KR100958096B1 - 염색체 특정 부위 제거용 재조합 벡터 및 이를 이용한미생물 내 염색체 특정 부위의 제거방법 - Google Patents

염색체 특정 부위 제거용 재조합 벡터 및 이를 이용한미생물 내 염색체 특정 부위의 제거방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 염색체 특정 부위 제거용 재조합 벡터 및 이를 이용한 미생물 내 염색체 특정 부위의 제거방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 아라비노즈에 의해 유도되는 프로모터; 람다(λ)-레드(red) 재조합에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자; 람노즈에 의해 유도되는 프로모터; 및 I-SceI 제한효소를 코딩하는 유전자;를 포함하는, 염색체 특정 부위 제거용 재조합 벡터로, 기존 방법에 비해 보다 간편하고 빠르게, 선별마커를 남기지 않고, 미생물 내 특정 유전자를 연속적으로 제거할 수 있다.
유전자 제거, 람다-레드 재조합 (λ-red recombination), 람노즈, 아라비노즈, 유전체 재조합

Description

염색체 특정 부위 제거용 재조합 벡터 및 이를 이용한 미생물 내 염색체 특정 부위의 제거방법 {A RECOMBINANT VECTOR FOR DELETING SPECIFIC REGIONS OF THE CHROMOSOME AND A METHOD FOR DELETING SPECIFIC CHROMOSOMAL REGIONS OF CHROMOSOME IN THE MICROORGANISM USING THE SAME}
본 발명은 보다 효과적이고 용이하게 미생물 내 여러 염색체 특정 부위를 동시에 제거할 수 있는 염색체 특정 부위 제거용 재조합 벡터 및 이를 이용한 미생물 내 염색체 특정 부위의 제거방법에 관한 것이다.
생물 공학의 눈부신 발전에 힘입어, 포스터 게놈 시대의 도래와 함께 많은 생명체의 유전자 정보를 토대로 생물산업에 널리 이용될 수 있는 산업용 균주가 제조되고 있다. 그러나, 현재의 많은 산업용 균주들은 불필요한 물질을 만드는 유전자군에 의해 과도한 에너지 소모 및 부산물의 생산 등과 같은 문제를 야기해 고순도 유용물질 대량 생산에는 매우 비적합하다. 따라서 불필요한 유전자군을 유전체로부터 제거하여, 생산성이 획기적으로 증대된 새로운 고기능 대사공학용 균주 및 세포주를 인위적으로 구축하고자, 미생물 유전체에서 산업적으로 불필요한 유전자군을 빠른 시간 내에 보다 효과적이고 용이하게 제거하는 기술들이 연구되고 있다.
종래에 알려진 대장균 염색체의 특정 부위를 제거하는 기술들은, 제거하고자 하는 특정 부위의 재조합부위와 선별 마커를 포함한 선형 DNA 단편과 상기 선형 DNA 단편의 유전체 삽입과 제거에 필요한 기능을 지닌 두 개의 벡터를 이용해야 한다. 구체적으로, 첫 번째 단계에서 재조합 기능을 가진 벡터를 이용하여 제거하고자 하는 염색체 특정 부위에 선별마커를 지닌 선형 DNA 단편을 재조합시켜 삽입함으로써, 염색체부위를 제거하며, 상기 단계가 끝난 후에 처음 넣어준 벡터를 대장균 내에서 제거한다. 다음으로, 두 번째 단계에서 염색체 특정 부위 제거시 사용한 선형 DNA 단편의 선별 마커를 제거하기 위한 벡터를 다시 넣어 주어, 선별마커 유전자를 제거시킨다. 그러므로, 종래 방법을 이용하게 되는 경우, 여러 곳의 대장균 염색체 특정 부위를 제거할 경우, 제거시 마다 매 단계에 필요한 두 개의 벡터를 차례로 넣어주고, 제거해야하므로, 방법상 번거롭고 시간이 낭비되는 많은 문제점을 가지고 있다.
본 발명의 목적은 미생물 내 특정 유전자 부위를 빠르고 효과적이면서도 연속적으로 제거할 수 있는 특정 유전자 부위 제거용 재조합 벡터 및 이를 이용한 미생물 내 염색체 특정 부위의 제거방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은, 아라비노즈에 의해 유도되는 프로모터 (Para); 람다(λ)-레드(red) 재조합에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자; 람노즈에 의해 유도되는 프로모터 (Prha); 및 I-SceI 제한효소를 코딩하는 유전자; 를 포함하는, 서열번호 1과 도 1의 개열지도를 가지는 염색체 특정 부위 제거용 재조합 벡터를 제공한다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은,
미생물에 도입시 람다-레드 재조합에 관여하는 상동부위 A 및 상동부위 B; 선별마커; 선별마커 제거를 위한 상동 재조합에 관여하는 I-SceI 제한효소 절단부위; 및 선별마커 제거를 위한 상동 재조합에 관여하는 상동부위 C;를 포함하는 선형 DNA 단편을 제조하는 단계;
상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물에 상기 선형 DNA 단편을 도입하여, 상기 DNA 단편 상의 상동 부위들과 이들과 상동인 미생물 염색체 부위간의 람다-레드 재조합을 이용하여, 상기 선형 DNA 단편을 미생물 염색체의 특정 위치에 대체 (replacment)시키는 단계; 및
상기 특정 염색체 부분이 대체된 미생물을 람노즈를 함유하는 배지에서 배양하여 I-SceI 제한효소를 발현시켜, 상기 DNA 단편 상의 상동부위 C 및 이와 상동인 미생물 염색체 부위 간의 상동 재조합 (homologous recombination)을 유발하여 선별마커를 제거하는 단계를 포함하고,
상기 상동부위 A는 미생물 염색체의 제거하고자 하는 부분의 한 쪽 말단의 50 내지 500bp와 상동인 부위이고, 상동부위 B는 상기 미생물 염색체의 제거하고자 하는 부분의 다른 쪽 말단의 50 내지 500bp와 상동인 부위이며,
상기 상동부위 C는 상기 상동부위 A 및 상동부위 B와 상동인 미생물 염색체 부위 중 어느 하나와 인접하는 300 내지 500bp 부위와 상동인 부위인 것을 특징으로 하는, 상기 재조합 벡터를 이용하여 미생물 내 특정 염색체 부위를 제거하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서,
상기 미생물에 도입시 람다-레드 재조합에 관여하는 상동부위 A 및 상동부위 B; 선별마커; 선별마커 제거를 위한 상동 재조합에 관여하는 I-SceI 제한효소 절단부위; 및 선별마커 제거를 위한 상동 재조합에 관여하는 상동부위 C;를 포함하는 선형 DNA 단편을 제조하는 단계; 및
상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물에 상기 선형 DNA 단편을 도입하여, 상기 DNA 단편 상의 상동 부위들과 이들과 상동인 미생물 염색체 부위간의 람다-레드 재조합을 이용하여, 상기 선형 DNA 단편을 미생물 염색체의 특정 위치에 대체 (replacement)시키는 단계;를 반복함으로써, 서로 다른 복수의 선형 DNA 단편을 제조하여 제1항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물에 도입하는 것인, 미생물 내 복수의 특정 염색체 부위를 제거하는 방법일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 선별마커는 서열번호 13의 염기서열을 가지는 클로람페니콜 저항 유전자, 서열번호 14의 염기서열을 가지는 카나마이신 저항 유전자 및 sacB로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 선별마커를 제거하는 단계 후에, 상기 미생물을 자당(sucrose)을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 상동부위 A, 상동부위 B 및 상동부위 C는 각각 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17의 염기서열을 가질 수 있고, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 상동부위 A, 상동부위 B 및 상동부위 C는 각각 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24의 염기서열을 가질 수 있으며, 또 다른 실시예에 따르면, 상기 상동부위 A, 상동부위 B 및 상동부위 C는 각각 서열번호 31, 서열번호 32 및 서열번호 33의 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제거하고자 하는 미생물 내 특정 염색체 부위가 미생물 생존에 필수적인 유전자를 포함하고, 상기 선형 DNA 단편은 상기 상동부위 A와 상동부위 C 사이에 상기 미생물 생존에 필수적인 유전자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 필수적인 유전자는 서열번호 43의 argS이고, 상기 상동부위 A, 상동부위 B 및 상동부위 C는 각각 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 42의 염기서열을 가질 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 염색체 특정 부위 제거용 재조합 벡터는 다수의 벡터를 이용한 종래 유전자 제거방법에 비해, 하나의 벡터를 이용하여 보다 간편하고, 빠르게, 특정 유전자를 연속적으로 제거할 수 있으며, 필수유전자를 포함한 부위도 한번의 제거작업으로 신속하면서도 효율적으로 미생물 내 특정 유전자 부위를 제거할 수 있다.
본 발명은 미생물 내 염색체 특정 부위 제거에 이용되는, 람다-레드 재조합 (λ-red recombintion) 및 I-SceI 제한효소 발현 기능을 위해, 두 개의 벡터를 사용해야 하는 종래의 단점을 해결하고자, 상기 두 개의 기능을 각각 다른 유도방법을 이용하여 하나의 벡터를 통해 발현할 수 있게 하는 재조합 벡터 (pREDI)에 관한 것으로, 미생물 내 염색체 특정 부위 제거를 위한 재조합 벡터 (pREDI), 상기 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 및 상기 재조합 벡터와 선별마커를 포함한 선형 DNA 단편을 이용한, 미생물 내 염색체 특정 부위의 제거방법에 관한 것이다.
