CN104818296A - 一种借助细胞穿透肽和小孢子培养建立大白菜遗传转化体系的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物细胞工程技术和分子生物学领域，具体涉及一种借助细胞穿透肽和小孢子培养建立大白菜遗传转化体系的方法，利用细胞穿透肽的穿膜功能，先在体外合成转染复合物，再将复合物添加到分离出的小孢子悬浮液中，最后利用游离小孢子培养技术获得再生植株并对再生植株进行鉴定。该方法旨在建立基于游离小孢子培养的大白菜遗传转化体系，为大白菜遗传育种提供研究平台,并为大白菜功能基因组学研究奠定方法基础。

Description

一种借助细胞穿透肽和小孢子培养建立大白菜遗传转化体系的方法

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术和分子生物学领域，具体涉及一种在小孢子培养过程中结合细胞穿透肽的穿膜功能建立大白菜遗传转化体系的方法。

背景技术

大白菜是我国最重要的蔬菜作物之一。随着大白菜的基因组序列的释放，对于其功能基因组学的研究越来越引起人们的重视，构建大白菜高效遗传转化体系在大白菜基因功能验证方面具有重要作用。

在转基因大白菜的研究方面，国内外众多学者借助于组织培养等手段已经建立起了大白菜的遗传转化体系。但是此类转化方法存在着转化效率低、实验周期长等不足。

细胞穿透肽是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽（一般不超过30个氨基酸），其跨膜能力不依赖经典的胞吞作用，被认为是一种理想的运载工具。它具有一些其他运载工具无法比拟的优点：低浓度条件下，可以穿过细胞膜进入细胞并且不会对膜造成明显破坏和损伤；能介导各种物质包括小分子、核酸、蛋白多肽以及纳米粒子等入胞；高效、低毒。如果将细胞穿透肽和小孢子培养技术结合起来，就能够避免农杆菌侵染的环节，直接可以利用细胞穿透肽将目的基因导入把基因组，省却了很多的实验环节。这类渗透肽的分子量非常小，很多的商业公司可提供合成业务。同时，它又巧妙利用了植物的小孢子培养技术，在游离小孢子加倍之前，将目的基因导入，借助游离小孢子的自然加倍现象，直接获得纯合稳定的转基因植株。

发明内容

本发明的目的是创建一种借助细胞穿透肽和小孢子培养建立大白菜遗传转化体系的方法，将细胞穿透肽和小孢子培养技术相结合，快速获得纯合的大白菜转化植株。

本发明提供的技术方案如下：

过程包括：

（1）进行分离纯化小孢子：在大白菜开花期，选取其长度为2-4 mm的未开放花蕾（小孢子发育期为单核晚期至二核早期）,花蕾在超净工作台内经75％乙醇溶液，0.1％HgCl₂溶液消毒后，再用无菌水冲洗3次；将消毒后的花蕾在蔗糖浓度为130g·L^-1，PH值为5.8的B₅培养基中进行分离纯化，收集得到的沉淀物即为纯净小孢子；将纯化后的小孢子用NLN-13培养基稀释后分装入直径60 mm的无菌培养皿内，置入33℃恒温箱中，热激预处理24h；

其中，NLN-13培养基为含130g·L^-1蔗糖，添加激素0.05mg·L^-1 6-BA（ 6-苄氨基腺嘌呤）和0.05mg·L^-1 NAA（α-萘乙酸），PH值为5.8的NLN-13培养基；

（2）转染小孢子的基因表达组件的获得：将载体pBI221-GFP质粒DNA转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并在添加相应抗生素的培养基上进行扩大培养；以2μL菌液为模板，用引物p1 GATGGTTAGAGAGGCTTACGCAG，p2 CACAATAAAGTGACAGATAGCTGGG，p3 AGT T CA CCT TGA TGC CGTTC和p4 GTG CTT CA G CCG CTACCC进行PCR扩增，再用紫外凝胶成像系统拍照鉴定；使用天根无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒DNA提取，将质粒DNA利用限制性内切酶PstI进行酶切反应；采用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒回收用于转染的目的DNA表达片段；

（3）获取用于小孢子转染的体外复合物：将目的DNA表达片段与细胞穿透肽按照1：4的比例混合，室温反应15min后再加入4μL无RNase 的DNaseI反应 15min，立即放置冰上终止反应；以未加CPP的DNA片段作为空白对照；然后用DNA纯化试剂盒回收反应产物，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

