.: NC_005856.1)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Abremski, K., and R. Hoess. 1984. Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein. J Biol Chem. 259:1509-1514.
Abremski, K., R. Hoess, and N. Sternberg. 1983. Studies on the properties of P1 site-specific recombination: evidence for topologically unlinked products following recombination. Cell. 32:1301-1311.
Akagi, K., V. Sandig, M. Vooijs, M. Van der Valk, M. Giovannini, M. Strauss, and A. Berns. 1997. Cre-mediated somatic site-specific recombination in mice. Nucleic Acids Res. 25:1766-1773.
Araki, K., M. Araki, J. Miyazaki, and P. Vassalli. 1995. Site-specific recombination of a transgene in fertilized eggs by transient expression of Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci USA. 92:160-164.
Austin, S., M. Ziese, and N. Sternberg. 1981. A novel role for site-specific recombination in maintenance of bacterial replicons. Cell. 25:729-736.
Baubonis, W., and B. Sauer. 1993. Genomic targeting with purified Cre recombinase. Nucleic Acids Res. 21:2025-2029.
Bezborodova, O.A., I.V. Alekseenko, E.R. Nemtsova, A.A. Pankratov, O.B. Filyukova, R.I. Yakubovskaya, M.B. Kostina, V.K. Potapov, and E.D. Sverdlov. 2018. The Antitumor Efficacy of a Complex Based on Two-Vector System for Coexpression of the Suicide Gene Fcu1 and Cre Recombinase. Dokl Biochem Biophys. 483:326-328.
Block, H., B. Maertens, A. Spriestersbach, N. Brinker, J. Kubicek, R. Fabis, J. Labahn, and F. . 2009. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463:439-473.
Branda, C.S., and S.M. Dymecki. 2004. Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice. Dev Cell. 6:7-28.
Cai, D., K.B. Cohen, T. Luo, J.W. Lichtman, and J.R. Sanes. 2013. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nat Methods. 10:540-547.
Cantor, E.J., and S. Chong. 2001. Intein-mediated rapid purification of Cre recombinase. Protein Expr Purif. 22:135-140.
D'Astolfo, D.S., R.J. Pagliero, A. Pras, W.R. Karthaus, H. Clevers, V. Prasad, R.J. Lebbink, H. Rehmann, and N. Geijsen. 2015. Efficient intracellular delivery of native proteins. Cell. 161:674-690.
de Wit, T., D. Drabek, and F. Grosveld. 1998. Microinjection of cre recombinase RNA induces site-specific recombination of a transgene in mouse oocytes. Nucleic Acids Res. 26:676-678.
Ennifar, E., J.E. Meyer, F. Buchholz, A.F. Stewart, and D. Suck. 2003. Crystal structure of a wild-type Cre recombinase-loxP synapse reveals a novel spacer conformation suggesting an alternative mechanism for DNA cleavage activation. Nucleic Acids Res. 31:5449-5460.
Gage, P.J., B. Sauer, M. Levine, and J.C. Glorioso. 1992. A cell-free recombination system for site-specific integration of multigenic shuttle plasmids into the herpes simplex virus type 1 genome. J Virol. 66:5509-5515.
Ghosh, K., and G.D. Van Duyne. 2002. Cre-loxP biochemistry. Methods. 28:374-383.
Gurumurthy, C.B., A.R. O'Brien, R.M. Quadros, J. Adams, Jr., P. Alcaide, S. Ayabe, J. Ballard, S.K. Batra, M.C. Beauchamp, K.A. Becker, G. Bernas, D. Brough, F. Carrillo-Salinas, W. Chan, H. Chen, R. Dawson, V. DeMambro, J. D'Hont, K.M. Dibb, J.D. Eudy, L. Gan, J. Gao, A. Gonzales, A.R. Guntur, H. Guo, D.W. Harms, A. Harrington, K.E. Hentges, N. Humphreys, S. Imai, H. Ishii, M. Iwama, E. Jonasch, M. Karolak, B. Keavney, N.C. Khin, M. Konno, Y. Kotani, Y. Kunihiro, I. Lakshmanan, C. Larochelle, C.B. Lawrence, L. Li, V. Lindner, X.D. Liu, G. Lopez-Castejon, A. Loudon, J. Lowe, L.A. Jerome-Majewska, T. Matsusaka, H. Miura, Y. Miyasaka, B. Morpurgo, K. Motyl, Y.I. Nabeshima, K. Nakade, T. Nakashiba, K. Nakashima, Y. Obata, S. Ogiwara, M. Ouellet, L. Oxburgh, S. Piltz, I. Pinz, M.P. Ponnusamy, D. Ray, R.J. Redder, C.J. Rosen, N. Ross, M.T. Ruhe, L. Ryzhova, A.M. Salvador, S.S. Alam, R. Sedlacek, K. Sharma, C. Smith, K. Staes, L. Starrs, F. Sugiyama, S. Takahashi, T. Tanaka, A.W. Trafford, Y. Uno, L. Vanhoutte, F. Vanrockeghem, B.J. Willis, C.S. Wright, Y. Yamauchi, X. Yi, K. Yoshimi, X. Zhang, Y. Zhang, M. Ohtsuka, S. Das, D.J. Garry, T. Hochepied, P. Thomas, J. Parker-Thornburg, A.D. Adamson, A. Yoshiki, et al. 2019. Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation. Genome Biol. 20:019-1776.
