CN107022561A - 用于培育转基因玉米的培养基及培养方法 - Google Patents

用于培育转基因玉米的培养基及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于培育转基因玉米的培养基，包括共培养培养基、愈伤诱导培养基、筛选培养基、分化培养基和生根培养基，其中共培养培养基和愈伤诱导培养基中分别添加有终浓度为0.5‑1.0mg/L的NAA，0.005‑0.05mg/L的TDZ和/或0‑0.1mg/L的KT。本发明还提供转基因玉米的培养方法，以玉米幼胚为外植体，通过农杆菌转化的方法获得转基因玉米植株，为玉米遗传育种提供新的种质资源。本方法具有周期短、阳性率高、操作简单的特点，为实现商业化大规模生产转基因玉米提供了新的方法。

Description

用于培育转基因玉米的培养基及培养方法
技术领域
本发明涉及植物转基因技术领域和作物遗传育种领域，具体地说，涉及用于培育转基因玉米的培养基及培养方法。
背景技术
玉米是我国重要的粮食作物和饲料作物，在我国粮食生产和国民经济中占有重要地位。然而自2010年以来，我国已从玉米净出口国转变为净进口国。2012年我国进口玉米521万吨，价值17亿美元。因此，通过育种技术的应用提高玉米产量，掌握玉米产业主动权是保持国内玉米供需平衡的关键，也将对我国粮食安全和应对可能出现的粮食危机产生深远影响。
随着生物技术的不断发展，越来越多优于传统育种技术的新型育种技术不断涌现。传统育种技术周期长，需要不断地回交才能获得纯合后代。生物技术育种很大程度上缩短了育种周期，因而得到了较快发展，转基因育种便是其中的一种。在转化方法方面，除了基因枪法，还包括电击法、超声波法、微注射法、PEG法和农杆菌介导法。农杆菌介导法操作简单，转化率较高，费用低，且导入的外源基因多为单拷贝，是目前应用最为广泛的转化方法。
在玉米转基因技术上，直到80年代后期才在遗传转化方面取得突破。1975年第一例玉米自交系(A188)转化再生植株见于报道。1988年，Klein等人以玉米的胚状体和非胚状体细胞为外植体，用基因枪法转移cat基因，观察到瞬时表达。农杆菌介导法直到1996年才成功用于转化玉米自交系A188。除了转化方法的限制，基因型也是限制玉米遗传转化发展的重要因素。因此，开发适合商业化生产的玉米品种的高效稳定的转基因方法，对于掌握转基因玉米产业主动权具有至关重要的作用。
发明内容
本发明的目的是提供用于培育转基因玉米的培养基及培养方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的用于培育转基因玉米的培养基组合，包括共培养培养基、愈伤诱导培养基、筛选培养基、分化培养基和生根培养基；
其中，所述共培养培养基和愈伤诱导培养基中添加NAA(萘乙酸)、TDZ(噻二唑苯基脲)和/或KT(6-糠基氨基嘌呤)，它们的终浓度分别为0.5-1.0mg/L、0.005-0.05mg/L、0-0.1mg/L；优选地，TDZ和NAA终浓度分别为0.005mg/L和0.5mg/L，KT的终浓度为0.1mg/L。
所述筛选培养基中添加有草丁膦，其终浓度为5-200mg/L，优选10-40mg/L，更优选20mg/L。
所述共培养培养基的组成如下：MS盐0.8-1.2g/L+N6盐0.8-1.5g/L+蔗糖15-30g/L+葡萄糖5-15g/L+脯氨酸0.1-0.3g/L+盐酸硫胺素0.1-1mg/L+AgNO3(硝酸银)10-20μM+L-半胱氨酸100-500mg/L+2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)1-1.5mg/L+NAA0.5-1.0mg/L+TDZ 0.005-0.05mg/L和/或KT 0-0.1mg/L+乙酰丁香酮100-500μM+MES(2-吗啉乙磺酸)0.5-1g/L+1000×MS维生素1mL/L+植物凝胶6-10g/L。