더욱 상세하게는 본 발명은, 아라비노즈에 의해 유도되는 프로모터 (Para); 람다-레드 재조합에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자; 람노즈에 의해 유도되는 프로모터 (Prha); 및 I-SceI 제한효소를 코딩하는 유전자;를 포함하는 미생물 내 염색체 특정 부위 제거용 재조합 벡터에 관한 것으로, 상기 재조합 벡터는 서열번호 1의 염기서열을 가지며, 도 1의 개열지도로 표시된다.
여기에서, 람다(λ)-레드(red) 재조합(recombination)에 관여하는 단백질은 Datsenko, K. A. et al.를 포함한 종래 문헌에 기재된 바와 같이, 갬 (Gam), 베트 (Bet) 및 엑소 (Exo)로 구성된 복합단백질로, 이들은 각각 γ, β, exo 유전자에 의해 발현되며, 갬 (Gam)은 숙주 RecBCD 엑소뉴클레이즈(exonuclease) V를 억제하여, 베트 (Bet)와 엑소 (Exo)가 재조합을 촉진하는 DNA 말단에 접근할 수 있도록 한다 (Datsenko, K. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6640, 2000; Murphy, K. C., J. Bacteriol., 180:2063, 1998).
본 발명에 있어서는, 아라비노즈 (arabinose)에 의해 유도되는 람다-레드 재조합에 관여하는 단백질로, 상기 재조합 벡터는 아라비노즈에 의해 유도되는 프로모터 (Para)(서열번호 2)와 함께 람다-레드 재조합 관여 단백질을 코딩하는 유전자인 γ, β, exo 유전자(서열번호 3)를 포함한다. 또한, 상기 람다-레드 재조합 관여 단백질(γ, β, exo)은 선형 DNA 단편의 상동 재조합(homologous-recombination)에 의한 염색체 내로의 삽입시에 람다-레드 재조합이 일어나도록 하는 것이며, 상기 갬을 코딩하는 γ 유전자, 베트를 코딩하는 β 유전자, 엑소를 코딩하는 exo 유전자는 각각 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 가 질 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 벡터는, 람노즈(rhamnose)에 의해 유도되는 I-SceI 제한효소를 발현하여, I-SceI 제한효소 인식 부위가 특이적으로 절단되도록 하는 것으로, 유전체 내에 삽입된 선형 DNA 단편에 포함되어 있는 I-SceI 제한효소 인식 부위를 절단하여 선형 DNA에 포함된 염색체 일부 단편과, 이와 상동성을 가지는 미생물 염색체 부위 사이의 상동 재조합이 촉진되도록 하는 것이다. 상기 람노즈(rhamnose)에 의해 유도되는 I-SceI 제한효소를 발현하기 위해, 상기 람노즈에 의해 유도되는 프로모터 (Prha) (서열번호 7) 및 I-SceI 제한효소를 코딩하는 유전자(서열번호 8)를 함께 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 대장균에 관한 것이다.
아울러, 본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터 (pREDI)와 선별마커를 포함한 선형 DNA 단편을 이용하여 미생물 내 염색체 특정 부위의 제거방법은, 구체적으로, 하기의 단계를 포함한다:
(1) 선별마커, sacB유전자, I-SceI 제한효소 절단부위 및 미생물 염색체의 일부와의 상동부위(homology arms)가 포함된 선형 DNA 단편을 제조하는 단계;
(2) 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 상기 선형 DNA 단편으로 형질전환 시켜, 상기 재조합 벡터 내 아라비노즈에 의해 유도되는 프로모터 하에서 발현되는 람다-레드 재조합 단백질에 의하여 미생물 내 염색체 특정 부위에 선형 DNA 단편을 대체시키는(replacement) 단계;
(3) 상기 DNA 단편으로 형질전환된 미생물 내 상기 재조합 벡터의 람노즈에 의해 유도되는 프로모터 하에서 발현되는 I-SceI 제한효소를 발현하여 유전체에 남아 있는 선별마커를 제거하는 단계;
또한, 상기 방법은 (4) 상기 선별마커가 서로 다른 둘 또는 그 이상의 선형 DNA 단편을 삽입하여 미생물 내 둘 또는 그 이상의 유전체 부위를 동시에 제거하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 방법은, (5) 미생물 내에 생물 생존에 필수적인 유전자를 포함하는 특정 부위의 제거에 있어서, 상기 필수 유전자를 포함하는 선형 DNA 단편을 이용하여 상기 방법에 의해 필수유전자는 남아있으면서도 원하는 특정 부위만을 빠른 시간 안에 효과적으로 제거할 수 있다.
본 발명에 따른 염색체 특정 부위 제거용 재조합 벡터를 이용하여, 미생물 내 염색체 특정 부위의 제거 방법 중, 상기 단계 (1)에 있어서, 상기 선형 DNA 단편은 선별마커; 람다-레드 재조합에 관여하고 미생물 염색체의 일부와 상동인 50 내지 500bp 정도의 상동부위 A 및 B; 상기 선별 마커 제거에 필요한 I-SceI 제한효소 절단부위; 300 내지 500bp 정도의 상동부위 C; 및 선별 마커의 제거 여부를 확인하기 위한 sacB 유전자를 포함한다.
상기 선별 마커로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 주로 클로람페니콜 저항 유전자(chloramphenicol resistant gene, CmR), 카나마이신 저항 유전자(kanamycin resistant gene, KmR), 테트라사이크린 저항 유전자 (tetracyclin resistant gene, TcR)를 사용가능하며, 이를 포함하는 DNA단편으로 재조합된 염색체를 가지는 변이주는, 해당하는 항생제에 저항성을 갖게 되므로, 염색체 특정 부위가 제거된 변이 주의 선별이 가능해진다.
도 2에 나타난 바와 같이, 상기 상동부위는 염색체가 변형될 미생물의 염색체 일부와 상동인 부분으로, 서열목록 및 도면상에 상동부위(homology arm) A, B 및 C로 표시되어있다. 이들 중 상동부위 A 및 B는 제거될 미생물 염색체 양 말단과 연결된 약 50 내지500bp를 PCR하여 얻은 상동부위로서, 선형 DNA 단편의 양쪽 말단에 위치하며, 선형 DNA 단편의 미생물 내 도입시의 람다-레드 재조합에 관여한다. 상동부위 C는 상동부위 A 또는 B와 상동인 미생물 염색체 중 하나와 연결된 약 300 내지 500bp를 PCR하여 얻은 상동부위로서, 선형 DNA단편의 한쪽 말단의 상동부위에 연이어 위치하며, 선별마커 제거시 상동 재조합에 관여한다. 여기서, 상기 상동부위 A, B 및 C는 대상 미생물과 제거하고자 하는 유전자에 따라 달라진다. 본 발명의 일 실시예로서, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 상동부위 A, B 및 C의 염기서열은 각각 서열번호 15, 16 및 17일 수 있고, 서열번호 22, 23 및 24일 수 있고, 서열번호 31, 32 및 33일 수 있으며, 서열번호 40, 41 및 42일 수 있다.
또한, 상기 I-SceI 제한효소 절단 부위(서열번호 52)는 18염기쌍으로 되어있고, 대장균(E. coli) 염색체에는 I-SceI 제한효소 절단 부위가 존재하지 않기 때문에, 특정 유전자의 제거를 위한 상기 선형 DNA 단편은 I-SceI 제한 효소 절단부위를 포함하고 있어야 한다.
상기 단계 (2)에 있어서, 상기 재조합 벡터로 통상적인 일렉트로포레이션(electrophoration)을 이용하여 미생물 균주를 형질전환시키고, 상기 선형 DNA 단편을 다시 일렉트로포레이션을 이용하여 상기 미생물 균주에 전달한다. 도 2에 나타난 바와 같이, 상기 선형 DNA 단편의 양 말단에 위치하는 미생물 염색체와의 상동부위 A 및 B와 이와 상동인 미생물 염색체 부위 간의 람다-레드 재조합 (λ-red recombination)에 의하여 상기 DNA 단편을 미생물 균주 염색체의 특정 위치에 대체(replacement)시켜 해당 염색체 특정 위치부분을 제거시킨 후, 상기 선형 DNA 단편이 대체된 미생물 변이주를 선별 마커의 종류에 따라 해당 항생제를 포함하는 배지에서 배양하여 선별한다. 또한, 상기 선별된 변이주 내의 람다-레드 재조합에 의한 선형 DNA 단편의 대체를 PCR을 통하여 확인할 수 있다.
상기 단계 (3)에 있어서, 도 2에 나타난 바와 같이, 선형 DNA 단편이 대체된 미생물 변이주를 선별한 후, 람노즈에 의해 유도되는 I-SceI 제한효소를 발현시켜서, 상기 선형 DNA 단편의 한쪽 말단에 위치하는 미생물 염색체의 상동부위 C 및 이와 상동성을 가지는 미생물 염색체 부위 사이의 상동 재조합을 촉진시킴으로써, 미생물 변이주 내의 선별마커를 제거한다. 상기 재조합 벡터에 존재하는 I-SceI 제한효소 유전자는 람노즈 프로모터에 의해서 전사조절되므로, 상기 재조합 벡터가 도입된 변이주를 람노즈가 존재하는 배지에서 배양하여 I-SceI 유전자를 발현시킴으로써, I-SceI 제한효소 인식 부위가 특이적으로 절단되도록 한다. 이와 같이 I-SceI 제한효소 인식 부위가 특이적으로 절단됨으로써, 선형 DNA 단편에 포함된 미생물 염색체 일부와의 상동부위와, 이와 상동성을 가지는 미생물 염색체 부위 사이의 상동 재조합 (homologous recombination)이 촉진된다.