Jo, D., A. Nashabi, C. Doxsee, Q. Lin, D. Unutmaz, J. Chen, and H.E. Ruley. 2001. Epigenetic regulation of gene structure and function with a cell-permeable Cre recombinase. Nat Biotechnol. 19:929-933.
Kalderon, D., B.L. Roberts, W.D. Richardson, and A.E. Smith. 1984. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell. 39:499-509.
Kalinichenko, S.V., M.V. Shepelev, and I.V. Korobko. 2017. A gel-less isolation of untagged plasmid DNA insert from vector backbone in homogeneous format. Anal Biochem. 521:28-30.
Kang, Q., Z. Sun, Z. Zou, M. Wang, Q. Li, X. Hu, and N. Li. 2018. Cell-penetrating peptide-driven Cre recombination in porcine primary cells and generation of marker-free pigs. PLoS One. 13.
Kolb, A.F., and S.G. Siddell. 1996. Genomic targeting with an MBP-Cre fusion protein. Gene. 183:53-60.
Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227:680-685.
Lakso, M., B. Sauer, B. Mosinger, Jr., E.J. Lee, R.W. Manning, S.H. Yu, K.L. Mulder, and H. Westphal. 1992. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA. 89:6232-6236.
Lin, Q., D. Jo, K.D. Gebre-Amlak, and H.E. Ruley. 2004. Enhanced cell-permeant Cre protein for site-specific recombination in cultured cells. BMC Biotechnol. 4:1472-6750.
Livet, J., T.A. Weissman, H. Kang, R.W. Draft, J. Lu, R.A. Bennis, J.R. Sanes, and J.W. Lichtman. 2007. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450:56-62.
, M.B., D.J. Rose, G. Plunkett, 3rd, M. Rusin, A. Samojedny, H. Lehnherr, M.B. Yarmolinsky, and F.R. Blattner. 2004. Genome of bacteriophage P1. J Bacteriol. 186:7032-7068.
Low, B.E., P.M. Kutny, and M.V. Wiles. 2016. Simple, Efficient CRISPR-Cas9-Mediated Gene Editing in Mice: Strategies and Methods. Methods Mol Biol:3661-3668_3662.
Lu, C., and H.P. Erickson. 1997. Expression in Escherichia coli of the thermostable DNA polymerase from Pyrococcus furiosus. Protein Expr Purif. 11:179-184.
Luckow, B., A. Hanggli, H. Maier, S. Chilla, R.P. Loewe, S. Dehmel, D. Schlondorff, P. Loetscher, H.G. Zerwes, and M. Muller. 2009. Microinjection of Cre recombinase protein into zygotes enables specific deletion of two eukaryotic selection cassettes and enhances the expression of a DsRed2 reporter gene in Ccr2/Ccr5 double-deficient mice. Genesis. 47:545-558.
Mack, A., B. Sauer, K. Abremski, and R. Hoess. 1992. Stoichiometry of the Cre recombinase bound to the lox recombining site. Nucleic Acids Res. 20:4451-4455.
Martin, S.S., E. Pulido, V.C. Chu, T.S. Lechner, and E.P. Baldwin. 2002. The order of strand exchanges in Cre-LoxP recombination and its basis suggested by the crystal structure of a Cre-LoxP Holliday junction complex. J Mol Biol. 319:107-127.
McLellan, M.A., N.A. Rosenthal, and A.R. Pinto. 2017. Cre-loxP-Mediated Recombination: General Principles and Experimental Considerations. Curr Protoc Mouse Biol. 7:1-12.
Metje-Sprink, J., J. Menz, D. Modrzejewski, and T. Sprink. 2019. DNA-Free Genome Editing: Past, Present and Future. Front Plant Sci. 9.
Orban, P.C., D. Chui, and J.D. Marth. 1992. Tissue- and site-specific DNA recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA. 89:6861-6865.
Peakman, T.C., R.A. Harris, and D.R. Gewert. 1992. Highly efficient generation of recombinant baculoviruses by enzymatically medicated site-specific in vitro recombination. Nucleic Acids Res. 20:495-500.
Peitz, M., K. Pfannkuche, K. Rajewsky, and F. Edenhofer. 2002. Ability of the hydrophobic FGF and basic TAT peptides to promote cellular uptake of recombinant Cre recombinase: a tool for efficient genetic engineering of mammalian genomes. Proc Natl Acad Sci USA. 99:4489-4494.
Plummer, N.W., E.K. Ungewitter, K.G. Smith, H.H. Yao, and P. Jensen. 2017. A new mouse line for cell ablation by diphtheria toxin subunit A controlled by a Cre-dependent FLEx switch. Genesis. 55:19.
Ponsaerts, P., J.P. Brown, D. Van den Plas, L. Van den Eeden, D.R. Van Bockstaele, P.G. Jorens, V.F. Van Tendeloo, J. Merregaert, P.B. Singh, and Z.N. Berneman. 2004. Messenger RNA electroporation is highly efficient in mouse embryonic stem cells: successful FLPe- and Cre-mediated recombination. Gene Ther. 11:1606-1610.
Raines, R.T., M. McCormick, T.R. Van Oosbree, and R.C. Mierendorf. 2000. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326:362-376.
Santoro, S.W., and P.G. Schultz. 2002. Directed evolution of the site specificity of Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci USA. 99:4185-4190.
Sauer, B. 1998. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods. 14:381-392.
Sauer, B., and N. Henderson. 1988. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci USA. 85:5166-5170.
Schlake, T., and J. Bode. 1994. Use of mutated FLP recognition target (FRT) sites for the exchange of expression cassettes at defined chromosomal loci. Biochemistry. 33:12746-12751.