所述愈伤诱导培养基的组成如下：MS盐1.6-2.4g/L+N6盐1.6-3g/L+蔗糖20-40g/L+脯氨酸1-2g/L+MES 0.5-1g/L+1000×MS维生素1mL/L+AgNO3 10-20μM+水解酪蛋白0.3-1.0g/L+2,4-D 1-1.5mg/L+NAA 0.5-1.0mg/L+TDZ 0.005-0.05mg/L和/或KT 0-0.1mg/L+特美汀100-300mg/L+植物凝胶2.5-3.5g/L。
所述筛选培养基的组成如下：MS盐1.6-2.4g/L+N6盐1.6-3g/L+蔗糖20-40g/L+脯氨酸1.0-2.0g/L+1000×MS维生素1mL/L+AgNO310-20μM+水解酪蛋白0.3-1.0g/L+2,4-D1.0-1.5mg/L+NAA0.5-1.0mg/L+MES 0.5-1.0g/L+特美汀100-300mg/L+草丁膦5-200mg/L+植物凝胶2.5-3.5g/L。
所述分化培养基包括分化培养基I和分化培养基II，它们的组成如下：
分化培养基I：MS盐4-5g/L+蔗糖20-30g/L+1000×LS维生素1mL/L+硫酸铜5-15μM+MES0.5-1.0g/L+6-BA(6-苄氨基嘌呤)2-4mg/L+特美汀100-300mg/L+双丙氨膦2-5mg/L+植物凝胶2.5-3.5g/L；
分化培养基II：MS盐4-5g/L+蔗糖20-30g/L+1000×LS维生素1mL/L+硫酸铜5-15μM+MES0.5-1.0g/L+特美汀100-300mg/L+双丙氨膦2-5mg/L+植物凝胶2.5-3.5g/L。
所述生根培养基的组成如下：MS盐4-5g/L+蔗糖20-30g/L+MES0.5-1.0g/L+IBA(吲哚丁酸)0.1-0.5mg/L+植物凝胶2.5-3.5g/L。
其中，MS盐的组成如下：
N6盐的组成如下：
本发明还提供上述培养基组合在转基因玉米遗传育种中的应用。
本发明进一步提供转基因玉米的培养方法，包括以下步骤：
(1)将玉米的幼胚浸入携带目的基因和Bar标记基因的农杆菌菌液中侵染；
(2)将幼胚移至所述共培养培养基上培养；
(3)将幼胚移至所述愈伤诱导培养基上培养，诱导初级愈伤组织；
(4)将初级愈伤组织移至所述筛选培养基上培养，诱导抗性愈伤组织，再转移到所述分化培养基上，分化形成再生幼苗；
(5)再生幼苗在所述生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因玉米。
前述的方法，步骤(1)中玉米的幼胚是从授粉后6-15天，待玉米幼胚长至0.5-2.0mm时，从玉米幼穗上剥取获得。即，将玉米幼穗进行灭菌后剥取0.5-2.0mm长的幼胚，将幼胚浸入如下侵染液中侵染，侵染时间不超过15min(5-15min)。
侵染液组成为：MS盐1.5-2.5g/L+蔗糖60-80g/L+葡萄糖20-40g/L+L-脯氨酸0.1-0.3g/L+乙酰丁香酮100-500μM+OD600值0.1-0.5(优选OD600值0.3)携带目的基因和Bar标记基因的农杆菌菌液。优选使用农杆菌菌株为EHA105。
步骤(2)中培养条件为：23℃黑暗培养48-96h。
步骤(3)中培养条件为：26-34℃黑暗培养1-2周。
所述步骤(4)具体为：将初级愈伤组织移至所述筛选培养基上培养，培养条件为：28℃黑暗培养4-6周，诱导抗性愈伤组织，再转移到所述分化培养基I上，培养条件为：25℃，5000lx，光照培养1周，然后转移到所述分化培养基II上，培养条件为：25℃，5000lx，光照培养2周，分化形成再生幼苗。
本发明还提供利用上述方法获得的转化玉米细胞、植株部分和转基因植株。