또한, 상기 미생물 변이주를 자당(sucrose)이 포함된 배지에서 배양하여, 미생물 변이주에 도입된 선형 DNA 단편 내의 sacB 유전자를 발현시켜 독성을 유발시 킨다. 일반적으로, sacB 유전자는 레반수크라아제(levansucrase)를 발현시키며, 이는 자당(sucrose)을 포도당(glucose) 및 과당(fructose)으로 분해하고, 과당을 중합체인 레반(levan)으로 합성한다. 이 때, 상기 레반이 미생물에 대하여 독성을 가지고 있기 때문에, sacB 유전자(서열번호 53)를 지닌 미생물은 자당이 포함된 배지에서 생존하지 못한다. 따라서, 상동 재조합에 의하여 선별마커가 제거된 미생물 변이주를 자당을 포함하는 배지에서 배양함으로써 선별할 수 있다.
또한, 추가적으로, 상기 단계 (4)에 있어서, 상기 방법을 응용하여 두 개의 서로 다른 부위를 제거하기 위해서, 도 3a에 나타난 바와 같이, 서로 다른 선별마커, 예를 들어, 클로람페니콜 저항 유전자(chloramphenicol resistant gene, CmR) 및 카나마이신 저항 유전자(kanamycin resistant gene, KmR)를 포함하는 두개의 선형 DNA 단편을 PCR을 통하여 제작한다. 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 미생물에 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 첫 번째 선형 DNA 단편을 전달하고, 상기 재조합 벡터의 람다-레드 재조합에 의하여 상기 선형 DNA 단편을 미생물 균주 염색체의 특정 위치에 대체시킨 후 선별마커의 종류에 따라 해당 항생제를 포함하는 배지에서 배양하여 선별하고, PCR을 통하여 선형 DNA 대체를 확인한다. 다음으로, 다른 선별마커를 가진 두 번째 선형 DNA 단편을 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 균주내로 전달하고, 람다-레드 재조합에 의하여 DNA 단편을 염색체의 특정 위치에 대체시킨 후 선별마커를 포함하는 배지에서 배양하여 선별하고, 선형 DNA 대체를 PCR을 통하여 확인할 수 있다 (도 3b).
또한, 두개의 선형 DNA 단편이 미생물 염색체 내로 대체된 균주를 람노즈가 존재하는 배지에서 배양하여 I-SceI 유전자를 발현, I-SceI 제한효소 인식 부위가 특이적으로 절단됨으로써, 선형 DNA에 포함된 미생물 염색체 상동부위와, 이와 상동성을 가지는 미생물 염색체 부위 사이의 상동 재조합이 이루어지고, 동시에, 미생물 변이주 내에 도입된 선형 DNA 단편 내의 sacB 유전자를 발현시켜 독성을 유발시킴으로써, 상동 재조합에 의하여 두 개의 선별마커가 모두 제거된 미생물 변이주를 자당을 포함하는 배지에서 배양함으로써 선별할 수 있다. 이로써 2개의 다른 부위에 재조합되어 들어간 선별마커를 한 번의 선별마커 제거 작업을 통해 제거함으로써, 시간을 줄일 수 있다는 큰 장점을 가지고 있다. 그리고, 상동 재조합에 의한 선형 DNA 단편 선별마커 제거를 PCR을 통하여 확인할 수 있다(도 3b). 앞서, 두개의 선형 DNA 단편을 예시로 들었으나, 둘 이상의 선형 DNA 단편을 이용하여 추가적으로 염색체 내 여러 특정부위를 제거하는 것 또한 가능하다.
아울러, 추가적으로, 상기 단계 (5)에 있어서, 기존의 유전체 제거 방법에서는 필수 유전자가 존재하는 유전체 부위는 제거할 수 없으므로, 필수 유전자가 존재하는 부위의 제거를 위해서는 제거하고자 하는 특정 부위를 필수 유전자를 중심으로 두 개의 유전체 부위로 나누어서 두 번의 제거 작업을 통하여 유전자 제거를 수행하여야 하는 단점이 있었다. 상기 단계 (5)은, 이러한 단점을 개선할 수 있는 것으로, 필수 유전자가 존재하는 특정 부위를 한 번에 제거하기 위해, 특정 부위에 존재하는 필수 유전자를 포함하는 선형 DNA 단편을 제작하고, 이를 본 발명에 따른 재조합 벡터 (pREDI)를 이용하여 특정 유전체 부위를 상기 제작한 선형 DNA 단편과 대체시킨다.
상기 필수 유전자라 함은, 대장균 생존에 필수적으로 필요한 유전자를 의미하는 것으로, 그 예로, argS 등이 있고, 자세하게는, Baba T, Ara T, Hasegawa M, Takai Y, Okumura Y, Baba M, Datsenko KA, Tomita M, Wanner BL, Mori H.; Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.; Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0008. Epub 2006 Feb 21.에 개시된 것으로, 5쪽 9째줄에 보충 데이터 (supplement data)에 300여개의 유전자가 개시되어 있다.
예를 들어, 도 4a에 나타난 바와 같이, 대장균 내에 argS와 같은 필수유전자 (E)를 상동부위 A 및 C 사이에 위치시켜 포함하도록 선형 DNA 단편을 제작하여, 특정 유전체 부위에 대체 시키는 것이다. 이 때, 상기 단계 (3)에 나타난 바와 같이, I-SceI 제한효소 발현에 따른 상동 재조합 (homologous recombination)시키는 과정 및 추가적으로, 자당을 포함하는 배지에서 배양함으로써 선별마커가 남아있지 않고 미생물 내 염색체 특정부위가 제거된 균주를 선별한다. 상기와 같은 방법을 통해, 필수 유전자가 존재하는 부위의 제거를 위해서 필수 유전자를 포함하는 선형 DNA 단편을 사용함으로써, 제거하고자 하는 목적 부위의 모든 불필요한 유전체 부위를 제거함과 동시에 기존의 필수 유전자를 그대로 가지고 있는 균주를 선별가능하고, 이는 PCR을 통하여 확인할 수 있다 (도 4b).
앞서 말한 바와 같이, 상기 재조합 벡터는 균주 내에 그대로 보존하면서, 특정 상동부위(homology arm)를 가진 선형 DNA 단편만을 제작하여 균주내로 전달하는 과정을 반복 실시함으로써, 두 군데 이상의 특정 부위를 제거하거나, 더하여, 필수 유전자를 포함하는 미생물 내 염색체의 특정 유전자 부위를 연속적으로 제거시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 대상 미생물은 실시예로써, 대장균(E.coli)을 사용하였으나 이에 제한되는 것은 아니고, 상기 선형 DNA의 대체는 람다-레드 재조합 방법을 기초로 한다. 상기 람다-레드 재조합 방법을 통하여 대장균 염색체의 일부를 PCR 반응을 통해서 얻은 선형 DNA 단편으로 대체시키는 과정은 Datsenko KA et al 에 개시되어 있으며 (Datsenko KA et al, PNAS, 97:6640), 대장균 염색체의 절단에 의하여 촉진되는 선별마커를 제거시키는 상동 재조합 과정에 대해서는 Posfai G, et al.에 기재되어 있으며 (Posfai G, et al., Nucleic Acids Res., 27:4409. 1999). 또한, sacB 유전자의 독성으로 인하여 선별마커로 활용됨에 대하여, Van der Geize R, et al.에 기재되어 있다 (Van der Geize R, et al., FEMS Microbiol. Lett., 205:197, 2001).
그러므로, 본 발명은 선형 DNA 단편을 람다-레드 재조합 방법을 이용하여 미생물 염색체 내의 특정 위치에 대체시키고, 여기에 I-SceI 제한효소에 의한 염색체 절단과 더불어 sacB 유전자의 독성 유발에 의해 선별마커를 제거하고, 상기 재조합 벡터 (pREDI) 내 두 개의 각기 다른 프로모터에서 발현시킴으로써, 신속하고 효과적이며, 선별마커가 남지 않는, 유전체 특정 부위 제거방법을 제공하는 것이고, 이는 최소화된 유전체를 만들기 위해 응용가능할 것이다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 상세히 설명하겠으나, 본 발명이 하 기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 본 발명에 따른 염색체 특정 부위 제거용 재조합 벡터 (pREDI)의 제조
본 발명에 따른 재조합 벡터는 제한효소 NcoI 인식부위를 포함하는, 람노즈에 의해 유도되는 Prha 프로모터 하 I-SceI 제한효소 발현하는 유전자들인 재조합 PCR 산물 rhaTS-Prha-I-SceI 단편을, 아라비노즈 프로모터 하 람다-레드 재조합 기능을 포함하는 pKD46 (Datsenko KA, et al., PNAS, 97:6640, 2000) 벡터를 주형으로 벡터내의 NcoI 인식부위에 클로닝하여 제작하였다. 상기 rhaTS-Prha-I-SceI 단편은 25 pmole 농도의 프라이머 NcoI-rha (서열번호 9)과 Prha (서열번호 10)를 이용하여 대장균 MG1655 유전체에서 증폭한 PCR 산물인 rhaTS-Prha단편과 프라이머 I-SceI-F (서열번호 11) 및 프라이머 NcoI-I-SceI (서열번호 12)을 이용하여 pST76-ASceP (Posfai G, et al., Nucleic Acids Res., 27:4409, 1999)에서 증폭한 PCR 산물인 I-SceI 단편을, 프라이머 NcoI-rha 및 NcoI-I-SceI를 이용하여, 재조합 PCR(recombinant PCR)을 통하여 증폭하였고, 이를 클로닝하여, 본 발명에 따른 재조합 벡터(pREDI)를 제작하였다. 그 개열지도는 도 1과 같다. 상기 프라이머들의 염기서열은 아래와 같다.
