CN104894046A - Hsv-1病毒体外基因敲除系统及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种HSV-1病毒体外基因敲除系统及其制备方法与应用。本发明中构建了可以进行诱导表达Cre-重组酶和I-Sce Ⅰ内切酶的pREDI质粒，并将pREDI质粒、BAC-HSV-1质粒和含有HSV-1病毒靶基因同源片段的DNA片段同时转化到细菌细胞内，在阿拉伯糖和鼠李糖的诱导下，经过同源重组和筛选标记的切除，获得敲除掉靶基因的BAC-HSV-1，从而实现体外快速敲除HSV-1病毒的特定基因。该系统具有快速高效，操作过程简单，成功率高，安全性高等优点，可用于构建临床基因缺陷活疫苗，也可作为对HSV-1特定靶基因功能研究的工具，因此具有很大的科研及临床应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种HSV-1病毒体外基因敲除系统及其制备方法与应用。
背景技术
基因敲除技术广义的定义是将生物细胞基因组某基因去除或使基因失去活性的技术，包括将某个或某些基因的完全敲除、部分敲除、基因调控序列的敲除以及成段基因组序列的敲除。基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲出的目的。
目前病毒基因敲除的方法基本上都是抗性基因替换法，即用一段编码抗性基因的外源片段，通过同源重组替换病毒基因组内的目的基因，然后通过空斑纯化的方法进行病毒的筛选，获得突变病毒株。但利用此方法进行基因敲除成功率太低，空斑纯化过程非常耗时耗力，并且由于直接涉及到活病毒操作，还给实验带来一定的危险性。因此如果开发出一套更加高效简便的体外病毒基因敲除的方法，毫无疑问会得到广泛的应用，促进对HSV病毒各基因功能的研究。
发明内容
为了克服现有技术中病毒基因敲除方法周期长、成功率低、空斑纯化工作量大，且涉及到活病毒操作，存在潜在的危险性等缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种HSV-1病毒体外基因敲除系统，该系统用于体外病毒基因敲除高效、简便。
本发明的另一目的在于提供上述基因敲除系统的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述基因敲除系统的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种HSV-1病毒体外基因敲除系统，为含有BAC-HSV-1载体和pREDI重组载体的细菌细胞；
所述的BAC-HSV-1载体为载有HSV-1病毒全基因组的细菌人工染色体；
所述的pREDI重组载体为含有阿拉伯糖诱导位点和鼠李糖诱导位点的载体；
所述的阿拉伯糖诱导位点和鼠李糖诱导位点可分别诱导Cre-recombinase重组酶和重组限制性内切酶I-SecI的表达；
所述的重组限制性内切酶I-SecI可识别I-SecI识别位点，并在此位点切开，此过程会造成DNA双链的断裂，引起DNA的损伤；
所述的细菌细胞优选为EPI300E.Coli细菌；
所述的pREDI重组载体为含有阿拉伯糖诱导位点和鼠李糖诱导位点的pKD46载体；
所述的HSV-1病毒体外基因敲除系统的制备方法，包含如下步骤：
(1)pREDI重组载体的构建：
①根据启动子PrhaB编码基因的序列信息，设计PCR扩增引物，扩增得到启动子PrhaB编码基因的DNA片段；
②根据重组限制性内切酶I-sceI编码基因的序列信息，设计PCR扩增引物，扩增得到重组限制性内切酶I-SecI编码基因的DNA片段；
③通过重组PCR连接步骤①扩增得到的启动子PrhaB编码基因的DNA片段和步骤②扩增得到的重组限制性内切酶I-SecI编码基因的DNA片段，获得PrhaB-I-SecI片段；
④将PrhaB-I-SecI片段和pKD46λ-red recombinase载体连接，获得pREDI重组载体；
(2)含有BAC-HSV-1载体和pREDI重组载体的细菌细胞的构建：
将步骤(1)制备得到的pREDI重组载体转入含有BAC-HSV-1载体的细菌细胞中，获得含有BAC-HSV-1载体和pREDI重组载体的细菌细胞，即为HSV-1病毒体外基因敲除系统；
步骤(1)①中所述的PCR扩增引物优选为：
PrhaB-F：5'-CATGCC ATGGGG CATGGC GAATTA ATCTTT CTGCG-3'；
PrhaB-R：5'-ATTACC TGGTTT TTTTGA TGCATT ATGTGA TCCTG-3'；
步骤(1)②中所述的PCR扩增引物优选为：
I-SceI-F：5'-TTA GAC TGG TCG TAA TGA AAT TCA GCA GGA TCA CATCTG GGT C-3'；
I-SceI-R：5'-CAT GCC ATG GGT CGA CTT ATT ATT TCA GGA AAG TTTCGG AGG AGA TAG TG-3'；