（4）小孢子转染与培养过程：目的DNA表达片段与细胞穿透肽按照1：4的比例混合反应后，将反应混合物添加到经热激预处理的小孢子悬浮液中，再置于33℃恒温箱中继续热激处理24h，最后转移至25℃培养箱暗培养。将得到的胚状体转接到MS培养基上进一步培养获得小孢子再生植株。

诱导再生植株的MS培养基为含30g·L^-1蔗糖，7.5g·L^-1琼脂，pH值为5.8，未添加任何激素的MS培养基；诱导再生植株生根的MS培养基为含30g·L^-1蔗糖，5.5g·L^-1琼脂，0.1mg·L^-1 NAA，pH值为5.8的MS培养基；

（5）对再生植株进行转基因鉴定：在再生植株继代培养的过程中，于超净工作台中取出再生植株的叶片，利用新型植物基因组DNA提取试剂盒提取大白菜转化与未转化植株的基因组总DNA，然后通过10μL的PCR反应体系（0.5μL模板DNA，1μL10× buffer，0.8μLdNTPs，0.5μL引物p1p2或p3p4，0.2μLTaq DNA 聚合酶）进行扩增反应，产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分离，紫外凝胶成像系统检测；

于超净工作台中，从三角瓶里取PCR阳性再生植株的嫩叶，采用新型植物RNA提取试剂盒提取大白菜基因组总RNA，然后进行反转录PCR扩增反应，产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分离，紫外凝胶成像系统检测。

于超净工作台中取出阳性与非转化再生植株的幼叶，用Fluor Cam便携式ChI/GFP荧光仪和激光共聚焦显微镜对PCR阳性转化植株进行检测；

采用罗氏地高辛标记试剂盒Ⅱ对阳性植株进行Southern Blot检测；

（6）利用流式细胞仪对再生植株进行倍性鉴定：取直径为1-2cm 大小的新鲜嫩叶放入培养皿内，加入2.0 mL Chopping Buffer缓冲液（15 mmol·L^-1三羟甲基氨基甲烷，2 mmol·L^-1乙二胺四乙酸二钠，0.5 mmol·L^-1精胺，80 mmo1·L^-1氯化钾，20 mmo1·L^-1氯化钠，0.1% [v/v] 聚乙二醇辛基苯基醚和15 mmo1·L^-1二巯基乙醇，pH 7.5），用手术剪刀将叶片剪碎，吸取上清液，用300目筛网将样品过滤到离心管内，1000rpm离心10min，离心后弃上清，沉淀加1mL PI（碘化丙啶）染液，混匀避光染色15min后，将样品用500目筛网过滤到上样管中，混匀上机检测，约20s后分析仪自动形成代表该样品倍性的DNA含量峰值图；以已知二倍体的材料为对照，使对照的DNA吸收峰处在200道（X轴）位置，每个待测植株分别测定3次, DNA吸收峰值处在200道的样本即为二倍体，而峰值处在100为单倍体，既有200峰值也有400峰值或者既有400峰值也有800峰值的则为嵌合体。

本发明的积极效果：

（1）游离小孢子培养本身具有快速获得目标性状、缩短育种年限、降低育种成本等优点。将其与细胞穿透肽相结合，获得的后代群体大，基因型纯合，将会提高转化频率。

（2）所用的转化材料为小孢子DH系，是遗传意义上的纯系。如果获得转基因植株，转化与非转化植株之间遗传背景完全一致，且完全纯合，便于后代的检测，进而进行基因功能的验证。