, F., N. Doerflinger, C. , O. Wendling, P. Chambon, and N.B. Ghyselinck. A directional strategy for monitoring Cre-mediated recombination at the cellular level in the mouse.
Shmerling, D., C.P. Danzer, X. Mao, J. Boisclair, M. Haffner, M. Lemaistre, V. Schuler, E. Kaeslin, R. Korn, K. , B. Ledermann, B. Kinzel, and M. . 2005. Strong and ubiquitous expression of transgenes targeted into the beta-actin locus by Cre/lox cassette replacement. Genesis. 42:229-235.
Siegel, R.W., R. Jain, and A. Bradbury. 2001. Using an in vivo phagemid system to identify non-compatible loxP sequences. FEBS Lett. 505:467-473.
Singh, P., J.C. Schimenti, and E. Bolcun-Filas. 2015. A mouse geneticist's practical guide to CRISPR applications. Genetics. 199:1-15.
Sternberg, N., and D. Hamilton. 1981. Bacteriophage P1 site-specific recombination. I. Recombination between loxP sites. J Mol Biol. 150:467-486.
Titus, D.E. 1991. Cloning of DNA inserts. In Promega Protocols and Applications Guide. D.E. Titus, editor, USA. 52-53.
Turan, S., M. Galla, E. Ernst, J. Qiao, C. Voelkel, B. Schiedlmeier, C. Zehe, and J. Bode. 2011. Recombinase-mediated cassette exchange (RMCE): traditional concepts and current challenges. J Mol Biol. 407:193-221.
Turan, S., C. Zehe, J. Kuehle, J. Qiao, and J. Bode. 2013. Recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) - a rapidly-expanding toolbox for targeted genomic modifications. Gene. 515:1-27.
Van Duyne, G.D. 2015. Cre Recombinase. Microbiol Spectr. 3:0014-2014.
Will, E., H. Klump, N. Heffner, M. Schwieger, B. Schiedlmeier, W. Ostertag, C. Baum, and C. Stocking. 2002. Unmodified Cre recombinase crosses the membrane. Nucleic Acids Res. 30.
Xu, J., and Y. Zhu. 2018. A rapid in vitro method to flip back the double-floxed inverted open reading frame in a plasmid. BMC Biotechnol. 18:018-0462.
Zhang, C., C.A. Myers, Z. Qi, R.D. Mitra, J.C. Corbo, and J.J. Havranek. 2015. Redesign of the monomer-monomer interface of Cre recombinase yields an obligate heterotetrameric complex. Nucleic Acids Res. 43:9076-9085.
--->
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт
биологии гена Российской академии наук (Institute of Gene Biology Russian
Academy of Sciences)
<120> Штамм клеток Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующих
сайт-специфическую рекомбиназу Cre
<160> 4
<210> 1
<211> 5596
<212> ДНК
<213> artificial sequence
<220>
<223> Плазмидная конструкция pET32v11
<400> 1
gatcccgcga aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct 60
ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca tatgcaccat catcatcatc 120
attcttctgg tctggtgcca cgcggttctg gtatgaaaga aaccgctgct gctaaattcg 180
aacgccagca catggacagc ccagatctgg gtaccgacga cgacgacaag gccatgggca 240
gatctgaaaa cctgtacttt cagagcggat ccccggaatt cccgggtcga ctcgatcgag 300
cggccgcatc gtgactgact gacgatctcg agcaccacca ccaccaccac tgagatccgg 360
ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag 420
cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta 480
tatccggatt ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 540
ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 600
cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct 660
ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg 720
tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga 780
gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc 840
ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga 900
gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta caatttcagg 960
tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc 1020
aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag 1080
gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg 1140
ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt 1200
gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt 1260
tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt 1320
attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa 1380
tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag 1440
agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac 1500
aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac 1560
tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac 1620
cacgatgcct gcagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac 1680
tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact 1740
tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg 1800
tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt 1860
tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat 1920
aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta 1980
gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa 2040
tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga 2100
aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac 2160
aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt 2220
tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc 2280
gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat 2340
cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag 2400
acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc 2460
cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag 2520
cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac 2580
aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg 2640
gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct 2700
atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc 2760
tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga 2820
gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga 2880
agcggaagag cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg 2940
catatatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagtataca 3000
ctccgctatc gctacgtgac tgggtcatgg ctgcgccccg acacccgcca acacccgctg 3060
acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct 3120
ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg aggcagctgc 3180
ggtaaagctc atcagcgtgg tcgtgaagcg attcacagat gtctgcctgt tcatccgcgt 3240
ccagctcgtt gagtttctcc agaagcgtta atgtctggct tctgataaag cgggccatgt 3300
taagggcggt tttttcctgt ttggtcactg atgcctccgt gtaaggggga tttctgttca 3360
tgggggtaat gataccgatg aaacgagaga ggatgctcac gatacgggtt actgatgatg 3420
aacatgcccg gttactggaa cgttgtgagg gtaaacaact ggcggtatgg atgcggcggg 3480
accagagaaa aatcactcag ggtcaatgcc agcgcttcgt taatacagat gtaggtgttc 3540
cacagggtag ccagcagcat cctgcgatgc agatccggaa cataatggtg cagggcgctg 3600
acttccgcgt ttccagactt tacgaaacac ggaaaccgaa gaccattcat gttgttgctc 3660
aggtcgcaga cgttttgcag cagcagtcgc ttcacgttcg ctcgcgtatc ggtgattcat 3720
tctgctaacc agtaaggcaa ccccgccagc ctagccgggt cctcaacgac aggagcacga 3780
tcatgcgcac ccgtggggcc gccatgccgg cgataatggc ctgcttctcg ccgaaacgtt 3840
tggtggcggg accagtgacg aaggcttgag cgagggcgtg caagattccg aataccgcaa 3900
gcgacaggcc gatcatcgtc gcgctccagc gaaagcggtc ctcgccgaaa atgacccaga 3960
gcgctgccgg cacctgtcct acgagttgca tgataaagaa gacagtcata agtgcggcga 4020
cgatagtcat gccccgcgcc caccggaagg agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca 4080
tcggtcgaga tcccggtgcc taatgagtga gctaacttac attaattgcg ttgcgctcac 4140
tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 4200
cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg 4260
ggcaacagct gattgccctt caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg 4320
ctggtttgcc ccagcaggcg aaaatcctgt ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat 4380
gagctgtctt cggtatcgtc gtatcccact accgagatgt ccgcaccaac gcgcagcccg 4440
gactcggtaa tggcgcgcat tgcgcccagc gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca 4500
gtgggaacga tgccctcatt cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc 4560
cagtcgcctt cccgttccgc tatcggctga atttgattgc gagtgagata tttatgccag 4620
ccagccagac gcagacgcgc cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc 4680
tggtgaccca atgcgaccag atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa 4740
ataatactgt tgatgggtgt ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg 4800
caggcagctt ccacagcaat ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat gatcagccca 4860
ctgacgcgtt gcgcgagaag attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt 4920
tctaccatcg acaccaccac gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg 4980
acaatttgcg acggcgcgtg cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac 5040
tgtttgcccg ccagttgttg tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc 5100
gcttccactt tttcccgcgt tttcgcagaa acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa 5160
acggtctgat aagagacacc ggcatactct gcgacatcgt ataacgttac tggtttcaca 5220
ttcaccaccc tgaattgact ctcttccggg cgctatcatg ccataccgcg aaaggttttg 5280
cgccattcga tggtgtccgg gatctcgacg ctctccctta tgcgactcct gcattaggaa 5340
gcagcccagt agtaggttga ggccgttgag caccgccgcc gcaaggaatg gtgcatgcaa 5400
ggagatggcg cccaacagtc ccccggccac ggggcctgcc accataccca cgccgaaaca 5460
agcgctcatg agcccgaagt ggcgagcccg atcttcccca tcggtgatgt cggcgatata 5520
ggcgccagca accgcacctg tggcgccggt gatgccggcc acgatgcgtc cggcgtagag 5580
gatcgagatc gatctc 5596
<210> 2
<211> 6648
<212> ДНК
<213> artificial sequence
<220>
<223> Плазмидная конструкция pET32v11-Cre:
gatcccgcga aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct 60
ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca tatgcaccat catcatcatc 120
attcttctgg tctggtgcca cgcggttctg gtatgaaaga aaccgctgct gctaaattcg 180
aacgccagca catggacagc ccagatctgg gtaccgacga cgacgacaag gccatgggca 240
gatctgaaaa cctgtacttt cagagcggat ccccggaatt cgagctcccc aagaagaaga 300
ggaaggtgtc caatttactg accgtacacc aaaatttgcc tgcattaccg gtcgatgcaa 360
cgagtgatga ggttcgcaag aacctgatgg acatgttcag ggatcgccag gcgttttctg 420
agcatacctg gaaaatgcta ctgtccgttt gccggtcgtg ggcggcatgg tgcaagttga 480
ataaccggaa atggtttccc gcagaacctg aagatgttcg cgattatctt ctatatcttc 540
aggcgcgcgg tctggcagta aaaactatcc agcaacattt gggccagcta aacatgcttc 600
atcgtcggtc cgggctgcca cgaccaagtg acagcaatgc tgtttcactg gttatgcggc 660
ggatccgaaa agaaaacgtt gatgccggtg aacgtgcaaa acaggctcta gcgttcgaac 720
gcactgattt cgaccaggtt cgttcactca tggaaaatag cgatcgctgc caggatatac 780
gtaatctggc atttctgggg attgcttata acaccctgtt acgtatagcc gaaattgcca 840
ggatcagggt taaagatatc tcacgtactg acggtgggag aatgttaatc catattggca 900
gaacgaaaac gctggttagc accgcaggtg tagagaaggc acttagcctg ggggtaacta 960
aactggtcga gcgatggatt tccgtctctg gtgtagctga tgatccgaat aactacctgt 1020
tttgccgggt cagaaaaaat ggtgttgccg cgccatctgc caccagccag ctatcaactc 1080
gcgccctgga agggattttt gaagcaactc atcgattgat ttacggcgct aaggatgact 1140
ctggtcagag atacctggcc tggtctggac acagtgcccg tgtcggagcc gcgcgagata 1200
tggcccgcgc tggagtttca ataccggaga tcatgcaagc tggtggctgg accaatgtaa 1260
atattgtcat gaactatatc cgtaacctgg atagtgaaac aggggcaatg gtgcgcctgc 1320
tggaagatgg cgattaggtc gactcgatcg agcggccgca tcgtgactga ctgacgatct 1380
cgagcaccac caccaccacc actgagatcc ggctgctaac aaagcccgaa aggaagctga 1440
gttggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt 1500
cttgaggggt tttttgctga aaggaggaac tatatccgga ttggcgaatg ggacgcgccc 1560
tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt 1620
gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc 1680
ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta 1740
cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc 1800
tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg 1860
ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt 1920
ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat 1980
tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga 2040
acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa 2100
ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt 2160
gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg 2220
ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg 2280
gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg 2340
agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag 2400
caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca 2460
gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg 2520
agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc 2580
gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg 2640
aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgcagcaat ggcaacaacg 2700
ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac 2760
tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg 2820
tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg 2880
gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact 2940
atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa 3000
ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 3060
aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 3120
ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct 3180
ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt 3240
tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 3300
cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 3360
gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc 3420
gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 3480
tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa 3540
ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg 3600
gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg 3660
ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga 3720
tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt 3780
ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct 3840
gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga 3900
acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcctgat gcggtatttt 3960
ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatatg gtgcactctc agtacaatct 4020
gctctgatgc cgcatagtta agccagtata cactccgcta tcgctacgtg actgggtcat 4080
ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc 4140
ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc 4200
accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagct gcggtaaagc tcatcagcgt ggtcgtgaag 4260
cgattcacag atgtctgcct gttcatccgc gtccagctcg ttgagtttct ccagaagcgt 4320
taatgtctgg cttctgataa agcgggccat gttaagggcg gttttttcct gtttggtcac 4380
tgatgcctcc gtgtaagggg gatttctgtt catgggggta atgataccga tgaaacgaga 4440
gaggatgctc acgatacggg ttactgatga tgaacatgcc cggttactgg aacgttgtga 4500
gggtaaacaa ctggcggtat ggatgcggcg ggaccagaga aaaatcactc agggtcaatg 4560
ccagcgcttc gttaatacag atgtaggtgt tccacagggt agccagcagc atcctgcgat 4620
gcagatccgg aacataatgg tgcagggcgc tgacttccgc gtttccagac tttacgaaac 4680
acggaaaccg aagaccattc atgttgttgc tcaggtcgca gacgttttgc agcagcagtc 4740
gcttcacgtt cgctcgcgta tcggtgattc attctgctaa ccagtaaggc aaccccgcca 4800
gcctagccgg gtcctcaacg acaggagcac gatcatgcgc acccgtgggg ccgccatgcc 4860
ggcgataatg gcctgcttct cgccgaaacg tttggtggcg ggaccagtga cgaaggcttg 4920
agcgagggcg tgcaagattc cgaataccgc aagcgacagg ccgatcatcg tcgcgctcca 4980
gcgaaagcgg tcctcgccga aaatgaccca gagcgctgcc ggcacctgtc ctacgagttg 5040
catgataaag aagacagtca taagtgcggc gacgatagtc atgccccgcg cccaccggaa 5100
ggagctgact gggttgaagg ctctcaaggg catcggtcga gatcccggtg cctaatgagt 5160
gagctaactt acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc 5220
gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg 5280
ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc ttcaccgcct 5340
ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca cgctggtttg ccccagcagg cgaaaatcct 5400
gtttgatggt ggttaacggc gggatataac atgagctgtc ttcggtatcg tcgtatccca 5460
ctaccgagat gtccgcacca acgcgcagcc cggactcggt aatggcgcgc attgcgccca 5520
gcgccatctg atcgttggca accagcatcg cagtgggaac gatgccctca ttcagcattt 5580
gcatggtttg ttgaaaaccg gacatggcac tccagtcgcc ttcccgttcc gctatcggct 5640
gaatttgatt gcgagtgaga tatttatgcc agccagccag acgcagacgc gccgagacag 5700
aacttaatgg gcccgctaac agcgcgattt gctggtgacc caatgcgacc agatgctcca 5760
cgcccagtcg cgtaccgtct tcatgggaga aaataatact gttgatgggt gtctggtcag 5820
agacatcaag aaataacgcc ggaacattag tgcaggcagc ttccacagca atggcatcct 5880
ggtcatccag cggatagtta atgatcagcc cactgacgcg ttgcgcgaga agattgtgca 5940
ccgccgcttt acaggcttcg acgccgcttc gttctaccat cgacaccacc acgctggcac 6000
ccagttgatc ggcgcgagat ttaatcgccg cgacaatttg cgacggcgcg tgcagggcca 6060
gactggaggt ggcaacgcca atcagcaacg actgtttgcc cgccagttgt tgtgccacgc 6120
ggttgggaat gtaattcagc tccgccatcg ccgcttccac tttttcccgc gttttcgcag 6180
aaacgtggct ggcctggttc accacgcggg aaacggtctg ataagagaca ccggcatact 6240
ctgcgacatc gtataacgtt actggtttca cattcaccac cctgaattga ctctcttccg 6300
ggcgctatca tgccataccg cgaaaggttt tgcgccattc gatggtgtcc gggatctcga 6360
cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg aagcagccca gtagtaggtt gaggccgttg 6420