步骤(1)③所述的重组PCR的扩增引物优选为：
PrhaB-F：5'-CATGCC ATGGGG CATGGC GAATTA ATCTTT CTGCG-3'；
I-SceI-R：5'-CAT GCC ATG GGT CGA CTT ATT ATT TCA GGA AAG TTTCGG AGG AGA TAG TG-3'；
步骤(2)中所述的BAC-HSV-1细菌细胞优选为载有HSV-1病毒1737株全基因组的细菌人工染色体(BAC-HSV-1-1737载体)的细菌细胞；
所述的HSV-1病毒体外基因敲除系统在病毒基因敲除领域中的应用；
所述的HSV-1病毒体外基因敲除系统在病毒基因敲除领域中的应用，包含如下步骤：
(1)通过PCR扩增获得靶基因敲除同源重组片段：
①分别通过PCR扩增获得的靶基因上下游同源片段A-C段、正向筛选标记基因M1片段、反向筛选标记基因M2-B片段；
②通过重组PCR将正向筛选标记基因M1片段和反向筛选标记基因M2-B片段连接，获得标记基因M1-标记基因M2-B片段，标记基因M1片段与标记基因M2-B片段中间含有重组限制性内切酶I-SecI的识别位点；
③再次通过重组PCR将标记基因M1-标记基因M2-B片段与A-C段相互连接，获得A-C-标记基因M1-标记基因M2-B全长同源重组片段，即为靶基因敲除同源重组片段；
(2)HSV-1靶基因敲除：
将步骤(1)制备得到的靶基因敲除同源重组片段转化到HSV-1病毒体外基因敲除系统中，经过诱导剂阿拉伯糖和鼠李糖分别诱导相关蛋白酶的表达，进行基因的重组及筛选抗性基因的去除，得到完全敲除缺失靶基因的BAC-HSV-1；
步骤(1)中所述的靶基因上下游同源片段A-C段长0.6～1.0kb，为长20～80bp的靶基因上游同源片段A与靶基因下游同源片段C通过PCR连接，其中，同源片段A位于同源片段C上游；
步骤(1)中所述的反向筛选标记基因M2-B片段为反向筛选标记基因M2片段与长20～80bp的靶基因末端同源片段B通过PCR连接，其中，标记基因M2片段位于同源片段B上游；
所述的通过PCR扩增获得靶基因敲除同源重组片段，优选通过如下步骤进行(图1)：
①分别通过PCR扩增获得长0.7～0.9kb的靶基因上下游同源片段A-C段、长1.0～1.2kb的正向筛选标记基因卡那霉素抗性基因Kanr片段、长1.9～2.1kb的反向筛选标记基因SacB-B片段；
②通过重组PCR将Kanr片段与SacB-B片段连接，获得长2.9～3.3kb的Kanr-SacB-B片段，Kanr与SacB-B中间含有重组限制性内切酶I-SecI的识别位点；
③再次通过重组PCR将Kanr-SacB-B片段与A-C段相互连接，获得长3.6～4.2kb的A-C-Kanr-SacB-B全长同源重组片段，即为靶基因敲除同源重组片段；
所述的靶基因上下游同源片段A-C段为长20～60bp的靶基因上游同源片段A与靶基因下游同源片段C通过PCR连接，其中，同源片段A位于同源片段C上游；
所述的反向筛选标记基因SacB-B片段为SacB基因片段与长20～60bp的靶基因末端同源片段B通过PCR连接，其中，SacB基因片段位于同源片段B上游；
所述的靶基因优选为HSV-1病毒UL18基因；
本发明的原理：本发明中利用携带有HSV-1病毒全基因组的BAC载体和pREDI重组载体，将这两种载体转化至同一细菌细胞内，构建成一个体外重组系统。其中，pREDI重组载体含有两个可诱导位点：阿拉伯糖诱导位点和鼠李糖诱导位点，阿拉伯糖诱导位点可在阿拉伯糖的诱导下表达Cre-recombinase重组酶，同时鼠李糖诱导位点可在鼠李糖的诱导下表达重组限制性内切酶I-SecI。重组限制性内切酶I-SecI识别两个筛选标记基因之间的I-SecI识别位点，并在此位点切开，此过程会造成DNA双链的断裂，引起DNA的损伤。
本发明构建了预敲除的HSV-1病毒靶基因同源片段，在该同源片段中含有两个筛选标记基因(如：Kanr基因和SacB基因)，三个靶基因上下游的同源序列A、B、C，以及I-SceI识别位点，然后将该靶基因敲除同源重组片段(A-C-Kanr-I-SceI-SacB-B)转化到上述的体外重组系统内。
重组限制性内切酶I-SecI识别Kanr和SacB片段之间的I-SecI识别位点，并在此位点切开，此过程会造成DNA双链的断裂，引起DNA的损伤。宿主细胞内存在的DNA损伤修复系统会识别DNA双链的断裂，并通过诱导损伤部位附近同源片段的重组进行DNA损伤的修复。即在A靶基因上游-C靶基因下游-Kanr-SacB-B(靶基因)片段的C片段与靶基因基因下游片段之间进行同源重组。通过SacB反向筛选标记基因对正确去除标记基因的细菌进行筛选，获得完全去除标记基因的靶基因敲除菌株，通过PCR对挑选的克隆进行鉴定。