프라이머 NcoI-rha (서열번호 9) :
5'-CATGCCATGGGGCATGGCGAATTAATCTTTCTG-3'
프라이머 Prha (서열번호 10) :
5'-ATGTGATCCTGCTGAATTTCATTACGACCAGTCT-3'
프라이머 I-SceI-F (서열번호 11) :
5'- TTAGACTGGTCGTAATGAAATTCAGCAGGATCACATAATGCAT
CAAAAAAAC CAGGTAATGAACCTGGG -3'
프라이머 NcoI-I-SceI (서열번호 12) :
5'- CATGCCATGGGTCGACTTATTATTTCAGGAAAGTTTCGGAGGAG
ATAG-3'
실시예 2: pREDI를 이용하여 미생물 내 염색체 특정 부위의 제거
(1) 선형 DNA 단편의 제조
대장균 K-12 MG1655(서울대학교 미생물학과 노정혜 교수)로부터 하기의 단계를 통해 불필요한 유전자군을 유전체로부터 제거된 대장균 변이주를 얻었다.
우선, CmR유전자(서열번호 13)를 가지는 pSG76 (Posfai G, et al., Nucleic Acid Res., 27:4409, 1999) 벡터를 두 개의 제한효소 KpnI (New England Biolabs, Beverly, MA) 및 BamHI (New England Biolabs, Beverly, MA) 제한효소로 절단시킨 후 동일한 효소들로 절단한 선상의 I-SceI 제한효소 절단부위를 가지는 pST76K (Posfai G, et al., Nucleic Acid Res., 27:4409, 1999) 벡터에 삽입하였다. 이를 BamHI (New England Biolabs, Beverly, MA) 제한효소로 한 번 더 절단한 후, 여기 에 pDELTA(GibcoBRL-DELETION FACTORY SYSTEM VERSION 2.) 벡터를 BamHI(New England Biolabs, Beverly, MA) 제한효소로 절단하여 얻은 sacB 유전자를 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 삽입하여 벡터를 제조한 후 이를 pSCI라 명명하였다.
그리고, pDELTA (GibcoBRL-DELETION FACTORY SYSTEM VERSION 2.) 벡터를 BamHI (New England Biolabs, Beverly, MA) 제한효소로 절단하여 얻은 sacB 유전자를 동일한 효소로 절단한 KmR유전자 (서열번호 14)와 I-SceI 제한효소 절단부위를 가지는 pST76K (Posfai G, et al., Nucleic Acid Res., 27:4409, 1999) 벡터에 리가아제 (New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 삽입하여 벡터를 제조한 후 이를 pSKI라 명명하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 세 상동부위 A (서열번호 15), B (서열번호 16), 및 C (서열번호 17), 선별마커인 클로람페니콜 저항 유전자 (CmR, 서열번호 13), sacB(서열번호 53), 및 I-SceI 제한효소 절단부위(S, 서열번호 52)를 포함하는 선형 DNA 단편(~3.5kb)은 대장균 MG1655 염색체와 상기와 같이 제조된 플라스미드 pSCI 또는 pSKI를 주형으로, 재조합 PCR 반응시켜서 제조하였다. 하나의 짧은(50bp) 말단 단편 (A: 서열번호 15), 하나의 상동부위(500bp)(C: 서열번호 17)는 대장균 K-12 MG1655염색체를 주형으로 프라이머 b0004A-F (서열번호 18) 및 프라이머 b0025C-R (서열번호 19)를 이용하여 증폭하였다. CmR-sacB-S 단편 (CSI 단편)과 다른 짧은 말단 단편(B: 서열번호 16)은 pSCI를 주형으로 프라이머 CSI-f (서열번 호 20) 및 b0024B-R (서열번호 21)를 사용하여 PCR을 이용하여 증폭하였다. 그 다음 완전한 선형 DNA 단편 A-C-CmR-sacB-S-B 및 A-C-KmR-sacB-S-B는 A-C단편과 CmR-sacB-S-B PCR 산물을 주형으로 프라이머 b0004A-F (서열번호 18), b0024B-R (서열번호 21)를 사용하여 재조합(recombination) PCR을 통하여 제조하였고, 상기 증폭된 DNA는 뉴클레오진 겔-추출 키트(Nucleogene Gel-Extraction KIT)를 사용하여 분리하였다. 상기 수득된 선형 DNA 단편은 서열번호 54와 같다.
상기 프라이머들의 염기서열은 아래와 같다.
프라이머 b0004A-F (서열번호 18):
5`-CCGCCGATTT TGCTGCGTTG CGTAAATTGA TGATGAATCA TCAGTAAAAT CCA GAC ATG AAG CTG ATA CGC GGC -3`
프라이머 b0025C-R (서열번호 19):
5`- CGA ATT CCG GTC TCC CTA TAG TGA GTC GTA CAG ATT GTC ATC CGC AAG GGC CTG -3`
프라이머 CSI-F (서열번호 20):
5'-TACGACTCACTATAGGGAGACCGGAATTCG-3'
프라이머 b0024B-R (서열번호 21):
5`- CCG AGT ATA CCT TGT ACA GCG GTC AAG GTT AAC CGG CGA TTG AGT ACC GA CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCT -3`
(2) pREDI벡터로 형질전환된 대장균에 선형 DNA 단편을 도입하여 미생물 내 특정 부위의 제거
상기와 같이 제작된 선형 DNA 단편을 표준적인 일렉트로포레이션법(Bio-RAD, Bacterial electro-transformation and Plus Controller Instruction Manual, Cat. NO 165-2098; Thompson, JR, et al . Yeast 14:565, 1998; Grant, SG, et al . Proc . Natl . Acas . Sci . USA , 87:4645, 1990)을 통해서 pREDI 벡터를 지닌 대장균 MG1655 균주 내로 전달시켰다. 이 때, 상기 선형 DNA 단편은 상기 균주 염색체와 두 개의 상동부위 A 및 B를 가지므로, 이 두 부분 사이의 균주 유전자(b0004-b0024)가 제거되고, 상기 선형 DNA 단편으로 대체된다. 상기 선형 DNA 단편으로 대체된 대장균 변이주는 선형 DNA 단편에 존재하는 CmR 유전자로 인해 클로람페니콜 저항성을 가지므로, 클로람페니콜 배지에서 선별하였다.
이와 같이, 대장균 내 b0004-b0024 부위의 유전자군이 대체되고, 선별 마커를 가지는 대장균 변이주내 pREDI벡터에 존재하는 I-SceI 제한효소 유전자는 람노즈 프로모터에 의해 전사 조절되므로, 람노즈가 존재하는 배지에서 배양하여 I-SceI 제한효소를 발현시켰다. 이 때, 상기 배지에 자당(sucrose)을 포함시킴으로써, 상기 대장균에 도입된 선형 DNA 단편 상에 존재하는 sacB 유전자를 이용한 선별 작업을 유도하였다. 즉, I-SceI 제한효소에 의한 미생물 염색체의 특정부위가 절단되어, 상기 도입된 선형 DNA 단편들에 존재하는 미생물 유래 부위와, 이와 상동성을 가지는 미생물 염색체에 존재하는 부위와의 상동 재조합이 유도되어 선별 마커 및 sacB유전자 부위가 대장균 염색체에서 제거되어, 레반 독성을 잃게 되므로, 자당이 포함된 배지에서 배양하여 선별 마커가 제거된 변이주를 선별할 수 있었다 (도 2). 선별된 변이주를 PCR 반응하여, b0004-b0024 부위의 유전자가 제거되었음을 확인하였고, 이를 Δ(b0004-b0024)이라고 명명하였다.
실시예 3: 유전체 특정 부위에 두개의 서로 다른 선별마커를 포함하는 선형 DNA 단편을 삽입 및 제거를 이용한 두 개의 특정 유전체 부위의 제거
상기 실시예 2에서 더 나아가, 두 개의 서로 다른 선별마커를 포함하는 서로 다른 선형 DNA 단편을 제작하여, 상기와 동일한 방법으로, 각각 차례대로 염색체내로 대체 (replacement)시킨 후에, 두 개의 서로 다른 유전체 부위를 한꺼번에 제거하였다.
우선, 제거하고자하는 두 유전체 부위로, 대장균 유전체의 b0980-b1052 및 b1137-b1168 부위를 선별하였다. 그리고, b0980-b1052부위를 제거하기 위하여, 클로람페니콜 저항 유전자 (CmR)를 포함하는 하나의 선형 DNA 단편을, 실시예 1과 동일한 방법으로, 상동부위 A는 서열번호 22의 염기서열로, 상동부위 B는 서열번호 23의 염기서열로, 상동부위 C는 서열번호 24의 염기서열 및 프라이머 b0980A-F (서열번호 25), b0980A-R (서열번호 26), b1051B-F (서열번호 27), b1051B-R (서열번호 28), b1052C-F (서열번호 29), b1052C-R (서열번호 30)을 이용하여 제작하였다. 상기 수득된 선형 DNA 단편은 서열번호 55와 같다.