（3）细胞穿透肽和质粒DNA之间通过一定的比例就可以结合从而形成一种复合物，向游离小孢子悬浮液中添加这些复合物后，胚胎发生基本不受影响。

（4）本发明获得高效的大白菜遗传转化体系，不仅为大白菜育种研究提供了新的研究平台，也为大白菜功能基因组学的研究提供了良好的基础。

附图说明

图1：DNase I保护分析检测结果。

图中：ck: 阴性对照；1: DNA(GFP)；2:DNA与细胞穿透肽的复合物；M: D5000

图2：转染后的小孢子培养过程。

图中：A: 转染后得到的胚状体；B: 胚状体转入固体MS培养基进行成苗；C: 再生植株的继代培养；D: 再生植株的生根情况

图3：大白菜基因组总DNA琼脂糖电泳检测结果。

图4：转化再生植株的部分PCR扩增检测结果。

图中：n: 非转化植株；p: 质粒DNA

图5：大白菜基因组总RNA和cDNA琼脂糖检测结果。

图中：A: 总RNA；B: 反转录成的cDNA

图6：反转录PCR检测结果。

图中：A: 引物p1p2；B: 引物p3p4；M: D5000；n: 非转化植株；p: 质粒DNA；1-X: PCR阳性植株

图7：荧光显微镜观察检测结果。

图中：A: 非转化植株；B: PCR阳性植株；C: 激光共聚焦检测结果

图8：大白菜基因组酶切检测结果。

图9：Southern Blot检测结果。

图中：1-2: 阳性植株；3: 非转化植株；4: 质粒DNA

图10：阳性植株倍性鉴定。

图中：A:对照，B:单倍体，C:双单倍体，D:嵌合体1，E:嵌合体2。

具体实施方式

      实施例      1      、游离小孢子分离过程

      一、植物材料

所用的转化材料是大白菜早熟品种‘福田50’经游离小孢子培养获得的DH系，我们将其命名为‘FT50’，它具有高成胚率的特点。

      二、游离小孢子分离

将挑选好的花蕾分离小孢子进行培养。花蕾在超净工作台内经浓度为75％乙醇溶液表面消毒30s后，用浓度为0.1％HgCl₂溶液消毒5-8 min，再用无菌水冲洗3次，每次5 min。消毒后的花蕾放入灭过菌的小烧杯内，加入蔗糖浓度为130g·L^-1，PH值为5.8的B₅培养基，用无菌研棒碾压花蕾，使小孢子游离出来，用40μm孔径的尼龙网过滤含小孢子的悬浮液，收集滤液于10 mL离心管中，1000 rpm离心3 min，弃上清液，沉淀加5 mL B₅培养基，摇匀，1000 rpm离心3 min，弃上清液，所得沉淀物即为纯净小孢子。将纯化后的小孢子用NLN-13培养基稀释，稀释密度至1~2×10⁵个·mL^-1，以每皿5 mL小孢子悬浮液分装入直径60 mm的无菌培养皿内, 每皿添加100μL高温灭菌后的0.5g·L^-1琼脂糖和10g·L^-1活性炭混合液；用石蜡膜封口，33℃恒温箱中热激预处理24h。

其中，B₅培养基为含130g·L^-1蔗糖，PH值为5.8的B₅培养基；NLN-13培养基为含130g·L^-1蔗糖，添加激素0.05mg·L^-1 6-BA（ 6-苄氨基腺嘌呤）和0.05mg·L^-1 NAA（α-萘乙酸），PH值为5.8的NLN培养基。

      实施例      2      、转染小孢子的目的基因表达组件的获得过程

将载体pBI221-GFP质粒DNA转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，具体步骤是①取出感受态细胞悬液（-80℃冰箱保存），冰上解冻；②向100μL DH5α感受态中加入质粒DNA 2μL，轻轻混匀，冰上放置30min；③42℃水浴90s，热激后迅速置于冰上静置3-5min；④加入500μL LB液体培养基(不含抗生素)，混匀，37℃，150rpm振荡培养1h，目的是使细菌恢复正常的生长状态，并表达质粒编码的相应抗生素的抗性基因；⑤4000rpm，离心5min，弃400μL上清液，剩余的重悬菌株；⑥涂布于含Kan或Amp 50μgmL-1的LB平板上，正面放置20min，再37℃倒置培养16-20小时。

分别从含有Kan和Amp 50μg mL-1的LB固体培养基上挑取单克隆菌落，分别接种于5mL含50μgmL-1氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜。以2μL过夜培养菌液为模板，以引物p1 GATGGTTAGAGAGGCTTACGCAG，p2 CACAATAAAGTGACAGATAGCTGGG，p3 AGT T CA CCT TGA TGC CGTTC和p4 GTG CTT CA G CCG CTACCC进行PCR扩增，剩余菌液用于扩大培养来提取质粒。PCR扩增产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测。吸取5μL PCR扩增产物上样到点样孔中，加上Marker D2000（天根），在120 U 恒定电压下电泳30min，再用紫外凝胶成像系统拍照分析。

从剩余过夜培养的菌液中吸取4mL，按照1：50的比例分别接种于200mL含50μgmL-1氨苄青霉素的LB液体培养基（LB培养基包含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，用氢氧化钠溶液调pH至7.0。）中，37℃，200rpm，过夜震荡培养。