本发明将带有HSV-1病毒基因组的BAC-HSV-1-1737载体和pREDI质粒采用转化的方式导入到同一细菌细胞内，再利用电转化的方式将靶基因同源片段(A靶基因上游-C靶基因下游-Kanr-SacB-B(靶基因))导入到含有两个质粒的细菌细胞内，经过阿拉伯糖的诱导，诱导重组酶的表达，实现靶基因与同源序列片段在靶基因的上下游进行重组替换。重组发生后再经过鼠李糖诱导I-SceI内切酶的表达，将重组到HSV-1基因组靶基因内的筛选标记基因去除，从而得到敲除靶基因的BAC-HSV-1-1737缺陷菌株(图2)。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)利用此基因敲除系统可以在很短的时间内(最快3周左右)完成病毒基因的敲除工作，敲除的周期极短，且成功率高。
(2)利用此系统进行基因敲除不会在基因组内掺入任何外源的DNA片段，是完完整整的基因敲除，而不是靶基因的取代，从而可以完全避免外源筛选标记基因对病毒基因组的影响，使得到的结果更加可信。
(3)利用此系统进行基因敲除，由于是体外操作，所以免去了重组病毒的筛选过程，简化了实验操作过程。
(4)整个基因敲除过程不涉及活体病毒，实验的安全性得到了保障。
(5)利用此套系统，理论上可以同时进行多个基因的敲除工作，以及进行外源基因的敲入。
附图说明
图1是敲除靶基因同源重组片段扩增流程图。
图2是HSV-1体外基因敲除系统示意图。
图3是内切酶I-SceI基因扩增片段和启动子PrhaB基因扩增片段琼脂糖凝胶电泳图，其中，A：I-SceI内切酶基因片段；B：PrhaB启动子基因片段。
图4是pREDI质粒鉴定的琼脂糖凝胶电泳图，其中，A：PCR扩增出重组PrhaB-I-SecI片段；B：pREDI质粒的NcoI单酶切鉴定。
图5是HSV-1病毒UL18基因同源重组片段的琼脂糖凝胶电泳图，其中，A：长约0.8kb的UL18基因下游同源片段A-C段；B:长约1.1kb的正向筛选标记基因卡那霉素抗性基因Kanr片段；C:长约2.0kb的反向筛选标记基因SacB-B片段；D：长约3.1kb的Kanr-SacB-B片段；E：长约3.9kb的A-C-Kanr-SacB-B全长同源重组片段。
图6是BAC-HSV-1-1737ΔUL18(Kanr+SacB)-pREDI菌株PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳图，其中，A：对挑选的单克隆UL18基因的PCR鉴定；B：挑选的单克隆进行插入的筛选标记基因Kanr基因的PCR鉴定；C：挑选的单克隆进行插入的筛选标记基因SacB基因的PCR鉴定。
图7是UL18基因敲除细菌BAC-HSV-1-1737ΔUL18菌株PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳图，其中，A：HSV-1病毒UL18基因的PCR鉴定；B：筛选标记基因Kanr去除PCR鉴定；C：筛选标记基因SacB去除PCR鉴定。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1 pREDI重组载体的构建
(一)PCR扩增启动子PrhaB编码基因片段
(1)MG1655菌株(购自addgene)的接种培养：实验前将超净台用酒精灯擦拭干净，放进去枪头，培养基等实验需要用的东西，紫外照射20～30min。实验前5min先关闭紫外灯，打开抽风通风5min，然后进行实验操作。在超净台内打开试管培养基的塞子，取出-80℃保存的MG1655菌种，接取适量的菌液(1：50的比例接种)于灭菌的LB培养基中。塞上塞子，置于恒温摇床培养，一般摇速为180rpm/min。细菌培养至OD值0.5左右后，吸取100μL菌液至1.5mL离心管内，10000rpm/min室温离心5min，弃掉上清，加入50μLddH2O重选菌体，沸水煮10min，10000rpm/min离心5min，转移上清至新的离心管内获得GM1655DNA样品，-20℃保存备用。
(2)根据启动子PrhaB编码基因的序列信息，设计PCR扩增引物，引物序列如下：PrhaB-F：5'-CATGCC ATGGGG CATGGC GAATTA ATCTTT CTGCG-3'；PrhaB-R：5'-ATTACC TGGTTT TTTTGA TGCATT ATGTGA TCCTG-3'。以GM1655 DNA样品为扩增模板，用上述引物进行PCR扩增得到PrhaB编码基因DNA片段，得到的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳检测并进行DNA片段的胶回收，电泳结果见图3B。PCR反应体系如下：
(二)PCR扩增限制性内切酶I-SecI编码基因