本发明中涉及的玉米品种包括但不限于玉米自交系AY63。AY63为玉米品种安玉2166的母本，安玉2166以其丰产稳产性好、品质优、适应性广、抗倒伏，抗丝黑穗病，高抗茎腐病、穗粒腐病和大小斑病等特点得到大面积推广种植。以自交系AY63作为受体材料，建立组织培养体系，通过转化导入外源基因，可加快大穗型玉米品种育种进程，具有较大的商业价值，同时可为玉米育种提供新的种质资源。
利用本发明提供的培养基和培养方法，以玉米幼胚为外植体，通过将外源基因成功地转入玉米组织中，可实现对玉米的高转化频率、高重复性的农杆菌介导转化，转化率可达10-20％，为玉米遗传育种提供新的种质资源；另外，本方法具有周期短、阳性率高、操作简单的特点，为实现商业化大规模生产转基因玉米提供了新的方法。
附图说明
图1为本发明实施例3中外源基因GFP在组织中的表达情况；其中，A为筛选结束后愈伤组织GFP表达情况，B为A中愈伤组织在自然光下组织形态；C为筛选结束后另一块愈伤组织GFP表达情况，D为C中愈伤组织在自然光下组织形态。
图2为本发明实施例3中外源基因Bar的Real-time PCR检测结果。
图3为本发明实施例3中外源基因GFP在组织中的Southern-blot检测结果；其中，泳道1为分子量标准，泳道2为空白对照，泳道3-10为不同转基因植株Hind III酶切基因组DNA杂交结果。
图4为本发明实施例3中外源基因Bar的PCR检测结果；其中，泳道M为分子量标准，泳道1为阳性质粒，泳道2为阴性对照，泳道3-10为不同转基因植株基因组DNA的PCR扩增产物。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1转基因玉米的制备方法
本实施例中所用玉米自交系为AY63，由中国种子集团有限公司提供。
1、玉米果穗处理与幼胚的分离
(1)玉米植株授粉6-15d后，幼胚长至0.5-2.0mm时，收获玉米幼穗，去除苞叶，准备灭菌；
(2)将浓度为6.15％的次氯酸钠母液用灭菌水按体积比稀释到15％-20％，每升溶液加入5-10μL Tween-20混匀制成灭菌液；
(3)将玉米幼穗放入灭菌液中浸泡15分钟，无菌水冲洗3-5次，备用；
(4)在超净工作台中用无菌的手术刀片削去种子顶端，用无菌刮铲掘取胚乳使幼胚从种子中暴露出来，剥取幼胚，将分离出的幼胚放入含有1.8mL悬浮液的2mL塑料离心管中。
2、侵染与共培养
(1)吸去离心管中的悬浮液，加入200μL新鲜的悬浮液，4000rpm离心15s，45℃水浴热击3min，然后转入0℃冰浴1min；
(2)用移液枪吸去离心管中的悬浮液，加入1.0ml OD600值为0.3携带目的基因(外源基因GFP)和Bar标记基因的农杆菌侵染液，菌株为EHA105，侵染5-15min；
(3)将离心管中的幼胚悬浮后倒入共培养培养基，并用移液枪吸去表面多余的农杆菌侵染液，将幼胚盾片朝上放置，于23℃黑暗共培养2-4d。
3、诱导与筛选
(1)共培养后，将幼胚转移到愈伤诱导培养基中，于26℃-34℃黑暗培养7-14d，诱导初级愈伤组织；
(2)初级诱导培养结束后，将初级愈伤组织转入含草丁膦(5-200mg/L)的筛选培养基上，于28℃黑暗培养。定期观察愈伤的生长状况及是否产生污染，若发生污染及时更换新的培养基。筛选2-3轮，一轮为2周。
4、植株再生与移栽
(1)筛选培养结束后，将表现抗性的愈伤组织转移至分化培养基I中，25℃，5000lx，光照培养1周；
(2)将出现绿点的愈伤组织转移至分化培养基II中，光照培养2周；
(3)将分化出的幼苗转移至生根培养基上，25℃，5000lx，光照培养直至生根；
(4)将转基因再生苗转入专用穴盘中生长，炼苗后移栽于温室中，3-4个月后即可收获后代种子。
上述方法中使用的培养基配方如下：
①悬浮液：MS盐2g/L+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+L-脯氨酸0.115g/L，以水配制；