다른 하나인 b1137-b1168부위를 제거하기 위하여, 카나마이신 저항 유전자(KmR)을 포함하는 선형 DNA 단편을 상동부위 A는 서열번호 31의 염기서열로, 상동부위 B는 서열번호 32의 염기서열로, 상동부위 C는 서열번호 33의 염기서열 및 1137A-F (서열번호 34), 1137A-R (서열번호 35), 1167B-F (서열번호 36), 1167B-R (서열번호 37), 1168C-F (서열번호 38), 1168C-R (서열번호 39)을 이용하여 제작하였다. 상기 수득된 선형 DNA 단편은 서열번호 56와 같다. 여기에서 사용된 프라이머의 염기서열은 아래와 같다.
프라이머 b0980A-F (서열번호 25): 5'- ACTGTTGGTGTGATTCATCTGCG -3'
프라이머 b0980A-R (서열번호 26):
5'-ACCCCAGGTATCGAACTGATTACCACATTGTTTCTGCTCCTTAG -3'
프라이머 b1051B-F (서열번호 27):
5'-GGCTGATCAGCTAGCCCATGGGTATGAGCATTATTAGTCGCACTATACCG -3'
프라이머 b1051B-R (서열번호 28):
5'- GATGACCATGTACGCAACGCTTG -3'
프라이머 b1052C-F (서열번호 29): 5'- AATCAGTTCGATACCTGGGGT -3'
프라이머 b1052C-R (서열번호 30):
5’-GCCGATCAACGTCTCATTTTCGCCAAAAATTCTGACGCTGTATGTCCGCG -3'
프라이머 b1137A-F (서열번호 34): 5’-CTGATGGATGGCGCTAAACTGCTG?3’
프라이머 b1137A-R (서열번호 35):
5’-CGCAGGATCTCTTCAGGCGTTGAAGATGTATGTGAAGGGGCCGC ?3’
프라이머 b1167B-F (서열번호 36):
5'-GGCTGATCAGCTAGCCCATGGGTATGATCCAGCTCTGGTATTCCGCA -3'
프라이머 b1167B-R (서열번호 37): 5'- CCAATAATGTCATCCGCCACGCG -3'
프라이머 b1168C-F (서열번호 38): 5'- CAACGCCTGAAGAGATCCTGCG -3'
프라이머 b1168C-R (서열번호 39):
5'-GCCGATCAACGTCTCATTTTCGCCAAAAATTCGGGTTGATTCTGGGTCTG -3'
도 3a에 나타난 바와 같이, 대장균 염색체 내 b0980-b1052 및 b1137-b1168 부위가 제거된 대장균 변이주를 제조하기 위하여, 선별마커로는 CmR을 포함하는 선형 DNA 단편(b0980-b1052+CmR)을 가지고, 대장균 내에 b0980-b1052부위를 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 대체시켰고, 그 다음, 두 번째 선형 DNA 단편 (b1137-b1168+KmR) 또한 실시예 2와 동일한 방법으로 전달하여 대장균 내 염색체와 대체시켰다. 상기 2개의 선형 DNA 단편들로 대체된 대장균 변이주는 선형 DNA 단편에 존재하는 CmR 유전자와 KmR 유전자 때문에 클로람페니콜과 카나마이신 저항성을 가지므로, 클로람페니콜과 카나마이신 배지에서 선별하였다.
그 후, 상기 b0980-b1052 및 b1137-b1168이 결실된 대장균 변이주에 남아있는 선별마커 CmR 유전자 및 KmR 유전자를 동시에 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 제거하여, 대장균 b0980-b1052 및 b1137-b1168이 제거된 변이주를 제작하였고, 이 를 PCR 실험을 통해 확인하였다. 도 3b에 나타난 바와 같이, M은 마커이고, 1 내지 3은 선형 DNA단편이 들어간 것을 확인하기 위한 것으로, 1은 아무것도 들어가지 않은 MG1655 균주 (Postive control), 2은 b0980-b1052 부위를 제거하기 위해 제작된 DNA 단편 A-C-Cm sacB I-SecI-B 가 균주에 들어간 것을 확인 PCR한 것이고, 3은 b1137-b1168 부위를 제거하기 위해 제작된 DNA 단편 A-C-Km sacB I-SecI-B가 균주에 들어간 것을 확인 PCR한 것이고, 4은 b0980-b1052을 제거하기 위해 제작된 DNA 단편 A-C-Cm sacB I-SecI-B가 균주에 들어간 후, I-SecI에 의해 Cm sacB I-SecI-B부분이 제거됨을 확인 PCR한 것이고, 5은 b1137-b1168을 이 제거하기 위해 제작된 DNA 단편 A-C-Km sacB I-SecI-B가 균주에 들어간 후, I-SecI에 의해 Km sacB I-SecI-B부분이 제거됨을 확인 PCR한 것이고, 6과 7은 b0980-b1052 및 b1137-b1168이 균주에서 제거되었는지를 확인하기 위해서 b0980-b1052 및 b1137-b1168 각각 사이에 해당되는 부위를 PCR한 결과이다. 6은 b0980-b1052 및 b1137-b1168부분이 제거되지 않은 즉 1과 같은 샘플로 MG1655로 위 부분이 제거 되지 않았으므로, 밴드가 나타나는 것이고, 7번은 b0980-b1052 및 b1137-b1168이 제거되었으므로 밴드가 나타나지 않는 것이다. 상기 실험에서 동시에 특정 유전체 부위를 제거할 확률은 95%였다.
아울러, 도 3a은 마커레스 (markerless) 제거 방법을 이용하여 특정한 두 유전체 부위에 다른 종류의 선별마커를 포함하는 두개의 선형 DNA 단편을 삽입하고, 동시에 특정 유전체 부위를 제거하는 과정을 나타낸 것이다.
실시예 4: 미생물 내에 필수유전자를 포함한 염색체 특정 부위의 제거
기존의 유전체 제거 방법으로는 미생물 생존에 필수적인 유전자가 포함되어 있는 불필요한 유전체군 부위는 제거할 수 없었으므로, 상기 필수 유전자가 존재하는 부위를 제거하기 위해, 특정 부위를 필수 유전자를 중심으로 두 개의 유전체 부위로 나누어서 두 번의 제거 작업을 수행했었다. 이와 같은 단점을 개선하기 위해, 실시예에서 제조된 재조합 벡터를 이용하여 필수 유전자가 남아있으면서도 원하는 염색체 부위만을 제거하였다.
먼저, 필수 유전자인 arginyl-tRNA 합성을 암호화하는 argS(b1876)를 포함하는 대장균의 특정 유전체 부위 yecD-araF(b1867-b1901)를 선택하였다. 그리고 상기 특정 유전체 부위 yecD-araF(b1867-b1901)를 제거하기 위하여, 상기 실시예 1에 기재된 방법을 이용하여, 도 4a에 나타난 구조와 같이, [상동부위 A(서열번호 40)-E(argS)-상동부위 C(서열번호42)-CmR-sacB-I-SceI-상동부위 B(서열번호 41)]의 구조를 가지는 선형 DNA 단편을 제작하였다. 상기 수득된 선형 DNA 단편은 서열번호 57과 같다.
b1867-b1901 유전체 부위를 대체하기 위하여, 대장균 균주내로 상기 제작된 DNA 단편을 도입하였고, argS(b1876)를 포함하는 yecD-araF(b1867-b1901)가 제거된 균주를 클로람페니콜이 포함된 배지에서 배양하여 선별하였다. 그리고 실시예 2에 개시된 방법을 통하여 선형 DNA에 포함되어있던 선별마커를 제거하면서 상동 재조합에 의하여 특정 염색체 부위가 흔적없이 제거된 균주를 선별할 수 있었다. 도 4a 는 필수유전자를 포함하는 특정 유전체 부위를 제거하는 과정을 나타낸 것이고, 선형 DNA 단편의 대장균 염색체 내로의 대체 및 제거는 상기 제거하고자 하는 특정 부위내의 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 확인하였다. 도 4b에 나타난 바와 같이, M은 마커이고, 1은 선형 DNA단편을 형질전환하지 않은 MG1655이고, 2는 상기 제작된 선형 DNA단편을 형질 전환한 MG1655로, 상기 선형 DNA단편으로 대체되었는지 여부를 확인한 것이고, 3은 상동부위 A-E(argS)-상동부위 C-CmR-sacB-I-SceI-상동부위 B의 DNA단편에서 I-SceI에 의해서 CmR-sacB-I-SceI-상동부위 B부분이 제거됨을 확인 PCR결과이고, 4는 상기 특정 염색체 부위가 제거되지 않은 MG1655인, 1번과 같은 샘플로써, 두 개의 밴드가 뜬 이유는 b1867-b1901사이에서 2부분을 동시에 PCR했기 때문에 2개의 밴드가 나왔고, 5는 상기 염색체 특정부위가 제거된 MG1655로, 아무 밴드도 나타나지 않아, 특정 염색체 부위가 제대로 제거되었음을 알 수 있었다. 상기 방법은 필수유전자를 기준으로 양쪽의 두 번의 제거 작업을 수행하는 대신에 한 번의 제거 작업으로 원하는 특정 부위를 신속하면서도 효율적으로 제거할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 여기에 사용되는 프라이머들의 염기서열은 다음과 같다.