(1)pBAD-I-sceI质粒提取：将pBAD-I-sceI菌种(购自addgene)接种至含氨苄抗生素的LB培养基内，37℃恒温摇床培养，摇速为180rpm/min。培养至OD值为0.4，离心收集菌体进行pBAD-I-sceI质粒抽提。采用E.Z.N.A Plasmid Mini KitI试剂盒进行质粒的抽提，步骤如下：取1.5～5.0mL菌液，于室温10000g离心10min收集菌体。弃去培养基，加入250μL预冷的Solution I/RNaseA混合溶液，涡旋混匀。向重悬混合液中加入250μL Solution II溶液，上下颠倒10次混匀。加入350μL Solution III，上下颠倒混匀，直至形成白色沉淀，室温10000g离心10min。取上清加入HinBindTM柱，切勿吸取到沉淀，室温10000g离心1min。弃取收集管内液体，往柱内加入500μL Buffer HB，室温10000g离心1min。弃取收集管内液体，往柱内加入700μL DNA wash buffer，室温10000g离心1min。重复此步骤一次。弃取收集管内液体，将空管室温10000g离心2min。将柱子放进干净灭菌1.5mL离心管中，加入30～100μL ddH2O，室温静置5min，10000g离心1min。收集质粒，必要时可以重复洗涤。质粒测定浓度后保存于-20℃冰箱。
(2)PCR扩增限制性内切酶I-SecI编码基因：根据限制性内切酶I-sceI编码基因的序列信息，设计PCR扩增引物，引物序列如下：I-SceI-F：5'-TTA GACTGG TCG TAA TGA AAT TCA GCA GGA TCA CAT CTG GGT C-3'；I-SceI-R：5'-CAT GCC ATG GGT CGA CTT ATT ATT TCA GGA AAG TTT CGG AGG AGATAG TG-3'。以抽提的pBAD-I-sceI质粒为扩增模板，用上述引物进行PCR扩增得到限制性内切酶I-SecI编码基因DNA片段。得到的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳检测及胶回收，电泳结果见(图3A)。测定胶回收的DNA浓度后-20℃保存备用。PCR反应体系如下：
(三)重组PCR连接限制性内切酶I-SecI编码基因片段和启动子PrhaB编码基因片段，获得2.7kb的PrhaB-I-SecI DNA片段并进行琼脂糖凝胶电泳检测(见图4A)。重组PCR的引物如下：PrhaB-F：5'-CATGCC ATGGGG CATGGCGAATTA ATCTTT CTGCG-3'；I-SceI-R：5'-CAT GCC ATG GGT CGA CTT ATTATT TCA GGA AAG TTT CGG AGG AGA TAG TG-3'。PCR体系如下：
(四)PrhaB-I-SecI片段连接到pKD46λ-red recombinase表达质粒
(1)将含有pKD46λ-red recombinase表达质粒DH5αE.Coli菌种(pKD46λ-red recombinase质粒和DH5a E.Coli菌株购自NTCC典型培养物保藏中心；)接种至含氨苄抗生素和氯霉素的LB培养基内，37℃恒温摇床培养，摇速为180rpm/min。培养至OD值为0.4，离心收集菌体进行pKD46λ-red recombinase表达质粒抽提。采用E.Z.N.A Plasmid Mini Kit I试剂盒进行质粒的抽提，具体方法同步骤(二)。抽屉的质粒测浓度后-20℃保存备用。
(2)PrhaB-I-SecI片段与pKD46λ-red recombinase表达质粒的连接：将步骤(三)得到的PrhaB-I-SecI片段和pKD46λ-red recombinase表达质粒分别进行NcoI单酶切，单酶切体系如下：
然后将酶切产物进行胶回收。将限制性内切酶酶切后的质粒及PCR片段用T4 DNA连接酶进行连接，于16℃恒温孵育连接过夜，产物用于转化实验。体系如下：
(3)连接产物转化DH5α细菌：实验前将超净台及所需耗材灭菌处理。从-80℃去除感受态细菌，在冰上解冻，然后于超净台内加入连接液10μL，混匀。置于冰上冰浴30～45min。去除EP管，迅速放入42℃，水浴热击90sec，再迅速放回冰上，冰浴2～3min。于超净台内向EP管内加入1mL培养基，于摇床低俗150r/min培养1h。取50μL或100μL均匀涂布于含氨苄抗生素和氯霉素的培养平板上，于37℃恒温培养箱倒置培养。待培养平板上长出细菌单克隆，随机挑取单克隆进行含有氨苄抗生素和氯霉素的液体培养基内，37℃恒温摇床培养，摇速为180rpm/min。培养至OD600值为0.4，离心收集菌体进行重组pKD46λ-redrecombinase表达质粒抽提。采用E.Z.N.A Plasmid Mini Kit I试剂盒进行重组pKD46λ-red recombinase质粒的抽提，具体方法同步骤(二)。抽提的质粒测浓度后-20℃保存备用。
(4)重组pKD46λ-red recombinase(pREDI)质粒的内酶切：将抽提的重组pKD46λ-red recombinase质粒进行NcoI单酶切鉴定，单酶切体系如下：
酶切4h后，进行琼脂糖凝胶电泳检测重组pKD46λ-red recombinase质粒是否连接上PrhaB-I-SecI片段。琼脂糖凝胶电泳结果显示PrhaB-I-SecI片段成功插入pKD46λ-red recombinase质粒NcoI位点，结果见(图4B)，证明pREDI工具质粒构建成功。