agcaccgccg ccgcaaggaa tggtgcatgc aaggagatgg cgcccaacag tcccccggcc 6480
acggggcctg ccaccatacc cacgccgaaa caagcgctca tgagcccgaa gtggcgagcc 6540
cgatcttccc catcggtgat gtcggcgata taggcgccag caaccgcacc tgtggcgccg 6600
gtgatgccgg ccacgatgcg tccggcgtag aggatcgaga tcgatctc 6648
<210> 3
<211> 411
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Белок 6-His-S-NLS-Cre
<400> 3
Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser 16
1 5 10 15
Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp 32
20 25 30
Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Gly Arg Ser 48
35 40 45
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ser Pro Glu Phe Glu Leu Pro Lys 64
50 55 60
Lys Lys Arg Lys Val Ser Asn Leu Leu Thr Val His Gln Asn Leu Pro 80
65 70 75 80
Ala Leu Pro Val Asp Ala Thr Ser Asp Glu Val Arg Lys Asn Leu Met 96
85 90 95
Asp Met Phe Arg Asp Arg Gln Ala Phe Ser Glu His Thr Trp Lys Met 112
100 105 110
Leu Leu Ser Val Cys Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu Asn Asn 128
115 120 125
Arg Lys Trp Phe Pro Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr Leu Leu 144
130 135 140
Tyr Leu Gln Ala Arg Gly Leu Ala Val Lys Thr Ile Gln Gln His Leu 160
145 150 155 160
Gly Gln Leu Asn Met Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg Pro Ser 176
165 170 175
Asp Ser Asn Ala Val Ser Leu Val Met Arg Arg Ile Arg Lys Glu Asn 192
180 185 190
Val Asp Ala Gly Glu Arg Ala Lys Gln Ala Leu Ala Phe Glu Arg Thr 208
195 200 205
Asp Phe Asp Gln Val Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arg Cys Gln 224
210 215 220
Asp Ile Arg Asn Leu Ala Phe Leu Gly Ile Ala Tyr Asn Thr Leu Leu 240
225 230 235 240
Arg Ile Ala Glu Ile Ala Arg Ile Arg Val Lys Asp Ile Ser Arg Thr 256
245 250 255
Asp Gly Gly Arg Met Leu Ile His Ile Gly Arg Thr Lys Thr Leu Val 272
260 265 270
Ser Thr Ala Gly Val Glu Lys Ala Leu Ser Leu Gly Val Thr Lys Leu 288
275 280 285
Val Glu Arg Trp Ile Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro Asn Asn 304
290 295 300
Tyr Leu Phe Cys Arg Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro Ser Ala 320
305 310 315 320
Thr Ser Gln Leu Ser Thr Arg Ala Leu Glu Gly Ile Phe Glu Ala Thr 336
325 330 335
His Arg Leu Ile Tyr Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Arg Tyr Leu 352
340 345 350
Ala Trp Ser Gly His Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg Asp Met Ala 368
355 360 365
Arg Ala Gly Val Ser Ile Pro Glu Ile Met Gln Ala Gly Gly Trp Thr 384
370 375 380
Asn Val Asn Ile Val Met Asn Tyr Ile Arg Asn Leu Asp Ser Glu Thr 400
385 390 395 400
Gly Ala Met Val Arg Leu Leu Glu Asp Gly Asp 411
405 410
<210> 4
<211> 4743
<212> ДНК
<213> artificial sequence
<220>
<223> Плазмидная конструкция pBl-Lox-PSMC-Lox-F3
<440> 4
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtacccc 660
acccgggtgg aaaatcgatg ggcccgcggc cgctctagaa gtactctcga gtaaactcct 720
cttcagacct aataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatattaa gggttattga 780
atattatcgg gaattaattc tttggatcca ctagtgtcga ggtcaacggc cgcatgtatg 840
ccctgcgaga acggcgagtc catgtcactc aggaggactt tgagatggca gtagccaagg 900
tataggcctc catctttgtg cctttgccag tggtggctct ggggcagtgg gctagggcat 960
gtgtgtgttc gtaacttaat gttcattctc tctcccaccc ctaggtcatg cagaaggaca 1020
gtgagaaaaa catgtccatc aagaaattat ggaagtgagt ggacagcctt tgtgtgtatc 1080
tctccaataa agctctgtgg gccaagtcct ctaggactcc agtctgttaa tgagggctgt 1140
gctgttcaag gaccaggtcc aggcaccacc aatagacaaa aggatttatt tggaaatttc 1200
caaacctgcc agatgtggca ctcgccaagc cctaggccca ccctcctcac caagctccaa 1260
agggcaacac cagtcctccc agcctcccca ttcaccttac cctggcctcc acatgcacat 1320
accccatacc tcaggccatg ctagagaact ggagtgtccc ctccccggcc caagccgctg 1380
gagaggcagc cctctggcat cccaggagat gatggcggcc agagccgctt gcatagattg 1440
aggaaagaaa agaaggaggc acctaacagg ctccctgaaa acccccaact tacccctgta 1500
caaaaaaagt ggctcccaca tagaaaactt gctcccaaaa tagtgcaaat acccaaagga 1560
aaggaaaaaa ccagcagcaa ggctgggctt gtaggaatgg caaagaactt tggtttagaa 1620
aggctaggaa gagtctgggc tgcacctcct cttcctagcc cagctcccca gagccagctc 1680
tgaccctcgc cccaggggga gtctgtaaac atgcaaaccc agcagccttt ggttcggaaa 1740
tgtcttacaa tgtcaaagca cagcctccag cagtcctact tgggcctgcc tgcagggggg 1800
cagaggaggc atctgctgaa cccaattaaa gccaatgcaa aaagtataag gctttgggga 1860
ccaagcaaca aggaatccta tcactacatt tataagacta aagctggaga gtagagggtg 1920
acagcagaca ctcctcaccc cagcctacgt gtctgcggcc ccagcaagga cccagagggt 1980
ggtctccctc caggctccag ggctgggaag aaagatccct gagcagttag gtcaggcgaa 2040
ttcccagcac ctgttccagt tcctgccttc gctgctgcac ctggagaagg gagaaaccaa 2100
gtggctcagg cctttgctac tcacggccaa aggagggaaa acagggcaga gcctcacctt 2160
ggcaaagatg tgcctgccta ctgcttcctg ggcccagggc tggtggtaga aagcagctcg 2220
tctctccggc cgttgacggt atcgataagc ttgatctaga actagtggat ctaaactcct 2280
cttcagacct aataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatattaa gggttattga 2340
atattatcgg gaattcgata tcaagcttat cgataccgtc gacggtatcg ataagcttga 2400
agttcctata ctatttgaag aataggaact tcggaatagg aacttcaaga tccccctggc 2460
gaaggaattc ctgcagccca tcgaattcct gcagcccggg ggatccacta gttctagagc 2520
ggccgccacc gcggtggagc tccagctttt gttcccttta gtgagggtta attgcgcgct 2580
tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac 2640
acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac 2700
tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc 2760
tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 2820
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 2880
actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 2940
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 3000
ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 3060
acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 3120
ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 3180
cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 3240
tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 3300
gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 3360
ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 3420
acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 3480
gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 3540
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 3600
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 3660
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 3720
tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 3780
ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 3840
taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 3900
cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 3960
gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 4020
gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg 4080
tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 4140
gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 4200
ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 4260
ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 4320
cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata 4380
ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 4440
gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 4500
ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 4560
ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 4620
tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 4680
ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 4740
cac 4743
Свободный текст перечня последовательностей
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии
гена Российской академии наук (Institute of Gene Biology Russian Academy of
Sciences)
<120> Штамм клеток Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующих
сайт-специфическую рекомбиназу Cre
<160> 4
<210> 1
<211> 5596
<212> ДНК
<213> artificial sequence
<220>
<223> Плазмидная конструкция pET32v11:
102-311 п.н. -> прямая цепь, 210 п.н.; рамка считывания, кодирующая химерный
белок, включающий 6-ти гистидиновый эпитоп, сайт расщепления тромбином, S-эпитоп,
сайты расщепления энтерокиназой и TEV протеазой.
1088-1945 п.н. -> прямая цепь, 858 п.н.; ген устойчивости к ампициллину
(β-лактамаза) 4140-5219 нт -> обратная цепь, 1080 п.н.; ген lac репрессора
(lacI) из E.coli 3137-3328 п.н. -> обратная цепь, 192 п.н.; ген rop из E.coli,
кодирующий белок,
регулирующий копийность плазмиды
<210> 2
<211> 648
<212> ДНК
<213> artificial sequence
<220>
<223> Плазмидная конструкция pET32v11-Cre:
102-1334 п.н. -> прямая цепь, 1233 п.н.; рамка считывания, кодирующая
рекомбинантный белок 6-His-S-NLS-Cre
2140-2997 п.н. -> прямая цепь, 858 п.н.; ген устойчивости к ампициллину
(β-лактамаза)
5192-6271 п.н. -> обратная цепь, 1080 п.н.; ген lac репрессора (lacI) из
E.coli
4189-4380 п.н. -> обратная цепь, 192 п.н.; ген rop из E.coli, кодирующий
белок, регулирующий копийность плазмиды
<210> 3
<211> 411
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Белок 6-His-S-NLS-Cre:
2-7: 6-гистидиновый эпитоп (HHHHHH)
11-16: Сайт расщепления тромбином (LVPRGS)
19-33: S-эпитоп из панкреатической РНКазы А (KETAAAKFERQHMDS)
39-43: Сайт расщепления энтерокиназы (DDDDK)
49-55: Сайт расщепления TEV протеазы (ENLYFQS)
63-69: Сигнал ядерной локализации из большого Т антигена вируса SV40, NLS
(PKKKRKV)
70-411: аминокислотная последовательность белка Cre без стартового метионина
(2-343 а.о.)
<210> 4
<211> 4743
<212> ДНК
<213> artificial sequence
<220>
<223> Плазмидная конструкция pBl-Lox-PSMC-Lox-F3:
3755-4612 п.н. -> прямая цепь, 858 п.н.; ген устойчивости к ампициллину
(β-лактамаза)
<---
Claims (4)
1. Рекомбинантная плазмида pET32v11-Cre, имеющая последовательность SEQ ID NO: 2 и обеспечивающая синтез рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre, имеющего последовательность SEQ ID NO: 3, в клетках Escherichia coli, за счет расположения гена рекомбиназы Cre в 3’-области относительно T7 промотора и lac оператора и в 5’-области относительно T7 терминатора, и полученная путем клонирования кДНК рекомбиназы Cre в вектор pET32v11, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1, таким образом, чтобы кДНК рекомбиназы Cre с N-концевой NLS находилась в одной рамке считывания с 6-гистидиновым и S-эпитопами и аминокислотными последовательностями сайтов расщепления тромбина, энтерокиназы и протеазы TEV.
2. Штамм клеток Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующий рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre, который имеет последовательность SEQ ID NO: 3, и полученный путем трансформации штамма клеток Escherichia coli BL21(DE3) плазмидой по п.1.
3. Способ получения белка 6His-S-NLS-Cre, имеющего последовательность SEQ ID NO: 3, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre по п.2, индукцию синтеза рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre, имеющего последовательность SEQ ID NO: 3, получение клеточного лизата и очистку белка 6His-S-NLS-Cre, имеющего последовательность SEQ ID NO: 3, с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии и катионообменной хроматографии.