收集菌液进行质粒提取，使用天根无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒DNA提取；将质粒DNA按照20μL的酶切体系（2μL10× Hbuffer，4μL质粒DNA，1μL限制性内切酶PstI，添加无菌双蒸水至20μL）进行酶切反应；酶切反应体系37℃水浴过夜反应，反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。吸取5μL产物上样到每样孔中，加上Marker D2000（天根），在120 U恒定电压下电泳30min，再用紫外凝胶成像系统拍照分析；经检琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后，扩大酶切体系用于回收目的片段，采用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒回收用于转染的目的DNA片段。

      实施例      3      、体外转染复合物的获取

将100μL含有1μg目的DNA表达片段的溶液与100μL含有4μg细胞穿透肽的溶液混合，室温15min后，加入4μL DNaseI (无RNase)到200μL的反应物中，室温反应15min后，以未加CPP的DNA片段作为空白对照同时加入4μL DNaseI，室温反应15min后，立即放置冰上5min以终止反应。然后用DNA纯化试剂盒回收反应产物，再以正常的DNA片段作为对照点样，用质量体积比为1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。结果如图1所示。

      实施例      4      、小孢子转染与植株再生的过程

100μL含有1μg目的DNA表达片段的溶液与100μL含有4μg细胞穿透肽的溶液混合反应后，将200μL反应混合物添加到经热激预处理的小孢子悬浮液中，再置于33℃恒温箱中继续热激处理24h，最后转移至25℃培养箱暗培养10-15天，肉眼可见胚状体后，将培养皿转移到转数为50转/分钟摇床上继续暗培养，培养温度为25℃；将子叶期胚状体转接到MS培养基上，在25℃，16h/8h光周期条件下培养；获得小孢子再生植株后，再进一步将再生植株接种到植株生根的MS培养基上进行人工诱导生根培养。

转染后的游离小孢子培养得到再生植株的过程如图2所示，这个过程需要经历胚状体的诱导（图2A），胚状体转入固体MS培养基（图2B），继代培养（图2C），生根过程如图2D。最后经移栽，获得236株转化再生植株，成苗率约为53.3％，移栽成活率达100％。

诱导再生植株的MS培养基为含30g·L^-1蔗糖，7.5g·L^-1琼脂，pH值为5.8，未添加任何激素的MS培养基；诱导再生植株生根的MS培养基为含30g·L^-1蔗糖，5.5g·L^-1琼脂，0.1mg·L^-1 NAA，pH值为5.8的MS培养基。

      实施例      5      、再生植株的获得及初步鉴定

      常规      PCR      检测

于超净工作台中，从三角瓶里取再生植株的嫩叶，每个离心管（2mL）里大约100mg，采用新型植物基因组DNA提取试剂盒提取大白菜基因组总DNA。经质量体积比为1％的琼脂糖凝胶电泳分离，紫外凝胶成像系统检测。从图3中可见，基因组总DNA带型整齐、清晰，无降解，没有RNA和其他杂质，适于后续的分子生物学操作。

我们主要利用常规PCR扩增反应来初步鉴定转化植株是否为转基因植株，筛选出PCR阳性植株。PCR扩增体系为：0.5μL模板DNA，1μL10× buffer，0.8μLdNTPs，0.5μL引物p1p2或p3p4，0.2μLTaq DNA 聚合酶，添加无菌双蒸水至10μL；PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性60s，58℃退火60s，72℃延伸1 min，35个循环后72℃延伸7min。经质量体积比为1％的琼脂糖凝胶电泳分离，从紫外凝胶成像系统检测结果得出，236株GFP转化再生植株中分别有121和115株（两者重复的共有99株，总阳性植株共有137株）植株扩增得到预期大小约为523bp和300bp的目的片段，部分检测结果见图4，PCR阳性率分别为51.27％和48.73％，条带清晰可见，此结果初步证实了外源基因已经整合到了大白菜基因组中。

      逆转录      PCR      检测

在PCR阳性植株继代培养的过程中，于超净工作台中取出10株植株的叶片，利用新型植物基因组RNA提取试剂盒提取大白菜转化与未转化植株的基因组总RNA（图5A），可见RNA带型整齐、清晰，无降解，没有DNA和其他杂质，适于后续的分子生物学操作。按照Quant cDNA第一链合成试剂盒(KR103，TianGen)的方法合成阳性植株的cDNA（图5B），然后进行反转录PCR扩增反应，产物经质量体积比为1％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图7，可以看出所选取的PCR阳性植株经反转录PCR反应均扩增到了目的条带，未转化植株无条带出现，阳性对照质粒DNA得到了目的条带（图6）。证实了外源基因阳性植株中得到了表达。