实施例2 HSV-1病毒UL18基因同源重组片段(简称A-C-Kanr-SacB-B)的构建
通过PCR扩增获得UL18的基因敲除同源重组片段。分别通过PCR扩增获得长0.8kb的UL18基因上下游同源片段A-C段(图5A)，C段上游通过PCR接有长约50bp的UL18上游同源片段A；长1.1kb的正向筛选标记基因卡那霉素抗性基因Kanr片段(图5B)；长2.0kb的反向筛选标记基因SacB-B片段(图5C)，SacB段下游通过PCR连接长50bp的UL18末端同源片段B。再通过重组PCR将Kanr片段与SacB-B片段连接，获得长3.1kb的Kanr-SacB-B片段(图5D)，Kanr与SacB-B中间含有内切酶I-SecI的识别序列。再次通过重组PCR将Kanr-SacB-B片段于A-C段相互连接，获得长3.9kb的A-C-Kanr-SacB-B全长同源重组片段(图5E)。通过以上PCR反应，扩增得到用于UL18基因敲除的同源重组片段。其中，所用引物分别为：
UL18基因上下游同源片段A-C段扩增引物分别为：
UL18-A-C上-F：5'-CCC ACC CCC CCG TGG GTC TAG CCG GGC C(A片段)GG CGC CGA TCCACG CGG CAG G(C上)-3'；
UL18-C下-Kanr-R：5'-TGG CTT TGT TGA ATA AAT CG(Kanr段)C GACCAC GGC CAG AGC GACCCG TCC(C下)-3'；
正向筛选标记基因卡那霉素抗性基因Kanr片段扩增引物分别为：UL18-C下-Kanr上-F：5'-GGA CGG GTC GCT CTG GCC GTG GTC G(C下)CG ATT TATTCA ACA AAG CCA CG(Kanr上)-3'；
Kmr下-I-SceI-F：5'-GGC CTA GGG ATA ACA GGG TAA TT(I-SceI段)GCCA GTG TTA CAA CCA ATT AAC C(Kanr下)-3'；
反向筛选标记基因SacB-B片段扩增引物分别：
I-SceI-SacB上-F：5'-CTG GCA ATT ACC CTG TTA TCC CTA(I-SceI段)GGC CCG TAG TCT GCAAAT CCT TTT(SacB上)-3'；
UL18-B-SacB下-R：5'-CAT CGC GAT ACC CTC GGG CAT CTC(SacB下)GCA TCT TGC AAG AATGGG CCT CGT T(B片段)-3'；
实施例3 pREDI质粒转化到含有BAC-HSV-1-1737细菌细胞内
(1)BAC-HSV-1-1737细菌转化感受态制备：BAC-HSV-1-1737细菌(EPI300E.Coli)(Gierasch W W,Zimmerman D L,Ward S L,et al.Construction andcharacterization of bacterial artificial chromosomes containing HSV-1strains 17andKOS[J].Journal of virological methods,2006,135(2):197-206.)冷冻保存的菌种，挑取一环，划线接种在LB固体培养基平板上(活化菌种)，37℃培养过夜(约16h)。从长好的平板上挑取一个单菌落，转接在含有3mL LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜(约16h)。取0.3mL菌液接种于20mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，37℃振荡培养2～3h，待OD600值达到0.3～0.4时，取下三角瓶，立即置冰10～15min。将细菌转到一个灭菌的50mL离心管中，4℃3000r/min离心10min，弃去上清液(尽可能将所有的上清液去净)，收集菌体。然后加入20mL用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，重新悬浮菌体，使菌体分散均匀，置冰浴中30min。4℃3000r/min离心10分钟，弃去上清液(尽可能将所有的上清液去净)。再加入2mL用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心重新悬浮菌体(操作要轻)。分装后-80℃保存备用。
(2)pREDI质粒转化BAC-HSV-1-1737细菌感受态，获得同时含有pREDI重组质粒和BAC-HSV-1-1737质粒的细菌。具体方法：从-80℃取出感受态细菌，在冰上解冻，然后于超净台内加入实施例1制备得到的pREDI重组质粒溶液10μL，混匀。置于冰上冰浴30～45min。取出离心管，迅速放入42℃，水浴热击90sec，再迅速放回冰上，冰浴2～3min，于超净台内向离心管内加入1mL培养基，于摇床低俗150r/min培养1h。取50μL均匀涂布于含氯霉素和氨苄抗生素的培养平板上，于恒温培养箱倒置培养。培养过夜后(16h)后，挑选细菌单克隆进行LB液体培养基培养，进行菌液PCR鉴定。菌液PCR结果显示重组质粒pREDI成功导入BAC-HSV-1-1737细菌内，简称BAC-HSV-1-1737-pREDI菌。