프라이머 b1867A-F (서열번호 44): 5'-TGCGCTGGTGGTGATCGATTTAC-3'
프라이머 b1867A-R (서열번호 45): 5'-TGGCACAGGGCAACAGGGTAAACGCGTTGAGGATCTCTTCCACG-3'
프라이머 argS-F (서열번호 46): 5'-TTACCCTGTTGCCCTGTGCCA-3'
프라이머 argS-R (서열번호 47): 5'-GCGATGTGATATTGCTCTCCTATGGAGATCGGCTAACCCTGATCAGGCTTC-3'
프라이머 b1901C-F (서열번호 48): 5'-CTCCATAGGAGAGCAATATCACATCGC-3'
프라이머 b1901C-R (서열번호 49): 5’-GCCGATCAACGTCTCATTTTCGCCAAAAATGTGATCGTGGAGTCAATTCTGACG-3'
프라이머 b1900B-F (서열번호 50): 5'-GGCTGATCAGCTAGCCCATGGGTATGACCAGCATTGAGTTGGCAGCG-3'
프라이머 b1900B-R (서열번호 51): 5'-ATGTCACAATCCGCTATGGCGG-3'
도 1은 본 발명에 따른 염색체 제거용 재조합 벡터 (pREDI)의 구조를 나타낸 개열지도이다.
도 2는 본 발명에 따른 재조합 벡터 (pREDI)를 이용하여 선별마커를 제거하는 과정을 나타낸 전체 모식도이다.
도 3a은 본 발명에 따른 재조합 벡터 (pREDI)를 이용하여 대장균 내 특정 두 유전체 부위에 다른 종류의 선별마커를 포함하는 두 개의 선형 DNA 단편을 삽입하고, 삽입된 선형 DNA 단편을 동시에 제거하는 과정을 나타낸 그림이다.
도 3b는 상기 대장균 내 특정 두 유전체 부위에 두개의 선형 DNA 단편을 삽입하고 제거한 결과, 두개의 선형 DNA 단편의 삽입과 유전체의 제거 정도를 확인하기 위하여 PCR 증폭 결과를 전기영동한 사진이다. (M: 마커, 1: 선형 DNA 단편을 형질전환하지 않은 MG1655 균주 (Postive control), 2: b0980-b1052 부위를 제거하기 위해 제작된 DNA 단편 A-C-Cm sacB I-SecI-B 가 균주에 들어간 것을 확인 PCR한 것, 3: b1137-b1168 부위를 제거하기 위해 제작된 DNA 단편 A-C-Km sacB I-SecI-B가 균주에 들어간 것을 확인 PCR한 것, 4: b0980-b1052을 제거하기 위해 제작된 DNA 단편 A-C-Cm sacB I-SecI-B가 균주에 들어간 후, I-SecI에 의해 Cm sacB I-SecI-B부분이 제거됨을 확인 PCR한 것, 5: b1137-b1168을 이 제거하기 위해 제작된 DNA 단편 A-C-Km sacB I-SecI-B가 균주에 들어간 후, I-SecI에 의해 Km sacB I-SecI-B부분이 제거됨을 확인 PCR한 것, 6과 7은 b0980-b1052 및 b1137-b1168이 균주에서 제거되었는지를 확인하기 위해서 b0980-b1052 및 b1137-b1168 각각 사이에 해당되는 부위를 PCR한 결과)
도 4a는 본 발명에 따른 재조합 벡터 (pREDI)를 이용한 특정 유전체 부위 제거 방법 중에서 생존 필수 유전자를 포함하는 특정 유전체 부위를 제거하는 과정을 나타낸 그림이다.
도 4b는 상기 생존 필수 유전자를 포함하는 특정 유전체 부위를 제거한 결과, 선형 DNA 단편의 삽입과 유전체의 제거정도를 확인하기 위하여 PCR 증폭 결과를 전기영동한 사진이다. ( 1: 선형 DNA단편을 형질 전환하지 않은 MG1655 균주, 2: 선형 DNA단편을 형질 전환한 MG1655 균주, 3: 선형 DNA단편을 형질 전환한 MG1655 균주, 4: 염색체 제거되지 않은 MG1655 균주, 및 5: 염색체 특정부위가 제거된 MG1655 균주)
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> A RECOMBINANT VECTOR FOR DELETING SPECIFIC REGIONS OF THE CHROMOSOME AND A METHOD FOR DELETING SPECIFIC CHROMOSOMAL REGIONS OF CHROMOSOME IN THE MICROORGANISM USING THE SAME <160> 57 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9036 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pREDI vector <400> 1 catcgattta ttatgacaac ttgacggcta catcattcac tttttcttca caaccggcac 60 ggaactcgct cgggctggcc ccggtgcatt ttttaaatac ccgcgagaaa tagagttgat 120 cgtcaaaacc aacattgcga ccgacggtgg cgataggcat ccgggtggtg ctcaaaagca 180 gcttcgcctg gctgatacgt tggtcctcgc gccagcttaa gacgctaatc cctaactgct 240 ggcggaaaag atgtgacaga cgcgacggcg acaagcaaac atgctgtgcg acgctggcga 300 tatcaaaatt gctgtctgcc aggtgatcgc tgatgtactg acaagcctcg cgtacccgat 360 tatccatcgg tggatggagc gactcgttaa tcgcttccat gcgccgcagt aacaattgct 420 caagcagatt tatcgccagc agctccgaat agcgcccttc cccttgcccg gcgttaatga 480 tttgcccaaa caggtcgctg aaatgcggct ggtgcgcttc atccgggcga aagaaccccg 540 tattggcaaa tattgacggc cagttaagcc attcatgcca gtaggcgcgc ggacgaaagt 600 aaacccactg gtgataccat tcgcgagcct ccggatgacg accgtagtga tgaatctctc 660 ctggcgggaa cagcaaaata tcacccggtc ggcaaacaaa ttctcgtccc tgatttttca 720 ccaccccctg accgcgaatg gtgagattga gaatataacc tttcattccc agcggtcggt 780 cgataaaaaa atcgagataa ccgttggcct caatcggcgt taaacccgcc accagatggg 840 cattaaacga gtatcccggc agcaggggat cattttgcgc ttcagccata cttttcatac 900 tcccgccatt cagagaagaa accaattgtc catattgcat cagacattgc cgtcactgcg 960 tcttttactg gctcttctcg ctaaccaaac cggtaacccc gcttattaaa agcattctgt 1020 aacaaagcgg gaccaaagcc atgacaaaaa cgcgtaacaa aagtgtctat aatcacggca 1080 gaaaagtcca cattgattat ttgcacggcg tcacactttg ctatgccata gcatttttat 1140 ccataagatt agcggatcct acctgacgct ttttatcgca actctctact gtttctccat 1200 acccgttttt ttgggaattc gagctctaag gaggttataa aaaatggata ttaatactga 1260 aactgagatc aagcaaaagc attcactaac cccctttcct gttttcctaa tcagcccggc 1320 atttcgcggg cgatattttc acagctattt caggagttca gccatgaacg cttattacat 1380 tcaggatcgt cttgaggctc agagctgggc gcgtcactac cagcagctcg cccgtgaaga 1440 gaaagaggca gaactggcag acgacatgga aaaaggcctg ccccagcacc tgtttgaatc 1500 gctatgcatc gatcatttgc aacgccacgg ggccagcaaa aaatccatta cccgtgcgtt 1560 tgatgacgat gttgagtttc aggagcgcat ggcagaacac atccggtaca tggttgaaac 1620 cattgctcac caccaggttg atattgattc agaggtataa aacgaatgag tactgcactc 1680 gcaacgctgg ctgggaagct ggctgaacgt gtcggcatgg attctgtcga cccacaggaa 1740 ctgatcacca ctcttcgcca gacggcattt aaaggtgatg ccagcgatgc gcagttcatc 1800 gcattactga tcgttgccaa ccagtacggc cttaatccgt ggacgaaaga aatttacgcc 1860 tttcctgata agcagaatgg catcgttccg gtggtgggcg ttgatggctg gtcccgcatc 1920 atcaatgaaa accagcagtt tgatggcatg gactttgagc aggacaatga atcctgtaca 1980 tgccggattt accgcaagga ccgtaatcat ccgatctgcg ttaccgaatg gatggatgaa 2040 tgccgccgcg aaccattcaa aactcgcgaa ggcagagaaa tcacggggcc gtggcagtcg 2100 catcccaaac ggatgttacg tcataaagcc atgattcagt gtgcccgtct ggccttcgga 2160 tttgctggta tctatgacaa ggatgaagcc gagcgcattg tcgaaaatac tgcatacact 2220 gcagaacgtc agccggaacg cgacatcact ccggttaacg atgaaaccat gcaggagatt 2280 aacactctgc tgatcgccct ggataaaaca tgggatgacg acttattgcc gctctgttcc 2340 cagatatttc gccgcgacat tcgtgcatcg tcagaactga cacaggccga agcagtaaaa 2400 gctcttggat tcctgaaaca gaaagccgca gagcagaagg tggcagcatg acaccggaca 2460 ttatcctgca gcgtaccggg atcgatgtga gagctgtcga acagggggat gatgcgtggc 2520 acaaattacg gctcggcgtc atcaccgctt cagaagttca caacgtgata gcaaaacccc 2580 gctccggaaa gaagtggcct gacatgaaaa tgtcctactt ccacaccctg cttgctgagg 2640 tttgcaccgg tgtggctccg gaagttaacg ctaaagcact ggcctgggga aaacagtacg 2700 agaacgacgc cagaaccctg tttgaattca cttccggcgt gaatgttact gaatccccga 2760 tcatctatcg cgacgaaagt atgcgtaccg cctgctctcc cgatggttta tgcagtgacg 2820 gcaacggcct tgaactgaaa tgcccgttta cctcccggga tttcatgaag ttccggctcg 2880 gtggtttcga ggccataaag tcagcttaca tggcccaggt gcagtacagc atgtgggtga 2940 cgcgaaaaaa tgcctggtac tttgccaact atgacccgcg tatgaagcgt gaaggcctgc 3000 attatgtcgt gattgagcgg gatgaaaagt acatggcgag ttttgacgag atcgtgccgg 3060 agttcatcga aaaaatggac 