      荧光显微镜观察检测

以未转化再生植株为对照，采用Fluor Cam便携式ChI/GFP荧光仪，分别对PCR阳性再生植株和对照植株进行观察。在蓝色激发光的照射下，99株PCR阳性转化植株中有80株叶片出现了绿色荧光，转化频率为33.9％，如图7（B）所示，对照（图7A）中则没有出现绿色荧光。同时选取有荧光信号的植株利用激光共聚焦显微镜进行观察，且观察到了较强的绿色荧光信号图7（C）。这同样证明了GFP基因在整合进大白菜基因组中后进行了表达。

采用罗氏地高辛标记试剂盒Ⅱ对阳性植株进行Southern Blot检测，具体步骤参考试剂盒说明书进行；

10μL的PCR反应体系包含0.5μL模板DNA，1μL10× buffer缓冲液，0.8μLdNTPs，0.5μL引物p1p2或p3p4，0.2μLTaq DNA 聚合酶；Fluor Cam便携式ChI/GFP荧光仪购于北京易科泰生态技术有限公司。

      实施例      6      、      Southern Blot      检测过程

具体步骤如下：

杂交探针的制备

a. 提取大肠杆菌中的质粒 DNA，以其为模板， 进行GUS和GFP基因的PCR 扩增。将反应产物用 DNA纯化试剂盒回收并纯化。

b. 取1μg的PCR纯化产物到经灭菌的1.5mL离心管中，加入高压灭菌的双蒸水，使终体积达16μL。

c. 沸水煮10min，使DNA变性，然后立即插入冰上5min，使 DNA 完全变性。 

d. 充分混匀DIG-High Prime(1号管)，吸取4μL加入到变性DNA中，混匀并简单离心。

e. 37℃孵育1h或者过夜（最高达20小时）。

f. 加入2μL 0.2M EDTA (pH8.0) 和/或 65℃加热10min终止反应。

大白菜基因组总DNA的酶切与电泳 

采用新型植物基因组DNA提取试剂盒提取非转化和转化大白菜基因组总DNA，选用限制性内切酶分别对非转化和转化的大白菜基因组DNA进行单酶切，同时酶切两种质粒作为正对照，非转化植株总DNA作为负对照。取出用10 μL水溶解酶切后沉淀的DNA，65℃水浴10min后立即放到冰上；酶切产物上样于 0.8%的琼脂糖凝胶中(加EB)，120V电压进行预电泳，待溴粉蓝跑出点样孔后，将调制电压18V，电泳12h以上；电泳充分进行后，用凝胶成像系统拍照，并在凝胶的一侧用透明尺记录下Marker所对应得刻度。

转膜

a. DNA的凝胶处理

拍完照后，切去点样孔，整修凝胶(记录胶的大小)；然后将胶块置于 100 mL 0.25 N HCl中去嘌呤10min，双蒸水洗涤胶3次，加入变性缓冲液并在摇床上低速摇动15min，两次。倒去变性缓冲液，双蒸水洗涤胶3次，最后将胶块在100 mL 中和液中并在摇床上低速摇动15min，两次，再用20×SSC漂洗10 min。

b. 膜的处理

裁剪一长宽均比胶块大 1-2 mm 的尼龙膜，并在一角作上标记，将其浸泡于 ddHO2中至膜完全湿透，然后将尼龙膜浸入转移缓冲液(20×SSC)中，浸泡5 min。2块Whatman长滤纸(两端要能跨过凝胶伸入两边的转移缓冲液中)，提前浸泡在转移缓冲液(20×SSC)中至少5 min。

c. DNA的毛细转移 

从下到上依次为： 10cm厚的吸水纸（两侧分别放一个装有500mL 20×SSC 的玻璃杯）→三层干Whatman滤纸→三层湿Whatman滤纸（预先20×SSC溶液浸泡）→尼龙莫→凝胶（用保鲜膜封住四周）→三层湿Whatman滤纸（预先20×SSC溶液浸泡）→2块Whatman长滤纸(两端要能跨过凝胶伸入两边的转移缓冲液中，提前用转移缓冲液浸泡) →一层保鲜膜盖住→表面光滑的板子→压500 g重物，过夜转移。

d. DNA 的固定：第二天转膜结束，，将膜（无需洗涤）放到已经用10×SSC湿润的Whatman 3MM滤纸上，紫外交联5 min，然后用双蒸水简单冲洗一下紫外交联后的尼龙膜，空气中自然晾干。