实施例4 HSV-1体外基因敲除系统的验证
(1)BAC-HSV-1-1737-pREDI细菌电转化感受态制备：取出保存于-20℃冰箱中的BAC-HSV-1-1737-pREDI菌种，划线于含氯霉素+氨苄青霉素抗性平板上，37℃过夜培养。挑取单克隆于含阿拉伯糖(10mM)，氯霉素，氨苄青霉素抗性的5mL LB试管中，37℃培养16～18h。转接100μL过夜培养菌于含阿拉伯糖(10mM)，氯霉素，氨苄青霉素抗性的5mL LB试管中，37℃培养2～3h至OD600＝0.4～0.6。10％(体积分数)甘油/三蒸水冰上预冷至少2h；预冷电转杯；预冷台式离心机至4℃。菌液于4℃，11000rpm离心30sec，弃上清，快速用移液器吸去残余上清。用预冷的10％甘油/三蒸水重悬沉淀3次。添加适量预冷10％甘油/三蒸水重悬沉淀，置冰上备用，按100μL/管分装于灭菌的EP管中，-80℃保存备用。
(2)HSV-1病毒UL18基因同源片段A-C-Kanr-SacB-B电转化至BAC-HSV-1-1737-pREDI感受态：用移液器吸取10μL(约100～200ng)实施例2制备得到的UL18基因同源片段至BAC-HSV-1-1737-pREDI电转感受态细胞，混匀后冰浴2～3min。将冰浴后的混合菌液移至预冷过的电转杯中，电击条件为1500V，40μs(eppendorf)。用移液器将电击后的菌液转移至1mL不加抗生素的含有10mM L-阿拉伯糖的SOC培养基内，30℃摇床培养，孵育1～2h左右。取100μL菌液铺板于含氯霉素+氨苄青霉素+卡那霉素抗性的固体LB培养基上，30℃过夜培养。挑取单克隆进行液体培养基培养，待OD600达到0.4～0.6，进行菌液PCR，鉴定UL18基因是否被同源重组片段取代。菌液PCR结果显示UL18基因被同源片段A-C-Kanr-SacB-B取代，完成UL18基因的敲除，获得的敲除UL18基因的重组细菌简称为BAC-HSV-1-1737ΔUL18(Kanr+SacB)-pREDI。菌液PCR结果见(图6A、B、C)。
(3)重组菌BAC-HSV-1-1737ΔUL18(Kanr+SacB)-pREDI中正负筛选标记基因的去除：将重组细菌BAC-HSV-1-1737ΔUL18(Kanr+SacB)-pREDI接种于5mL LB液体培养基，含Cmr、Kanr、Ampr和10mM鼠李糖，30℃，培养至OD600＝0.4。按1/10的接种量，接种上步的重组细菌菌液于5mL新的LB液体培养基中，Cmr、Ampr，10mM鼠李糖和5％(体积分数)蔗糖，30℃，培养至OD600＝0.4。重复操作2～3次。将第三次的菌液涂布于含有Cmr、Ampr和5％蔗糖的LB平板上，30℃培养过夜，挑取单克隆与液体培养基中培养至ODOD600＝0.4，进行菌液PCR，验证正负筛选标记基因Kanr和SacB是否去除。结果显示在鼠李糖诱导I-SceI内切酶的表达，经过第二次同源重组完全去除筛选标记基因Kanr和SacB，获得了UL18基因完全去除，并且不含任何外源基因片段的突变细菌BAC-HSV-1-1737ΔUL18。结果见(图7A、B、C)。
实施例5 去除UL18基因的缺陷病毒HSV-1-BAC感染性验证
(1)BAC-HSV-1-1737质粒和BAC-HSV-1-1737ΔUL18质粒的提取：用100(MACHEREY-NAGEL)试剂盒提取细菌人工染色体BAC。培养包含病毒基因组的两种细菌(BAC-HSV-1-1737菌和BAC-HSV-1-1737ΔUL18菌)，过夜培养12～16h。收集菌体：每个离心管收集约300mL的菌液，5000g，4℃离心15min。用10mL移液管加24mL的Buffer S1(已加入RNaseA，4℃冰箱保存)，用1mL移液枪吹打重悬菌体。加入24mL Buffer S2，小心颠倒离心管混匀8次，室温静置3min。加入24mL预冷Buffer S3(提前1h放进4度冰箱)，立即颠倒混匀8次，可以看到大量白色絮状物质形成，冰上静置5min。柱平衡：用胶带将column固定在大烧杯内侧壁上，加Buffer N26mL，保鲜膜封口，让Buffer N2由于重力流出。提前将玻璃漏斗固定放在架子上，滤纸展开放在漏斗内侧，加入几滴Buffer N2润湿滤纸。漏斗底端对准平衡好的column。用10mL移液管将裂解的菌液转至滤纸漏斗过滤。等过滤完后让滤液由于重力流出column。洗涤：用10mL移液管加18mL的Buffer N3到column，重力流过column，重复此步。待Buffer N3全部流出column后，将column固定在灭菌的50mL离心管上，向column内加入15mL Buffer N5洗脱(提前50℃预热)。让Buffer N5洗脱液由于重力滴入离心管内。待收集完洗脱液，加11mL常温的异丙醇到离心管内，轻轻颠倒混匀，16000g，4℃离心30min。小心吸弃上清液，加入常温70％乙醇5mL，震荡涡旋混匀，16000g，离心10min。小心用1mL移液枪吸弃70％乙醇，室温干燥20min。加200μL灭菌蒸馏水溶解。