②侵染液：MS盐2g/L+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+L-脯氨酸0.115g/L+乙酰丁香酮200μM+OD600值0.3农杆菌液，以水配制；
③共培养培养基：MS盐1.0825g/L+N6盐1.0g/L+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+脯氨酸0.115g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO320μM+L-半胱氨酸200mg/L+2,4-D1.5mg/L+NAA0-1.0mg/L+TDZ 0-0.05mg/L或KT 0-0.1mg/L+乙酰丁香酮200μM+MES 0.5g/L+1000×MS维生素1mL/L+植物凝胶8g/L；
④愈伤诱导培养基：MS盐2.165g/L+N6盐2g/L+蔗糖30g/L+脯氨酸1.38g/L+MES0.5g/L+1000×MS维生素1mL/L+AgNO320μM+水解酪蛋白0.5g/L+2,4-D1.5mg/L+NAA0-1.0mg/L+TDZ 0-0.05mg/L或KT 0-0.1mg/L+特美汀200mg/L+植物凝胶3g/L；
⑤筛选培养基：MS盐2.165g/L+N6盐2g/L+蔗糖30g/L+脯氨酸1.38g/L+1000×MS维生素1mL/L+AgNO320μM+水解酪蛋白0.5g/L+2,4-D 1.5mg/L+NAA0.5mg/L+MES 0.5g/L+特美汀200mg/L+草丁膦5-200mg/L+植物凝胶3g/L；
⑥分化培养基I：MS盐4.3g/L+蔗糖20g/L+1000×LS维生素1mL/L+硫酸铜10μM+MES0.5g/L+6-BA 3.5mg/L+特美汀200mg/L+双丙氨膦3mg/L+植物凝胶3g/L；
⑦分化培养基II：MS盐4.3g/L+蔗糖20g/L+1000×LS维生素1mL/L+硫酸铜10μM+MES 0.5g/L+特美汀200mg/L+双丙氨膦3mg/L+植物凝胶3g/L；
⑧生根培养基：MS盐4.3g/L+蔗糖20g/L+MES 0.5g/L+IBA0.2mg/L+植物凝胶3g/L。
其中，MS盐的组成如下：
N6盐的组成如下：
实施例2 AY63幼胚农杆菌转化体系的优化
1、共培养培养基和愈伤诱导培养基中添加NAA
在共培养和愈伤诱导培养阶段，培养基中除了添加适量的植物生长调节剂2,4-D之外，不同浓度NAA的添加对转化效率有一定的影响。其添加效果如表1所示，在共培养和愈伤诱导培养基中添加0.5mg/L NAA或1.0mg/L NAA，转化率得到了大幅提高，平均值由1.63％分别提高到3.66％和3.42％。
表1共培养培养基和愈伤诱导培养基中添加不同浓度NAA的转化率(％)对比
2、共培养培养基和愈伤诱导培养基中添加KT
在共培养培养基和愈伤诱导培养阶段，培养基中除了添加适量的植物生长调节剂2,4-D和NAA之外，KT的添加对转化效率有一定的影响。其添加与否的对比效果如表2所示，在共培养和愈伤诱导培养基中添加0.1mg/L KT，转化率得到了提高，平均值由4.00％提高到4.67％。
表2共培养培养基和愈伤诱导培养基中KT添加与否的转化率(％)对比
3、共培养培养基和愈伤诱导培养基中添加TDZ
在共培养培养基和愈伤诱导培养阶段，培养基中除了添加适量的植物生长调节剂2,4-D和NAA之外，不同浓度TDZ的添加对转化效率有一定的影响，其添加效果如表3所示。TDZ浓度范围在0.005-0.05mg/L时，均可以得到转基因阳性植株。在共培养培养基和愈伤诱导培养基中添加0.005mg/L TDZ，可使转化率的平均值由3.98％提高到11.66％。
表3共培养培养基和愈伤诱导培养基中添加不同浓度TDZ的转化率(％)对比
4、筛选培养阶段筛选剂浓度的确定