杂交

a. 预杂交：将膜放入杂交瓶，倒入预热到杂交温度的（42℃）DIG Easy Hyb（10mL /100cm2膜），然后转入杂交箱中（预热到杂交温度），42℃ ，60 rpm，预杂交30min（可延长到45min）。

b. 将DNA探针（约25ng/mL DIG Easy Hyb）在100℃变性5 min后，立即放到冰水混合物上，冷却2 min。

c. 将变性的DNA探针加到预热的（42℃）DIG Easy Hyb中（3.5mL /100cm2膜），轻柔混匀，避免泡沫。

d. 倒掉预杂交液，将加入探针的杂交液倒入杂交瓶中，42℃，60 rpm，过夜杂交。

洗膜

a. 用足够的2×SSC +0.5%SDS，室温 60 rpm 洗涤2×5 min。

b. 用足够的0.5×SSC +0.5%SDS（提前预热到洗涤温度），68℃，60 rpm 洗涤2×15 min。

免疫检测

应用试剂盒提供的化学发光检测法， 室温进行：

a. 杂交结束并洗膜后，在Washing buffer中短暂冲洗膜约1-5 min。

b. 在80mL Blocking solution 中封闭30 min。（轻摇） 

c. 在20mL Antibody solution 中反应30 min。

d. 转移膜入新容器，用Washing buffer 洗两次，每次15min。

e. 在20mL Detection buffer 中平衡2-5min。

f. 将印迹上DNA的尼龙膜面朝上，小心放入干净的培养皿中，吸取1mL CSPD ready-to-use（Kit瓶5）均匀应用到膜上，立即用保鲜膜盖在膜上，使膜表面均匀的布满发光底物，注意避免产生气泡。室温反应5min 。

g. 把培养皿用封口膜封住，将其放在37℃恒温箱中反应10 min，以强化发光反应。（防止膜干燥）

h. 在室温条件下，采用图像仪曝光大约5-20min，观察图像结果。

为检测方便，我们随机选取10株荧光显微镜观察的阳性植株进行Southern Blot试验。选取GFP基因片段的PCR产物制作探针，酶切质粒DNA为阳性对照，未转化植株DNA为阴性对照，Southern Blot检测结果表明，部分大白菜转化植株外源基因以单拷贝形式插入基因组中，还有一部分大白菜转化植株外源基因以多拷贝形式插入，见图9(1、2)，阳性质粒DNA也出现了杂交信号，如图9（4），大白菜非转化植株则没有杂交信号出现，见图9（3）。至此，我们已经完全证明了外源基因成功的整合到了大白菜的基因组中。

      实施例      7      、再生阳性植株倍性鉴定过程

待再生阳性植株生根后，将再生植株移栽到温室进行培养，温室内温度白天应为20-25℃，晚间温度应为5-10℃。

我们主要利用流式细胞仪对再生植株进行倍性鉴定（图10），筛选出双单倍体植株。取直径为1-2cm 大小的新鲜嫩叶放入培养皿内，加入2.0 mL Chopping Buffer缓冲液（15 mmol·L^-1三羟甲基氨基甲烷，2 mmol·L^-1乙二胺四乙酸二钠，0.5 mmol·L^-1精胺，80 mmo1·L^-1氯化钾，20 mmo1·L^-1 氯化钠，0.1% [v/v] 聚乙二醇辛基苯基醚和15 mmo1·L^-1二巯基乙醇，pH 7.5），用手术剪刀将叶片剪碎，吸取上清液，用300目筛网将样品过滤到离心管内，1000rpm离心10min，离心后弃上清，沉淀加1mL PI（碘化丙啶）染液，混匀避光染色15min后，将样品用500目筛网过滤到上样管中，混匀上机检测， 20s后分析仪自动形成代表该样品倍性的DNA含量峰值图；以已知二倍体的大白菜‘FT’为对照, 使对照的DNA吸收峰处在200道（X轴）位置，每个待测植株分别测定3次，DNA吸收峰值处在X轴200道的样本即为二倍体，而峰值处在100为单倍体，既有200峰值也有400峰值或者既有400峰值也有800峰值的则为嵌合体。