(2)BAC-HSV-1-1737质粒和BAC-HSV-1-1737ΔUL18质粒转染Vero细胞：用6孔板培养Vero细胞(ATCC)，待细胞密度长至50～70％时，进行两种质粒的转染。将不同量的BAC-HSV-11737质粒和BAC-HSV-1-1737ΔUL18质粒分别取1μg、2μg、3μg、4μg溶于250μL转染培养基Opti-MEM，室温静置5min。将siRNA-Mate加入混有质粒的转染培养基中，形成转染复合物，室温静置10min。将转染复合物加入到含有2mL维持液的6孔板中。同时设置HSV-1病毒对照组和正常细胞对照组。于转染后在显微镜下观察病变情况。病毒病变CPE观察结果：转染BAC-HSV-1-1737ΔUL18质粒的细胞孔内和正常细胞对照组孔内没有细胞病变空斑出现，在BAC-HSV-1-1737质粒转染孔内，HSV-1对照组孔内皆有细胞病变，产生病毒感染空斑，证明去除UL18基因的HSV-1失去致病变的能力。
(3)BAC-HSV-1-1737ΔUL18质粒和pcDNA3.1-UL18质粒(表达UL18基因编码的蛋白，由本实验构建并保存。构建流程参考实施例1，首先通过PCR扩增全长UL18基因，所用引物为HindIII-UL18-Forward：CCCAAGCTTGCCACCATGGGCCTGGCGGACGGC，UL18-BamHI-Reverse:CGCGGATCCGCGTTAGGGATAGCGTATAACGGG，PCR扩增所用模板为BAC-HSV-1-1737质粒。通过胶回收获得985bp的HindIII-UL18-BamHI片段并进行琼脂糖凝胶电泳检测。采用E.Z.N.A Plasmid Mini Kit I试剂盒进行pcDNA3.1+(购自addgene)质粒的抽提，并用HindIII(购自TAKARA)和BamHI(购自TAKARA)对pcDNA3.1+质粒和HindIII-UL18-BamHI片段进行双酶切。双酶切完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测，通过胶回收获得酶切后的质粒和片段。最后通过DNA连接酶对pcDNA3.1+质粒和HindIII-UL18-BamHI片段进行连接，并将连接产物转化至DH5αE.Coli，挑取克隆进行PCR、酶切及测序鉴定。将鉴定获得的阳性克隆命名为pcDNA3.1-UL18，保存于-80℃冰箱。)共转染Vero细胞(ATCC)：按照上述转染方法分别将3μg的BAC-HSV-1-1737ΔUL18质粒和pcDNA3.1-UL18质粒溶于250μL转染培养基Opti-MEM，室温静置5min。将siRNA-Mate加入混有质粒的转染培养基中，形成转染复合物，室温静置10min。将转染复合物加入到含有2mL维持液的6孔板中。同时设置HSV-1病毒对照组和正常细胞对照组。于转染后在显微镜下观察病变情况。病毒病变CPE观察结果。结果显示共转染BAC-HSV-1-1737ΔUL18质粒和pcDNA3.1-UL18质粒的细胞孔内和HSV-1孔内皆有细胞病变，产生病毒感染形成的空斑，正常细胞对照组没有细胞病变，无病变空斑产生。证明利用BAC-HSV-1-pREDI体外基因敲除系统成功将HSV-1的UL18基因敲除，获得了病毒基因缺陷株。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种HSV-1病毒体外基因敲除系统，其特征在于：所述的HSV-1病毒体外基因敲除系统为含有BAC-HSV-1载体和pREDI重组载体的细菌细胞；
所述的BAC-HSV-1载体为载有HSV-1病毒全基因组的细菌人工染色体；
所述的pREDI重组载体为含有阿拉伯糖诱导位点和鼠李糖诱导位点的载体；
所述的阿拉伯糖诱导位点和鼠李糖诱导位点可分别诱导Cre-recombinase重组酶和重组限制性内切酶I-SecI的表达；
所述的重组限制性内切酶I-SecI可识别I-SecI识别位点。
2.根据权利要求1所述的HSV-1病毒体外基因敲除系统，其特征在于：
所述的细菌细胞为EPI300E.Coli细菌；
所述的pREDI重组载体为含有阿拉伯糖诱导位点和鼠李糖诱导位点的pKD46载体。
3.权利要求1或2所述的HSV-1病毒体外基因敲除系统的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)pREDI重组载体的构建：
①根据启动子PrhaB编码基因的序列信息，设计PCR扩增引物，扩增得到启动子PrhaB编码基因的DNA片段；
②根据重组限制性内切酶I-sceI编码基因的序列信息，设计PCR扩增引物，扩增得到重组限制性内切酶I-SecI编码基因的DNA片段；