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tttactgttg gctccagcaa 4440 tcgacaccgt taatagatta cctatcctgc tctatcagaa ccaatttgca gatacgcgca 4500 ttttggttac gataagcgat cagcatattc gtggggcact taatgtaccc ttgaaagggg 4560 taaggtatgt attacgcgtg gcggatgaca ttattgg 4597 <210> 57 <211> 6549 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b1867-b1901 <400> 57 tgcgctggtg gtgatcgatt tacaagaagg catcttacct tttgccggtg gtccacatac 60 tgccgatgag gtagttaatc gcgccgggaa gctggcggcg aaatttcgcg ccagcggtca 120 gcccgtgttt ctggtgcgcg ttggctggtc tgccgattac gctgaagcat taaaacagcc 180 ggtcgatgcg ccctcaccgg ctaaagtgtt gcccgaaaat tggtggcaac atcctgctgc 240 attaggtgca accgacagcg atatcgaaat catcaaacgt caatggggtg cgttttacgg 300 tacggatctg gagttgcaat tacgccgccg aggtatcgat acaatagtgt tatgtgggat 360 ctcgaccaat atcggtgttg aatccaccgc ccgcaatgcc tgggaacttg gctttaatct 420 ggtgattgcc gaagacgcct gtagtgccgc cagcgccgag cagcacaata acagtatcaa 480 ccatatctac ccgcgcatcg cccgtgtgcg tagcgtggaa gagatcctca acgcgtttac 540 cctgttgccc tgtgccaacc aaccgctgat ttcacgccgc ttctgatgca atagtgaaaa 600 cggcaatacg ccacgcgcac gttgctgacg aaaacagcca tttgcagtat actcccgccc 660 taatttcttt aactggtgcg ggcaattttt gctcgcttca tcaatgtaag gtattccggt 720 gaatattcag gctcttctct cagaaaaagt ccgtcaggcc atgattgcgg caggcgcgcc 780 tgcggattgc gaaccgcagg ttcgtcagtc agcaaaagtt cagttcggcg actatcaggc 840 taacggcatg atggcagttg ctaaaaaact gggtatggca ccgcgacaat tagcagagca 900 ggtgctgact catctggatc ttaacggtat cgccagcaaa gttgagatcg ccggtccagg 960 ctttatcaac attttccttg atccggcatt cctggctgaa catgttcagc aggcgctggc 1020 gtccgatcgt ctcggtgttg ctacgccaga aaaacagacc attgtggttg actactctgc 1080 gccaaacgtg gcgaaagaga tgcatgtcgg tcacctgcgc tctaccatta ttggtgacgc 1140 agcagtgcgt actctggagt tcctcggtca caaagtgatt cgcgcaaacc acgtcggcga 1200 ctggggcact cagttcggta tgctgattgc atggctggaa aagcagcagc aggaaaacgc 1260 cggtgaaatg gagctggctg accttgaagg tttctaccgc gatgcgaaaa agcattacga 1320 tgaagatgaa gagttcgccg agcgcgcacg taactacgtg gtaaaactgc aaagcggtga 1380 cgaatatttc cgcgagatgt ggcgcaaact ggtcgacatc accatgacgc agaaccagat 1440 cacctacgat cgtctcaacg tgacgctgac ccgtgatgac gtgatgggcg aaagcctcta 1500 caacccgatg ctgccaggaa ttgtggcgga tctcaaagcc aaaggtctgg cagtagaaag 1560 cgaaggggcg accgtcgtat tccttgatga gtttaaaaac aaggaaggcg aaccgatggg 1620 cgtgatcatt cagaagaaag atggcggcta tctctacacc accactgata tcgcctgtgc 1680 gaaatatcgt tatgaaacac tgcatgccga tcgcgtgctg tattacatcg actcccgtca 1740 gcatcaacac ctgatgcagg catgggcgat cgtccgtaaa gcaggctatg taccggaatc 1800 cgtaccgctg gaacaccaca tgttcggcat gatgctgggt aaagacggca aaccgttcaa 1860 aacccgcgcg ggtggtacag tgaaactggc cgatctgctg gatgaagccc tggaacgtgc 1920 acgccgtctg gtggcagaaa agaacccgga tatgccagcc gacgagctgg aaaaactggc 1980 taacgcggtt ggtattggtg cggtgaaata tgcggatctc tccaaaaacc gcaccacgga 2040 ctacatcttc gactgggaca acatgctggc gtttgagggt aataccgcgc catacatgca 2100 gtatgcatac acgcgtgtat tgtccgtgtt ccgtaaagca gaaattgacg aagagcaact 2160 ggctgcagct ccggttatca tccgtgaaga tcgtgaagcg caactggcag ctcgcctgct 2220 gcagtttgaa gaaaccctca ccgtggttgc ccgtgaaggc acgccgcatg taatgtgtgc 2280 ttacctgtac gatctggccg gtctgttctc tggcttctac gagcactgcc cgatcctcag 2340 cgcagaaaac gaagaagtgc gtaacagccg tctaaaactg gcacaactga cggcgaagac 2400 gctgaagctg ggtctggata cgctgggtat tgagactgta gagcgtatgt aatcgatttt 2460 tcgtgagagt gaagcctgat cagggttagc cgatctccat aggagagcaa tatcacatcg 2520 cagaattaca gtgagaacgt gcataaattt agcgggaaaa gacataaggg aaagccaatt 2580 tgtcagacaa attgtcgaat gcacagcaga ttaatccata agattagcct ggaaatcctt 2640 gttgtctttg gtacccatgc gggatgtctt ctttttaacc agtcaatagg ccgcattacc 2700 tggcgttgag tttttgaaat ggtgtaataa ccgcaactca aagatgtgga aaatgcacgt 2760 cattcatttc gtcattaatt atcactgtgc tcattaatta acagaacacg tataatgaga 2820 gccatctcgc aaaaatgaaa aaacgtttta taaaatcatc acttcatcat gaattcaaat 2880 tcattgatta atatcaacaa gatacaaaaa gcactatcat taaaattcat tgcagttaca 2940 ttgatttcat caatgaaatg taaaaatata taaacttgat gatttaagca ttttcttata 3000 cccgttcaga cgttattctt atttcagatc atcgtcagaa ttgactccac gatcacattt 3060 ttggcgaaaa tgagacgttg atcggcacgt aagaggttcc agctttcacc ataatgaaat 3120 aagatcacta ccgggcgtat tttttgagtt atcgagattt tcaggagcta aggaagctaa 3180 aatggagaaa aaaatcactg gatataccac cgttgatata tcccaatggc atcgtaaaga 3240 acattttgag gcatttcagt cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcagctgga 3300 tattacggcc tttttaaaga ccgtaaagaa aaataagcac aagttttatc cggcctttat 3360 tcacattctt gcccgcctga tgaatgctca tccgaaattc cgtatggcaa tgaaagacgg 3420 tgagctggtg atatgggata gtgttcaccc ttgttacacc gttttccatg agcaaactga 3480 aacgttttca tcgctctgga gtgaatacca cgacgatttc cggcagtttc tacacatata 3540 ttcgcaagat gtggcgtgtt acggtgaaaa cctggcctat ttccctaaag ggtttattga 3600 gaatatgttt ttcgtctcag ccaatccctg ggtgagtttc accagttttg atttaaacgt 3660 ggccaatatg gacaacttct tcgcccccgt tttcaccatg ggcaaatatt atacgcaagg 3720 cgacaaggtg ctgatgccgc tggcgattca ggttcatcat gccgtctgtg atggcttcca 3780 tgtcggcaga atgcttaatg aattacaaca gtactgcgat gagtggcagg gcggggcgta 3840 atttttttaa ggcagttatt ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagatccgg 3900 ggaatttatg ggattcacct ttatgttgat aagaaataaa agaaaatgcc aataggatat 3960 cggcattttc ttttgcgttt ttatttgtta actgttaatt gtccttgttc aaggatgctg 4020 tctttgacaa cagatgtttt cttgcctttg atgttcagca ggaagctcgg cgcaaacgtt 4080 gattgtttgt ctgcgtagaa tcctctgttt gtcatatagc ttgtaatcac gacattgttt 4140 cctttcgctt gaggtacagc gaagtgtgag taagtaaagg ttacatcgtt aggatcaaga 4200 tccattttta acacaaggcc agttttgttc agcggcttgt atgggccagt taaagaatta 4260 gaaacataac caagcatgta aatatcgtta gacgtaatgc cgtcaatcgt catttttgat 4320 ccgcgggagt cagtgaacag ataccatttg ccgttcattt taaagacgtt cgcgcgttca 4380 atttcatctg ttactgtgtt agatgcaatc agcggtttca tcactttttt cagtgtgtaa 4440 tcatcgttta gctcaatcat accgagagcg ccgtttgcta actcagccgt gcgtttttta 4500 tcgctttgca gaagtttttg actttcttga cggaagaatg atgtgctttt gccatagtat 4560 gctttgttaa ataaagattc ttcgccttgg tagccatctt cagttccagt gtttgcttca 4620 aatactaagt atttgtggcc