Chopping Buffer缓冲液包含15 mmol·L^-1三羟甲基氨基甲烷，2 mmol·L^-1乙二胺四乙酸二钠，0.5 mmol·L^-1精胺，80 mmo1·L^-1氯化钾，20 mmo1·L^-1氯化钠，0.1% [v/v] 聚乙二醇辛基苯基醚和15 mmo1·L^-1二巯基乙醇，pH 为7.5。

序列表

SEQUENCE LISTING

 

<110>沈阳农业大学

<120>一种借助细胞穿透肽和小孢子培养建立大白菜遗传转化体系的方法

<160>5

 

<210>1

<211>1880

<212>DNA

<213> pBI221-GFP (Transient expression vector pBI221-GFP)

 

<400>1

ggtccccagattagccttttcaatttcagaaagaatgctaacccacagatggttagagag  60

gcttacgcagcaggtctcatcaagacgatctacccgagcaataatctccaggaaatcaaa  120

taccttcccaagaaggttaaagatgcagtcaaaagattcaggactaactgcatcaagaac  180

acagagaaagatatatttctcaagatcagaagtactattccagtatggacgattcaaggc  240

ttgcttcacaaaccaaggcaagtaatagagattggagtctctaaaaaggtagttcccact  300

gaatcaaaggccatggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaactcgccgtaaag  360

actggcgaacagttcatacagagtctcttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtc  420

aacatggtggagcacgacacacttgtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaa  480

gaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattc  540

cattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctac  600

aaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggt  660

cccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacg  720

tcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcc  780

cactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagagaaca  840

cgggggactctagaggatccatagatctgataacaaagatgagtaaaggagaagaacttt  900

tcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaatttt  960

ctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttattt  1020

gcactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactactttctcttatggtg  1080

ttcaatgcttttcaagatacccagatcatatgaaacagcatgactttttcaagagtgcca  1140

tgcccgaaggttatgtacaggaaagaactatatttttcaaagatgacgggaactacaaga  1200

cacgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagttaaaaggta  1260

ttgattttaaagaagatggaaacattcttggacacaaattggaatacaactataactcac  1320

acaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagttaacttcaaaatta  1380

gacacaacattgaagatggaagcgttcaactagcagaccattatcaacaaaatactccaa  1440

ttggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccacacaatctgcccttt  1500

cgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttcttgagtttgtaacagctgctg  1560

ggattacacatggcatggatgaactatacaaataagagctcgaatttccccgatcgttca  1620

aacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatc  1680

atataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgtta  1740

tttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaa  1800

aacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttacta  1860

gatcgggaattcactggccg  1880

 

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213> pBI221-GFP (Transient expression vector pBI221-GFP)

 

<400>2

gatggttagagaggcttacgcag                                          23

                   

 

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213> pBI221-GFP (Transient expression vector pBI221-GFP)

 

<400>3

cacaataaagtgacagatagctggg                                     25

 

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213> pBI221-GFP (Transient expression vector pBI221-GFP)

 

<400>4

agt t ca cct tga tgc cgttc                       20

 

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213> pBI221-GFP (Transient expression vector pBI221-GFP)

 

<400>5

gtg ctt ca g ccg ctaccc                                             18

 

Claims (1)

1.一种借助细胞穿透肽和小孢子培养建立大白菜遗传转化体系的方法，其特征在于过程包括：

（1）进行分离纯化小孢子：在大白菜开花期，选取其长度为2-4 mm的未开放花蕾，花蕾在超净工作台内经浓度75％乙醇溶液，浓度0.1％HgCl₂溶液消毒后，再用无菌水冲洗3次；将消毒后的花蕾在B₅培养基中进行分离纯化，收集得到的沉淀物即为纯净小孢子；将纯化后的小孢子用NLN-13培养基稀释后分装入直径60 mm的无菌培养皿内，置入33℃恒温箱中，热激预处理24h；

其中，B₅培养基为含130g·L^-1蔗糖，PH值为5.8的B₅培养基，NLN-13培养基为含130g·L^-1蔗糖，添加激素0.05mg·L^-1 6-BA和0.05mg·L^-1 NAA，PH值为5.8的NLN-13培养基；