转化幼胚经过愈伤诱导培养后，需要筛选培养2个周期，每个周期为1-2周。如表4所示，在外植体实验条件一致的前提下，不同浓度草丁膦筛选是转化率不同，在筛选培养基中草丁膦的添加浓度范围在5-200mg/L时，均能得到转基因阳性植株。因此，筛选培养基中草丁膦的添加量为终浓度范围在5-200mg/L之间，优选10-40mg/L，更优选20mg/L。
表4不同浓度草丁膦筛选的转化率(％)对比
实施例3转基因玉米的检测
1、外源基因GFP在转基因玉米组织中的表达观察
取实施例1的AY63转化愈伤组织观察外源基因GFP在组织中的表达，在荧光下见绿色荧光，说明外源基因成功表达，否则为阴性材料，阴性材料与阳性材料相比，在荧光下无典型绿色荧光，愈伤组织呈黄色(图1)。
2、Real-time PCR检测
使用ABI 7900荧光定量PCR仪。
内参基因为IVR，正向引物为5-ACTAGGCATCCAAGGCGAACG-3；反向引物为5-AGTGCGAGAAGAACGAGTGTCC-3’。目标检测基因为Bar，正向引物为5-GACCTCCACCGTGAACTTCC-3；反向引物为5-GTCCAGTCGTAGGCGTTGC-3’。
PCR反应体系(10μL)：MIX(Roche FastStart Universal SYBR Green Master[ROX]Cat.No.04913914001)5μL，引物溶液(含正向引物和反向引物)2.5μL，玉米叶片DNA模板2.5μL。
PCR反应程序为：95℃预变性10分钟，95℃变性10秒，60℃延伸55秒，35个循环。
Real time-PCR反应完成后，根据荧光定量PCR仪生成的内参基因和目标基因的平均Ct(扩增循环数)值，判定阳性和阴性样品，在整个扩增区间中内有扩增曲线的为阳性(图2)。
3、Southern-blot检测
选取若干样品进行Southern杂交。Southern杂交探针标记及杂交与显影采用Roche公司DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit I。具体实验方法如下：
(1)CTAB法抽提转化植株总基因组DNA
分单株取叶片0.5-1g，放入预冷的研钵中，加入液氮快速将叶片研磨成粉末，倒入2mL离心管中。加入700μL预热至65℃的1.5％CTAB提取液并摇匀，65℃水浴保温30-60min，期间摇动几次；
室温冷却后，加入700μL氯仿，摇匀后，颠倒轻摇10min，室温下8000rpm离心10min；
移上清至另一离心管，加入等体积的沉淀液(异丙醇)，-20℃下沉淀30分钟，室温下8000rpm离心10min；
用700μL 75％乙醇漂洗2-3次，风干后溶于50μL TE中-20℃保存备用。
(2)基因组DNA的酶切
选用合适的限制性内切酶酶切转化植株总基因组DNA，酶切反应体系如下：
混匀后，于37℃酶切10-18h左右，酶切后先取少量进行预电泳检测酶切效果，然后用酶切好的总DNA在1％的琼脂糖凝胶中进行低电压(30-40V)电泳过夜，使DNA充分分离。
(3)转膜
将凝胶修整后切去右下角作为标记，浸泡在0.25mol/L HCl至溴酚蓝变黄，蒸馏水洗两次；碱变性液(1.5M NaCl,0.5M NaOH)中变性45min，去离子水漂洗；中和液[1M Tris-HCl(pH7.4),1.5M NaCl]中漂洗30min，更换中和液漂洗15min；置于搭好的转膜台上，用10×SSC作为转膜液，Hybond-N和尼龙膜漂洗于去离子水液面，直至完全湿润，浸入转移缓冲液中；用10×SSC溶液进行毛细管法转移16-20h，将胶上的DNA转移到尼龙膜上。转移结束后，将尼龙膜用2×SSC溶液简单漂洗后，紫外交联仪上交联1min后，室温晾干，用保鲜膜将膜包好，4℃下保存备用。
(4)探针合成及杂交与显影