tttatcttct acgtagtgag gatctctcag cgtatggttg 4680 tcgcctgagc tgtagttgcc ttcatcgatg aactgctgta cattttgata cgtttttccg 4740 tcaccgtcaa agattgattt ataatcctct acaccgttga tgttcaaaga gctgtctgat 4800 gctgatacgt taacttgtgc agttgtcagt gtttgtttgc cgtaatgttt accggagaaa 4860 tcagtgtaga ataaacggat ttttccgtca gatgtaaatg tggctgaacc tgaccattct 4920 tgtgtttggt cttttaggat agaatcattt gcatcgaatt tgtcgctgtc tttaaagacg 4980 cggccagcgt ttttccagct gtcaatagaa gtttcgccga ctttttgata gaacatgtaa 5040 atcgatgtgt catccgcatt tttaggatct ccggctaatg caaagacgat gtggtagccg 5100 tgatagtttg cgacagtgcc gtcagcgttt tgtaatggcc agctgtccca aacgtccagg 5160 ccttttgcag aagagatatt tttaattgtg gacgaatcaa attcaggaac ttgatatttt 5220 tcattttttt gctgttcagg gatttgcagc atatcatggc gtgtaatatg ggaaatgccg 5280 tatgtttcct tatatggctt ttggttcgtt tctttcgcaa acgcttgagt tgcgcctcct 5340 gccagcagtg cggtagtaaa ggttaatact gttgcttgtt ttgcaaactt tttgatgttc 5400 atcgttcatg tctccttttt tatgtactgt gttagcggtc tgcttcttcc agccctcctg 5460 tttgaagatg gcaagttagt tacgcacaat aaaaaaagac ctaaaatatg taaggggtga 5520 cgccaaagta tacactttgc cctttacaca ttttaggtct tgcctgcttt atcagtaaca 5580 aacccgcgcg atttactttt cgacctcatt ctattagact ctcgtttgga ttgcaactgg 5640 tctattttcc tcttttgttt gatagaaaat cataaaagga tttgcagact acgggcctaa 5700 agaactaaaa aatctatctg tttcttttca ttctctgtat tttttatagt ttctgttgca 5760 tgggcataaa gttgcctttt taatcacaat tcagaaaata tcataatatc tcatttcact 5820 aaataatagt gaacggcagg tatatgtgat gggttaaaaa ggatccgcta gggataacag 5880 ggtaatatag atcctctaga gtcgacctgc aggcatgcaa gcttggcact ggctgatcag 5940 ctagcccatg ggtatgacca gcattgagtt ggcagcgtca aatgcccccg ggatgtcgtt 6000 agatttggta ggtacctgat aaatttgttt ttccgggaat ccggccgctt tcagcgcatc 6060 catagatccc gtagtacggc ggcgggcggt atccagttcg ttggcggtaa tcgccatcac 6120 cgcgctttct ttgacatccc agccacgttt ctgcatctct ttatacagtt cctggccctg 6180 acgttcgcca attttagtcg ccgccatcat caccagcgga acggtatcca ttggcttacc 6240 tttggcgtta acaaactggt catccacggc aatgactttc atatcgtagc cacgcgcttt 6300 cgcgacgatg gcagagccga gtttggggtc cggagtacaa ataacgaaac cttttgcgcc 6360 actggcagcc aggctgtcga tcgcgttcaa tgttttttcg ccatccggca cggcaatctt 6420 aataacctca aaccctaaat ccttcccggc tttatcggca aacttccatt cggtctggaa 6480 ccacggctct tccggttgct tcaccagaaa accgagcttc aggttctccg ccatagcgga 6540 ttgtgacat 6549

Claims (16)

  1. 아라비노즈에 의해 유도되는 프로모터 (Para); 람다(λ)-레드(red) 재조합에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자; 람노즈에 의해 유도되는 프로모터 (Prha); 및 I-SceI 제한효소를 코딩하는 유전자; 를 포함하는, 서열번호 1과 도 1의 개열지도를 가지는 염색체 특정 부위 제거용 재조합 벡터.
  2. 제1항의 재조합 벡터로 형질전환된 대장균.
  3. (a) 미생물에 도입시 람다-레드 재조합에 관여하는 상동부위 A 및 상동부위 B; 선별마커; 선별마커 제거를 위한 상동 재조합에 관여하는 I-SceI 제한효소 절단부위; 및 선별마커 제거를 위한 상동 재조합에 관여하는 상동부위 C;를 포함하는 선형 DNA 단편을 제조하는 단계;
    (b) 제1항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물에 상기 선형 DNA 단편을 도입하여, 상기 DNA 단편 상의 상동 부위들과 이들과 상동인 미생물 염색체 부위간의 람다-레드 재조합을 이용하여, 상기 선형 DNA 단편을 미생물 염색체의 특정 위치에 대체 (replacement)시키는 단계; 및
    (c) 상기 특정 염색체 부분이 대체된 미생물을 람노즈를 함유하는 배지에서 배양하여 I-SceI 제한효소를 발현시켜, 상기 DNA 단편 상의 상동부위 C 및 이와 상동인 미생물 염색체 부위 간의 상동 재조합 (homologous recombination)을 유발하여 선별마커를 제거하는 단계를 포함하고,
    상기 상동부위 A는 미생물 염색체의 제거하고자 하는 부분의 한 쪽 말단의 50 내지 500bp와 상동인 부위이고, 상동부위 B는 상기 미생물 염색체의 제거하고자 하는 부분의 다른 쪽 말단의 50 내지 500bp와 상동인 부위이며,
    상기 상동부위 C는 상기 상동부위 A 및 상동부위 B와 상동인 미생물 염색체 부위 중 어느 하나와 인접하는 300 내지 500bp 부위와 상동인 부위인 것을 특징으로 하는,
    제1항의 재조합 벡터를 이용하여 미생물 내 특정 염색체 부위를 제거하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 (a) 미생물에 도입시 람다-레드 재조합에 관여하는 상동부위 A 및 상동부위 B; 선별마커; 선별마커 제거를 위한 상동 재조합에 관여하는 I-SceI 제한효소 절단부위; 및 선별마커 제거를 위한 상동 재조합에 관여하는 상동부위 C;를 포함하는 선형 DNA 단편을 제조하는 단계; 및 (b) 제1항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물에 상기 선형 DNA 단편을 도입하여, 상기 DNA 단편 상의 상동 부위들과 이들 과 상동인 미생물 염색체 부위간의 람다-레드 재조합을 이용하여, 상기 선형 DNA 단편을 미생물 염색체의 특정 위치에 대체 (replacement)시키는 단계;를 반복함으로써, 서로 다른 복수의 선형 DNA 단편을 제조하여 제1항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물에 도입하는 것인, 미생물 내 복수의 특정 염색체 부위를 제거하는 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 선별마커는 서열번호 13의 염기서열을 가지는 클로람페니콜 저항 유전자, 서열번호 14의 염기서열을 가지는 카나마이신 저항 유전자 및 sacB로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것인 미생물 내 특정 염색체 부위를 제거하는 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 선별마커는 서열번호 13의 염기서열을 가지는 클로람페니콜 저항 유전자, 서열번호 14의 염기서열을 가지는 카나마이신 저항 유전자 및 sacB로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것인 미생물 내 특정 염색체 부위를 제거하는 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 선별마커를 제거하는 단계 후에, 상기 미생물을 자당을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 더 포함하는 미생물 내 특정 염색체 부위를 제거하는 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 선별마커를 제거하는 단계 후에, 상기 미생물을 자당을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 더 포함하는 미생물 내 특정 염색체 부위를 제거하는 방법.
  9. 제3항에 있어서,
    상기 상동부위 A, 상동부위 B 및 상동부위 C는 각각 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17의 염기서열을 가지는 미생물 내 특정 염색체 부위를 제거하는 방법.
  10. 제4항에 있어서,
    상기 상동부위 A, 상동부위 B 및 상동부위 C는 각각 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17의 염기서열을 가지는 미생물 내 특정 염색체 부위를 제거하는 방법.
  11. 제3항에 있어서,
    상기 상동부위 A, 상동부위 B 및 상동부위 C는 각각 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24의 염기서열을 가지는 미생물 내 특정 염색체 부위를 제거하는 방법.
  12. 제4항에 있어서,
    상기 상동부위 A, 상동부위 B 및 상동부위 C는 각각 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24의 염기서열을 가지는 미생물 내 특정 염색체 부위를 제거하는 방법.
  13. 제3항에 있어서,
    상기 상동부위 A, 상동부위 B 및 상동부위 C는 각각 서열번호 31, 서열번호 32 및 서열번호 33의 염기서열을 가지는 미생물 내 특정 염색체 부위를 제거하는 방법.
  14. 제4항에 있어서,
    상기 상동부위 A, 상동부위 B 및 상동부위 C는 각각 서열번호 31, 서열번호 32 및 서열번호 33의 염기서열을 가지는 미생물 내 특정 염색체 부위를 제거하는 방법.
  15. 제3항에 있어서,
    상기 제거하고자 하는 미생물 내 특정 염색체 부위가 미생물 생존에 필수적인 유전자를 포함하고, 상기 선형 DNA 단편은 상기 상동부위 A와 상동부위 C 사이에 상기 미생물 생존에 필수적인 유전자를 더 포함하는, 미생물 내 특정 염색체 부위를 제거하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 필수적인 유전자는 서열번호 43의 argS이고, 상기 상동부위 A, 상동부위 B 및 상동부위 C는 각각 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 42의 염기서열을 가지는 미생물 내 특정 염색체 부위를 제거하는 방법.
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