（2）转染小孢子的基因表达组件的获得：将载体pBI221-GFP质粒DNA转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并在添加氨苄青霉素的LB培养基上进行扩大培养；以2μL菌液为模板，用引物

p1 GATGGTTAGAGAGGCTTACGCAG，

p2 CACAATAAAGTGACAGATAGCTGGG，

p3 AGT T CA CCT TGA TGC CGTTC和p4 GTG CTT CA G CCG CTACCC进行PCR扩增，再用紫外凝胶成像系统拍照鉴定；使用天根无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒DNA提取，将质粒DNA利用限制性内切酶PstI进行酶切反应；采用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒回收用于转染的目的DNA表达片段；

LB培养基包含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，用氢氧化钠溶液调pH至7.0；

（3）获取用于小孢子转染的体外复合物：将100μL含有1μg目的DNA表达片段的溶液与100μL含有4μg细胞穿透肽的溶液混合，室温反应15分钟后再向200μL混合液中加入4μL无RNA酶的DNA酶，室温放置15分钟，立即放置冰上终止反应；以未加细胞穿透肽的DNA片段作为空白对照；然后用天根通用型DNA纯化回收试剂盒回收反应产物，用质量体积比为1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测；

（4）小孢子转染与培养过程：100μL含有1μg目的DNA表达片段的溶液与100μL含有4μg细胞穿透肽的溶液混合反应后，将200μL反应混合物添加到经热激预处理的小孢子悬浮液中，再置于33℃恒温箱中继续热激处理24h，最后转移至25℃培养箱暗培养；将得到的胚状体转接到MS培养基上进一步培养获得小孢子再生植株；

获得小孢子再生植株后，再进一步将再生植株接种到植株生根的MS培养基上进行人工诱导生根培养；

诱导再生植株的MS培养基为含30g·L^-1蔗糖，7.5g·L^-1琼脂，pH值为5.8，未添加任何激素的MS培养基；

诱导再生植株生根的MS培养基为含30g·L^-1蔗糖，5.5g·L^-1琼脂，0.1mg·L^-1 NAA，pH值为5.8的MS培养基；

（5）对再生植株进行转基因鉴定：在再生植株继代培养的过程中，于超净工作台中取出再生植株的叶片，利用天根新型植物基因组提取试剂盒提取大白菜转化与未转化植株的基因组总DNA，然后通过10μL的PCR反应体系进行扩增反应，产物经质量体积比为1％的琼脂糖凝胶电泳分离，紫外凝胶成像系统检测；

于超净工作台中，从三角瓶里取PCR阳性再生植株的嫩叶，采用新型植物RNA提取试剂盒提取大白菜总RNA，然后进行反转录PCR扩增反应，产物经质量体积比为1％的琼脂糖凝胶电泳分离，紫外凝胶成像系统检测；

于超净工作台中取出阳性与非转化再生植株的幼叶，用Fluor Cam便携式ChI/GFP荧光仪和激光共聚焦显微镜对PCR阳性转化植株进行检测；

采用罗氏地高辛标记试剂盒Ⅱ对阳性植株进行Southern Blot检测；

10μL的PCR反应体系包含0.5μL模板DNA，1μL10× buffer缓冲液，0.8μLdNTPs，0.5μL引物p1p2或p3p4，0.2μLTaq DNA 聚合酶；

（6）利用流式细胞仪对再生植株进行倍性鉴定：取直径为1-2cm 大小的新鲜嫩叶放入培养皿内，加入2.0 mL Chopping Buffer缓冲液，用手术剪刀将叶片剪碎，吸取上清液，用300目筛网将样品过滤到离心管内，1000rpm离心10min，离心后弃上清，沉淀加1mL PI（碘化丙啶）染液，混匀避光染色15min后，将样品用500目筛网过滤到上样管中，混匀上机检测，20s后分析仪自动形成代表该样品倍性的DNA含量峰值图；以已知二倍体的材料为对照，使对照的DNA吸收峰处在X轴200道位置，每个待测植株分别测定3次, DNA吸收峰值处在200道的样本即为二倍体，而峰值处在100为单倍体，既有200峰值也有400峰值或者既有400峰值也有800峰值的则为嵌合体；

Chopping Buffer缓冲液包含15 mmol·L^-1三羟甲基氨基甲烷，2 mmol·L^-1乙二胺四乙酸二钠，0.5 mmol·L^-1精胺，80 mmo1·L^-1氯化钾，20 mmo1·L^-1氯化钠，0.1% [v/v] 聚乙二醇辛基苯基醚和15 mmo1·L^-1二巯基乙醇，pH 为7.5。