探针标记：取1μg或(10ng-3μg)回收的DNA，加灭菌ddH2O至16μL；PCR仪95℃，10分钟，迅速放冰上；加入4μL DIG-High Prime，短暂离心；37℃PCR仪或水浴，1h或过夜(O/N)；65℃，10分钟或加入2μL 0.2mol/L EDTA(pH 8.0)以终止反应。
(5)探针效率检测
将已完成标记的探针，稀释成8个浓度梯度；每个稀释度各取1μL点于尼龙膜上，120℃下烘30分钟；将膜放入杂交管，在杂交管中加入20mL马来酸，杂交炉里室温转动2分钟；倒掉马来酸，加入10mL1×Blocking solution，室温转动30分钟；倒掉1×Blockingsolution，加入10ml Antibody solution，室温转动30分钟；倒掉Antibody solution，加入20ml Washing buffer，室温转动15分钟；倒掉Washing buffer，加入10ml Detectionbuffer，室温转动2-5分钟；随后将膜用镊子轻轻取出，放入封口袋，在袋中加入2mL Clor-substrate，5-10分钟暗处显影，忌摇动。
显色适时，将膜放于TE或ddH2O中浸泡冲洗。
(6)杂交
加热杂交液DIG Easy Hyb(10mL/100cm2)，在杂交炉中42℃下预杂交30分钟；
95℃下变性探针(25ng/mL)，5分钟后置于冰上；
将变性探针加入到预先加热的DIG Easy Hyb中(3.5mL/100cm2)，混匀；倒掉预杂交液，加入变性好的探针；杂交炉中42℃下杂交4h-O/N。
(7)洗膜
倒掉杂交液，然后用2×SSC，0.1％SDS室温下洗涤两次，每次5分钟；最后用0.5×SSC，0.1％SDS，65℃下洗涤两次，每次15分钟。
(8)显色：同探针检测操作。
本实施例选择目的基因GFP上不存在识别位点，并且在插入片段中只具有单一位点的高活性内切酶Hind III处理植物基因组。所得包含目的基因的植物基因组片段较小，有利于进行后续的转膜等处理。
结果如图3所示，检测的8个玉米转基因事件中，有2个为单拷贝植株，5个双拷贝植株，1个四拷贝植株。说明目的基因Bar已经成功插入玉米基因组中。
4、PCR检测
提取转基因植株基因组DNA，根据Bar基因序列设计引物，引物序列如下：
F：5’-GTCCAGTCGTAGGCGTTGC-3’
R：5’-GACCTCCACCGTGAACTTCC-3’
PCR反应程序为：95℃预变性10分钟，95℃变性10秒，60℃延伸55秒，35个循环。
结果如图4所示，阳性质粒对照的PCR扩增片段大小为168bp，转化植株的基因扩增片段大小与阳性质粒对照的PCR扩增片段大小一致。表明Bar基因整合到转化植株的基因组中。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.用于培育转基因玉米的培养基组合，其特征在于，包括共培养培养基、愈伤诱导培养基、筛选培养基、分化培养基和生根培养基；
所述共培养培养基和愈伤诱导培养基中添加有NAA、TDZ和/或KT，它们的终浓度分别为0.5-1.0mg/L、0.005-0.05mg/L、0-0.1mg/L；优选地，TDZ和NAA终浓度分别为0.005mg/L和0.5mg/L，KT的终浓度为0.1mg/L。
2.根据权利要求1所述的培养基组合，其特征在于，所述筛选培养基中添加有草丁膦，其终浓度为5-200mg/L，优选10-40mg/L，更优选20mg/L。
3.根据权利要求1或2所述的培养基组合，其特征在于，所述共培养培养基的组成如下：MS盐0.8-1.2g/L+N6盐0.8-1.5g/L+蔗糖15-30g/L+葡萄糖5-15g/L+脯氨酸0.1-0.3g/L+盐酸硫胺素0.1-1.0mg/L+AgNO3 10-20μM+L-半胱氨酸100-500mg/L+2,4-D 1.0-1.5mg/L+NAA0.5-1.0mg/L+TDZ 0.005-0.05mg/L和/或KT 0-0.1mg/L+乙酰丁香酮100-500μM+MES 0.5-1.0g/L+1000×MS维生素1mL/L+植物凝胶6-10g/L。