4. Способ по п.3, в котором выход каталитически активной рекомбиназы Cre составляет около 17 мкг с 1 мл культуры.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020144117A RU2761637C1 (ru) | 2020-12-30 | 2020-12-30 | Штамм клеток Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующих сайт-специфическую рекомбиназу Cre |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020144117A RU2761637C1 (ru) | 2020-12-30 | 2020-12-30 | Штамм клеток Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующих сайт-специфическую рекомбиназу Cre |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2761637C1 true RU2761637C1 (ru) | 2021-12-13 |
Family
ID=79174982
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2020144117A RU2761637C1 (ru) | 2020-12-30 | 2020-12-30 | Штамм клеток Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующих сайт-специфическую рекомбиназу Cre |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2761637C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2774333C1 (ru) * | 2021-12-27 | 2022-06-17 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Рекомбинантная плазмида pET-GST-3CL-GPG, обеспечивающая синтез протеазы 3CL SARS-CoV-2 в клетках E.coli в растворимой форме |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2633504C1 (ru) * | 2016-12-27 | 2017-10-12 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Штамм E.coli - продуцент полноразмерного протективного антигена Bacillus anthracis в форме вирусоподобных частиц |
-
2020
- 2020-12-30 RU RU2020144117A patent/RU2761637C1/ru active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2633504C1 (ru) * | 2016-12-27 | 2017-10-12 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Штамм E.coli - продуцент полноразмерного протективного антигена Bacillus anthracis в форме вирусоподобных частиц |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
GUO F. et al., Structure of Cre recombinase complexed with DNA in a site-specific recombination synapse, Nature, 1997, 389 (6646), с. 40-46, doi: 10.1038/37925. * |
БУЙНИЦКАЯ С. В. и др. Оптимизация метода рекомбинерии для направленного мутагенеза бактерий PSEUDOMONAS CORRUGATA 3ʹ, Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты, Том 11, 30.04.2019, с. 45-61. * |
БУЙНИЦКАЯ С. В. и др. Оптимизация метода рекомбинерии для направленного мутагенеза бактерий PSEUDOMONAS CORRUGATA 3ʹ, Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты, Том 11, 30.04.2019, с. 45-61. GUO F. et al., Structure of Cre recombinase complexed with DNA in a site-specific recombination synapse, Nature, 1997, 389 (6646), с. 40-46, doi: 10.1038/37925. * |
ШЕПЕЛЕВ М.В. и др. Метод очистки вырезанных из плазмиды фрагемнтов ДНК от вектора в гомогенном формате без использования электрофореза в агарозном геле, БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития, материалы IX международного конгресса, Москва, 2017, с. 220-221. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2774333C1 (ru) * | 2021-12-27 | 2022-06-17 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Рекомбинантная плазмида pET-GST-3CL-GPG, обеспечивающая синтез протеазы 3CL SARS-CoV-2 в клетках E.coli в растворимой форме |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2020289750B2 (en) | Engineered meganucleases with recognition sequences found in the human T cell receptor alpha constant region gene | |
KR102506185B1 (ko) | 표적 핵산의 변형을 위한 개선된 방법 | |
KR20210149060A (ko) | Tn7-유사 트랜스포존을 사용한 rna-유도된 dna 통합 | |
AU2014273089B2 (en) | A LAGLIDADG homing endonuclease cleaving the C-C Chemokine Receptor Type-5 (CCR5) gene and uses thereof | |
AU2023270322A1 (en) | Compositions and methods for modifying genomes | |
US20190112596A1 (en) | Tal-effector assembly platform, customized services, kits and assays | |
KR20180081618A (ko) | 유전자 편집에 의한 인간 디스트로핀 유전자의 교정을 위한 치료용 표적 및 사용 방법 | |
AU2016333898A1 (en) | Genetically-modified cells comprising a modified human T cell receptor alpha constant region gene | |
CN110055224A (zh) | 一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用 | |
CN104342410B (zh) | 一种酮还原酶突变体及其制备方法 | |
CN104342411B (zh) | 活性增强的酮还原酶突变体、编码序列及其制备方法 | |
CN104342412B (zh) | 用于生产(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的酮还原酶突变体 | |
KR20100057016A (ko) | 생활성 펩티드의 발현 및 정제를 위한 가용성 태그 | |
KR20210151916A (ko) | 뒤시엔느 근육 이영양증의 치료를 위한 aav 벡터-매개된 큰 돌연변이 핫스팟의 결실 | |
CN112154211A (zh) | 用于束缚供体dna的修饰的核酸编辑系统 | |
CN113584134A (zh) | 一种基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测系统及其方法和应用 | |
CN113939595A (zh) | 包括人源化白蛋白基因座的非人动物 | |
KR102330593B1 (ko) | 신규 이소프렌 신타아제 및 이를 이용한 이소프렌의 제조방법 | |
KR100958096B1 (ko) | 염색체 특정 부위 제거용 재조합 벡터 및 이를 이용한미생물 내 염색체 특정 부위의 제거방법 | |
CN113122513B (zh) | 一种丹参p450突变体及其应用 | |
RU2761637C1 (ru) | Штамм клеток Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующих сайт-специфическую рекомбиназу Cre | |
KR20130078265A (ko) | 감염력이 있는 구제역바이러스 O형 cDNA 클론 및 클론의 전체염기서열 | |
CN113846019B (zh) | 一种海洋微拟球藻靶向表观基因组遗传调控方法 | |
CN113755518B (zh) | 一种构建重组解脂耶氏酵母的方法与应用 | |
CN109337851B (zh) | 一种在枯草芽孢杆菌的芽孢表面高效展示海藻糖合酶的方法 |