③通过重组PCR连接步骤①扩增得到的启动子PrhaB编码基因的DNA片段和步骤②扩增得到的重组限制性内切酶I-SecI编码基因的DNA片段，获得PrhaB-I-SecI片段；
④将PrhaB-I-SecI片段和pKD46 λ-red recombinase载体连接，获得pREDI重组载体；
(2)含有BAC-HSV-1载体和pREDI重组载体的细菌细胞的构建：
将步骤(1)制备得到的pREDI重组载体转入含有BAC-HSV-1载体的细菌细胞中，获得含有BAC-HSV-1载体和pREDI重组载体的细菌细胞，即为HSV-1病毒体外基因敲除系统。
4.根据权利要求3所述的HSV-1病毒体外基因敲除系统的制备方法，其特征在于：
步骤(1)①中所述的PCR扩增引物为：
PrhaB-F：5'-CATGCC ATGGGG CATGGC GAATTA ATCTTT CTGCG-3'；
PrhaB-R：5'-ATTACC TGGTTT TTTTGA TGCATT ATGTGA TCCTG-3'。
5.根据权利要求3所述的HSV-1病毒体外基因敲除系统的制备方法，其特征在于：
步骤(1)②中所述的PCR扩增引物为：
I-SceI-F：5'-TTA GAC TGG TCG TAA TGA AAT TCA GCA GGA TCA CATCTG GGT C-3'；
I-SceI-R：5'-CAT GCC ATG GGT CGA CTT ATT ATT TCA GGA AAG TTTCGG AGG AGA TAG TG-3'。
6.根据权利要求3所述的HSV-1病毒体外基因敲除系统的制备方法，其特征在于：
步骤(1)③所述的重组PCR的扩增引物为：
PrhaB-F：5'-CATGCC ATGGGG CATGGC GAATTA ATCTTT CTGCG-3'；
I-SceI-R：5'-CAT GCC ATG GGT CGA CTT ATT ATT TCA GGA AAG TTTCGG AGG AGA TAG TG-3'。
7.权利要求1或2所述的HSV-1病毒体外基因敲除系统在病毒基因敲除领域中的应用。
8.根据权利要求7所述的HSV-1病毒体外基因敲除系统在病毒基因敲除领域中的应用，其特征在于包含如下步骤：
(1)通过PCR扩增获得靶基因敲除同源重组片段：
①分别通过PCR扩增获得的靶基因上下游同源片段A-C段、正向筛选标记基因M1片段、反向筛选标记基因M2-B片段；
②通过重组PCR将正向筛选标记基因M1片段和反向筛选标记基因M2-B片段连接，获得标记基因M1-标记基因M2-B片段，标记基因M1片段与标记基因M2-B片段中间含有重组限制性内切酶I-SecI的识别位点；
③再次通过重组PCR将标记基因M1-标记基因M2-B片段与A-C段相互连接，获得A-C-标记基因M1-标记基因M2-B全长同源重组片段，即为靶基因敲除同源重组片段；
(2)HSV-1靶基因敲除：
将步骤(1)制备得到的靶基因敲除同源重组片段转化到HSV-1病毒体外基因敲除系统中，经过诱导剂阿拉伯糖和鼠李糖分别诱导相关蛋白酶的表达，进行基因的重组及筛选抗性基因的去除，得到完全敲除缺失靶基因的BAC-HSV-1；
步骤(1)中所述的靶基因上下游同源片段A-C段长0.6～1.0kb，为长20～80bp的靶基因上游同源片段A与靶基因下游同源片段C通过PCR连接，其中，同源片段A位于同源片段C上游；
步骤(1)中所述的反向筛选标记基因M2-B片段为反向筛选标记基因M2片段与长20～80bp的靶基因末端同源片段B通过PCR连接，其中，标记基因M2片段位于同源片段B上游。
9.根据权利要求8所述的HSV-1病毒体外基因敲除系统在病毒基因敲除领域中的应用，其特征在于：
所述的通过PCR扩增获得靶基因敲除同源重组片段，通过如下步骤进行：
①分别通过PCR扩增获得长0.7～0.9kb的靶基因上下游同源片段A-C段、长1.0～1.2kb的正向筛选标记基因卡那霉素抗性基因Kanr片段、长1.9～2.1kb的反向筛选标记基因SacB-B片段；
②通过重组PCR将Kanr片段与SacB-B片段连接，获得长2.9～3.3kb的Kanr-SacB-B片段，Kanr与SacB-B中间含有重组限制性内切酶I-SecI的识别位点；
③再次通过重组PCR将Kanr-SacB-B片段与A-C段相互连接，获得长3.6～4.2kb的A-C-Kanr-SacB-B全长同源重组片段，即为靶基因敲除同源重组片段。
10.根据权利要求9所述的HSV-1病毒体外基因敲除系统在病毒基因敲除领域中的应用，其特征在于：
所述的靶基因上下游同源片段A-C段为长20～60bp的靶基因上游同源片段A与靶基因下游同源片段C通过PCR连接，其中，同源片段A位于同源片段C上游；
所述的反向筛选标记基因SacB-B片段为SacB基因片段与长20～60bp的靶基因末端同源片段B通过PCR连接，其中，SacB基因片段位于同源片段B上游。
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