4.根据权利要求1或2所述的培养基组合，其特征在于，所述愈伤诱导培养基的组成如下：MS盐1.6-2.4g/L+N6盐1.6-3g/L+蔗糖20-40g/L+脯氨酸1-2g/L+MES 0.5-1g/L+1000×MS维生素1mL/L+AgNO3 10-20μM+水解酪蛋白0.3-1.0g/L+2,4-D 1.0-1.5mg/L+NAA 0.5-1.0mg/L+TDZ 0.005-0.05mg/L和/或KT 0-0.1mg/L+特美汀100-300mg/L+植物凝胶2.5-3.5g/L。
5.根据权利要求1或2所述的培养基组合，其特征在于，所述筛选培养基的组成如下：MS盐1.6-2.4g/L+N6盐1.6-3g/L+蔗糖20-40g/L+脯氨酸1-2g/L+1000×MS维生素1mL/L+AgNO310-20μM+水解酪蛋白0.3-1.0g/L+2,4-D 1.0-1.5mg/L+NAA 0.5-1.0mg/L+MES 0.5-1.0g/L+特美汀100-300mg/L+草丁膦5-200mg/L+植物凝胶2.5-3.5g/L。
6.根据权利要求1或2所述的培养基组合，其特征在于，所述分化培养基包括分化培养基I和分化培养基II，它们的组成如下：
分化培养基I：MS盐4-5g/L+蔗糖20-30g/L+1000×LS维生素1mL/L+硫酸铜5-15μM+MES0.5-1g/L+6-BA 2-4mg/L+特美汀100-300mg/L+双丙氨膦2-5mg/L+植物凝胶2.5-3.5g/L；
分化培养基II：MS盐4-5g/L+蔗糖20-30g/L+1000×LS维生素1mL/L+硫酸铜5-15μM+MES0.5-1.0g/L+特美汀100-300mg/L+双丙氨膦2-5mg/L+植物凝胶2.5-3.5g/L。
7.根据权利要求1或2所述的培养基组合，其特征在于，所述生根培养基的组成如下：MS盐4-5g/L+蔗糖20-30g/L+MES 0.5-1.0g/L+IBA 0.1-0.5mg/L+植物凝胶2.5-3.5g/L。
8.转基因玉米的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将玉米的幼胚浸入携带目的基因和Bar标记基因的农杆菌菌液中侵染；
(2)将幼胚移至权利要求1-7任一项所述的共培养培养基上培养；
(3)将幼胚移至权利要求1-7任一项所述的愈伤诱导培养基上培养，诱导初级愈伤组织；
(4)将初级愈伤组织移至权利要求1-7任一项所述的筛选培养基上培养，诱导抗性愈伤组织，再转移到权利要求1-7任一项所述的分化培养基上，分化形成再生幼苗；
(5)再生幼苗在权利要求1-7任一项所述的生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因玉米。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
步骤(1)中玉米的幼胚是从授粉后6-15天，待玉米幼胚长至0.5-2.0mm时，从玉米幼穗上剥取获得；
步骤(1)中将玉米的幼胚浸入如下侵染液中侵染，侵染时间不超过15min；侵染液组成为：MS盐1.5-2.5g/L+蔗糖60-80g/L+葡萄糖20-40g/L+L-脯氨酸0.1-0.3g/L+乙酰丁香酮100-500μM+OD600值0.1-0.5携带目的基因和Bar标记基因的农杆菌菌液；
步骤(2)中培养条件为：23℃黑暗培养48-96h；
步骤(3)中培养条件为：26-34℃黑暗培养1-2周。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述玉米品种包括玉米自交系AY63。
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